CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đặc điểm Lactase là tên gọi thông thường của -D-galactosidase (-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.23) có khả năng thủy phân lactose thành các đường đơn galactose và glucose (Gekas V, López-Leiva M; 1985). Ngoài ra, lactase còn có khả năng xúc tác phản ứng transglycosyl tạo galacto-oligosaccharides (Prenosil J.E và cộng sự, 1987). Lactase thủy phân các liên kết O-glycosyl tại các phần glycone của cơ chất (hình 1.
Một số tác động có thể làm thay đổi hoạt tính của enzyme như sự thay thế nhóm hydroxylmethyl trên carbon số 6 bởi nhóm methyl hoặc một nguyên tử hydro. Kết quả làm cho enzyme này có hoạt tính trên -L-arabinoside và -D-fucoside. Ngoài ra, lactase có thể bị mất hoạt tính nếu cơ chất bị methyl hóa ở carbon số 2, 3, 4, hoặc 6; mất cấu trúc vòng pyranose; hoặc cấu hình thay đổi từ β sang α. Khi thay thế oxy bằng lưu huỳnh cũng làm enzyme mất hoạt tính nhưng không mất liên kết ái lực.1: Sự thủy phân lactose bằng lactase Hoạt tính của lactase ở người giảm sau khi cai sữa, và điều này làm cho một số người giảm khả năng tiêu thụ lactose.
Vì vậy, lactase đã được ứng dụng trong ngành 2 Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 dược nhằm hỗ trợ quá trình tiêu hóa lactose và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm sản xuất sữa và những sản phẩm từ sữa nghèo lactose. Cơ chế xúc tác Lactase thủy phân lactose theo hai cơ chế [5,9]: Thủy phân lactose tạo thành glucose và galactose: Sử dụng enzyme thủy phân lactose là một trong những kỹ thuật sinh học quan trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm. Vào năm 1994, Jacobson đã sử dụng enzyme lactase thu nhận từ Escherichia coli để giải thích cơ chế thủy phân lactose thành glucose và galactose. Các nhà nghiên cứu đã giả định trung tâm hoạt động của lactase chứa cysteine và histidine có chức năng tương ứng là nhóm cho proton và nhận proton.
Cysteine chứa nhóm sulphydryl sẽ hoạt động như nhóm cho proton và histidine chứa vòng imidazole sẽ hoạt động như tâm ái nhân để thuận tiện phân cắt liên kết glycoside trong quá trình thủy phân liên kết β-glycoside của lactose (Mahoney 1998, Zhow and Chen 2001). Với khả năng thủy phân lactose thành glucose và galactose, lactase đã có những ứng dụng rất quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong công nghiệp chế biến sữa và những sản phẩm từ sữa. β-galactosidase β-linkage Lactose Galactose Glucose Hình 1.2: Cơ chế thủy phân lactose bởi lactase (© Dr. Noel Sturm 2003) Phản ứng chuyển nhóm galactosyl tạo oligosaccharide Trong quá trình thủy phân lactose, enzyme lactase còn có khả năng gắn nhóm glactosyl vào các phân tử đường, kết quả tạo ra những phân tử oligosaccharide.
Nguồn 3 Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 thu nhận enzyme, bản chất enzyme và nồng độ cơ chất sẽ quyết định số lượng cũng như bản chất oligosaccharide hình thành thông qua phản ứng chuyển nhóm galactosyl. Nếu như nồng độ cơ chất sử dụng cao hơn và / hoặc giảm lượng nước sử dụng sẽ làm tăng hiệu suất tạo oligosaccharide (Mahoney, 1998). Hiện tại, cơ chế của phản ứng này vẫn chưa được biết rõ nhưng có lẽ liên quan đến việc các phân tử galactose liên kết 1,4 được chuyển thành liên kết 1,6 (Huber và cộng sự, 1976). Các phân tử oligosaccharide có mặt trong thực phẩm có nhiều tác động có lợi đến sức khỏe người tiêu dùng.
