Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33

• Tác giả: Trần Thị Thúy Nga
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Nho Thái
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về ung thư hiện đại
• 1.2. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới
• 1.3. Các con đường cơ bản hình thành ung thư
• 1.4. Nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay
• 1.5. P53 và các nghiên cứu biểu hiện p53 ứng dụng điều trị ung thư
• 1.6. Tổng quát về TP53 và protein tương ứng
• 1.7. Trình tự nhận biết đặc hiệu của p53 trên các gen mục tiêu
• 1.8. Những nghiên cứu về biểu hiện protein p53 tái tổ hợp
• 1.9. Hệ thống nấm men Pichia pastoris biểu hiện protein ngoại lai
• 1.10. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
• 1.11. Vector pPICZα biểu hiện protein ở Pichia pastoris
• 1.12. Quá trình chuyển gen vào nấm men Pichia pastoris
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
• 2.3. Các môi trường nuôi cấy
• 2.4. Các dung dịch và đệm
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Tách chiết vector biểu hiện từ chủng E. coli
• 2.5.2. Xử lý vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
• 2.5.3. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.5.4. Tinh sạch DNA gel agarose
• 2.5.5. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
• 2.5.6. Tách chiết DNA tổng số của nấm men
• 2.5.7. Sàng lọc thể biến nạp bằng kỹ thuật PCR
• 2.5.8. Nghiên cứu các điều kiện nhằm biểu hiện p53 tái tổ hợp tốt nhất
• 2.5.9. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)
• 2.5.10. Phương pháp EMSA
• 2.5.11. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký
• 2.5.12. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tạo chủng nấm men Pichia pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His
• 3.2. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ chủng E. coli DH5α và xử lý với SacI
• 3.3. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào Pichia pastoris và sàng lọc thể biến nạp
• 3.4. Tối ưu quy trình biểu hiện p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris
• 3.5. Lựa chọn dòng biểu hiện p53 tái tổ hợp
• 3.6. Tối ưu môi trường biểu hiện p53 tái tổ hợp
• 3.7. Tối ưu nồng độ methanol cảm ứng biểu hiện
• 3.8. Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp thu được
• 3.9. Tinh sạch protein p53 tái tổ hợp
• 3.10. Định lượng protein p53 bằng phương pháp Bradford
• 3.11. Xác định protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33 là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Protein p53 được biết đến như một yếu tố ức chế khối u, có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chu trình tế bào và sửa chữa DNA. Việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp có thể giúp nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của nó trong điều trị ung thư.

1.1. Đặc điểm của protein p53 và vai trò trong ung thư

Protein p53 là một yếu tố phiên mã quan trọng, có khả năng điều chỉnh nhiều gen liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis. Sự bất hoạt của gen TP53 thường liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư, làm cho việc nghiên cứu protein này trở nên cần thiết.

1.2. Hệ thống nấm men Pichia pastoris trong nghiên cứu

Nấm men Pichia pastoris là một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với số lượng lớn. Hệ thống này có nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy, chi phí thấp và khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã hoàn chỉnh.

II. Thách thức trong nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc biểu hiện protein p53 tái tổ hợp gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như điều kiện nuôi cấy, tối ưu hóa quy trình biểu hiện và tinh sạch protein là những yếu tố quan trọng cần được giải quyết.

2.1. Điều kiện nuôi cấy nấm men Pichia pastoris

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ methanol có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả biểu hiện protein. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đạt được sản lượng protein cao nhất.

2.2. Tối ưu hóa quy trình biểu hiện protein

Quy trình biểu hiện protein p53 tái tổ hợp cần được tối ưu hóa để đảm bảo protein được sản xuất với hoạt tính sinh học cao. Các phương pháp như điều chỉnh nồng độ methanol và thời gian nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng.

III. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, từ việc tạo vector biểu hiện đến các kỹ thuật tinh sạch protein. Các bước này cần được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo chất lượng protein thu được.

3.1. Tạo vector biểu hiện pPICZα

Vector pPICZα được sử dụng để biểu hiện protein p53 tái tổ hợp. Việc thiết kế vector này bao gồm việc tích hợp gen p53 vào vị trí thích hợp để đảm bảo sự biểu hiện hiệu quả trong nấm men.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein p53

Sau khi biểu hiện, protein p53 cần được tinh sạch để loại bỏ các tạp chất. Các phương pháp như sắc ký và điện di SDS-PAGE thường được sử dụng để đạt được protein tinh khiết với hoạt tính sinh học cao.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33 đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển liệu pháp điều trị ung thư. Protein p53 tái tổ hợp có thể được sử dụng trong các nghiên cứu in vitro và in vivo để đánh giá hiệu quả điều trị.

4.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein p53

Các thí nghiệm in vitro cho thấy protein p53 tái tổ hợp có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư

Protein p53 tái tổ hợp có thể được sử dụng như một liệu pháp điều trị mới, giúp tăng cường khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường. Nghiên cứu này có thể dẫn đến những bước tiến quan trọng trong điều trị ung thư.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33 không chỉ mở ra cơ hội mới trong điều trị ung thư mà còn góp phần vào sự phát triển của công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu protein p53

Với những tiến bộ trong công nghệ sinh học, việc nghiên cứu và phát triển protein p53 tái tổ hợp sẽ tiếp tục được mở rộng. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải thiện hiệu quả và độ an toàn của liệu pháp điều trị.

5.2. Định hướng nghiên cứu trong lĩnh vực ung thư

Nghiên cứu về protein p53 và các protein đích khác sẽ tiếp tục là một lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu ung thư. Việc phát triển các phương pháp điều trị mới sẽ giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư.