Tổng quan luận án

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue (DENV) gây nên, lây truyền qua trung gian muỗi Aedes aegyptiAedes albopictus. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 390 triệu người nhiễm DENV mỗi năm với hơn 25.000 ca tử vong trên toàn cầu, trong đó có 96 triệu trường hợp biểu hiện lâm sàng. Tại Việt Nam, bệnh diễn biến phức tạp theo chu kỳ và phân bố ở nhiều địa phương; năm 2022 cả nước ghi nhận 367.729 ca mắc và 140 ca tử vong. DENV gồm 4 týp huyết thanh (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4) có độ tương đồng trình tự bộ gen từ 60% đến 80%. Protein không cấu trúc 1 (NS1) là protein phi cấu trúc duy nhất được bài tiết vào máu người bệnh trong giai đoạn cấp tính và có tính sinh miễn dịch cao. Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán thương mại hiện nay chủ yếu sử dụng kháng nguyên đơn lẻ từng týp, chưa có kháng nguyên NS1 gộp đủ cả 4 týp huyết thanh được nghiên cứu chế tạo đồng bộ nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện kháng thể. Do đó, luận án tiến sĩ y học của tác giả Hoàng Xuân Cường tập trung giải quyết khoảng trống này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

  1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022.
  2. Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng: Người bệnh được chẩn đoán SXHD điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103 (Hà Nội) và Bệnh viện Quân y 175 (Thành phố Hồ Chí Minh) trong năm 2022.
  • Nghiên cứu thực nghiệm sinh học phân tử: Thiết kế, tách dòng, biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp (DENV1-4) trên tế bào vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) BL21 và đánh giá hoạt tính phát hiện kháng thể kháng DENV bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình dịch tễ, cơ chế bệnh sinh, đặc điểm lâm sàng và công nghệ chẩn đoán DENV:

  1. Dịch tễ học và cơ chế bệnh sinh: Luận án dẫn chứng số liệu của WHO (2000–2019) về sự gia tăng số ca mắc trên toàn cầu và các đợt dịch lớn tại Việt Nam (các năm 1987, 1998, 2009, 2017, 2022). Về cơ chế bệnh sinh, tác giả điểm lại ba giả thuyết chính giải thích bệnh cảnh nặng:
    • Giả thuyết nhiễm đồng thời hai týp huyết thanh của Hammon.
    • Giả thuyết độc lực vi rút của Leon Rose.
    • Giả thuyết tăng cường miễn dịch phụ thuộc kháng thể (ADE) của Halstead khi tái nhiễm một týp huyết thanh khác.
  2. Cấu trúc sinh học của DENV và NS1: Dẫn truyền công trình của Roy SK và cộng sự (2021), hệ gen RNA đơn dương kích thước khoảng 11 kb của DENV mã hóa 3 protein cấu trúc (Capsid, Màng, Vỏ) và 7 protein phi cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Protein NS1 có kích thước 352 axit amin, monomer 45–55 kDa, cấu tạo gồm 3 miền: miền β-roll (aa 1–29), miền cánh (aa 30–180) và thang β (aa 181–352). NS1 được tiết vào máu dưới dạng hexamer (sNS1).
  3. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán:
    • Nghiên cứu của Luvira so sánh xét nghiệm ELISA NS1 (độ nhạy 82,4%, độ đặc hiệu 94,3%) với kit test nhanh (độ nhạy 76,5%) và xét nghiệm phát hiện IgM bằng ELISA (độ nhạy 27,5%).
    • Nghiên cứu tại Quảng Châu (Trung Quốc, 2006) dùng bộ kit ELISA Panbio Dengue IgM cho thấy độ nhạy phát hiện NS1 dao động từ 81,8% đến 91,1% trong 7 ngày đầu.
    • Báo cáo của Versiani về hệ thống máy xét nghiệm VIDAS® với xét nghiệm kết hợp VIDAS® NS1/IgM đạt tỷ lệ phù hợp dương tính (PPA) 96,4% ở giai đoạn cấp tính.
    • Đánh giá tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương (TP. Hồ Chí Minh) trên kit SD Bioline Dengue NS1 Antigen (độ nhạy 51,2%, độ đặc hiệu 92,9%) và careUS Dengue IgM/IgG (độ nhạy IgM 21,4%, độ đặc hiệu 76,9%).