Các phân tử oligosaccharide sẽ thúc đẩy sự phát triển và tập hợp vi khuẩn có lợi (Hsu và cộng sự 2005). Hơn thế nữa, oligosaccharide còn có khả năng giảm hàm lượng cholesterol trong máu, thúc đẩy việc hấp thụ calci trong thức ăn và thúc đẩy tổng hợp các vitamin nhóm B (Onishi và cộng sự 1995). – Glucose β-galactosidase Lactose β-6’galactosyllactose Hình 1.3: Phản ứng chuyển galactosyl xúc tác bởi lactase Bảng 1.1: Cấu trúc của một số oligosaccharide được tạo thành với xúc tác của lactase trên cơ chất lactose (Nguồn: Mahoney 1998) β-D-Gal (16)-D-Glc Allolactose β-D-Gal (16)-D-Gal Galactobiose Disaccharide β-D-Gal (13)-D-Glc β-D-Gal (12)-D-Glc β-D-Gal (13)-D-Gal β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-D-Glc 6’ digalactosyl-glucose β-D-Gal (16)-β-D-Gal (14)-D-Glc 6’ galactosyl-lactose Trisaccharides β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-D-Gal 6’ galactotriose β-D-Gal (13)-β-D-Gal (14)-D-Glc 3’ galactosyl-lactose β-D-Gal (14)-β-D-Gal (14)-D-Glc 4’ galactosyl-lactose β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-β-D-Gal Tetrasaccharide 6’ digalactosyl-lactose (14)-D-Glc Pentasaccharide β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-β-D-Gal 6’ trigalactosyl-lactose 4 Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 (16)-β-D-Gal (14)-D-Glc *Gal, Galactose *Glc, Glucose 1. Nguồn thu nhận lactase Lactase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên do có nhiều chức năng như vai trò chức năng của nó như vai trò trong tiêu hóa, thoái hóa lysosomal, vai trò trong quá trình dị hóa.
Tuy nhiên, lactase được tìm thấy phổ biến ở thực vật, ruột động vật có vú và ở các vi sinh vật như nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Nguồn từ động thực vật: Enzyme lactase được tìm thấy nhiều trong mô thực vật, có vai trò nhất định liên quan đến quá trình sinh học như tăng trưởng của cây, chín trái và thủy phân lactose. Những nghiên cứu sinh học phân tử đã làm sáng tỏ vai trò của lactase đối với sự sinh trưởng của cây và chín trái. Lactase có vai trò quan trọng đối với quá trình chín của trái hồng vì làm giảm đáng kể nồng độ galactosyl trong vách tế bào và thủy phân liên kết với pectin.
Enzyme lactase từ đu đủ thủy phân vách tế bào và làm mềm trái trong suốt quá trình chín (Lazan và cộng sự, 2004). Hầu như pH tối ưu cho enzyme lactase từ thực vật nằm ở khoảng pH acid. Enzyme lactase tách từ quả hạnh có pH tối ưu 5,5, nhiệt độ tối ưu 500C, duy trì được 89% hoạt tính sau 2 tháng lưu giữ ở 4oC. Ở động vật hữu nhũ, enzyme lactase nằm trong đường tiêu hóa, đặc biệt nhiều ở những động vật mới sinh ra (Husain, 2010).
Nguồn gốc từ vi sinh vật: Trong ruột, enzyme này có vị trí tại các vi nhung mao của tế bào nhầy. Ở vi sinh vật, các enzyme này là enzyme nội bào ở vi khuẩn, nấm men và có thể là nội bào hoặc ngoại bào ở nấm sợi. 5 Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 Bảng 1.2: Nguồn lactase từ vi sinh vật (Panesar và cộng sự, 2010) Nguồn gốc Vi sinh vật Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii Arthrobacter sp.
Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus megaterum, Bacillus stearothermophilus Bacteriodes polypragmatus Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E. cloaceae Escherichia coli Klebsiella pneumoniae L. lactis, Vi khuẩn L. delbrueckii Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento Propioionibacterium shermanii Pseudomonas fluorescens Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophius Sulfolobus solfatarius Thermoanaerobacter sp.
Thermus rubus, Thermus aquaticus Trichoderma reesei Vibrio cholera Xanthomonas campestris Nấm mốc Alternaria alternate, Alternaria palmi 6 Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 Aspergillus foelidis, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus oryzae Auerobasidium pullulans Curvularia inaequalis Fusarium monilliforme, Fusarium oxysporum Mucor meihei, Muco pusillus Neurospora crassa Penicillum canescens, Penicillum chrysogenum, Penicillumexpansum Saccharopolyspora rectivergula Scopulariapsis sp. Streptomyces violaceus Bullera singularis Candida pseudotropicalis Nấm men Saccharomyces anamensis, Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis Kluyveromyces bulgaricus, K. marxianus Lactase thu từ các nguồn khác nhau có đặc tính và cấu trúc riêng (trọng lượng phân tử, chiều dài chuỗi amino acid, vị trí các trung tâm hoạt động, pH và nhiệt độ hoạt động tối ưu (bảng 1. Lựa chọn nguồn lactase phù hợp phụ thuộc vào điều kiện phản ứng thủy phân lactose.
