Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men pichia pastoris x33, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực

• Tác giả: Trần Thị Thúy Nga
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Nho Thái
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về ung thư hiện đại
• 1.2. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới
• 1.3. Các con đường cơ bản hình thành ung thư
• 1.4. Nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay
• 1.5. P53 và các nghiên cứu biểu hiện p53 ứng dụng điều trị ung thư
• 1.6. Tổng quát về TP53 và protein tương ứng
• 1.7. Trình tự nhận biết đặc hiệu của p53 trên các gen mục tiêu
• 1.8. Những nghiên cứu về biểu hiện protein p53 tái tổ hợp
• 1.9. Hệ thống nấm men Pichia pastoris biểu hiện protein ngoại lai
• 1.10. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
• 1.11. Vector pPICZα biểu hiện protein ở Pichia pastoris
• 1.12. Quá trình chuyển gen vào nấm men Pichia pastoris
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
• 2.3. Các môi trường nuôi cấy
• 2.4. Các dung dịch và đệm
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Tách chiết vector biểu hiện từ chủng E. coli
• 2.5.2. Xử lý vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
• 2.5.3. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.5.4. Tinh sạch DNA gel agarose
• 2.5.5. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
• 2.5.6. Tách chiết DNA tổng số của nấm men
• 2.5.7. Sàng lọc thể biến nạp bằng kỹ thuật PCR
• 2.5.8. Nghiên cứu các điều kiện nhằm biểu hiện p53 tái tổ hợp tốt nhất
• 2.5.9. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)
• 2.5.10. Phương pháp EMSA
• 2.5.11. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký
• 2.5.12. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tạo chủng nấm men Pichia pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His
• 3.2. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ chủng E. coli DH5α và xử lý với SacI
• 3.3. Biến nạp DNA tái tổ hợp vào Pichia pastoris và sàng lọc thể biến nạp
• 3.4. Tối ưu quy trình biểu hiện p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris
• 3.5. Lựa chọn dòng biểu hiện p53 tái tổ hợp
• 3.6. Tối ưu môi trường biểu hiện p53 tái tổ hợp
• 3.7. Tối ưu nồng độ methanol cảm ứng biểu hiện
• 3.8. Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp thu được
• 3.9. Tinh sạch protein p53 tái tổ hợp
• 3.10. Định lượng protein p53 bằng phương pháp Bradford
• 3.11. Xác định protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33 là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Protein p53 được biết đến như một yếu tố ức chế khối u, có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát chu trình tế bào và sửa chữa DNA. Việc sản xuất protein p53 tái tổ hợp có thể giúp nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của nó trong điều trị ung thư.

1.1. Đặc điểm của protein p53 và vai trò trong ung thư

Protein p53 là một yếu tố phiên mã quan trọng, có khả năng điều chỉnh nhiều gen liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis. Sự bất hoạt của gen TP53 thường liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư, làm cho việc nghiên cứu protein này trở nên cần thiết.

1.2. Hệ thống nấm men Pichia pastoris trong nghiên cứu

Nấm men Pichia pastoris là một hệ thống biểu hiện protein hiệu quả, cho phép sản xuất protein tái tổ hợp với số lượng lớn. Hệ thống này có nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy, chi phí thấp và khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã hoàn chỉnh.

II. Thách thức trong nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc biểu hiện protein p53 tái tổ hợp gặp phải nhiều thách thức. Các vấn đề như điều kiện nuôi cấy, tối ưu hóa quy trình biểu hiện và tinh sạch protein là những yếu tố quan trọng cần được giải quyết.

2.1. Điều kiện nuôi cấy nấm men Pichia pastoris

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ methanol có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả biểu hiện protein. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đạt được sản lượng protein cao nhất.

2.2. Tối ưu hóa quy trình biểu hiện protein

Quy trình biểu hiện protein p53 tái tổ hợp cần được tối ưu hóa để đảm bảo protein được sản xuất với hoạt tính sinh học cao. Các phương pháp như điều chỉnh nồng độ methanol và thời gian nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng.

III. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp

Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, từ việc tạo vector biểu hiện đến các kỹ thuật tinh sạch protein. Các bước này cần được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo chất lượng protein thu được.

3.1. Tạo vector biểu hiện pPICZα

Vector pPICZα được sử dụng để biểu hiện protein p53 tái tổ hợp. Việc thiết kế vector này bao gồm việc tích hợp gen p53 vào vị trí thích hợp để đảm bảo sự biểu hiện hiệu quả trong nấm men.

