Luận án: Khảo sát tế bào Treg, Th17 ở người nhiễm HBV mạn - TS. Lê Thị Thuý Hằng

Nghiên cứu vai trò và sự biến đổi của quần thể tế bào Treg, Th17 trong đáp ứng miễn dịch ở người bệnh nhiễm virus viêm gan B (HBV) mạn tính.

• Tác giả: Lê Thị Thuý Hằng
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Thị Lệ Hoa
• Trường học: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Bệnh Truyền Nhiễm và Các Bệnh Nhiệt Đới
• Đề tài: Khảo Sát Quần Thể Tế Bào Lympho TCD4 Treg Và Th17 Ở Bệnh Nhân Nhiễm HBV Mạn
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ Y học
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nhiễm HBV Mạn và Đáp Ứng Miễn Dịch

Nhiễm HBV mạn là một vấn đề sức khỏe công cộng toàn cầu với hàng triệu người bị ảnh hưởng. Vi rút viêm gan B (HBV) gây ra các giai đoạn bệnh khác nhau, từ giai đoạn miễn dịch dung nạp đến giai đoạn xóa sổ miễn dịch. Đáp ứng miễn dịch thích nghi đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát nhiễm HBV. Tế bào Treg (CD4+CD25+FOXP3+) và tế bào Th17 (CD4+IL-17+RORγt+) là hai quần thể tế bào lympho T CD4 chính, có vai trò đối kháng trong điều hòa miễn dịch. Sự mất cân bằng giữa hai loại tế bào này ảnh hưởng đáng kể đến tiến triển và kết quả điều trị của bệnh viêm gan B mạn.

1.1. Đặc điểm Cấu Trúc và Chu Trình Nhân Lên của HBV

Vi rút HBV là một virus DNA vòng có cấu trúc phức tạp với bao bọc protein và DNA vòng đóng đồng hoá trị (cccDNA) trong nhân. Virus có kháng nguyên bề mặt (HBsAg), kháng nguyên lõi (HBcAg) và kháng nguyên e (HBeAg). Chu trình nhân lên HBV diễn ra trong tế bào gan (hepatocyte), bao gồm quá trình sao chép ngược thông qua men sao chép ngược HBV. Hiểu rõ cơ chế này giúp giải thích các giai đoạn bệnh và mức độ biểu hiện yếu tố HBV DNA.

1.2. Các Giai Đoạn Diễn Biến của Nhiễm HBV Mạn

Nhiễm HBV mạn trải qua nhiều giai đoạn: giai đoạn miễn dịch dung nạp (HBeAg+, HBV DNA cao), giai đoạn chuyển tiếp (HBeAg-/+), giai đoạn miễn dịch xóa sổ (HBeAg-, HBV DNA thấp) và giai đoạn không hoạt động. Tại mỗi giai đoạn, tỉ lệ Treg/Th17, mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt, cũng như các chỉ số men gan (ALT) và chức năng gan thay đổi khác nhau, phản ánh tình trạng miễn dịch của bệnh nhân.

II. Tế Bào Treg và Th17 trong Miễn Dịch Chống HBV

Tế bào Treg (CD4+CD25+FOXP3+) là những tế bào miễn dịch chuyên biệt, có chức năng ức chế phản ứng miễn dịch và duy trì sự khoan dung miễn dịch. Chúng sản xuất IL-10 và TGF-β, góp phần giảm viêm nhưng cũng có thể ức chế phản ứng miễn dịch chống virus quá mạnh. Ngược lại, tế bào Th17 (CD4+IL-17+RORγt+) tạo ra IL-17, kích hoạt phản ứng viêm và giúp loại bỏ virus. Sự cân bằng giữa quần thể Treg và Th17 quyết định kết quả của nhiễm HBV mạn. Tỉ lệ Treg/Th17 cao gắn liên với khả năng kiểm soát virus kém, trong khi tỉ lệ thấp có thể dẫn đến viêm gan cấp tính.

2.1. Chức Năng Sinh Học của Tế Bào Treg

Tế bào Treg biểu hiện FOXP3 (yếu tố phiên mã Forkhead), là protein điều hòa chính của quần thể này. Chúng tạo ra các cytokine ức chế như IL-10 và TGF-β, giúp điều hoà phản ứng viêm. Tuy nhiên, trong nhiễm HBV mạn, số lượng và hoạt tính Treg thường tăng cao, dẫn đến ức chế quá mức phản ứng miễn dịch chống virus, làm tăng tải virus (HBV DNA) và gây viêm gan mạn.

