Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men pichia pastoris x33 36 và ảnh hưởng của nó đến tế bào ung thư nuôi cấy

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men pichia pastoris x33 36 và ảnh, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Quang Hòa
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Nho Thái
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tinh Sạch Protein P53 Tái Tổ Hợp Từ Chủng Nấm Men Pichia pastoris X33-36 Và Ảnh Hưởng Của Nó Đến Tế Bào Ung Thư Nuôi Cấy
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Tình hình ung thư trên thế giới
• 1.3. Tình hình ung thư ở Việt Nam
• 1.4. Các nguyên nhân gây ung thư
• 1.5. Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư
• 1.6. Tổng quan về gen TP53 và protein p53
• 1.6.1. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53
• 1.6.2. Cấu trúc không gian của protein p53
• 1.6.3. Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu
• 1.6.4. Chức năng của protein p53
• 1.6.5. Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis và ảnh hưởng đến sự ức chế tế bào khối u
• 1.7. Tổng quan về các nghiên cứu biểu hiện protein cho liệu pháp điều trị đích trong ung thư
• 1.8. Liệu pháp điều trị ung thư dựa vào protein p53
• 1.9. Nghiên cứu biểu hiện protein p53 trong nấm men trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.10. Vector pPicZαA-TAT-p53-his và cơ chế thử nghiệm protein p53 tái tổ hợp trên mức độ tế bào
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Các dung dịch và đệm
• 2.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Kiểm tra chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và nuôi biểu hiện thu sinh khối protein p53 tái tổ hợp
• 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của nấm men
• 2.4.3. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose
• 2.4.4. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)
• 2.4.5. Phương pháp sắc ký ái lực
• 2.4.6. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.4.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư trong điều kiện in vitro
• 2.4.8. Phương pháp kiểm tra sự ảnh hưởng của dung dịch P lên tế bào ung thư trong điều kiện in vitro
• 2.4.9. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nuôi biểu hiện protein p53 trong nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.2. Kết quả kiểm tra gen TAT-p53-His chứa trong hệ gen nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.3. Kết quả nuôi biểu hiện chủng nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.4. Kết quả điện di dịch nuôi biểu hiện thô và sau khi tinh sạch
• 3.5. Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 3.6. Kết quả nuôi tế bào ung thư in vitro
• 3.7. Kết quả kiểm tra khả năng ảnh hưởng của môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy
• 3.8. Kết quả thử độc tính tế bào và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein p53 từ nấm men Pichia pastoris

Nghiên cứu về protein p53 tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử và điều trị ung thư. Protein p53 được biết đến như một yếu tố quan trọng trong việc điều chỉnh chu trình tế bào và ngăn ngừa sự phát triển của khối u. Việc sản xuất protein p53 từ nấm men Pichia pastoris không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.1. Tại sao protein p53 lại quan trọng trong điều trị ung thư

Protein p53 đóng vai trò như một gen ức chế khối u, giúp ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng protein này có khả năng sửa chữa DNA và kích hoạt quá trình apoptosis, từ đó giảm thiểu sự phát triển của tế bào ung thư.

1.2. Nấm men Pichia pastoris và lợi ích trong nghiên cứu sinh học

Nấm men Pichia pastoris là một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao. Hệ thống này có khả năng sản xuất protein trong môi trường nuôi cấy đơn giản và tiết kiệm chi phí, đồng thời dễ dàng kiểm soát các điều kiện nuôi cấy.

II. Thách thức trong việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp

Mặc dù việc sản xuất protein p53 từ nấm men Pichia pastoris mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức cần được giải quyết. Các vấn đề như độ tinh khiết của protein, khả năng biểu hiện và điều kiện nuôi cấy là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của nghiên cứu.

2.1. Độ tinh khiết của protein p53 và ảnh hưởng đến nghiên cứu

Độ tinh khiết của protein p53 là yếu tố quyết định đến tính khả thi của các thí nghiệm sau này. Việc tách chiết và tinh sạch protein p53 từ nấm men cần được tối ưu hóa để đảm bảo rằng protein thu được có hoạt tính sinh học cao nhất.

2.2. Điều kiện nuôi cấy nấm men và ảnh hưởng đến sản xuất protein

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ dinh dưỡng có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng biểu hiện protein p53. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là cần thiết để đạt được sản lượng protein cao và chất lượng tốt.

