Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ y học với đề tài "Khảo sát quần thể tế bào lympho TCD4 Treg và Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Lê Thị Thuý Hằng, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Thị Lệ Hoa, bảo vệ tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào năm 2023, thuộc chuyên ngành Bệnh truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới (Mã số: 9720109).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Nhiễm vi rút viêm gan B (HBV) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên phạm vi toàn cầu do các biến chứng của bệnh gan giai đoạn cuối như xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Dữ liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2019 ghi nhận khoảng 296 triệu người nhiễm HBV mạn tính, 1,5 triệu ca nhiễm mới và 820.000 ca tử vong mỗi năm. Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành dịch tễ cao của HBV với tỉ lệ HBsAg dương tính ở người trưởng thành ước tính khoảng 10,5% (qua phân tích gộp 72 nghiên cứu giai đoạn 1999–2021). Phương thức lây truyền chu sinh từ mẹ sang con khiến 95% trẻ nhiễm mang vi rút suốt đời.

Cơ chế bệnh sinh của nhiễm HBV mạn tính được xác định là quá trình tương tác phức tạp giữa vi rút và đáp ứng miễn dịch của cơ thể ký chủ. Trong đáp ứng miễn dịch tế bào, hai quần thể tế bào lympho T biệt hóa từ T CD4+ đóng vai trò đối kháng chức năng gồm: tế bào T điều hòa (Treg) có vai trò ức chế miễn dịch và tế bào T trợ giúp 17 (Th17) kích thích phản ứng viêm gây tổn thương mô. Sự cân bằng giữa hai quần thể tế bào này cùng các yếu tố phiên mã đặc hiệu (FOXP3 đối với Treg và RORγt đối với Th17) diễn ra xuyên suốt quá trình bệnh lý. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trên thế giới trước đây đưa ra những kết quả chưa đồng nhất về biến thiên số lượng tế bào Treg, Th17, sự hiện diện của quần thể kép Treg tiết IL-17A cũng như mức độ biểu hiện của các yếu tố phiên mã FOXP3, RORγt ở các giai đoạn bệnh khác nhau, đặc biệt là trong các đợt bùng phát viêm gan. Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào khảo sát toàn diện và đồng thời các chỉ số này trên các nhóm đối tượng nhiễm HBV mạn.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định mục tiêu tổng quát là phân tích đặc điểm quần thể tế bào lympho Treg, Th17 và yếu tố phiên mã FOXP3, RORγt trong máu ngoại vi của bệnh nhân ở các giai đoạn khác nhau của nhiễm HBV mạn. Mục tiêu chuyên biệt được đánh số cụ thể như sau:

  1. Xác định tỉ lệ tế bào Treg, Th17 và tỉ số Treg/Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn thuộc các nhóm: nhiễm HBV mạn HBeAg dương, viêm gan B mạn HBeAg dương và viêm gan B mạn đợt bùng phát.
  2. Đánh giá mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt và tỉ số FOXP3/RORγt ở các nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn.
  3. Phân tích mối tương quan giữa tỉ lệ Treg, Th17 và mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt với tình trạng HBeAg, HBV DNA, men gan và chức năng gan ở các nhóm nhiễm HBV mạn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa qua điều trị bằng các thuốc tương tự nucleos(t)ide (NAs) và nhóm người khỏe mạnh đối chứng.
  • Không gian nghiên cứu: Bệnh nhân theo dõi ngoại trú tại phòng khám viêm gan Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và bệnh nhân điều trị nội trú tại Khoa Nhiễm A Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh.
  • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2018 đến tháng 03/2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã tổng quan các cột mốc thay đổi nhận thức bệnh sinh và các nghiên cứu miễn dịch học liên quan đến nhiễm HBV:

  • Tiến trình quan niệm diễn tiến tự nhiên của HBV: Năm 1981, bệnh được chia thành 2 giai đoạn (viêm gan hoạt động và người lành mang trùng). Đến năm 2005, tiến trình diễn tiến được mô tả qua 4 giai đoạn dựa trên đáp ứng miễn dịch (dung nạp miễn dịch, thải trừ miễn dịch, kiểm soát miễn dịch, trốn thoát miễn dịch). Đến năm 2017, các hướng dẫn quốc tế đã thay thế khái niệm "dung nạp miễn dịch" bằng "nhiễm HBV mạn HBeAg dương" vì bằng chứng cho thấy tế bào T đặc hiệu vẫn hiện diện và có chức năng, đồng thời nguy cơ lồng ghép DNA của vi rút vào bộ gen người cùng sự tăng sinh tạo dòng tế bào gan đã diễn ra ngay từ giai đoạn này.
  • Nghiên cứu về phân bố tế bào Treg và Th17:
    • Xue và cộng sự (2012): Khảo sát 4 nhóm bệnh nhân ghi nhận số lượng Th17 tăng và tỉ số Treg/Th17 giảm rõ rệt ở nhóm viêm gan B mạn có suy gan cấp trên nền mạn (ACLF) so với nhóm nhiễm HBV mạn HBeAg dương, viêm gan B mạn và người khỏe mạnh; số lượng Treg có xu hướng giảm ở nhóm ACLF nhưng không có ý nghĩa thống kê.
    • Liu và cộng sự (2017): Ghi nhận nhóm viêm gan B mạn nặng có tỉ lệ Treg thấp hơn và Th17 cao hơn có ý nghĩa so với nhóm nhiễm HBV mạn thông thường, dẫn đến tỉ số Treg/Th17 giảm.
    • Niu và cộng sự (2021): Khảo sát trên cỡ mẫu lớn hơn (≥ 50 ca ACLF và 29 ca viêm gan mạn) cho thấy cả Treg và Th17 đều tăng có ý nghĩa ở nhóm ACLF, tỉ số Treg/Th17 không có sự khác biệt giữa hai nhóm; đồng thời bệnh nhân ACLF tử vong có mật độ Treg và Th17 cao hơn nhóm sống sót sau 8 tuần.
  • Nghiên cứu về tiểu quần thể Treg tiết IL-17A: Jung (2017) và Zhang (2013) phát hiện tiểu quần thể T CD4+ mang đặc tính kép (vừa biểu hiện FOXP3 vừa tiết IL-17A) gia tăng rõ rệt ở bệnh nhân bùng phát viêm gan có suy gan cấp và tương quan thuận với mức độ tổn thương gan.
  • Nghiên cứu về các yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt: Liu và cộng sự (2017) ghi nhận tương quan giữa RORγt và Th17 nhưng không tìm thấy tương quan giữa FOXP3 và Treg; Xia và cộng sự (2018) lại ghi nhận cả FOXP3 và RORγt đều cao ở nhóm nhiễm HBV mạn men gan bình thường so với nhóm viêm gan nặng và nhẹ.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Các công trình quốc tế còn nhiều điểm bất đồng về chiều hướng biến đổi của tế bào Treg, tỉ số Treg/Th17 và mức độ biểu hiện gen phiên mã FOXP3 ở các mức độ tổn thương gan khác nhau. Tại Việt Nam, chưa có dữ liệu đánh giá đầy đủ trên các tầng bệnh nhân mang các trạng thái lâm sàng khác nhau (người khỏe mạnh, nhiễm HBV mạn HBeAg dương men gan bình thường, viêm gan B mạn HBeAg dương và viêm gan B mạn đợt bùng phát). Luận án định vị việc giải quyết khoảng trống này bằng cách xác lập dữ liệu định lượng đồng thời về số lượng tế bào, tỉ lệ tế bào, chức năng tiết cytokine và mức độ biểu hiện mRNA của hai yếu tố phiên mã trên quần thể bệnh nhân Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Quá trình biệt hóa tế bào T: Tế bào T CD4+ sơ khai dưới tác động của các môi trường cytokine và yếu tố vi mô sẽ biệt hóa thành các dòng tế bào chuyên biệt:
    • Dưới tác động của TGF-β, tín hiệu STAT5 hoạt hóa yếu tố phiên mã FOXP3, định hướng biệt hóa thành tế bào Treg có chức năng ức chế miễn dịch qua 4 cơ chế: tiếp xúc tế bào (CTLA4, LAG3), tiết cytokine ức chế (IL-10, TGF-β), cạnh tranh yếu tố tăng trưởng và ly giải tế bào bằng Granzyme B (GzB) cùng Perforin (PRF).
    • Dưới tác động đồng thời của TGF-β và IL-6 (hoặc IL-23, IL-1β, TNF), FOXP3 bị ức chế và yếu tố phiên mã RORγt được kích hoạt qua trục STAT3, định hướng biệt hóa thành Th17, sản xuất các cytokine gây viêm nhóm IL-17 (từ IL-17A đến IL-17F) nhằm chiêu mộ bạch cầu trung tính gây viêm và hoại tử mô.
  • Tính mềm dẻo của tế bào: Sự tồn tại của quần thể tế bào T mang đồng thời dấu ấn FOXP3 và khả năng tiết IL-17A phản ánh tính linh hoạt chức năng trong các tình trạng viêm mạn tính và bùng phát cấp tính.
       (TGF-β + STAT5)                  (TGF-β + IL-6 / STAT3)
        Ức chế miễn dịch                 Kích hoạt viêm mô
   (IL-10, TGF-β, CTLA4, GzB)           (IL-17A, IL-17F, IL-22)

Phương pháp nghiên cứu

  • Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả hàng loạt ca thực hiện trên nhiều tầng dân số.
  • Tiêu chuẩn chọn bệnh:
    • HBsAg dương tính > 6 tháng; HBV DNA dương tính (ngưỡng phát hiện 250 copies/mL).
    • HBeAg dương tính (riêng nhóm bùng phát có thể có HBeAg âm tính).
    • Chưa từng điều trị bằng các thuốc kháng vi rút nhóm tương tự nucleos(t)ide (NAs).
    • Tự nguyện ký phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu.
  • Tiêu chuẩn loại trừ: Đồng nhiễm HCV, HIV; có bệnh gan kết hợp (rượu, thoái hóa mỡ, tự miễn, chuyển hóa, do thuốc); nhiễm trùng cấp tính hoặc lao tiến triển; bệnh ác tính; tiền sử bệnh lý dị ứng (hen, chàm, viêm mũi dị ứng); phụ nữ mang thai.
  • Phân chia các nhóm nghiên cứu:
    1. Nhóm khỏe mạnh (KM): Không nhiễm HBV, ALT < 40 U/L, không bệnh mạn tính.
    2. Nhóm nhiễm HBV mạn HBeAg dương (HBVe+): ALT ≤ ULN (40 U/L) liên tục > 6 tháng, HBV DNA > 6 log copies/mL, gan bình thường trên siêu âm hoặc chỉ số APRI < 0,5.
    3. Nhóm viêm gan B mạn HBeAg dương (VGMe+): HBV DNA > 5 log copies/mL, ALT từ > 1 đến 5 ULN kéo dài hoặc lặp lại ≥ 2 lần trong 6 tháng.
    4. Nhóm viêm gan B mạn đợt bùng phát (BP): HBeAg dương hoặc âm, ALT > 5 ULN, HBV DNA > 5 log copies/mL (nếu HBeAg dương) hoặc > 4 log copies/mL (nếu HBeAg âm). Nhóm này được chia nhỏ thành các phân nhóm bùng phát nhẹ, nặng; HBeAg dương, âm; và theo nhóm tuổi (≤ 40 và > 40 tuổi).

Kỹ thuật thu thập và phân tích dữ liệu

  • Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry): Phân tích các thông số huỳnh quang từ mẫu máu toàn phần chống đông EDTA trong vòng 4 giờ sau khi lấy mẫu để xác định tỉ lệ tế bào T CD4+, Treg (CD4+ CD25+ FOXP3+), Th17 (CD4+ IL-17A+) và tiểu quần thể Treg tiết IL-17A.
  • Kỹ thuật Real-time RT-PCR (RT-qPCR):
    • Chiết tách tổng số RNA và tổng hợp cDNA với nồng độ chuẩn hóa 25 ng RNA/1 phản ứng.
    • Sử dụng mồi đặc hiệu cho gen FOXP3, RORγt và gen chứng nội sinh GAPDH.
    • Đo chu trình ngưỡng ($C_T$) và phân tích mức độ biểu hiện tương đối qua công thức $2^{-\Delta\Delta C_T}$ của Livak.
  • Phân tích thống kê: Xử lý dữ liệu định lượng, kiểm định phi tham số so sánh trung vị và khoảng tứ phân vị (IQR); phân tích tương quan đơn biến và mô hình hồi quy đa biến (tính hệ số hồi quy chưa chuẩn hóa $B$, hệ số chuẩn hóa $\beta$, sai số chuẩn $SE$, khoảng tin cậy $KTC$, và hệ số phóng đại phương sai $VIF$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa các kiến thức cơ bản và chuyên sâu về cấu trúc sinh học của HBV, gồm 4 vùng đọc mã mở (C, P, S, X) mã hóa các protein cấu trúc và chức năng (HBcAg, HBeAg, HBsAg, HBx, men sao chép ngược HBV Pol/RT). Chu trình nhân đôi của vi rút từ dạng DNA vòng duỗi (rcDNA) chuyển thành DNA vòng đóng đồng hóa trị (cccDNA) trong nhân tế bào gan đóng vai trò làm khuôn dịch mã bền vững.