2.2. Vai Trò của Tế Bào Th17 trong Bệnh HBV Mạn

Tế bào Th17 được định hình bởi yếu tố phiên mã RORγt và sản xuất IL-17, một cytokine pro-inflammatory quan trọng. IL-17 kích hoạt phản ứng viêm, tuyển mộ bạch cầu đa nhân và tế bào miễn dịch khác để loại bỏ virus. Tuy nhiên, phản ứng Th17 quá mạnh có thể gây viêm gan, tổn thương hepatocyte và tiến triển thành xơ gan. Mức độ biểu hiện RORγt và số lượng Th17 thay đổi tùy theo giai đoạn bệnh.

III. Phương Pháp Khảo Sát và Đo Lường Tế Bào Miễn Dịch

Khảo sát quần thể tế bào lympho T CD4 Treg và Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn sử dụng các kỹ thuật hiện đại để đánh giá tỉ lệ tế bào và mức độ biểu hiện yếu tố phiên mã. Phương pháp đếm tế bào miễn dịch bao gồm sử dụng luồng tế bào (flow cytometry) với các kháng thể đơn dòng đánh dấu CD4, CD25, CD127, IL-17, FOXP3. Đo mức độ biểu hiện yếu tố phiên mã FOXP3 và RORγt được thực hiện bằng kỹ thuật RT-qPCR. Các phương pháp này cho phép định lượng chính xác tỉ lệ Treg, tỉ lệ Th17 và mối tương quan với các chỉ số lâm sàng như HBeAg, HBV DNA, men gan và chức năng gan.

3.1. Kỹ Thuật Luồng Tế Bào Phân Tích Tế Bào Treg và Th17

Luồng tế bào (flow cytometry) là phương pháp tiêu chuẩn vàng để xác định tế bào CD4+CD25+FOXP3+ (Treg) và tế bào CD4+IL-17+ (Th17) từ mẫu máu ngoại vi. Kỹ thuật sử dụng kháng thể đơn dòng được gắn huỳnh quang (APC, FITC, PE) để đánh dấu các marker bề mặt tế bào như CD4, CD25, CD127 và marker nội bào như FOXP3, IL-17. Máy đếm luồng tế bào phân tích hàng triệu tế bào, cho phép tính toán phần trăm Treg và phần trăm Th17 trong tổng số lympho T CD4.

3.2. Phương Pháp RT qPCR Đo Mức Độ Biểu Hiện FOXP3 và RORγt

RT-qPCR (real-time quantitative PCR) được sử dụng để đo lường mức độ biểu hiện mRNA của FOXP3 (marker của Treg) và RORγt (marker của Th17). Mẫu RNA được trích xuất từ tế bào lympho, sau đó chuyển phiên thành cDNA và khuếch đại qua PCR định lượng. Giá trị cycle threshold (CT) được chuẩn hoá so với GAPDH (gen housekeeping), tính toán bằng phương pháp ΔΔCt. Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt ở các nhóm bệnh nhân khác nhau.

IV. Kết Quả Khảo Sát và Ý Nghĩa Lâm Sàng

Các khảo sát về tế bào Treg và Th17 ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn cho thấy những thay đổi có ý nghĩa trong tỉ lệ tế bào và mức độ biểu hiện FOXP3, RORγt. Bệnh nhân HBeAg dương thường có tỉ lệ Treg cao hơn, HBV DNA cao, men gan (ALT) tăng và chức năng gan giảm. Ngược lại, bệnh nhân HBeAg âm có tỉ lệ Th17 tương đối cao hơn, phản ánh phản ứng miễn dịch chống virus mạnh hơn. Tương quan giữa tỉ lệ Treg/Th17 và các chỉ số HBeAg, HBV DNA, men gan, chỉ số APRI giúp đánh giá tiến triển bệnh và phương pháp điều trị phù hợp, đặc biệt là trong việc quyết định sử dụng thuốc chống virus (NAs, interferon).