III. Phương pháp tối ưu hóa sản xuất protein p53 tái tổ hợp

Để giải quyết các thách thức trong việc sản xuất protein p53, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các yếu tố trong quy trình nuôi cấy có thể cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất protein.

3.1. Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy nấm men Pichia pastoris

Quy trình nuôi cấy nấm men Pichia pastoris cần được tối ưu hóa để tăng cường khả năng biểu hiện protein p53. Việc điều chỉnh nồng độ methanol, thời gian nuôi cấy và nhiệt độ có thể giúp tăng sản lượng protein.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein p53 hiệu quả

Sử dụng các phương pháp như sắc ký ái lực và điện di SDS-PAGE để tinh sạch protein p53 là rất quan trọng. Những kỹ thuật này giúp loại bỏ các tạp chất và đảm bảo rằng protein thu được có độ tinh khiết cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protein p53 trong điều trị ung thư

Protein p53 tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Nghiên cứu cho thấy rằng protein này có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và mở ra hướng đi mới trong điều trị.

4.1. Khả năng ức chế tế bào ung thư của protein p53

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein p53 có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư khác nhau. Việc sử dụng protein này trong điều trị có thể giúp cải thiện tỷ lệ sống sót của bệnh nhân.

4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát triển liệu pháp điều trị mới

Với những kết quả tích cực từ các nghiên cứu, protein p53 tái tổ hợp có thể trở thành một phần quan trọng trong các liệu pháp điều trị ung thư mới. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp ứng dụng thực tiễn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu protein p53

Nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris không chỉ mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư mà còn góp phần vào sự phát triển của công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu protein p53 trong y học

Nghiên cứu protein p53 có thể giúp phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của protein này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong y học.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu protein tái tổ hợp

Tương lai của nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp sản xuất hiệu quả hơn và ứng dụng thực tiễn trong điều trị ung thư. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để khám phá tiềm năng của protein này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam 1. Tình hình ung thư trên thế giới Ung thư là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, với khoảng 18,1 triệu trường hợp mới vào năm 2018. Số ca tử vong do ung thư lên đến 9,6 triệu người, chiếm gần 1/6 các ca tử vong.

Trong cả hai giới, số ca mắc bệnh do ung thư phổi chiếm tỷ lệ lớn nhất chiếm 11,6% trong tổng số ca và chiếm 18,4% trong tổng số ca tử vong do ung thư. Theo sau đó là ung thư vú ở nữ với 11,6% số ca mắc, ung thư tuyến tiền liệt với 7,1%. Đa số các ca mắc bệnh thường được chuẩn đoán ở giai đoạn cuối khi mà không thể can thiệp và điều trị được nữa. Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình.

Năm 2017, chỉ có 26% các quốc gia có thu nhập thấp báo cáo có dịch vụ khám bệnh công cộng trong khi ở các nước có thu nhập cao là 90%. Áp lực của ung thư đến nền kinh tế là vô cùng đáng kể và đang ngày một gia tăng. Tổng kinh phí hàng năm chi trả cho điều trị trong năm 2010 ước tính khoảng 1,16 nghìn tỉ USD [26]. Dù vậy cũng chỉ có 1 trong 5 nước có thu nhập thấp và trung bình có những dữ liệu cần thiết để thúc đẩy các chính sách phòng chống ung thư.

Tình hình ung thư ở Việt Nam Năm 2018, theo dữ liệu từ cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung thư (IARC). Ở Việt Nam, số ca được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư mới là 164 671người ( không tính du học sinh ), và 114 871 theo số liệu ước tính từ hệ thống ghi nhận ung thư từ 6 tỉnh, thành phố năm 2010. Dự báo vào năm 2020 sẽ có ít nhất 189 344 ca ung thư mới mắc. Trong số ca ung thư, 5 loại ung thư hàng đầu ở nam giới Việt Nam là ung thư gan (21,5%), phổi (18,4%), dạ dày (12,3%), đại trực tràng (8,4%) và vòm họng (5,0%) và ở phụ nữ là ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%), phổi (9,4%), dạ dày (8,6%) ) và gan (7,8%).