3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein p53

Sau khi biểu hiện, protein p53 cần được tinh sạch để loại bỏ các tạp chất. Các phương pháp như sắc ký và điện di SDS-PAGE thường được sử dụng để đạt được protein tinh khiết với hoạt tính sinh học cao.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33 đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển liệu pháp điều trị ung thư. Protein p53 tái tổ hợp có thể được sử dụng trong các nghiên cứu in vitro và in vivo để đánh giá hiệu quả điều trị.

4.1. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein p53

Các thí nghiệm in vitro cho thấy protein p53 tái tổ hợp có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư

Protein p53 tái tổ hợp có thể được sử dụng như một liệu pháp điều trị mới, giúp tăng cường khả năng tiêu diệt tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường. Nghiên cứu này có thể dẫn đến những bước tiến quan trọng trong điều trị ung thư.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men Pichia pastoris X33 không chỉ mở ra cơ hội mới trong điều trị ung thư mà còn góp phần vào sự phát triển của công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu protein p53

Với những tiến bộ trong công nghệ sinh học, việc nghiên cứu và phát triển protein p53 tái tổ hợp sẽ tiếp tục được mở rộng. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc cải thiện hiệu quả và độ an toàn của liệu pháp điều trị.

5.2. Định hướng nghiên cứu trong lĩnh vực ung thư

Nghiên cứu về protein p53 và các protein đích khác sẽ tiếp tục là một lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu ung thư. Việc phát triển các phương pháp điều trị mới sẽ giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Báo cáo của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) ghi nhận khoảng 14 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu ca tử vong trên toàn cầu vào năm 2012, con số này tiếp tục tăng lên 8,8 triệu ca tử vong vào năm 2015. Tại Việt Nam, thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp hạng tỷ lệ tử vong do ung thư ở vị trí 78/172 quốc gia với tỷ lệ 110 ca tử vong trên 100.000 dân. Các phương pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị thường gây tổn thương mô lành và khó loại bỏ triệt để tế bào ác tính khi đã di căn. Trước thực trạng đó, liệu pháp sinh học điều trị đích nhắm vào các protein điều hòa chu trình tế bào đang trở thành xu hướng mũi nhọn.

Vấn đề then chốt của nghiên cứu tập trung vào protein ức chế khối u p53, nhân tố kiểm soát quá trình sửa chữa DNA và kích hoạt quá trình tự chết theo chương trình (apoptosis). Đột biến ở gen TP53 xuất hiện ở hơn 50% các ca ung thư ở người, dẫn đến sự mất chức năng ức chế khối u. Mục tiêu cụ thể của luận văn là tạo dòng nấm men Pichia pastoris X33 mang cấu trúc dung hợp TAT-p53-His tích hợp vào hệ gen, tối ưu hóa các thông số nuôi cấy biểu hiện protein ngoại bào dạng tiết, tinh sạch sản phẩm bằng sắc ký ái lực ion kim loại và kiểm tra hoạt tính liên kết DNA đặc hiệu thông qua kỹ thuật EMSA.

Nghiên cứu được hoàn thành vào năm 2017 tại Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên kết hợp cùng Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein (KLEPT), Đại học Quốc gia Hà Nội. Đề tài mang ý nghĩa quan trọng trong việc thiết lập quy trình công nghệ sinh học sản xuất protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học, tạo nguồn nguyên liệu chuẩn cho các thử nghiệm tiền lâm sàng in vitro và in vivo, mở ra hướng tiếp cận kinh tế và an toàn trong điều trị ung thư đích.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai nền tảng lý thuyết cốt lõi trong sinh học phân tử và di truyền y học:

Lý thuyết gen ức chế khối u và cơ chế tự chết apoptosis: Gen TP53 nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 17 (17p13.1) có kích thước khoảng 20 kb, gồm 11 exon mã hóa chuỗi polypeptide 393 amino acid với khối lượng phân tử lý thuyết 43,7 kDa (di chuyển ở mức 53 kDa trên gel SDS-PAGE do giàu gốc proline). Protein p53 hoạt động ở dạng tetramer gồm 4 monomer gắn đặc hiệu vào trình tự đáp ứng DNA (p53REs) với motif bảo thủ RRRCWWGYYY nhằm kích hoạt phiên mã các gen đích như p21, Bax và MDM2.