Chương này trình bày 5 giai đoạn diễn tiến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính theo quan điểm miễn dịch cập nhật năm 2017:

  1. Giai đoạn nhiễm HBV mạn HBeAg dương (trước đây gọi là dung nạp miễn dịch).
  2. Giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg dương (thải trừ miễn dịch).
  3. Giai đoạn nhiễm HBV mạn HBeAg âm (kiểm soát miễn dịch).
  4. Giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg âm (trốn thoát miễn dịch).
  5. Giai đoạn khỏi bệnh.

Chương 1 cũng phân tích chi tiết cơ chế của hệ miễn dịch bẩm sinh (cảm biến TLR, RIG-I, cGAS; tế bào NK, tế bào Kupffer, bạch cầu đơn nhân) và miễn dịch thích nghi (vai trò tạo kháng thể và điều hòa của tế bào B; vai trò ly giải và tiết cytokine của lympho T CD8+ và T CD4+). Đồng thời, chương này tổng kết cấu trúc sinh học, các con đường truyền tín hiệu biệt hóa và cơ chế hoạt động của tế bào Treg, Th17, các yếu tố phiên mã FOXP3, RORγt, nguyên lý hoạt động của máy đếm tế bào dòng chảy và kỹ thuật RT-qPCR theo phương pháp $2^{-\Delta\Delta C_T}$.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết phương pháp luận của đề tài:

  • Thiết kế: Nghiên cứu tiến cứu mô tả hàng loạt ca trên các tầng mẫu độc lập.
  • Cỡ mẫu và phân bổ: Tổng cộng 159 đối tượng được đưa vào nghiên cứu chính để đếm tế bào dòng chảy (bao gồm 61 bệnh nhân thuộc nhóm đợt bùng phát). Trong đó, phân nhóm 80 đối tượng (gồm 30 ca đợt bùng phát) được thực hiện kỹ thuật sinh học phân tử RT-qPCR để định lượng biểu hiện gen FOXP3 và RORγt.
  • Quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm:
    • Bảng 2.1 - 2.2: Quy định lượng RNA chuẩn 25 ng/phản ứng và chu trình nhiệt tổng hợp cDNA.
    • Bảng 2.3 - 2.5: Chi tiết trình tự các đoạn mồi xuôi, mồi ngược dùng cho phản ứng qPCR đo mức độ biểu hiện gen FOXP3, RORγt, GAPDH, thành phần hỗn dịch phản ứng và chu trình luân nhiệt.
  • Thu thập biến số: Ghi nhận đầy đủ các biến số nền (tuổi, giới tính), dấu ấn vi rút (HBeAg, HBV DNA), men gan (AST, ALT), chỉ số chức năng gan (Bilirubin, Albumin, INR) và chỉ số APRI.
  • Đạo đức nghiên cứu: Đề tài được thông qua hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học, bảo đảm tính tự nguyện, bảo mật thông tin và quyền lợi của người tham gia.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thông qua hệ thống bảng biểu và sơ đồ:

  • Đặc điểm dân số nghiên cứu (Bảng 3.1, Bảng 3.2): Phân tích các thông số lâm sàng và cận lâm sàng lúc vào nghiên cứu của 159 đối tượng và 61 bệnh nhân trong nhóm bùng phát.
  • Đặc điểm tế bào Treg, Th17 và Treg tiết IL-17A (Bảng 3.3, 3.4, 3.5; Biểu đồ 3.1 - 3.4, 3.9 - 3.12):
    • Xác định tỉ lệ tế bào Treg, Th17 và tỉ số Treg/Th17 giữa nhóm người khỏe mạnh và nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn ($n = 159$).
    • Phân tích sự khác biệt giữa 4 nhóm chính (KM, HBVe+, VGMe+, BP) và so sánh giữa 2 phân nhóm bùng phát nhẹ và bùng phát nặng ($n = 61$).
    • Đánh giá tỉ lệ tiểu quần thể Treg tiết IL-17A ở các nhóm bệnh nhân, so sánh giữa phân nhóm bùng phát HBeAg dương và HBeAg âm, cũng như giữa hai nhóm tuổi ($\le 40$ và $> 40$).
  • Mức độ biểu hiện yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt (Bảng 3.6, 3.7, 3.8; Biểu đồ 3.5 - 3.8, 3.13 - 3.16):
    • Định lượng mức biểu hiện tương đối của mRNA FOXP3, RORγt và tỉ số FOXP3/RORγt trên 80 đối tượng nghiên cứu.
    • So sánh mức độ biểu hiện gen giữa nhóm người khỏe mạnh và nhóm nhiễm HBV mạn, giữa các nhóm nghiên cứu riêng biệt và giữa hai phân nhóm bùng phát nhẹ vs nặng ($n = 30$).
  • Phân tích tương quan và hồi quy (Bảng 3.9 - 3.15):
    • Phân tích tương quan giữa các chỉ số tế bào (Treg, Th17), yếu tố phiên mã (FOXP3, RORγt) với nồng độ HBV DNA, men gan (AST, ALT), Bilirubin, INR và Albumin trên toàn bộ dân số và trên từng phân nhóm bệnh lý.
    • Phân tích hồi quy đa biến xác định các yếu tố độc lập có mối tương quan với tỉ lệ tế bào Treg và Th17 trên toàn dân số ($n = 137$) và trong riêng nhóm đợt bùng phát ($n = 61$).
Nhóm biến số phân tích Đối tượng khảo sát Chỉ số đo lường chính Phương pháp xét nghiệm
Quần thể tế bào lympho T Toàn bộ các nhóm ($n = 159$) Tỉ lệ Treg, Th17, Treg tiết IL-17A, tỉ số Treg/Th17 Đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry)
Yếu tố phiên mã Phân nhóm khảo sát ($n = 80$) Biểu hiện mRNA FOXP3, RORγt, tỉ số FOXP3/RORγt Real-time RT-PCR ($2^{-\Delta\Delta C_T}$)
Dấu ấn vi rút & sinh hóa Toàn bộ bệnh nhân HBV DNA, HBeAg, ALT, AST, Bilirubin, INR, Albumin Xét nghiệm miễn dịch, sinh hóa tự động, PCR
Mô hình đa biến Dân số chung ($n = 137$) & nhóm bùng phát ($n = 61$) Hệ số hồi quy $B$, $\beta$, $SE$, giá trị $p$, hệ số $VIF$ Hồi quy tuyến tính đa biến

Chương 4. BÀN LUẬN

Chương 4 tập trung biện luận và đối chiếu các phát hiện nghiên cứu với các tài liệu khoa học trong và ngoài nước:

  • Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng: Biện luận về phân bố tuổi, giới tính và các chỉ số men gan, tải lượng vi rút ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tại Việt Nam.
  • Biến thiên của tế bào Treg và Th17: Phân tích sự chuyển dịch cán cân miễn dịch từ trạng thái cân bằng sang trạng thái kích hoạt viêm mạnh mẽ trong các đợt bùng phát; làm rõ vai trò ức chế của Treg và vai trò phá hủy tế bào gan của Th17.
  • Ý nghĩa của tiểu quần thể Treg tiết IL-17A: Bàn luận về sự hiện diện của quần thể tế bào mang tính chất kép này, lý giải mối liên hệ giữa tỉ lệ tế bào Treg tiết IL-17A với mức độ hoại tử tế bào gan trong đợt bùng phát.
  • Biểu hiện của các yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt: Phân tích mức độ tương thích giữa số lượng tế bào đo bằng dòng chảy và mức độ biểu hiện gen đo bằng RT-qPCR; giải thích nguyên nhân dẫn đến sự tương đồng hay dị biệt giữa kết quả nghiên cứu với các công bố trước đây của Xue, Liu, Niu, và Xia.
  • Tương quan giữa miễn dịch tế bào với tổn thương gan và vi rút: Làm rõ mối liên quan giữa tải lượng HBV DNA, nồng độ HBeAg, sự gia tăng ALT/AST và suy giảm chức năng gan với sự biến đổi của hệ thống tế bào miễn dịch điều hòa và tiền viêm.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