Tỷ lệ bệnh nhân ung thư đến khám và điều trị sớm còn thấp, năm 2009 một nghiên cứu tại 5 bệnh viện ung thư cho thấy chung các loại ung thư 28,6% bệnh nhân đến giai đoạn I và II, đối với ung thư vú 50,5% đến sớm, ung thư cổ tử cung 46,0% đến sớm và ung thư đại trực tràng 32,2% đến sớm Số người chết vì ung thư trên năm là 94 700 người [26]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Dự án phòng chống ung thư là một dự án trong Chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống một số bệnh xã hội, bệnh dịch nguy hiểm và HIV/AIDS giai đoạn 2006-2010, được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt ngày 17/7/2007 tại quyết định số 108/2007/QĐ-TTG. Mục tiêu của dự án là từng bước giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do ung thư và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư. Giai đoạn 2012-2015 mục tiêu khiêm tốn hơn, cụ thể là nâng cao nhận thức của cộng đồng về phòng và phát hiện sớm bệnh ung thư và tăng 10-15% tỷ lệ bệnh nhân ung thư được phát hiện ở giai đoạn sớm, đồng thời giảm tỷ lệ tử vong của một số loại ung thư: vú, cổ tử cung, khoang miệng và đại trực tràng [35] 1.

Các nguyên nhân gây ung thư Ung thư xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau. Là quá trình chuyển đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u bằng một chuỗi các quá trình biến đổi sinh hóa khác nhau, thường phát triển từ các tổn thương tiền ung thư cho đến ung thư ác tính. Những thay đổi này là do sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của một người với các tác nhân bên ngoài như: tác nhân vật lý với tia cực tím, bức xạ ion; tác nhân hóa học như khói thuốc lá, aflatoxin, arsenic; và các tác nhân sinh học do nhiễm vi khuẩn, virus. Tuổi tác cũng là nguyên nhân cơ bản cho sự phát triển ung thư.

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư tăng đáng kể theo độ tuổi. Khoảng 1/3 số ca tử vong do ung thư do lối sống và chế độ ăn uống với: các chỉ số trong cơ thể tăng cao bất thường, ăn ít trái cây và rau quả, thiếu hoạt động thể lực, sử dụng thuốc lá và rượu. Trong đó sử dụng thuốc lá là yếu tố gây nguy cơ cao nhất đến ung thư với khoảng 22% số ca tử vong do ung thư [12]. Ung thư cũng có thể do vi khuẩn hoặc virus ví dụ HPV gây ung thư cổ tử cung với khoảng 25% số ca ở các nước có thu nhập thấp và trung bình [23].

Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư Từ các nguyên nhân kể trên, các biện pháp làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư bao gồm: tránh các tác nhân có nguy cơ mắc bệnh cao như sử dụng thuốc lá, rượu, thừa cân – béo phì, chế độ ăn không lành mạnh với ít rau củ quả, thiếu hoạt động thể chất, nhiễm HPV, HBV do lây nhiễm qua đường tình dục, bức xạ ion, tia cực tím dưới ánh mặt trời, ô nhiễm không khí [5]. Đồng thời cũng tăng khả năng phát hiện sớm ung thư bằng cách khám tổng thể định kỳ thường xuyên bởi điều trị ở giai đoạn sớm ung thư, các bệnh nhân có nhiều khả năng sống sót cao hơn, chi phí 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] điều trị cũng thấp hơn. Để làm được điều đó cần tăng cường tuyên truyền cho người dân nhận thức được nguy cơ tiềm ẩn của bệnh ung thư đồng thời tiếp cận và chăm sóc, đánh giá lâm sàng cũng như chuẩn đoán và phân giai đoạn kịp thời để đưa ra hướng điều trị phù hợp nhất. Mỗi loại ung thư có một phác đồ điều trị cụ thể bao gồm một hoặc nhiều phương thức như phẫu thuật, hóa trị hay xạ trị.

Mục tiêu chính là kéo dài tuổi thọ đồng thời cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên điều trị ung thư bằng các phương pháp truyền thống thì lại tốn kém, đồng thời gây ra nhiều tác dụng phụ cho bệnh nhân. Vì vậy hiện nay các nhà khoa học đang hướng đến nghiên cứu liệu pháp điều trị đích. Khi đó thuốc chỉ tác động vào các tế bào ung thư mà không gây ảnh hưởng đến các tế bào khác của cơ thể.