Lý thuyết biểu hiện protein tái tổ hợp ở nấm men methylotrophic Pichia pastoris: Hệ thống Pichia pastoris kết hợp ưu điểm của sinh vật nhân chuẩn (khả năng cuộn gập chính xác, hình thành cầu nối disulfide và glycosyl hóa chuỗi N-/O- vừa phải) với tốc độ sinh trưởng nhanh và mật độ tế bào cao. Dưới sự điều khiển của promoter cực mạnh AOX1 (alcohol oxidase 1), quá trình biểu hiện gen ngoại lai được cảm ứng nghiêm ngặt bởi methanol, trong khi tín hiệu tiết α-factor từ Saccharomyces cerevisiae chỉ đạo protein đích tiết trực tiếp ra môi trường nuôi cấy.

Các khái niệm chính bao gồm: peptide xuyên màng TAT (nguồn gốc từ HIV) giúp đưa protein qua màng tế bào ung thư; đuôi ái lực 6xHistidine hỗ trợ tinh sạch nhanh; và kiểu hình sử dụng methanol kiểu dại Mut+ ở chủng nấm men Pichia pastoris X33.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu: Vector biểu hiện pPICZαA-TAT-p53-His (kích thước 4,8 kb) mang khung vector pPICZαA 3,6 kb và đoạn chèn TAT-p53-His 1,2 kb; chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α; chủng nấm men Pichia pastoris X33 (Invitrogen).

Cỡ mẫu và chọn mẫu: Khảo sát chọn lọc trên 9 khuẩn lạc E. coli biến nạp (đạt 7/9 khuẩn lạc dương tính, tỷ lệ 77,8%); sàng lọc 7 dòng nấm men Pichia pastoris X33 tái tổ hợp mang gen kháng zeocin (từ dòng X33-17 đến X33-36); đánh giá biểu hiện trên 5 hệ môi trường nuôi cấy khác nhau và 4 mức nồng độ methanol cảm ứng.

Quy trình kỹ thuật và phương pháp phân tích:

• Mở vòng plasmid bằng enzyme cắt giới hạn SacI tại vị trí promoter AOX1, tinh sạch DNA đạt nồng độ cao trước khi chuyển gen.
• Biến nạp vào tế bào khả biến Pichia pastoris X33 bằng phương pháp xung điện (thông số 1,5 kV, điện dung 25 µF, điện trở 200 Ω).
• Tách chiết DNA tổng số và sàng lọc thể biến nạp bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu: EcoRI-Fw/XhoI-Rv (khuếch đại đoạn 1247 bp của gen TAT-p53-His) và AOX1-Fw/AOX1-Rv (khuếch đại đoạn 2800 bp). Lý do lựa chọn PCR kép là nhằm xác định chính xác sự tích hợp đồng nhất của cấu trúc tái tổ hợp vào hệ gen nấm men.
• Điện di protein biến tính trên gel polyacrylamide 12% (SDS-PAGE) ở điện áp 150 V để đánh giá mức độ biểu hiện và kích thước protein.
• Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực cột Ni-Sepharose qua các nồng độ đệm Imidazole từ 5 mM, 20 mM đến 200 mM.
• Định lượng protein tổng số theo phương pháp Bradford tại bước sóng OD595 nm dựa trên đường chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA nồng độ 0 - 50 µg/ml).
• Đánh giá hoạt tính liên kết DNA đặc hiệu bằng phương pháp chuyển dịch dải điện di (EMSA) trên gel polyacrylamide 10% không biến tính, sử dụng đoạn mồi dò promoter mdm2 dài 187 bp chứa trình tự nhận biết của p53 và đoạn đối chứng âm DCmdm2 dài 200 bp.

Timeline nghiên cứu: Toàn bộ quá trình thực nghiệm tách dòng, biến nạp, tối ưu hóa lên men, tinh sạch và thử nghiệm hoạt tính sinh học được thực hiện liên tục và hoàn thành trong năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao:

Thứ nhất, tái tổ hợp và xử lý vector biểu hiện thành công: Plasmid pPICZαA-TAT-p53-His tách chiết từ E. coli đạt nồng độ ấn tượng 5981,3 ng/µl với độ sạch A260/A280 đạt 1,09. Sau khi xử lý cắt mở vòng bằng enzyme SacI, sản phẩm thu được duy nhất một băng DNA mạch thẳng kích thước 4,8 kb trên gel agarose 1%, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn để biến nạp vào nấm men.

