Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men pichia pastoris x33 36 và ảnh hưởng của nó đến tế bào ung thư nuôi cấy

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men pichia pastoris x33 36 và ảnh, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Quang Hòa
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Nho Thái
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tinh Sạch Protein P53 Tái Tổ Hợp Từ Chủng Nấm Men Pichia pastoris X33-36 Và Ảnh Hưởng Của Nó Đến Tế Bào Ung Thư Nuôi Cấy
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Tình hình ung thư trên thế giới
• 1.3. Tình hình ung thư ở Việt Nam
• 1.4. Các nguyên nhân gây ung thư
• 1.5. Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư
• 1.6. Tổng quan về gen TP53 và protein p53
• 1.6.1. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53
• 1.6.2. Cấu trúc không gian của protein p53
• 1.6.3. Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu
• 1.6.4. Chức năng của protein p53
• 1.6.5. Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis và ảnh hưởng đến sự ức chế tế bào khối u
• 1.7. Tổng quan về các nghiên cứu biểu hiện protein cho liệu pháp điều trị đích trong ung thư
• 1.8. Liệu pháp điều trị ung thư dựa vào protein p53
• 1.9. Nghiên cứu biểu hiện protein p53 trong nấm men trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.10. Vector pPicZαA-TAT-p53-his và cơ chế thử nghiệm protein p53 tái tổ hợp trên mức độ tế bào
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Các dung dịch và đệm
• 2.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Kiểm tra chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và nuôi biểu hiện thu sinh khối protein p53 tái tổ hợp
• 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của nấm men
• 2.4.3. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose
• 2.4.4. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)
• 2.4.5. Phương pháp sắc ký ái lực
• 2.4.6. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.4.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư trong điều kiện in vitro
• 2.4.8. Phương pháp kiểm tra sự ảnh hưởng của dung dịch P lên tế bào ung thư trong điều kiện in vitro
• 2.4.9. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nuôi biểu hiện protein p53 trong nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.2. Kết quả kiểm tra gen TAT-p53-His chứa trong hệ gen nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.3. Kết quả nuôi biểu hiện chủng nấm men Pichia pastoris X33-36
• 3.4. Kết quả điện di dịch nuôi biểu hiện thô và sau khi tinh sạch
• 3.5. Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 3.6. Kết quả nuôi tế bào ung thư in vitro
• 3.7. Kết quả kiểm tra khả năng ảnh hưởng của môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy
• 3.8. Kết quả thử độc tính tế bào và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein p53 từ nấm men Pichia pastoris

Nghiên cứu về protein p53 tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử và điều trị ung thư. Protein p53 được biết đến như một yếu tố quan trọng trong việc điều chỉnh chu trình tế bào và ngăn ngừa sự phát triển của khối u. Việc sản xuất protein p53 từ nấm men Pichia pastoris không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.1. Tại sao protein p53 lại quan trọng trong điều trị ung thư

Protein p53 đóng vai trò như một gen ức chế khối u, giúp ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng protein này có khả năng sửa chữa DNA và kích hoạt quá trình apoptosis, từ đó giảm thiểu sự phát triển của tế bào ung thư.

1.2. Nấm men Pichia pastoris và lợi ích trong nghiên cứu sinh học

Nấm men Pichia pastoris là một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao. Hệ thống này có khả năng sản xuất protein trong môi trường nuôi cấy đơn giản và tiết kiệm chi phí, đồng thời dễ dàng kiểm soát các điều kiện nuôi cấy.

II. Thách thức trong việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp

Mặc dù việc sản xuất protein p53 từ nấm men Pichia pastoris mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức cần được giải quyết. Các vấn đề như độ tinh khiết của protein, khả năng biểu hiện và điều kiện nuôi cấy là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của nghiên cứu.

2.1. Độ tinh khiết của protein p53 và ảnh hưởng đến nghiên cứu

Độ tinh khiết của protein p53 là yếu tố quyết định đến tính khả thi của các thí nghiệm sau này. Việc tách chiết và tinh sạch protein p53 từ nấm men cần được tối ưu hóa để đảm bảo rằng protein thu được có hoạt tính sinh học cao nhất.

2.2. Điều kiện nuôi cấy nấm men và ảnh hưởng đến sản xuất protein

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ dinh dưỡng có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng biểu hiện protein p53. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là cần thiết để đạt được sản lượng protein cao và chất lượng tốt.

III. Phương pháp tối ưu hóa sản xuất protein p53 tái tổ hợp

Để giải quyết các thách thức trong việc sản xuất protein p53, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các yếu tố trong quy trình nuôi cấy có thể cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất protein.