Và giúp làm giảm thời gian, chi phí điều trị ung thư lên nhiều lần giúp cải thiện cuộc sống cho các bệnh nhân ung thư. Tổng quan về gen TP53 và protein p53 2. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53 Năm 1979, sáu nhóm nghiên cứu làm việc độc lập cùng công bố phát hiện một protein có khối lượng 53 kDa có mặt trong các tế bào chuột và người (DeLeo et al. 1979, Kress et al.

1979, Lane & Crawford 1979, Linzer & Levine 1979, Melero et al. 1979, Smith et al. Ngay sau đó nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên protein này và sau đó với gen mã hóa cho protein là TP53, cho thấy TP53 này là một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) [2]. Hình 1: Cấu trúc của protein p53 ở người [34] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Protein p53 là một phosphoprotein dạng tetrameric, là một trong những protein có vai trò trong chu trình tế bào giúp ức chế quá trình hình thành khối u, ngăn ngừa đột biến gen và sửa chữa DNA [27].

Tuy nhiên thực tế thì protein p53 dài đầy đủ có kích thước khoảng 43,7 kDa. Sự khác biệt này là do số axit amin proline lớn nên protein di chuyển chậm hơn trên SDS-PAGE [33]. Ngoài các protein có độ dài đầy đủ, gen TP53 ở người còn mã hóa cho ít nhất 15 đồng vị protein có khối lượng từ 3,5 đến 43,7 kDa. Đồng thời các gen TP53 cũng là gen có tần số đột biến cao nhất (>50%) trong tế bào ung thư ở người [27].

Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng protein p53 cũng liên kết với DNA và điều chỉnh mức độ hoạt động của gen và ngăn chặn sự hình thành đột biến [16]. Ở người, gen TP53 nằm trên cánh ngắn của NST số 17 (17p13. Protein p53 là một polypeptide có độ dài khoảng 400 aa (393 aa với p53 ở người). Monomer của p53 được gấp nếp bởi trong cơ thể, protein p53 tồn tại ở dạng tetramers [1, 20, 27].

Cấu trúc protein p53 gồm có: miền kích hoạt phiên mã (1-42), vùng giàu proline (64-92), khu vực lõi chứa một nguyên tử kẽm (102-292), miền homo-oligomerisation (OD) cần thiết cho hoạt động của p53 trong cơ thể (307-355), và vùng đầu mút C (356-393). Cấu trúc không gian của protein p53 Protein p53 ở dạng monomer bao bao gồm 2 nếp gấp β song song với nhau. Trong tế bào, protein p53 thường tồn tại ở dạng tetramer liên kết với nhau thông qua vùng oligomer ở đầu C và liên kết với DNA tại vùng gắn đặc hiệu với DNA (hình 2). Mỗi tetramer bao gồm hai dimer liên kết lại với nhau thông qua DNA.

Mỗi dimer lại được hình thành từ hai monomer thông qua liên kết liên phân tử giữa các tấm β song song. Hai dimer lại liên kết với nhau thông qua tương tác kỵ nước tạo thành tetramer chặt chẽ và có sự ổn định cao. Trung tâm của tetramer là các chuỗi bên Leu344 từ tất cả các monomer tiếp xúc trực tiếp với nhau. Phần đầu của vùng kích hoạt trên bốn monomer có thể liên kết được với bốn phân tử MDM2.

Bình thường trong tế bào, cấu trúc tetramer của protein p53 bao gồm bốn monomer liên kết với phân tử DNA đích và bốn phân tử MDM2 [1, 11, 28]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc phân tử của protein p53 [24]. Chú thích: A: protein p53 nhìn từ phía trên; B: chồng chất protein không có DNA (vàng) bên trong phức hợp p53-DNA; C: cấu trúc tinh thể của 2 miền lõi liên kết với DNA; D: lắp các miền lõi và DNA lại với nhau trong cấu trúc tinh thể [36].

Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu Protein p53 hoạt động chủ yếu như một nhân tố phiên mã. Được kích hoạt để đáp ứng các căng thẳng của tế bào như tổn thương DNA, căng thẳng ribosome, thiếu oxy,… bằng cách ngừng chu trình tế bào hoặc gây ra apoptosis. Thông thường trong tế bào protein p53 được liên kết với DNA ở dạng tetramer, gồm 2 dimer. Mỗi dimer liên kết với một trình tự đồng thuận RRRCWWGYYY (R = A / G, W = A / T, Y = C / T) [7].