  • Dữ liệu miễn dịch tế bào trên người Việt Nam: Luận án cung cấp bộ số liệu định lượng đầy đủ về tỉ lệ tế bào Treg, Th17, tỉ số Treg/Th17 và tiểu quần thể Treg tiết IL-17A trên các nhóm đối tượng nhiễm HBV mạn tính ở các giai đoạn lâm sàng khác nhau tại Việt Nam.
  • Làm sáng tỏ động học tế bào trong đợt bùng phát: Công trình xác định rõ sự thay đổi của quần thể tế bào Treg và Th17 ở nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn đợt bùng phát (phân chia theo mức độ nặng/nhẹ, tình trạng HBeAg và nhóm tuổi), chứng minh vai trò tham gia trực tiếp của phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Th17 và tiểu quần thể Treg tiết IL-17A vào cơ chế gây tổn thương tế bào gan cấp tính.
  • Đánh giá giá trị của kỹ thuật sinh học phân tử RT-qPCR: Luận án đã ứng dụng thành công kỹ thuật RT-qPCR để lượng hóa mức độ biểu hiện mRNA của hai yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt theo phương pháp $2^{-\Delta\Delta C_T}$, mở ra khả năng sử dụng các chỉ dấu phiên mã này trong việc hỗ trợ đánh giá hoạt tính miễn dịch của tế bào thay cho kỹ thuật đếm dòng chảy đòi hỏi điều kiện xử lý mẫu tươi phức tạp.
  • Mối tương quan đa biến: Xác lập mô hình tương quan giữa các thông số miễn dịch tế bào với tải lượng vi rút HBV DNA, tình trạng kháng nguyên HBeAg và mức độ hoại tử tế bào gan (ALT, AST, Bilirubin, INR).

Kiến nghị rút ra từ nghiên cứu

  • Kiến nghị ứng dụng việc theo dõi tỉ số Treg/Th17 và mức độ biểu hiện gen phiên mã RORγt, FOXP3 như những dấu ấn sinh học bổ trợ nhằm tiên lượng mức độ nặng của đợt bùng phát viêm gan B mạn tính.
  • Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa quy trình xét nghiệm RT-qPCR đo yếu tố phiên mã để ứng dụng trong nghiên cứu miễn dịch học lâm sàng tại các cơ sở y tế.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Các đánh giá về tế bào Treg, Th17 và biểu hiện gen phiên mã chỉ mới được thực hiện trên mẫu máu ngoại vi (PBMC), chưa thể đối chiếu trực tiếp với mật độ thâm nhiễm tế bào lympho T tại mô học gan do hạn chế về chỉ định sinh thiết gan ở bệnh nhân đang trong đợt viêm gan bùng phát hoặc có rối loạn đông máu.
  • Cỡ mẫu thực hiện xét nghiệm sinh học phân tử RT-qPCR đo yếu tố phiên mã ($n = 80$) và phân nhóm đợt bùng phát ($n = 30$) còn ở mức độ vừa phải do giới hạn về nguồn lực xét nghiệm.
  • Thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả chưa theo dõi dọc được biến động của các quần thể tế bào miễn dịch này sau khi bệnh nhân được can thiệp điều trị bằng các thuốc kháng vi rút NAs.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Thiết kế các nghiên cứu đoàn hệ theo dõi dọc (longitudinal studies) để đánh giá sự phục hồi chức năng của tế bào T, sự thay đổi của tỉ số Treg/Th17 và biểu hiện FOXP3, RORγt trước, trong và sau liệu trình điều trị thuốc kháng vi rút kéo dài.
  • Mở rộng nghiên cứu cơ chế và chức năng sinh học chi tiết của tiểu quần thể Treg tiết IL-17A trong mối liên quan với xơ hóa gan tiến triển và nguy cơ sinh ung thư biểu mô tế bào gan.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo đối với nhiều đối tượng trong ngành y tế:

  • Bác sĩ chuyên khoa Truyền nhiễm và Tiêu hóa - Gan mật: Cung cấp góc nhìn miễn dịch học chuyên sâu để giải thích các hiện tượng lâm sàng phức tạp trong đợt cấp/đợt bùng phát viêm gan B mạn tính, hỗ trợ đánh giá mức độ tổn thương gan trên bệnh nhân.
  • Nhà nghiên cứu miễn dịch học và sinh học phân tử: Tham khảo quy trình kỹ thuật chuẩn hóa về nhuộm huỳnh quang đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry) đối với các quần thể tế bào nội bào (FOXP3, IL-17A) và quy trình Real-time RT-PCR định lượng mRNA của các yếu tố phiên mã với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt chuẩn.
  • Học viên sau đại học, bác sĩ nội trú và nghiên cứu sinh: Cung cấp tài liệu tham khảo về phương pháp luận nghiên cứu đa tầng, kỹ thuật xử lý số liệu thống kê y học (kiểm định phi tham số, phân tích hồi quy đa biến và kiểm soát đa cộng tuyến $VIF$).

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án khảo sát các nhóm đối tượng bệnh nhân nào?

Nghiên cứu khảo sát trên 4 nhóm đối tượng chính gồm:

  • Nhóm người khỏe mạnh đối chứng (KM).
  • Nhóm nhiễm HBV mạn HBeAg dương (HBVe+) có men gan bình thường.
  • Nhóm viêm gan B mạn HBeAg dương (VGMe+) có tăng men gan từ 1 đến 5 lần giới hạn trên bình thường.
  • Nhóm viêm gan B mạn đợt bùng phát (BP) có men gan tăng trên 5 lần giới hạn trên bình thường (được phân nhóm thành bùng phát nhẹ, nặng; HBeAg dương, HBeAg âm; và theo nhóm tuổi).

2. Các phương pháp xét nghiệm chính được sử dụng trong luận án là gì?

Luận án sử dụng hai kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch và sinh học phân tử:

  • Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry) để xác định tỉ lệ tế bào Treg ($CD4^+CD25^+FOXP3^+$), Th17 ($CD4^+IL\text{-}17A^+$) và tế bào Treg tiết IL-17A.
  • Kỹ thuật Real-time RT-PCR (RT-qPCR) sử dụng phương pháp so sánh $2^{-\Delta\Delta C_T}$ để đo lường mức độ biểu hiện mRNA của yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt chuẩn hóa theo gen chứng nội sinh GAPDH.

3. Khái niệm "dung nạp miễn dịch" đã được thay đổi như thế nào trong luận án?

Theo quan điểm cập nhật năm 2017 được luận án trình bày, thuật ngữ "giai đoạn dung nạp miễn dịch" được thay thế bằng "giai đoạn nhiễm HBV mạn HBeAg dương". Lý do là vì ở giai đoạn này, hệ miễn dịch của ký chủ không hoàn toàn trơ ỳ mà vẫn có sự hiện diện của các tế bào lympho T chuyên biệt với HBV có khả năng phản ứng khi được kích thích, đồng thời các biến đổi như lồng ghép HBV DNA vào bộ gen người và tăng sinh tế bào gan tạo dòng đã bắt đầu diễn ra.

4. Quần thể tế bào Treg tiết IL-17A có đặc điểm gì đáng chú ý?

Đây là một tiểu quần thể tế bào lympho T CD4+ mang đặc tính kép, vừa biểu hiện yếu tố phiên mã FOXP3 (đặc trưng của Treg) vừa có khả năng tiết cytokine tiền viêm IL-17A (đặc trưng của Th17). Quần thể này thể hiện tính mềm dẻo của hệ miễn dịch và gia tăng rõ rệt ở những bệnh nhân viêm gan B đợt bùng phát có tổn thương tế bào gan nặng.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thị Thuý Hằng là công trình nghiên cứu chuyên sâu về miễn dịch học lâm sàng trên bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính tại Việt Nam. Thông qua việc kết hợp kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy và sinh học phân tử RT-qPCR, công trình đã định lượng và làm sáng tỏ sự biến đổi của quần thể tế bào Treg, Th17, tiểu quần thể Treg tiết IL-17A cùng hai yếu tố phiên mã tương ứng FOXP3 và RORγt qua các giai đoạn bệnh lý khác nhau. Kết quả nghiên cứu khẳng định mối liên quan giữa sự mất cân bằng cán cân miễn dịch Treg/Th17 với mức độ hoại tử tế bào gan và đợt bùng phát viêm gan, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho nghiên cứu bệnh sinh và định hướng các liệu pháp can thiệp miễn dịch trong tương lai.