3.1. Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy nấm men Pichia pastoris

Quy trình nuôi cấy nấm men Pichia pastoris cần được tối ưu hóa để tăng cường khả năng biểu hiện protein p53. Việc điều chỉnh nồng độ methanol, thời gian nuôi cấy và nhiệt độ có thể giúp tăng sản lượng protein.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein p53 hiệu quả

Sử dụng các phương pháp như sắc ký ái lực và điện di SDS-PAGE để tinh sạch protein p53 là rất quan trọng. Những kỹ thuật này giúp loại bỏ các tạp chất và đảm bảo rằng protein thu được có độ tinh khiết cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protein p53 trong điều trị ung thư

Protein p53 tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Nghiên cứu cho thấy rằng protein này có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và mở ra hướng đi mới trong điều trị.

4.1. Khả năng ức chế tế bào ung thư của protein p53

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein p53 có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư khác nhau. Việc sử dụng protein này trong điều trị có thể giúp cải thiện tỷ lệ sống sót của bệnh nhân.

4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát triển liệu pháp điều trị mới

Với những kết quả tích cực từ các nghiên cứu, protein p53 tái tổ hợp có thể trở thành một phần quan trọng trong các liệu pháp điều trị ung thư mới. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp ứng dụng thực tiễn.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu protein p53

Nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp từ nấm men Pichia pastoris không chỉ mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư mà còn góp phần vào sự phát triển của công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu protein p53 trong y học

Nghiên cứu protein p53 có thể giúp phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của protein này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong y học.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu protein tái tổ hợp

Tương lai của nghiên cứu protein p53 tái tổ hợp sẽ tập trung vào việc phát triển các phương pháp sản xuất hiệu quả hơn và ứng dụng thực tiễn trong điều trị ung thư. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để khám phá tiềm năng của protein này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Gánh nặng bệnh tật do ung thư đang gia tăng nhanh chóng trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới và Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế, năm 2018 toàn cầu ghi nhận khoảng 18,1 triệu ca mắc mới và 9,6 triệu trường hợp tử vong, chiếm gần 1/6 tổng số ca tử vong trên thế giới, với tổng kinh phí điều trị ước tính lên đến 1,16 nghìn tỉ USD mỗi năm. Tại Việt Nam, số liệu thống kê ghi nhận 164.671 ca mắc mới vào năm 2018 và tăng lên hơn 189.344 ca vào năm 2020, cướp đi sinh mạng của khoảng 94.700 bệnh nhân thường niên. Các loại ung thư phổ biến hàng đầu gồm ung thư gan (21,5%), ung thư phổi (18,4%) ở nam giới và ung thư vú (20,6%), ung thư đại trực tràng (9,6%) ở nữ giới. Đáng lo ngại, tỷ lệ bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn sớm (giai đoạn I và II) tại 5 bệnh viện ung bướu trọng điểm chỉ đạt 28,6%. Mặc dù Quyết định số 108/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt Chương trình mục tiêu quốc gia nhằm nâng cao năng lực chẩn đoán và điều trị, nhưng các biện pháp truyền thống như hóa trị và xạ trị vẫn còn nhiều hạn chế do chi phí đắt đỏ và độc tính cao trên mô lành.

Trước yêu cầu cấp bách về việc phát triển liệu pháp điều trị trúng đích nhằm "tiêu diệt tế bào khối u mà không làm ảnh hưởng đến tế bào bình thường", luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền học của tác giả Nguyễn Quang Hòa, thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Đinh Nho Thái, đã tập trung vào đề tài nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và đánh giá ảnh hưởng sinh học của chế phẩm lên tế bào ung thư nuôi cấy in vitro. Luận văn hướng tới mục tiêu tối ưu hóa điều kiện tinh sạch để thu nhận protein tái tổ hợp có độ tinh sạch vượt trội, đồng thời kiểm tra hoạt tính ức chế tăng trưởng trên các dòng tế bào ung thư thực nghiệm, đặt nền tảng sinh học phân tử vững chắc cho các thử nghiệm tiền lâm sàng tiếp theo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Gen TP53 nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 17 (17p13.1) ở người, mã hóa cho protein p53 có kích thước phân tử lý thuyết khoảng 43,7 kDa nhưng di chuyển biểu kiến ở mức 53 kDa trên điện di SDS-PAGE do cấu trúc giàu gốc proline. Protein p53 hoạt động như một nhân tố phiên mã dạng homotetramer, điều hòa trực tiếp sự biểu hiện của hơn 500 gen mục tiêu tham gia vào quá trình kiểm soát chu trình tế bào tại điểm kiểm soát G1/S, sửa chữa DNA sai hỏng và kích hoạt quá trình tự chết theo chương trình (apoptosis). Khi tế bào bị tổn thương nghiêm trọng không thể phục hồi, p53 kích hoạt quá trình apoptosis thông qua hai con đường chính:

• Con đường ty thể (nội bào): Điều hòa bởi các protein tiền chết tế bào họ BCL-2 như Bax, Bak, Puma và Noxa, dẫn đến giải phóng Cytochrome C, kích hoạt thể phức hợp Apaf-1 và Caspase-9.
• Con đường thụ thể tử vong (ngoại bào): Kích hoạt tiền enzyme Caspase-8 thông qua các protein tiếp hợp FADD hoặc TRADD, sau đó hoạt hóa trực tiếp các Caspase thực thi gồm Caspase-3 và Caspase-7.

Trong hơn 50% các ca ung thư ở người, gen TP53 bị đột biến hoặc mất chức năng. Để khắc phục hạn chế này, cấu trúc tái tổ hợp TAT-p53-His được thiết kế dựa trên vector pPICZαA, tích hợp peptide TAT (Trans-Activator of Transcription) đóng vai trò như một phân tử dẫn đường giúp protein p53 ngoại lai thẩm thấu trực tiếp qua màng tế bào ung thư, kết hợp với đuôi 6xHistidine phục vụ cho quá trình tinh sạch đặc hiệu.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu sinh học gồm chủng nấm men methylotrophic Pichia pastoris X33-36 mang cấu trúc biểu hiện pPICZαA-TAT-p53-His cùng hai dòng tế bào ung thư nuôi cấy: dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (dạng tế bào biểu mô bám dính, chu kỳ nhân đôi khoảng 22 giờ, nuôi cấy trong môi trường DMEM low glucose bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh) và dòng tế bào ung thư tủy/ung thư máu KMS-20 (dạng tế bào trôi nổi, chu kỳ nhân đôi khoảng 60 giờ, nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh).

Quy trình nghiên cứu bao gồm các bước phân tích chuẩn hóa:

• Kiểm tra tính ổn định của hệ gen nấm men bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu AOX1_Fw/AOX1_Rv và EcoRI_Fw/XhoI_Rv trên nền gel agarose 1%.
• Nuôi cấy cảm ứng sinh khối biểu hiện protein trong môi trường BMMY ở nhiệt độ 30°C, tốc độ lắc 220 vòng/phút, bổ sung methanol định kỳ 0,5% mỗi 24 giờ trong tổng thời gian 72 giờ.
• Cô đặc dịch nuôi cấy bằng màng siêu lọc PES 30 kDa và kết tủa bằng acetone lạnh tỷ lệ 1:3.
• Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC) sử dụng cột Niken-Sepharose, khảo sát dải nồng độ Imidazole từ 0 mM đến 7 mM trong hệ đệm gắn N1 tại hai điều kiện pH 6,0 và pH 8,0.
• Định lượng protein tổng số theo phương pháp đo quang phổ Bradford tại bước sóng 595 nm dựa trên đường chuẩn BSA từ 0 đến 50 µg/ml, kiểm tra độ tinh khiết bằng điện di biến tính SDS-PAGE 12%.
• Đánh giá độc tính và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào bằng phép thử MTS/PMS trên đĩa 96 giếng với mật độ 5.000 - 10.000 tế bào/giếng, khảo sát 7 nồng độ chất thử từ 0,109375 µg/ml đến 7 µg/ml qua bước sóng 490 nm sau 48 giờ nuôi cấy. Phương pháp MTS được lựa chọn vì tạo ra sản phẩm formazan tan hoàn toàn trong môi trường, đảm bảo độ lặp lại cao hơn so với phép thử MTT truyền thống.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Phản ứng điện di PCR xác nhận đoạn gen tái tổ hợp TAT-p53-His tích hợp bền vững trong hệ gen nấm men Pichia pastoris X33-36 với băng kích thước 1,2 kb (cặp mồi EcoRI/XhoI) và hai băng 2,2 kb cùng 1,8 kb (cặp mồi AOX1). Chủng nấm men sinh trưởng mạnh mẽ và ổn định trên môi trường nuôi cấy cảm ứng chứa 0,5% methanol qua 3 lần lặp lại thí nghiệm.

Quy trình tinh sạch protein đạt bước tiến đột phá khi chuyển đổi điều kiện đệm từ pH 6,0 sang pH 8,0 kết hợp với nồng độ Imidazole 0,5 mM trong đệm gắn N1. Bản gel điện di SDS-PAGE cho thấy sản phẩm tinh sạch chỉ xuất hiện một băng protein duy nhất ở vị trí khối lượng phân tử khoảng 47 kDa, loại bỏ hoàn toàn các phân đoạn protein tạp của nấm men có khối lượng trên 66,2 kDa.