Vị trí của luận án: Giải quyết hạn chế bỏ sót chẩn đoán do tính đa dạng kháng nguyên của 4 týp huyết thanh DENV bằng cách thiết kế phân tử protein tái tổ hợp gộp chứa các đoạn epitop đặc hiệu nhận diện cả 4 týp (DENV1-4) biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn E. coli, kết hợp với dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng thu thập đồng thời tại hai bệnh viện quân y lớn ở hai miền Bắc - Nam trong vụ dịch năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Khung phân loại lâm sàng SXHD theo Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị của Bộ Y tế ban hành kèm Quyết định số 3705/QĐ-BYT (22/8/2019) và khuyến cáo của WHO (2009): phân loại thành 3 mức độ (SXHD, SXHD có dấu hiệu cảnh báo, SXHD nặng).
  • Cơ chế phản ứng miễn dịch gắn enzym gián tiếp (Indirect ELISA): kháng nguyên tái tổ hợp rNS1 hấp phụ trên bề mặt đĩa polystyrene, liên kết đặc hiệu với kháng thể kháng DENV trong mẫu huyết thanh, được nhận diện bởi kháng thể thứ cấp gắn enzym để chuyển hóa cơ chất sinh màu, đo mật độ quang (OD).

Phương pháp nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng (Mục tiêu 1)

  • Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang, tiến cứu kết hợp hồi cứu.
  • Đối tượng nghiên cứu: Người bệnh SXHD điều trị nội trú tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 trong năm 2022.
  • Tiêu chuẩn lựa chọn: Người bệnh có yếu tố dịch tễ sống hoặc đi đến vùng dịch; lâm sàng sốt $\le$ 7 ngày kèm ít nhất 2 dấu hiệu (buồn nôn/nôn, phát ban, đau cơ/khớp/nhức hai hố mắt, xuất huyết da/dây thắt dương tính, bạch cầu bình thường hoặc giảm); cận lâm sàng có NS1 (+) và/hoặc IgM (+); người bệnh tự nguyện đồng ý tham gia.
  • Tiêu chuẩn loại trừ: Người bệnh mắc ung thư, ghép tạng, bệnh tự miễn, hội chứng AIDS; đồng nhiễm vi khuẩn, EBV, CMV, HBV, HCV; mắc các bệnh giảm tiểu cầu khác (giảm tiểu cầu miễn dịch, xơ gan giảm tiểu cầu).
  • Các chỉ số thu thập: Đặc điểm sốt, triệu chứng cơ năng, triệu chứng thực thể, dạng xuất huyết, tràn dịch màng phổi/màng bụng qua siêu âm; chỉ số huyết học (bạch cầu, tiểu cầu, Hematocrit, hồng cầu, Hemoglobin), đông máu (APTT, tỷ lệ prothrombin, fibrinogen), sinh hóa (AST, ALT, creatinin, điện giải đồ, protein, albumin).

Phương pháp công nghệ sinh học và thực nghiệm ELISA (Mục tiêu 2)

  • Thiết kế đoạn gen kháng nguyên tái tổ hợp: Mô phỏng cấu trúc 3D của đoạn peptit từ axit amin 112–260 trên protein NS1; thực hiện docking phân tử giữa đoạn peptit 112–260 với các kháng thể đặc hiệu (kháng thể 1G5 và kháng thể 2B).
  • Tách dòng và biểu hiện gen:
    • Đoạn gen mã hóa rNS1 gộp 4 týp được gắn vào vector tách dòng pJET, sàng lọc và kiểm tra trên tế bào E. coli.
    • Chuyển gen vào vector biểu hiện pET22b(+), biến nạp vào tế bào chủ E. coli BL21.
    • Sàng lọc khuẩn lạc sau biến nạp và xác nhận trình tự bằng phương pháp giải trình tự Sanger.
  • Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện:
    • Khảo sát các mức nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau.
    • Tối ưu nồng độ chất cảm ứng Isopropyl $\beta$-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
    • Tối ưu thời gian nuôi cấy biểu hiện protein.
  • Kiểm tra và tinh sạch protein:
    • Điện di SDS-PAGE và phản ứng Western blot kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên rNS1 với kháng thể kháng NS1 thương mại và kháng thể đơn dòng tự sản xuất.
    • Định lượng nồng độ protein bằng phương pháp Bradford (xây dựng đường chuẩn Bradford).
  • Xây dựng quy trình ELISA gián tiếp:
    • Tối ưu hóa nồng độ phủ kháng nguyên rAgNS1-DENV1-4 và độ pha loãng huyết thanh.
    • Xác định giá trị ngưỡng cắt (cut-off) dựa trên mật độ quang OD.
    • Phân tích độ tin cậy bằng đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic), xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm.
Thành phần nghiên cứu Nội dung kỹ thuật và công cụ áp dụng
Đối tượng lâm sàng Người bệnh điều trị tại BVQY 103 và BVQY 175 năm 2022
Chẩn đoán căn nguyên Test nhanh NS1, kháng thể IgM/IgG, RT-PCR
Hệ thống tạo dòng Vector pJET, vector biểu hiện pET22b(+), tế bào E. coli BL21
Kiểm tra phân tử Giải trình tự Sanger, điện di SDS-PAGE, Western blot
Định lượng protein Phương pháp đo màu Bradford
Kỹ thuật miễn dịch ELISA gián tiếp sử dụng rAgNS1-DENV1-4
Đánh giá thống kê Xác định ngưỡng cut-off, phân tích đường cong ROC