Thứ hai, tạo dòng và sàng lọc thành công chủng Pichia pastoris X33 mang gen tái tổ hợp: Kết quả biến nạp bằng xung điện trên môi trường thạch YPDS chứa 100 µg/ml zeocin đã chọn lọc được các khuẩn lạc kháng thuốc phát triển ổn định. Phân tích nồng độ DNA tổng số của 7 dòng nấm men dao động từ 122,2 ng/µl đến 531,3 ng/µl. Kỹ thuật PCR khẳng định dòng X33-36 (nồng độ DNA 447,9 ng/µl, tỷ lệ A260/A280 đạt 1,77) cho vạch khuếch đại rõ nét ở kích thước 1247 bp và 2800 bp, chứng minh cấu trúc gen TAT-p53-His đã dung hợp bền vững vào vị trí 5'AOX1 trên hệ gen vật chủ.

Thứ ba, xác định môi trường và nồng độ cảm ứng methanol tối ưu: Trong 5 hệ môi trường nuôi cấy khảo sát (BMMY, BMM, MMY, YPM, YPDM), môi trường phức hợp đệm BMMY (pH 6,0) cho sinh khối tế bào cao nhất và lượng protein tiết dồi dào nhất sau 72 giờ nuôi cấy ở 30°C. Khảo sát 4 mức nồng độ methanol cho thấy nồng độ 1,0% đến 1,5% (v/v) bổ sung định kỳ sau mỗi 24 giờ kích thích mức độ biểu hiện protein p53 ngoại bào cao hơn 35% so với mức 0,5% và không gây độc ức chế sinh trưởng như mức 2,0%.

Thứ tư, tinh sạch hiệu quả và khẳng định hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp: Protein TAT-p53-His dạng tiết được thu nhận qua cột sắc ký ái lực Ni-Sepharose, rửa giải sạch ở nồng độ Imidazole 200 mM, cho một băng protein đồng nhất trên gel SDS-PAGE 12%. Phép thử EMSA chứng minh protein p53 tái tổ hợp liên kết đặc hiệu với đoạn DNA promoter mdm2 dài 187 bp, tạo nên phức hợp dịch chuyển tốc độ di chuyển trên gel polyacrylamide 10%, trong khi đoạn đối chứng 200 bp không xuất hiện hiện tượng gắn kết.

Thảo luận kết quả

Khả năng biểu hiện vượt trội của chủng X33-36 trong môi trường BMMY được giải thích bởi thành phần môi trường chứa đầy đủ dịch chiết nấm men, peptone, muối khoáng YNB, biotin và hệ đệm phosphate pH 6,0. Hệ đệm này giúp hạn chế tối đa hoạt tính của các protease ngoại bào tự nhiên làm phân hủy sản phẩm đích. Chủng Pichia pastoris X33 với kiểu hình Mut+ duy trì tốc độ đồng hóa methanol mạnh mẽ, cho phép promoter AOX1 hoạt động liên tục với công suất phiên mã cao nhất khi bổ sung 1,0% - 1,5% methanol.

Dữ liệu thực nghiệm biểu hiện có thể được mô hình hóa rõ ràng thông qua biểu đồ tăng trưởng mật độ quang học OD600 kết hợp với biểu đồ cột định lượng mật độ quang OD595 theo phương pháp Bradford. Đường chuẩn BSA xây dựng đạt hệ số tương quan tuyến tính cao (R² > 0,99), bảo đảm độ tin cậy tuyệt đối khi xác định hàm lượng protein. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp có kích thước phân tử khoảng 53 kDa, phù hợp hoàn hảo với khối lượng của phức hợp monomer p53 dung hợp cùng đoạn peptide TAT và đuôi 6xHis.

So sánh với các công bố quốc tế, kết quả này tương đồng với nghiên cứu của các tác giả tại Châu Âu (năm 2012) và nhóm nghiên cứu tại Châu Á (năm 2012) khi sản xuất TAT-p53 trên nấm men. Tuy nhiên, luận văn đã cải tiến tối ưu hóa bộ mã di truyền theo codon preference của Pichia pastoris, giúp nâng cao chỉ số thích nghi dịch mã CAI mà vẫn giữ nguyên 100% trình tự 393 amino acid gốc của người. Hoạt tính liên kết DNA được xác nhận qua EMSA là bằng chứng then chốt chứng minh protein tái tổ hợp giữ vững cấu trúc không gian bậc 4 tetramer chức năng, không bị sai lệch trong quá trình cuộn gập và biến đổi sau dịch mã tại nấm men.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đề xuất 4 khuyến nghị hành động cụ thể nhằm hoàn thiện công nghệ và thúc đẩy ứng dụng y sinh học:

Mở rộng quy mô lên men trong hệ thống bioreactor tự động: Cần chuyển đổi quy trình nuôi cấy từ bình lắc tam giác sang nồi lên men công nghiệp dung tích 5 - 10 lít có kiểm soát tự động nồng độ oxy hòa tan (DO > 20%), pH ổn định ở 6,0 và hệ thống nạp methanol liên tục theo tín hiệu sinh khối. Mục tiêu nâng sản lượng protein p53 tái tổ hợp đạt mức 50 - 100 mg/lít trong khung thời gian 6 - 12 tháng, do Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein chủ trì thực hiện.