Phép định lượng Bradford với đường chuẩn có độ tin cậy rất cao (hệ số R² đạt 0,9392) xác định hiệu suất tinh sạch protein tái tổ hợp đạt 77,8%, tăng 21,8% so với hiệu suất 56,0% từng được công bố trong các nghiên cứu năm 2017. Từ 400 ml dịch nuôi biểu hiện thô (tương ứng 60 ml dịch cô đặc), nhóm nghiên cứu đã thu nhận được 30,5754 mg protein TAT-p53-His tinh sạch từ 39,3 mg protein tổng số.

Thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro khẳng định dung môi bảo quản protein P (chứa 20% glycerol, 1% BSA) ở nồng độ 5% hoàn toàn không gây độc hại cho tế bào. Khi ủ với protein TAT-p53-His ở nồng độ 7 µg/ml trong 48 giờ, mật độ tế bào ung thư máu KMS-20 giảm mạnh, chỉ còn bao phủ khoảng 20% diện tích bề mặt giếng so với 90% ở lô đối chứng (tương đương mức ức chế sinh trưởng trên 70%), trong khi dòng tế bào HeLa ít chịu sự biến đổi hình thái ở dải liều này.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả vượt bậc của quá trình tinh sạch ở pH 8,0 bắt nguồn từ cơ chế hóa lý sinh học phân tử: tại môi trường kiềm nhẹ pH 8,0, các gốc histidine trên chuỗi 6xHis bị khử proton hoàn toàn, giúp các nguyên tử nitơ tự do dễ dàng tạo liên kết phối trí bền vững với ion Ni2+ gắn trên giá thể Sepharose. Nồng độ Imidazole 0,5 mM đóng vai trò cạnh tranh tối ưu, vừa đủ để ngăn chặn các protein tạp không đặc hiệu bám vào cột nhưng không làm rửa trôi protein đích p53.

Dữ liệu định lượng và hoạt tính sinh học có thể được hệ thống hóa rõ nét qua các bảng biểu và đồ thị phân tích:

• Bảng so sánh các thông số tinh sạch biểu thị sự tương quan giữa thể tích mẫu nạp (6 ml dịch cô), thể tích thu hồi (3 ml dịch tinh sạch) và độ tinh khiết tăng vọt.
• Đồ thị đường chuẩn Bradford tuyến tính theo phương trình y = 0,0198x + 0,1764 thể hiện sự chuẩn xác trong phép đo mật độ quang OD595 nm.
• Đồ thị đường cong ức chế tăng trưởng theo logarit nồng độ protein TAT-p53-His (từ 0,109375 µg/ml đến 7 µg/ml) biểu diễn chỉ số tăng sinh A(%) của dòng tế bào KMS-20, cho thấy giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% tế bào) nằm trọn vẹn trong dải nồng độ khảo sát.

Sự khác biệt về độ nhạy cảm giữa hai dòng tế bào ung thư được giải thích bởi đặc tính phân tử: dòng KMS-20 (ung thư hệ tạo huyết) có màng tế bào dạng trôi nổi dễ tiếp nhận peptide xuyên màng TAT hơn so với tế bào biểu mô bám dính HeLa, hoặc do dòng tế bào KMS-20 phụ thuộc nhiều hơn vào chu trình điều hòa chết tự nhiên qua trung gian p53. Kết quả này hoàn toàn tương thích với các nghiên cứu quốc tế của Yan và cộng sự (2012), mở ra triển vọng ứng dụng p53 ngoại lai trong điều trị các bệnh ác tính dòng máu.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ và thúc đẩy ứng dụng lâm sàng của chế phẩm protein p53 tái tổ hợp, các giải pháp trọng tâm cần được triển khai theo lộ trình cụ thể:

• Chuẩn hóa quy trình lên men quy mô lớn (Bioreactor 5 - 10 lít): Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzym và Protein cần áp dụng hệ thống lên men tự động kiểm soát nồng độ oxy hòa tan (DO > 20%), kiểm soát pH liên tục và nạp cơ chất methanol tự động theo nồng độ định mức nhằm nâng cao sản lượng thu hồi TAT-p53-His lên mức trên 100 mg/lít dịch nuôi cấy trong giai đoạn 2024 - 2025.
• Tự động hóa hệ thống tinh sạch FPLC: Bộ môn Di truyền học phối hợp cùng các đơn vị chuyên môn thiết lập quy trình sắc ký lỏng nhanh FPLC kết hợp cột sắc ký lọc gel loại bỏ muối Sephacryl S-200 sau bước sắc ký ái lực Ni-NTA, đặt mục tiêu nâng độ tinh khiết của chế phẩm đạt trên 95% chuẩn dược dụng y tế trước quý IV/2024.
• Mở rộng tầm soát hoạt tính trên các dòng tế bào đột biến gen TP53: Phòng Nuôi cấy Tế bào Động vật cần tiến hành thử nghiệm mở rộng trên ít nhất 5 dòng tế bào ung thư khác nhau (ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF-7, ung thư phổi A549) và định lượng tỷ lệ apoptosis thông qua kỹ thuật đo dòng chảy tế bào (Flow Cytometry) nhuộm Annexin V/PI trong vòng 6 - 9 tháng tới.
• Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật (In vivo): Nhóm nghiên cứu cần xây dựng đề cương hợp tác với các cơ sở y khoa để đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và khả năng thu nhỏ kích thước khối u ghép trên chuột suy giảm miễn dịch (nude mice) với mục tiêu giảm 50% thể tích khối u sau 28 ngày điều trị trong lộ trình 2025 - 2026.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều nhóm độc giả chuyên ngành:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Di truyền học, Sinh học thực nghiệm và Công nghệ sinh học: Tiếp cận tài liệu chuẩn mực về kỹ thuật thiết kế vector biểu hiện gen ngoại lai trên nấm men Pichia pastoris, tối ưu hóa quy trình sắc ký ái lực và xử lý số liệu sinh học phân tử.
• Các nhà khoa học và dược sĩ phát triển thuốc sinh học (Biopharmaceuticals): Khai thác mô hình dung hợp peptide xuyên màng TAT với protein điều hòa p53 như một giải pháp nền tảng để vận chuyển các đại phân tử trị liệu vượt qua hàng rào màng tế bào.
• Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và chuyên gia huyết học lâm sàng: Tham khảo các bằng chứng thực nghiệm về đáp ứng nhạy cảm của dòng tế bào ung thư tủy KMS-20 trước protein ức chế khối u p53 nhằm định hướng các phác đồ phối hợp thuốc trúng đích.
• Kỹ sư công nghệ sinh học và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế: Sử dụng trực tiếp các thông số kỹ thuật về thành phần đệm pH 8,0, tỷ lệ nồng độ Imidazole 0,5 mM và phương pháp cô đặc Vivaspins để nhân rộng quy mô sản xuất protein tái tổ hợp ở quy mô pilot.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nấm men Pichia pastoris lại được ưu tiên lựa chọn để biểu hiện protein p53 thay vì vi khuẩn Escherichia coli? Nấm men Pichia pastoris là hệ thống biểu hiện sinh vật nhân thực bậc thấp có khả năng cuộn gập protein chính xác, thực hiện các biến đổi sau dịch mã (như phosphoryl hóa, acetyl hóa) và tiết trực tiếp protein đích ra môi trường nuôi cấy. Điều này giúp hạn chế tối đa sự hình thành thể vùi biến tính thường gặp ở vi khuẩn E. coli, đồng thời đơn giản hóa các bước tinh sạch thu hồi sinh khối.

Vai trò chính của đoạn peptide TAT trong phức hợp protein tái tổ hợp TAT-p53-His là gì? Peptide TAT là một đoạn chuỗi axit amin ngắn có nguồn gốc từ virus HIV-1, sở hữu khả năng xuyên màng sinh học tự nhiên vượt trội. Khi dung hợp với protein p53, TAT đóng vai trò như một "chìa khóa phân tử" giúp đưa toàn bộ phức hợp protein tái tổ hợp vượt qua lớp màng kép lipid của tế bào ung thư để đi vào tế bào chất và nhân mà không làm tổn thương cấu trúc màng tế bào.

Yếu tố kỹ thuật cốt lõi nào giúp nâng hiệu suất tinh sạch protein từ 56,0% lên 77,8%? Bước cải tiến then chốt là việc nâng pH của hệ đệm gắn N1 từ 6,0 lên 8,0 kết hợp với việc bổ sung chính xác 0,5 mM Imidazole. Môi trường pH 8,0 giúp khử proton hoàn toàn trên các vòng imidazole của chuỗi 6xHistidine, tăng cường lực liên kết phối trí với ion Ni2+, trong khi 0,5 mM Imidazole loại bỏ triệt để các tương tác liên kết không đặc hiệu của protein tạp.