Enzyme thương mại thường có pH acid (pH tối ưu < 5) sử dụng trong xử lý chế biến whey chua, hoặc pH trung tính (pH tối ưu 5,5–7,0) sử dụng trong sữa hay whey ngọt. Hoạt tính của các lactase phụ thuộc sự hiện diện của các ion. Lactase từ nấm sợi có hoạt tính mà không cần các ion làm cofactor, lactase từ nấm men cần có các ion như Mn2+, Mg2+, Na+, K+ làm cofactor. Ion Ca2+ và các kim loại nặng ức chế hoạt tính của tất cả các lactase.
7 Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 Bảng 1.3: Đặc điểm của lactase từ các vi sinh vật Vi sinh vật Loại enzyme pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu Aspergillus niger 3,0–4,0 55–60 Nấm sợi Ngoại bào Aspergillus oryzae 5,0 50–55 Kluyveromyces lactis 6,5–7,0 30–35 Nấm men Nội bào Kluyveromyces fragilis 6,6 30–35 Escherichia coli 7,2 40 Lactobacillus thermophilus 6,2 55 Vi khuẩn Nội bào Leuconostoc citrovorum 6,5 66 Bacillus circulans 6,0 65 Bảng 1.4: Tính chất hóa lý của lactase từ những nguồn vi sinh vật khác nhau (Zhou và Chen, 2001) Nguồn gốc K.niger enzyem Khối lượng phân 117618 116351 118016 119160 tử (Da) Độ dài (AA) 1025 1023 1031 1006 Proton donor Glu482 Glu461 Glu449 Glu200 Nucleophile/base Glu551 Glu537 Glu512 Glu298 Bảng 1.5: Tính chất của lactase (Gikas và López-Leiva 1985, Mahoney 1985) Nguồn gốc Khối lượng phân tử Inhibitors pHopt Topt Coenzyme enzyem (kDa) 3,0 – A.oryzae 5,0 50 – 55 90 6,9 – K+, Mn2+, Ca2+, Na+ K.lactis 7,2 35 135 K+, Mg2+ Ca2+, Na+ 6,2 – E.coli 40 540 K+, Na+ 7,1 8 Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 3,4 – L.circulans 6,8 60 – 65 6,5 – Bacillus sp.thermophilus 7,1 55 500 – 600 K+, Mg2+ Ca2+ Trong thương mại, lactase được sản xuất từ các vi sinh vật có hiệu suất cao hơn từ thực vật và động vật, và nó được xem là an toàn khi sử dụng trong thực phẩm. Có thể sử dụng lactase từ các nguồn khác bằng cách nhân bản chúng trong các tế bào chủ. Hai loại lactase thường dùng trong các quá trình chế biến công nghiệp là enzyme có hoạt tính ổn định nhiệt và enzyme hoạt động lạnh. Enzyme hoạt tính ổn định nhiệt có ưu điểm là sử dụng được ở nhiệt độ cao và trong điều kiện này các vi sinh vật không mong muốn sẽ bị ức chế.
Enzyme hoạt động lạnh được sử dụng trong các quá trình chế biến sản phẩm từ sữa ở điều kiện ôn hòa để ổn định và duy trì các thành phần dinh dưỡng. Ngoài ra, enzyme này cũng được sử dụng trong y học, hóa học và phân tích. Nguồn lactase từ nấm mốc: Enzyme lactase từ nấm mốc có pH tối ưu nằm trong khoảng acid từ 2,5 đến 5,4, do đó có hiệu quả nhất khi thủy phân lactose trong các sản phẩm có tính acid như whey. Enzyme lactase từ nguồn này thường là enzyme chịu nhiệt.
Tuy nhiên, enzyme này dễ bị ức chế ngược do sản phẩm mà chủ yếu là galactose. Nấm mốc thường sử dụng lactose với tỷ lệ rất thấp, với hai cơ chế chuyển hóa lactose là thủy phân ngoại bào và hấp thu các monomer và hấp thu luôn disaccharide. Enzyme lactase từ Aspergillus oryzae được tinh sạch bằng dung môi 2- propanol trên DEAE-Sephadex A-50 và Sephadex G-200, có pH tối ưu với Ortho- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) là 4,5 còn lactose là 4,8. Khoảng pH hoạt động từ 4,0 đến 9,0, nhiệt độ tối ưu 46oC.
Hằng số Michaelis với ONPG là 7,2 x 10-4M và 1,8 × 10-2M với lactose. Hg2+, Cu2+, sodium lauryl sulfate và N-bromo-succinimide là những thành phần kìm hãm hoạt tính lactase (Husain, 2010).