4.1. Đặc Điểm Tế Bào Treg và Th17 Ở Các Nhóm Bệnh Nhân

Nghiên cứu khảo sát cho thấy nhóm bệnh nhân khỏe mạnh có tỉ lệ Treg và Th17 cân bằng, mức độ biểu hiện FOXP3 và RORγt thấp. Nhóm HBV mạn HBeAg+ có số lượng Treg cao, FOXP3 biểu hiện cao, Th17 thấp, HBV DNA cao và ALT tăng cao. Nhóm HBV mạn HBeAg- có tỉ lệ Th17 cao hơn HBeAg+, RORγt biểu hiện cao, HBV DNA thấp hơn, chức năng gan tốt hơn. Những khác biệt này giúp phân loại bệnh nhân theo khả năng điều trị.

4.2. Tương Quan Với Chỉ Số Lâm Sàng và Ý Nghĩa Điều Trị

Tỉ lệ Treg cao tương quan với HBV DNA cao, ALT tăng cao và tổn thương gan nặng. Mức độ biểu hiện FOXP3 cao gắn liên với viêm gan mạn và tiến triển xơ gan. Ngược lại, tỉ lệ Th17 cao và RORγt biểu hiện cao tương quan với kiểm soát virus tốt hơn và viêm gan nhẹ hơn. Những phát hiện này có ý nghĩa lâm sàng quan trọng trong việc dự báo diễn tiến bệnh, chỉ định điều trị chống virus và mục tiêu điều trị cá nhân hoá cho bệnh nhân nhiễm HBV mạn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và hình thái nhiễm HBV cấp và mạn Nhiễm HBV mạn là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh gan giai đoạn cuối như xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Theo dữ liệu của Tổ chức Y tế Thế giới vào năm 2019, HBV gây nhiễm mạn tính cho 296 triệu người, 1,5 triệu trường hợp nhiễm mới mỗi năm và 820000 trường hợp tử vong vì bệnh gan mạn giai đoạn cuối do HBV.22 Tỉ lệ mang HBsAg trên thế giới khác nhau từ < 2% (vùng lưu hành thấp) đến > 8% (vùng lưu hành cao).23 Phần lớn các ca nhiễm ở vùng lưu hành cao như Đông Nam Á, Tây Địa Trung Hải,… do lây từ mẹ sang con, xâm mình, quan hệ tình dục hay dùng chung kim tiêm.22 Việt Nam thuộc vùng lưu hành cao của HBV. Trong một phân tích gộp tổng hợp 72 nghiên cứu từ năm 1999 đến năm 2021 ghi nhận tỉ lệ HBsAg dương tính ở người trưởng thành tại Việt Nam là 10,5%.24 Nhiễm HBV mạn ở các nước thuộc vùng lưu hành cao của HBV có đường lây chủ yếu từ mẹ sang con. Hậu quả quan trọng nhất ở nhiễm HBV chu sinh tức truyền dọc từ mẹ sang con là 95% trẻ nhiễm vi rút sẽ mang HBV suốt đời sống,25 nguy cơ bệnh gan mạn và ung thư biểu mô tế bào gan cao hơn nhiều so với lây truyền ngang ở tuổi trưởng thành.

Cho đến nay, các tác giả đều ghi nhận quá trình nhiễm HBV ở người là quá trình tương tác phức tạp giữa vi rút và phản ứng của hệ thống miễn dịch của cơ thể. Quá trình này có thể dẫn tới nhiễm HBV cấp tính và tự hồi phục hoặc dẫn tới nhiễm HBV mạn tính. Trong nhiễm HBV cấp tính xảy ra ở tuổi trưởng thành, hệ thống miễn dịch thích nghi nhanh chóng nhận diện và tiêu huỷ tế bào nhiễm HBV gây tổn thương gan cấp giúp thải trừ sạch hoàn toàn vi rút sau khỏi bệnh.26 Ngược lại, phản ứng miễn. 5 dịch chuyên biệt đã được chứng minh hoạt động không hiệu quả ở người mang HBV mạn dù có hay không có triệu chứng,27 dẫn đến tập trung kéo dài các tế bào viêm không chuyên biệt, tích luỹ dần các vùng tổn thương tế bào xen lẫn với các vùng tân sinh tế bào và phản ứng xơ hoá.