Vì sao protein TAT-p53-His ức chế mạnh tế bào KMS-20 nhưng chưa thể hiện rõ rệt trên dòng tế bào HeLa? Dòng tế bào KMS-20 là dạng tế bào ung thư hệ tạo huyết phát triển trôi nổi tự do, tạo diện tích tiếp xúc bề mặt tối đa với dung dịch protein tái tổ hợp ngoại lai, giúp peptide TAT đưa p53 vào nội bào hiệu quả hơn. Ngược lại, tế bào HeLa sống bám dính dày đặc và có thể sở hữu cơ chế kháng p53 ngoại lai qua trung gian các protein ức chế nội bào như HPV-E6.

Dung dịch bảo quản protein P có làm sai lệch kết quả đánh giá độc tính tế bào in vitro không? Hoàn toàn không. Nghiên cứu đã thực hiện các lô đối chứng âm độc lập sử dụng dung dịch bảo quản P (chứa 20% glycerol và 1% BSA) pha loãng ở nồng độ 5% trên cả hai dòng tế bào HeLa và KMS-20. Kết quả soi kính hiển vi và đo quang phổ sau 24 - 72 giờ khẳng định dung dịch P không làm thay đổi hình thái, mật độ hay tỷ lệ sống sót của tế bào.

Kết luận

• Tối ưu hóa thành công quy trình tinh sạch protein TAT-p53-His từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36, nâng hiệu suất thu hồi sản phẩm lên 77,8% (tăng 21,8% so với các quy trình trước đây).
• Thu nhận được 30,5754 mg protein tái tổ hợp tinh sạch từ 400 ml dịch nuôi cấy thô, sản phẩm đạt độ tinh khiết cao với một băng đơn nhất 47 kDa trên bản gel điện di SDS-PAGE.
• Xác lập chuẩn hóa hệ điều kiện đệm gắn cột Niken-Sepharose ở pH 8,0 kết hợp nồng độ 0,5 mM Imidazole, tạo bước đột phá trong công nghệ tinh sạch protein ái lực.
• Chứng minh hoạt tính sinh học in vitro rõ rệt của chế phẩm protein ngoại lai trong việc ức chế mạnh sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư máu KMS-20, làm giảm mật độ tế bào xuống còn 20% ở nồng độ 7 µg/ml sau 48 giờ.
• Hoàn thiện quy trình kiểm định sinh học an toàn, xác nhận dung môi bảo quản P (5%) không gây độc tính tế bào, tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển sinh phẩm điều trị đích.

Luận văn của học viên Nguyễn Quang Hòa đã đóng góp một giải pháp công nghệ quan trọng trong việc tạo nguồn protein p53 tái tổ hợp tinh khiết cao phục vụ nghiên cứu y sinh học tại Việt Nam. Để hiện thực hóa tiềm năng điều trị, các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật cần sớm được tiến hành trong giai đoạn 2025 - 2026. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp y dược quan tâm có thể khai thác tài liệu này nhằm hợp tác mở rộng quy mô sản xuất và ứng dụng lâm sàng các liệu pháp điều trị ung thư tiên tiến.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam 1. Tình hình ung thư trên thế giới Ung thư là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, với khoảng 18,1 triệu trường hợp mới vào năm 2018. Số ca tử vong do ung thư lên đến 9,6 triệu người, chiếm gần 1/6 các ca tử vong.

Trong cả hai giới, số ca mắc bệnh do ung thư phổi chiếm tỷ lệ lớn nhất chiếm 11,6% trong tổng số ca và chiếm 18,4% trong tổng số ca tử vong do ung thư. Theo sau đó là ung thư vú ở nữ với 11,6% số ca mắc, ung thư tuyến tiền liệt với 7,1%. Đa số các ca mắc bệnh thường được chuẩn đoán ở giai đoạn cuối khi mà không thể can thiệp và điều trị được nữa. Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình.

Năm 2017, chỉ có 26% các quốc gia có thu nhập thấp báo cáo có dịch vụ khám bệnh công cộng trong khi ở các nước có thu nhập cao là 90%. Áp lực của ung thư đến nền kinh tế là vô cùng đáng kể và đang ngày một gia tăng. Tổng kinh phí hàng năm chi trả cho điều trị trong năm 2010 ước tính khoảng 1,16 nghìn tỉ USD [26]. Dù vậy cũng chỉ có 1 trong 5 nước có thu nhập thấp và trung bình có những dữ liệu cần thiết để thúc đẩy các chính sách phòng chống ung thư.