Thực hiện thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro và in vivo: Triển khai đánh giá khả năng xâm nhập tế bào nhờ đoạn peptide TAT và hiệu quả ức chế tăng sinh, kích nạp apoptosis trên các dòng tế bào ung thư người (như ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF-7, ung thư cổ tử cung HeLa). Chỉ số mục tiêu cần đạt là tỷ lệ ức chế tế bào ác tính vượt trên 65% ở nồng độ protein tối ưu trong lộ trình 12 - 18 tháng, do nhóm nghiên cứu Di truyền Y Dược phối hợp với các cơ sở chuyên khoa ung bướu tiến hành.

Tối ưu hóa quy trình tinh sạch chuẩn FPLC công nghiệp: Thay thế cột sắc ký trọng lực bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao FPLC với cột Ni-NTA cải tiến, bổ sung bước thẩm tách loại muối Imidazole và siêu lọc cô đặc màng 10 kDa. Mục tiêu nâng độ tinh sạch sản phẩm đạt trên 95% và hiệu suất thu hồi protein đạt trên 80% trong vòng 18 - 24 tháng, do các kỹ sư công nghệ sinh học và hóa sinh đảm trách.

Phát triển hệ chất mang nano hướng đích cho protein TAT-p53-His: Phối hợp nghiên cứu bào chế phức hợp hạt nano polymer tương thích sinh học hoặc liposome nhằm bảo vệ protein khỏi sự phân hủy của enzyme huyết tương, kéo dài thời gian bán hủy sinh học in vivo lên trên 24 giờ trong thời gian 2 - 3 năm, do các viện nghiên cứu dược phẩm và vật liệu y sinh triển khai.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình thiết kế vector chuyển gen, biến nạp xung điện nấm men, các phản ứng PCR sàng lọc và phương pháp điện di không biến tính EMSA kiểm tra tương tác protein-DNA.

Chuyên gia nghiên cứu và phát triển thuốc sinh học (Biopharmaceuticals R&D): Luận văn là cơ sở thực nghiệm giá trị cho việc tiếp cận liệu pháp điều trị ung thư bằng protein tái tổ hợp mang tín hiệu xuyên màng TAT, mở ra giải pháp thay thế cho các vector virus tiềm ẩn nguy cơ sinh u trong liệu pháp gen truyền thống.

Giảng viên và cán bộ giảng dạy khối ngành Khoa học Sự sống và Y Dược: Luận văn đóng vai trò là học liệu chuyên sâu phục vụ công tác giảng dạy các chuyên đề công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ biểu hiện protein dị loại và cơ chế di truyền phân tử của bệnh ung thư.

Kỹ sư công nghệ lên men và các doanh nghiệp sinh phẩm y tế: Tài liệu cung cấp thông số chi tiết về thành phần môi trường, động học sinh trưởng của chủng Pichia pastoris Mut+ và nồng độ methanol cảm ứng, làm tiền đề thiết kế quy trình sản xuất quy mô công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao lựa chọn nấm men Pichia pastoris X33 thay vì vi khuẩn E. coli để biểu hiện protein p53? Hệ thống nấm men Pichia pastoris là sinh vật nhân chuẩn có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như tạo cầu disulfide và glycosyl hóa chuỗi bên, giúp protein p53 cuộn gập chuẩn xác để tạo cấu trúc tetramer hoạt tính. Ngược lại, biểu hiện p53 trong vi khuẩn E. coli thường tạo thể vùi bất hoạt, đòi hỏi quy trình tái biến tính phức tạp và tốn kém.

Vai trò của đoạn peptide TAT trong cấu trúc tái tổ hợp TAT-p53-His là gì? Peptide TAT gồm chuỗi amino acid giàu arginine và lysine có nguồn gốc từ virus HIV, hoạt động như một phân tử dẫn đường xuyên màng sinh chất. Nhờ đoạn peptide TAT này, protein p53 tái tổ hợp có thể chủ động thẩm thấu trực tiếp vào nội bào tế bào ung thư mà không cần dựa vào các vector virus chuyển gen hay hóa chất mang trợ lực.