Ngoài ra ở người nhiễm HBV mạn, DNA vòng đóng đồng hoá trị (cccDNA) của HBV có thể lồng ghép trên bộ DNA người gây các đột biến gen sinh HCC.2 Đặc điểm cấu trúc di truyền của HBV và chu trình HBV trong gan HBV gây bệnh cho người thuộc gia đình Hepadnaviridae (bộ gen DNA), có ái tính với gan và có vỏ bọc. Bộ gen của vi rút được sắp xếp cực kì nhỏ gọn (hình 1. DNA vòng duỗi (relaxed circular DNA, rc DNA), chuỗi đôi không hoàn toàn và nhỏ (3.2kb) có 4 vùng đọc mã mở, vùng C, P, S và X mã hoá tổng hợp các protein: HBcAg (kháng nguyên lõi HBV, protein nhân capsid), HBeAg (kháng nguyên e của HBV), HBV Pol/RT (polymerase, hoạt tính sao chép ngược), 3 kháng nguyên bề mặt HBsAg (nhỏ, trung bình và lớn), và HBx (kháng nguyên x của HBV).28,29 Sau khi HBV xâm nhập vào gan, virion của HBV được chuyển vào nhân, sản xuất các chất liệu di truyền của HBV, tạo nên cấu trúc virion và các tiểu phần không có virion, hoàn tất chu trình của HBV. Cấu trúc DNA vòng duỗi (rcDNA) được tạo nên trước tiên, sau đó sẽ chuyển thành cấu trúc DNA vòng đóng đồng hoá trị (cccDNA) để đảm nhiệm vai trò làm khuôn DNA cho hoạt động dịch mã thành cấu trúc RNA tiền gen (pregenomic RNA) và đưa ra ngoài nhân để tổng hợp tiếp thành 4 protein chính S/preS, core (protein capsid), polymerase (P) và X.30 Cấu trúc DNA nhân capsid trong bào tương tiếp tục được đóng gói và đưa vào mạng lưới nội bào hoặc đưa trở lại nhân để duy trì nguồn cccDNA.28 Ngoài ra, sợi RNA tiền gen còn được sao chép ngược thành sợi rcDNA mới cho vỏ capsid của vi rút.28 Cùng với các virion hoàn chỉnh (đường kính 42 nm) được phóng thích ra khỏi tế bào gan, gây nhiễm cho tế bào mới, tế bào gan nhiễm HBV còn sản xuất rất.

6 nhiều phần tử hình cầu hoặc hình sợi đường kính 22 nm và không chứa capsid. Hoạt động lồng ghép bộ gen của HBV vào bộ gen kí chủ hiếm xảy ra nhưng có thể có ảnh hưởng quan trọng trên quá trình tân sinh tế bào, gây ung thư biểu mô tế bào gan.31 Mặc khác, sự khiếm khuyết khả năng kiểm tra lỗi trong quá trình sao chép của men sao chép ngược gây ra các đột biến điểm, thay đổi trình tự đoạn, thêm hay mất đoạn trên bộ gen của HBV là nguyên nhân hình thành nên tính đa dạng của quẩn thể vi rút, đặc biệt nhất là tạo nên các chủng đột biến mang ý nghĩa bệnh lý. Thật vậy, HBV được phân loại thành kiểu gen và dưới kiểu gen dựa trên trình tự nucleotide khác nhau ở một mức độ nhất định và không có ý nghĩa bệnh lý và được thừa nhận như một quá trình tiến hoá của vi rút. Tuy nhiên, nhiều đột biến kèm theo các biến đổi bệnh lý và thường diễn ra dưới áp lực điều trị hay miễn dịch như các đột biến kháng thuốc, các đột biến gây trốn thoát miễn dịch hay tăng sinh không kiểm soát cho tế bào gan.1: Cấu trúc tiểu thể Dane và các tiểu phần của HBV “Nguồn: Tsukada S, 2020” [32] .3 Các giai đoạn diễn biến ở người nhiễm HBV mạn theo quan điểm miễn dịch Nhiễm HBV mạn là quá trình tương tác kéo dài, liên tục giữa phản ứng miễn dịch của ký chủ với HBV.