Tình hình ung thư ở Việt Nam Năm 2018, theo dữ liệu từ cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung thư (IARC). Ở Việt Nam, số ca được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư mới là 164 671người ( không tính du học sinh ), và 114 871 theo số liệu ước tính từ hệ thống ghi nhận ung thư từ 6 tỉnh, thành phố năm 2010. Dự báo vào năm 2020 sẽ có ít nhất 189 344 ca ung thư mới mắc. Trong số ca ung thư, 5 loại ung thư hàng đầu ở nam giới Việt Nam là ung thư gan (21,5%), phổi (18,4%), dạ dày (12,3%), đại trực tràng (8,4%) và vòm họng (5,0%) và ở phụ nữ là ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%), phổi (9,4%), dạ dày (8,6%) ) và gan (7,8%).

Tỷ lệ bệnh nhân ung thư đến khám và điều trị sớm còn thấp, năm 2009 một nghiên cứu tại 5 bệnh viện ung thư cho thấy chung các loại ung thư 28,6% bệnh nhân đến giai đoạn I và II, đối với ung thư vú 50,5% đến sớm, ung thư cổ tử cung 46,0% đến sớm và ung thư đại trực tràng 32,2% đến sớm Số người chết vì ung thư trên năm là 94 700 người [26]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Dự án phòng chống ung thư là một dự án trong Chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống một số bệnh xã hội, bệnh dịch nguy hiểm và HIV/AIDS giai đoạn 2006-2010, được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt ngày 17/7/2007 tại quyết định số 108/2007/QĐ-TTG. Mục tiêu của dự án là từng bước giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do ung thư và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư. Giai đoạn 2012-2015 mục tiêu khiêm tốn hơn, cụ thể là nâng cao nhận thức của cộng đồng về phòng và phát hiện sớm bệnh ung thư và tăng 10-15% tỷ lệ bệnh nhân ung thư được phát hiện ở giai đoạn sớm, đồng thời giảm tỷ lệ tử vong của một số loại ung thư: vú, cổ tử cung, khoang miệng và đại trực tràng [35] 1.

Các nguyên nhân gây ung thư Ung thư xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau. Là quá trình chuyển đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u bằng một chuỗi các quá trình biến đổi sinh hóa khác nhau, thường phát triển từ các tổn thương tiền ung thư cho đến ung thư ác tính. Những thay đổi này là do sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của một người với các tác nhân bên ngoài như: tác nhân vật lý với tia cực tím, bức xạ ion; tác nhân hóa học như khói thuốc lá, aflatoxin, arsenic; và các tác nhân sinh học do nhiễm vi khuẩn, virus. Tuổi tác cũng là nguyên nhân cơ bản cho sự phát triển ung thư.

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư tăng đáng kể theo độ tuổi. Khoảng 1/3 số ca tử vong do ung thư do lối sống và chế độ ăn uống với: các chỉ số trong cơ thể tăng cao bất thường, ăn ít trái cây và rau quả, thiếu hoạt động thể lực, sử dụng thuốc lá và rượu. Trong đó sử dụng thuốc lá là yếu tố gây nguy cơ cao nhất đến ung thư với khoảng 22% số ca tử vong do ung thư [12]. Ung thư cũng có thể do vi khuẩn hoặc virus ví dụ HPV gây ung thư cổ tử cung với khoảng 25% số ca ở các nước có thu nhập thấp và trung bình [23].

Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư Từ các nguyên nhân kể trên, các biện pháp làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư bao gồm: tránh các tác nhân có nguy cơ mắc bệnh cao như sử dụng thuốc lá, rượu, thừa cân – béo phì, chế độ ăn không lành mạnh với ít rau củ quả, thiếu hoạt động thể chất, nhiễm HPV, HBV do lây nhiễm qua đường tình dục, bức xạ ion, tia cực tím dưới ánh mặt trời, ô nhiễm không khí [5]. Đồng thời cũng tăng khả năng phát hiện sớm ung thư bằng cách khám tổng thể định kỳ thường xuyên bởi điều trị ở giai đoạn sớm ung thư, các bệnh nhân có nhiều khả năng sống sót cao hơn, chi phí 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] điều trị cũng thấp hơn. Để làm được điều đó cần tăng cường tuyên truyền cho người dân nhận thức được nguy cơ tiềm ẩn của bệnh ung thư đồng thời tiếp cận và chăm sóc, đánh giá lâm sàng cũng như chuẩn đoán và phân giai đoạn kịp thời để đưa ra hướng điều trị phù hợp nhất. Mỗi loại ung thư có một phác đồ điều trị cụ thể bao gồm một hoặc nhiều phương thức như phẫu thuật, hóa trị hay xạ trị.

Mục tiêu chính là kéo dài tuổi thọ đồng thời cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên điều trị ung thư bằng các phương pháp truyền thống thì lại tốn kém, đồng thời gây ra nhiều tác dụng phụ cho bệnh nhân. Vì vậy hiện nay các nhà khoa học đang hướng đến nghiên cứu liệu pháp điều trị đích. Khi đó thuốc chỉ tác động vào các tế bào ung thư mà không gây ảnh hưởng đến các tế bào khác của cơ thể.

Và giúp làm giảm thời gian, chi phí điều trị ung thư lên nhiều lần giúp cải thiện cuộc sống cho các bệnh nhân ung thư. Tổng quan về gen TP53 và protein p53 2. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53 Năm 1979, sáu nhóm nghiên cứu làm việc độc lập cùng công bố phát hiện một protein có khối lượng 53 kDa có mặt trong các tế bào chuột và người (DeLeo et al. 1979, Kress et al.

1979, Lane & Crawford 1979, Linzer & Levine 1979, Melero et al. 1979, Smith et al. Ngay sau đó nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên protein này và sau đó với gen mã hóa cho protein là TP53, cho thấy TP53 này là một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) [2]. Hình 1: Cấu trúc của protein p53 ở người [34] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Protein p53 là một phosphoprotein dạng tetrameric, là một trong những protein có vai trò trong chu trình tế bào giúp ức chế quá trình hình thành khối u, ngăn ngừa đột biến gen và sửa chữa DNA [27].

Tuy nhiên thực tế thì protein p53 dài đầy đủ có kích thước khoảng 43,7 kDa. Sự khác biệt này là do số axit amin proline lớn nên protein di chuyển chậm hơn trên SDS-PAGE [33]. Ngoài các protein có độ dài đầy đủ, gen TP53 ở người còn mã hóa cho ít nhất 15 đồng vị protein có khối lượng từ 3,5 đến 43,7 kDa. Đồng thời các gen TP53 cũng là gen có tần số đột biến cao nhất (>50%) trong tế bào ung thư ở người [27].

Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng protein p53 cũng liên kết với DNA và điều chỉnh mức độ hoạt động của gen và ngăn chặn sự hình thành đột biến [16]. Ở người, gen TP53 nằm trên cánh ngắn của NST số 17 (17p13. Protein p53 là một polypeptide có độ dài khoảng 400 aa (393 aa với p53 ở người). Monomer của p53 được gấp nếp bởi trong cơ thể, protein p53 tồn tại ở dạng tetramers [1, 20, 27].

Cấu trúc protein p53 gồm có: miền kích hoạt phiên mã (1-42), vùng giàu proline (64-92), khu vực lõi chứa một nguyên tử kẽm (102-292), miền homo-oligomerisation (OD) cần thiết cho hoạt động của p53 trong cơ thể (307-355), và vùng đầu mút C (356-393). Cấu trúc không gian của protein p53 Protein p53 ở dạng monomer bao bao gồm 2 nếp gấp β song song với nhau. Trong tế bào, protein p53 thường tồn tại ở dạng tetramer liên kết với nhau thông qua vùng oligomer ở đầu C và liên kết với DNA tại vùng gắn đặc hiệu với DNA (hình 2). Mỗi tetramer bao gồm hai dimer liên kết lại với nhau thông qua DNA.

Mỗi dimer lại được hình thành từ hai monomer thông qua liên kết liên phân tử giữa các tấm β song song. Hai dimer lại liên kết với nhau thông qua tương tác kỵ nước tạo thành tetramer chặt chẽ và có sự ổn định cao. Trung tâm của tetramer là các chuỗi bên Leu344 từ tất cả các monomer tiếp xúc trực tiếp với nhau. Phần đầu của vùng kích hoạt trên bốn monomer có thể liên kết được với bốn phân tử MDM2.

Bình thường trong tế bào, cấu trúc tetramer của protein p53 bao gồm bốn monomer liên kết với phân tử DNA đích và bốn phân tử MDM2 [1, 11, 28]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc phân tử của protein p53 [24]. Chú thích: A: protein p53 nhìn từ phía trên; B: chồng chất protein không có DNA (vàng) bên trong phức hợp p53-DNA; C: cấu trúc tinh thể của 2 miền lõi liên kết với DNA; D: lắp các miền lõi và DNA lại với nhau trong cấu trúc tinh thể [36].

Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu Protein p53 hoạt động chủ yếu như một nhân tố phiên mã. Được kích hoạt để đáp ứng các căng thẳng của tế bào như tổn thương DNA, căng thẳng ribosome, thiếu oxy,… bằng cách ngừng chu trình tế bào hoặc gây ra apoptosis. Thông thường trong tế bào protein p53 được liên kết với DNA ở dạng tetramer, gồm 2 dimer. Mỗi dimer liên kết với một trình tự đồng thuận RRRCWWGYYY (R = A / G, W = A / T, Y = C / T) [7].