Nồng độ methanol và thời gian cảm ứng tối ưu trong nghiên cứu được xác định như thế nào? Qua khảo sát thực nghiệm 4 mức nồng độ methanol (0,5%, 1,0%, 1,5% và 2,0%), mức 1,0% - 1,5% (v/v) bổ sung định kỳ mỗi 24 giờ trong tổng thời gian nuôi 72 giờ tại nhiệt độ 30°C cho hiệu suất sinh tổng hợp p53 cao nhất. Nồng độ này duy trì hoạt tính cảm ứng mạnh của promoter AOX1 mà không làm ngộ độc gây chết tế bào nấm men.

Phương pháp EMSA chứng minh điều gì về hoạt tính sinh học của p53 tái tổ hợp? Kỹ thuật EMSA chứng minh protein p53 tái tổ hợp có khả năng liên kết đặc hiệu với trình tự nhận biết tự nhiên trên promoter mdm2 dài 187 bp, tạo phức hợp cồng kềnh di chuyển chậm lại trên gel polyacrylamide 10%. Hiện tượng này khẳng định protein thu được giữ nguyên cấu trúc không gian và chức năng sinh học gắn DNA đích tương đương protein tự nhiên.

Protein p53 tái tổ hợp tiết ra ngoại bào có bị phân hủy bởi protease của nấm men không? Trong nghiên cứu, việc sử dụng môi trường đệm BMMY duy trì ổn định pH ở mức 6,0 kết hợp với việc thu hoạch dịch nuôi cấy đúng thời điểm 72 giờ đã ức chế phần lớn hoạt tính protease ngoại bào. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy một băng protein đơn duy nhất ở 53 kDa, chứng minh sản phẩm không bị cắt mảnh phân hủy.

Kết luận

• Luận văn đã thiết kế thành công quy trình mở vòng vector tái tổ hợp pPICZαA-TAT-p53-His (4,8 kb) bằng enzyme SacI với nồng độ plasmid thu nhận đạt 5981,3 ng/µl.
• Chuyển gen thành công vào nấm men Pichia pastoris X33 bằng xung điện, sàng lọc được chủng ưu tú X33-36 mang đầy đủ gen đích qua xác nhận PCR kích thước 1247 bp và 2800 bp.
• Xác định môi trường phức hợp BMMY (pH 6,0) kết hợp nồng độ cảm ứng methanol 1,0% - 1,5% bổ sung mỗi 24 giờ trong 72 giờ là điều kiện tối ưu để thu nhận protein ngoại bào.
• Tinh sạch thành công protein TAT-p53-His qua cột sắc ký ái lực Ni-Sepharose và khẳng định hoạt tính liên kết DNA đặc hiệu trên promoter mdm2 bằng kỹ thuật EMSA.
• Lộ trình tiếp theo tập trung vào việc nâng quy mô lên men bioreactor 10 lít trong 12 tháng tới và thử nghiệm hoạt tính ức chế trên các dòng tế bào ung thư người in vitro trong 18 tháng tiếp theo.

Các nhà khoa học, nghiên cứu sinh và doanh nghiệp y dược quan tâm đến công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp điều trị ung thư đích có thể khai thác và kế thừa trực tiếp quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh từ công trình nghiên cứu này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về ung thư hiện đại 1. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới Thuật ngữ “ung thư” ngày nay được sử dụng để chỉ một nhóm bệnh phát sinh do sự biến đổi của các gen đặc thù, có thể tạo ra một tập hợp các tế bào phân chia một cách không kiểm soát (khối u) phát triển từ một mô hay từ một tế bào bình thường.

Khối u ác tính khi phát triển xâm lấn sẽ tiếp cận với mạch máu, từ đó có thể di chuyển và phát triển tại các mô ở xa, gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong [19, 41]. Những con số thống kê cụ thể chứng minh “Ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây ra tử vong ở người” vào những năm gần đây đã được Cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) báo cáo vào năm 2013. Cụ thể, đã có khoảng 14 triệu trường hợp mới mắc ung thư và 8,2 triệu trường hợp tử vong do ung thư vào năm 2012, ảnh hưởng đến các quần thể người ở tất cả các nước và các vùng trên thế giới [18, 26]. Tính riêng trong giới tính nam, năm 2012, chẩn đoán mắc ung thư ở nam giới phổ biến nhất là ung thư phổi (16,7%), ung thư tuyến tiền liệt (15,0%) và ung thư đại tràng (10,0%).

Ung thư ở những vị trí này cũng là nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong cho nam giới với 23,6% ở ung thư phổi, tiếp theo là ung thư gan (11,2%) và ung thư dạ dày (10,1%). Đối với phụ nữ, chuẩn đoán mắc ung thư phổ biến nhất là ung thư vú (25,2%), ung thư đại trực tràng (9,2%), ung thư phổi (8,7%) và ung thư cổ tử cung (7,9%). Ung thư tại những vị trí này cũng tương tự là nguyên nhân phổ biến nhất gây tử vong ở phụ nữ với 14,7% ở ung thư vú và 13,8% ở ung thư phổi [26, 27,43]. Đến năm 2015, xếp sau bệnh tim và đột quỵ, ung thư trở thành nguyên nhân gây tử vong thứ hai trên toàn cầu với 8,8 triệu người chết, phổ biến xảy ra ở ung thư phổi với 1,69 triệu ca tử vong, sau đó đến ung thư gan (788.000 ca tử vong), u ruột kết (774.000 ca NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ tử vong), ung thư dạ dày (754.000 ca tử vong) và ung thư vú (571.000 ca tử vong).

Ước tính chung về tỉ lệ tử vong do ung thư trên toàn thế giới thì có khoảng 70% số ca xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, khoảng 30% số ca phát sinh từ năm nguy cơ sinh hoạt và chế độ ăn uống như: chỉ số cơ thể cao, ăn ít trái cây và rau quả, thiếu hoạt động thể lực, sử dụng thuốc lá và bia rượu. Thuốc lá là một yếu tố gây ung thư phổ biến nhất và chiếm khoảng 22% số ca tử vong. Nhiễm trùng gây ung thư lên đến 25% các trường hợp ung thư ở những nước thu nhập thấp và trung bình [20]. Vào năm 2015, chỉ có 35% các quốc gia thu nhập thấp báo cáo có dịch vụ chuẩn đoán bệnh lý tại thành phố và các khu trung tâm.

Tổng chi phí kinh tế hàng năm dành cho ung thư ước tính khoảng 1,16 nghìn tỷ USD. Do đó, chỉ có khoảng 20% các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình có những giải pháp cần thiết để thúc đẩy chính sách về ung thư [18, 43]. Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều khó khăn về chữa trị bệnh với số lượng người mắc ung thư ngày một tăng. Theo thống kê của Đại học Y Hà Nội, năm 2005, số ca tử vong do ung thư là 45.413 người; năm 2006, con số này là 48.306 người, trong đó phổ biến nhất là ung thư gan, sau đó đến ung thư phổi và ung thư dạ dày [34].

Tuy nhiên, các phương thức điều trị ung thư hiện nay còn tốn kém, hầu hết dựa vào phương pháp truyền thống là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật. Các phương pháp này gây đau đớn kéo dài cho người bệnh, và chỉ kéo dài tuổi thọ được trong thời gian ngắn hoặc khả năng tái phát cao do không thể tiêu diệt triệt để tế bào ung thư. Điều này đòi hỏi cần phải có giải pháp điều trị mới, tăng hiệu quả chữa trị bệnh và giảm thiểu kinh phí. Các con đường cơ bản hình thành ung thư 1.

Cơ sở di truyền học phân tử hình thành ung thư Gen ung thư là dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do đột biến, làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư phát sinh từ tế bào mầm sinh dục sẽ có mặt trong hầu hết các tế bào của cơ thể và truyền lại NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ cho thế hệ sau, ngược lại, nếu từ tế bào soma sẽ không được truyền cho thế hệ sau. Gen ung thư được xuất phát từ hai nhóm gen là gen tiền ung thư và gen ức chế khối u [19]. Gen tiền ung thư có chức năng điều khiển quá trình sinh trưởng và biệt hóa trong tế bào.

Các đột biến chuyển gen tiền ung thư thành gen ung thư (oncogene) gây nên rối loạn chuyển hóa ở tế bào và tạo ra ung thư. Protein được mã hóa bởi gen ung thư thường có mức biểu hiện chức năng tăng lên so với protein được mã hóa bởi gen tiền ung thư. Sự tái sắp xếp phức tạp của hệ gen có thể tạo ra gen ung thư. Điển hình là họ gen MYC (ví dụ gen tiền ung thư C-MYC) mã hóa cho các yếu tố phiên mã ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ biểu hiện của gen, qua đó tác động đến sự tăng sinh tế bào và liên quan đến sự phát sinh của khối u.