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng thuật các kiến thức kinh điển và hiện đại về bệnh sốt xuất huyết Dengue. Tác giả trình bày cấu trúc hạt vi rút DENV hình cầu, đường kính 35–50 nm, đối xứng khối, có màng lipid kép. Polyprotein gồm khoảng 3400 axit amin được cắt thành 3 protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc.

Protein Số lượng axit amin Trọng lượng phân tử (kDa) Vai trò chức năng chính
Capsid (C) 100 12 Bao bọc RNA tạo nucleocapsid, tương tác màng
Màng (M/prM) 75 / 166 8,2–8,5 / 26 Định hình, thúc đẩy sự trưởng thành của hạt vi rút
Vỏ (E) 495 ~50 Gắn kết thụ thể tế bào chủ, hòa màng xâm nhập
NS1 350–352 45–55 Tham gia sao chép RNA, bài tiết dạng hexamer gây thoát mạch
NS2A / NS2B 218–231 / – 22 / 14 Lắp ráp vi rút, liên kết màng, cofactor của protease NS3
NS3 618 Serine protease, RNA helicase, RTPase/NTPase
NS4A / NS4B 127 / 248 16 / 27 Biến đổi màng tế bào chủ, hỗ trợ sao chép RNA
NS5 900 104 Methyltransferase (đầu N) và RNA polymerase (đầu C)

Chương này cũng phân tích chi tiết quy trình 4 bước sản xuất protein tái tổ hợp (nhân bản gen, biến nạp vector, biểu hiện trong tế bào chủ, tinh sạch) và cơ chế các xét nghiệm chẩn đoán DENV (MAC-ELISA, Indirect ELISA, NS1-ELISA, Realtime RT-PCR).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết các bước triển khai của hai nhánh nghiên cứu:

  • Nhánh nghiên cứu lâm sàng: Áp dụng các tiêu chuẩn phân loại bệnh nhân theo hướng dẫn số 3705/QĐ-BYT. Trình bày chi tiết các biến số nghiên cứu gồm tuổi, giới tính, nghề nghiệp, số ngày mắc bệnh trước khi vào viện, tiền sử bệnh lý, các dấu hiệu lâm sàng (sốt, đau đầu, đau hốc mắt, đau cơ, phát ban, dạng xuất huyết), các chỉ số cận lâm sàng (tiểu cầu, hematocrit, bạch cầu, men gan, đông máu, siêu âm dịch màng phổi, màng bụng) và các biện pháp kiểm soát sai số, đạo đức nghiên cứu.
  • Nhánh công nghệ sinh học: Trình bày quy trình thiết kế đoạn gen mang các epitop nhận biết 4 týp DENV1-4; quy trình tạo dòng trên pJET và pET22b(+); biến nạp vào E. coli BL21; các bước giải trình tự Sanger kiểm tra dòng; các thực nghiệm tối ưu hóa nồng độ IPTG, nhiệt độ, thời gian biểu hiện; kỹ thuật Western blot và kỹ thuật ELISA gián tiếp xác định kháng thể.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các phát hiện thực nghiệm và số liệu thống kê thu được từ hai nội dung chính:

  1. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng tại BVQY 103 và BVQY 175 (năm 2022):

    • Thống kê các nhóm tuổi, tỷ lệ giới tính và nghề nghiệp của người bệnh mắc SXHD.
    • Thống kê các triệu chứng cơ năng: sốt cao liên tục, nhức đầu, đau hốc mắt, đau cơ khớp; triệu chứng thực thể: xung huyết da, phát ban, các dạng xuất huyết dưới da (dạng chấm, nốt, mảng bầm tím), xuất huyết niêm mạc (chảy máu chân răng, chảy máu mũi, xuất huyết tiêu hóa, xuất huyết âm đạo).
    • Biến đổi cận lâm sàng: Tỷ lệ giảm tiểu cầu (< 100 G/L và < 50 G/L), tăng Hematocrit (> 20%), giảm bạch cầu; tăng enzym gan (AST thường tăng cao hơn ALT), kéo dài thời gian đông máu APTT, giảm tỷ lệ prothrombin, giảm fibrinogen; hình ảnh siêu âm dày thành túi mật, tràn dịch màng bụng, tràn dịch màng phổi theo nhóm tuổi và giới tính.
    • Phân tích các mối liên quan: Mối liên quan giữa mức độ bệnh (SXHD, SXHD có dấu hiệu cảnh báo, SXHD nặng) với nhóm tuổi, giới tính, số ngày mắc bệnh trước khi nhập viện, tiền sử bệnh, cùng sự thay đổi của các chỉ số huyết học (tiểu cầu, HCT, hemoglobin, hồng cầu, bạch cầu).
  2. Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể:

    • Kết quả mô phỏng cấu trúc đoạn peptit 112–260 trên protein NS1 và kết quả docking phân tử cho thấy liên kết ổn định với các kháng thể đặc hiệu 1G5 và 2B.
    • Sàng lọc tế bào E. coli BL21 sau biến nạp và xác nhận đúng trình tự gen mục tiêu qua kết quả giải trình tự Sanger (khuẩn lạc số 2).
    • Kết quả tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: xác định được nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng tối ưu cho sự biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp.
    • Kết quả phản ứng Western blot: Kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp phản ứng đặc hiệu với cả kháng thể kháng NS1 thương mại và kháng thể đơn dòng NS1 gộp 4 tự sản xuất.
    • Kết quả xét nghiệm ELISA gián tiếp: Xây dựng đường chuẩn Bradford xác định nồng độ protein; thiết lập giá trị ngưỡng cut-off = 0,353; phân tích đường cong ROC khẳng định độ tin cậy của kháng nguyên rAgNS1-DENV1-4 trong phát hiện kháng thể kháng DENV với độ nhạy và độ đặc hiệu cụ thể.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 phân tích, so sánh các kết quả nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng với các báo cáo trong và ngoài nước; thảo luận về giá trị của các dấu hiệu cảnh báo, biến đổi huyết học và chức năng gan trong phân loại và tiên lượng bệnh. Đồng thời, tác giả biện giải tính khả thi của thiết kế kháng nguyên tái tổ hợp mang các epitop gộp 4 týp, sự tương thích khi biểu hiện trong hệ thống E. coli, cũng như tiềm năng ứng dụng của kỹ thuật ELISA sử dụng rAgNS1-DENV1-4 trong chẩn đoán huyết thanh học sốt xuất huyết Dengue.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt học thuật và lý luận

  • Cung cấp dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng cập nhật của người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị nội trú tại hai trung tâm y tế lớn đại diện cho miền Bắc (BVQY 103) và miền Nam (BVQY 175) trong năm 2022.
  • Làm rõ mối liên quan giữa mức độ nặng của bệnh với các yếu tố dịch tễ, thời gian khởi phát bệnh trước khi nhập viện và sự biến đổi của các thông số huyết học (tiểu cầu, hematocrit, bạch cầu).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và công nghệ

  • Thiết kế thành công kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp (rAgNS1-DENV1-4) mang các epitop nhận diện đặc hiệu cho cả 4 týp huyết thanh DENV1, DENV2, DENV3 và DENV4 dựa trên phân tích mô phỏng cấu trúc và docking phân tử.
  • Xây dựng thành công quy trình công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp rNS1 trên tế bào chủ vi khuẩn E. coli BL21 sử dụng vector pET22b(+), tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, nồng độ IPTG, thời gian biểu hiện).
  • Phát triển và tối ưu hóa kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên rAgNS1-DENV1-4 với giá trị cut-off xác định (0,353), chứng minh khả năng phát hiện kháng thể kháng DENV với độ nhạy và độ đặc hiệu cao qua phân tích đường cong ROC.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu lâm sàng được thu thập trên nhóm người bệnh điều trị nội trú tại hai bệnh viện quân y tuyến cuối (BVQY 103 và BVQY 175) trong năm 2022, chưa bao phủ toàn bộ các tuyến y tế cơ sở hoặc các nhóm bệnh nhân ngoại trú thể nhẹ trong cộng đồng.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục mở rộng quy mô thử nghiệm bộ sinh phẩm ELISA sử dụng kháng nguyên rAgNS1-DENV1-4 trên các quần thể mẫu bệnh phẩm lớn và đa dạng hơn; nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp gộp 4 týp này để phát triển các dạng que thử chẩn đoán nhanh tại điểm chăm sóc (Point-of-Care Testing).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

  • Bác sĩ truyền nhiễm và hồi sức cấp cứu: Nắm bắt các đặc điểm lâm sàng, sự biến thiên của tiểu cầu, hematocrit và các chỉ số đông máu để phân loại, theo dõi các dấu hiệu cảnh báo và xử trí kịp thời các ca bệnh SXHD nặng.
  • Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học y dược: Tham khảo thiết kế phân tử epitop gộp, quy trình tách dòng trên vector pJET/pET22b(+), biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli BL21 và tối ưu hóa các thông số kỹ thuật phản ứng ELISA.
  • Học viên sau đại học chuyên ngành Bệnh truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới, Vi sinh vật học: Sử dụng làm tài liệu học tập về phương pháp kết hợp nghiên cứu lâm sàng với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.

Câu hỏi thường gặp

1. Mục tiêu chính của luận án là gì? Luận án thực hiện hai mục tiêu: (1) Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022; (2) Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA.

2. Tại sao protein NS1 lại được chọn làm đối tượng nghiên cứu để chế tạo kháng nguyên chẩn đoán? NS1 là protein phi cấu trúc duy nhất của vi rút Dengue được bài tiết vào máu người bệnh trong giai đoạn cấp tính của nhiễm trùng (thường trước khi xuất hiện triệu chứng rõ rệt). Ngoài ra, NS1 có tính sinh miễn dịch cao, có thể phát hiện bằng các kháng thể đặc hiệu với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đóng vai trò như chỉ thị phân tử protein quan trọng trong chẩn đoán.

3. Kháng nguyên tái tổ hợp được biểu hiện trên hệ thống sinh học nào và kiểm tra trình tự bằng cách nào? Kháng nguyên rNS1 gộp 4 týp được biểu hiện trên tế bào vi khuẩn Escherichia coli BL21 sử dụng vector pET22b(+) sau khi tạo dòng trung gian trên vector pJET. Dòng tái tổ hợp được xác nhận độ chính xác của trình tự gen bằng phương pháp giải trình tự Sanger (khuẩn lạc số 2).

4. Giá trị ngưỡng cắt (cut-off) và công cụ đánh giá độ tin cậy của xét nghiệm ELISA trong luận án là gì? Xét nghiệm ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên rAgNS1-DENV1-4 xác định giá trị ngưỡng cắt cut-off = 0,353. Độ tin cậy, độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm được đánh giá và chuẩn hóa thông qua phân tích đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Hoàng Xuân Cường đã tổng hợp toàn diện các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của người bệnh sốt xuất huyết Dengue tại hai bệnh viện quân y đại diện cho hai miền Nam - Bắc trong vụ dịch năm 2022. Đồng thời, nghiên cứu đã thiết kế và biểu hiện thành công kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp (DENV1-4) trên tế bào chủ E. coli BL21. Kết quả thực nghiệm ELISA gián tiếp sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp rAgNS1-DENV1-4 với ngưỡng cut-off 0,353 đã khẳng định hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue, cung cấp cơ sở khoa học và công nghệ cho việc phát triển các sinh phẩm chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue trong nước.