Cấu trúc di truyền của MYC bị sắp xếp lại theo một số cách dẫn đến mức biểu hiện cao bất thường các protein MYC, làm hoạt hóa các gen tiền ung thư. Số gen MYC có thể tăng lên do hiện tượng lặp đoạn NST mang gen MYC hoặc do vị trí của nó được xếp lại gần một promoter mạnh dẫn đến tăng lượng sản phẩm protein. Những đột biến NST kiểu này ở tế bào soma có thể được nhân lên ổn định cùng quá trình chọn lọc dòng tế bào ung thư [19, 28]. Các gen tiền ung thư cũng có thể được hoạt hóa bởi cơ chế nhân bản gen.

Số bản sao của mỗi gen có thể tăng do hiện tượng nhân bản một vùng DNA (amplicon) của NST, dẫn đến lượng protein trong tế bào do gen đó mã hóa tăng theo. Ví dụ lặp vùng NST 2p24 của gen N-MYC là một gen tiền ung thư được chuyển thành gen ung thư gây phát sinh các u nguyên bào thần kinh. Hiện tượng lặp 20-500 bản sao gen ERBB2 phổ biến trong các trường hợp ung thư vú và ung thư buồng trứng, u tuyến phát sinh từ dạ dày và tuyến nước bọt [19,41]. Sự hoạt hóa gen tiền ung thư còn có thể được tạo ra bởi chuyển đoạn NST theo hai cơ chế, tùy thuộc vào vị trí của điểm đứt gãy NST: chuyển đoạn có thể đặt hai trình tự exon thuộc hai gen khác nhau dưới sự điều khiển của chung một promoter dẫn đến sự biểu hiện của một protein dung hợp; hoặc chuyển đoạn NST đặt một khung đọc mở hoàn chỉnh cạnh một promoter hoạt động mạnh.

Ví dụ điển hình là bệnh ung thư bạch cầu thể tủy trường diễn có dạng chuyển đoạn tương hỗ hình thành theo hai cách: dung hợp của các gen BCR và C-ABL từ NST số 22 và từ NST số 9 dẫn NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ đến sản phẩm của gen dung hợp BCR-ABL có tác động gây ung thư. Nhiều sản phẩn gen dung hợp BCR-ABL với các khung dung hợp khác nhau được tạo ra nhờ trên NST số 9 chỉ có một điểm đứt gãy duy nhất, còn trên NST số 22 có một cụm các điểm đứt gãy đặc thù [19, 22, 41]. Các gen ung thư là các gen trội về khả năng phát sinh khối u bởi chỉ một đột biến duy nhất có thể chuyển một gen tiền ung thư thành gen ung thư. Đột biến hoạt hóa các gen này luôn tạo ra ưu thế tăng sinh tế bào mặc dù vẫn tồn tại bản sao của các alen bình thường.

Do kiểu hình mà các gen ung thư quy định không bị át chế bởi sự có mặt của bản sao kiểu dại còn lại, nên có thể coi các gen ung thư là các gen trội [28, 47]. Các gen ức chế khối u bình thường điều khiển các quá trình cơ bản nhằm duy trì sự cân bằng nội mô bao gồm: duy trì tính toàn vẹn của vật chất di truyền, các bước của chu kỳ tế bào, sự biệt hóa tế bào, mối tương tác giữa các tế bào và quá trình apoptosis. Các đột biến làm bất hoạt gen ức chế khối u, biến gen đó trở thành một gen ung thư, gây ra mất cân bằng nội mô, từ đó dẫn đến sự phát sinh các khối u [19]. Sự bất hoạt một gen ức chế khối u trải qua hai bước tách biệt nhau: đột biến thứ nhất làm bất hoạt một alen xảy ra ở tế bào dòng sinh dục hoặc ở tế bào soma; đột biến thứ hai làm bất hoạt hoàn toàn gen ức chế khối u luôn xảy ra ở tế bào soma và gây nên mất alen bình thường còn lại, từ đó phát triển thành khối u.

Hiện tượng mất tính dị hợp tử (Loss of Heterozygosity, LOH) phản ánh sự mất đi của bản sao alen kiểu dại duy nhất còn lại của một gen ức chế khối u và có thể xuất hiện theo các cơ chế khác nhau: mất toàn bộ NST; tái tổ hợp trong nguyên phân hoặc các đột biến cục bộ. Kết quả là mất các gen ức chế khối u diễn ra nhanh hơn ở các tế bào ung thư so với ở các tế bào tiền khối u [19, 28]. Theo cơ chế di truyền, các gen ức chế khối u (dạng đột biến) thường là lặn trong khi các gen gây khối u là trội.