Trước đây người ta chưa rõ cơ chế nào khiến nhiễm HBV mạn tuần tự diễn biến theo các giai đoạn. Năm 1981, nhiễm HBV mạn được biết gồm 2 giai đoạn: viêm gan hoạt động (HBeAg dương, hiện diện HBV DNA và bệnh gan hoạt tính) và người lành mang trùng (HBeAg chuyển huyết thanh, HBV DNA dưới ngưỡng phát hiện và bệnh gan không hoạt động).33 Cho đến năm 2005, quá trình diễn biến này được mô tả tuần tự trải qua 4 giai đoạn theo tương quan giữa miễn dịch và HBV, khởi đầu từ dung nạp miễn dịch, thải trừ miễn dịch, kiểm soát miễn dịch và trốn thoát miễn dịch.25 Đến năm 2017, các giai đoạn lại được định nghĩa dựa trên kết hợp 2 tiêu chí “có hay không có tổn thương gan (tăng ALT)” và “có hay không có hoạt động sao chép” (hình 1.10 Điểm quan trọng nhất ở cách phân loại mới này là khái niệm “dung nạp miễn dịch” không còn được thừa nhận do trên cá thể được cho là ở thời kỳ dung nạp miễn dịch vẫn ghi nhận được trong gan có hiện diện các tế bào miễn dịch, các tế bào này vẫn có phản ứng đầy đủ khi được kích thích từ các kháng nguyên chuyên biệt của HBV.2 Điểm mới cũng được phát hiện cuối thập niên 2010 là tình trạng kiệt quệ miễn dịch (giảm chức năng và số lượng) đặc biệt là của tế bào T chuyên biệt với HBV do tiếp xúc kéo dài với lượng kháng nguyên HBV cao.3 Ngoài ra các cytokine được tiết ra từ môi trường viêm mạn tính cũng có tác dụng ức chế các tế bào T và ngăn cản đáng kể việc thanh thải HBV.3 Diễn tiến tự nhiên của nhiễm HBV mạn theo quan niệm mới nhất được mô tả như sau.2 Các quan niệm về diễn tiến tự nhiên nhiễm HBV mạn theo thời gian 1.1 Giai đoạn nhiễm HBV mạn HBeAg dương Trước đây được gọi là giai đoạn dung nạp miễn dịch,25 do giai đoạn này men gan trong giới hạn bình thường, HBeAg dương, tải lượng HBV DNA cao, không có tổn thương mô học gan. Về miễn dịch, thời kỳ này từng được đánh giá là không có phản ứng miễn dịch của tế bào với kháng nguyên của HBV. Tuy vậy, các khảo sát gần đây đã tìm thấy vẫn có hiện diện nhiều tế bào lympho T chuyên biệt với HBV nhưng không kèm theo các tế bào viêm không chuyên biệt như bạch cầu đơn nhân và đa nhân.2 Các tế bào chuyên biệt này vẫn kích hoạt và biệt hoá khi tiếp xúc với các kháng nguyên HBV cho thấy từ ngữ dung nạp với HBV là không đúng.

Vì vậy, “giai đoạn dung nạp miễn dịch” được thống nhất thay thế bởi “nhiễm HBV mạn HBeAg dương” nhằm mục đích nhấn mạnh 2 tiêu chí “HBV có sao chép mạnh” và không có phản ứng tích tụ tế bào viêm”.10 Mặc dù phản ứng viêm hoại tử hoặc xơ hoá gan chỉ hiện diện tối thiểu hay không có nhưng sự lồng. 9 ghép HBV DNA và sự tăng sinh tế bào gan tạo dòng (clonal hepatocyte expansion) nhắc nhở rằng quá trình sinh ung thư biểu mô tế bào gan có thể đã diễn ra trong giai đoạn sớm này.10 Thuốc kháng vi rút ở giai đoạn này không giúp giảm nồng độ kháng nguyên HBsAg và HBeAg. Tuy nhiên, việc lưu hành lượng lớn và kéo dài kháng nguyên có thể dẫn đến kiệt quệ miễn dịch, kéo dài tình trạng nhiễm HBV HBeAg dương và có liên quan với xơ gan, ung thư biểu mô tế bào gan do tích tụ phản ứng xơ hoá, đột biến trên bộ gen hay tân sinh tế bào gan bất thường. Các liệu pháp miễn dịch nhằm phục hồi tế bào T đang được nghiên cứu như liệu pháp vắc xin, thuốc kháng PD-1 bước đầu đã được thử nghiệm trên chuột chũi, còn đang được nghiên cứu trên người nhiễm HBV giai đoạn HBeAg dương này.2 Giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg dương Giai đoạn viêm gan B mạn HBeAg dương trước đây được gọi là giai đoạn thải trừ miễn dịch hay giai đoạn hoạt tính miễn dịch.25 Trong giai đoạn này, phản ứng miễn dịch được kích hoạt thể hiện bằng sự hiện diện của tế bào T chuyên biệt với HBV, bạch cầu đơn nhân và đa nhân không chuyên biệt cùng với hình ảnh tổn thương tế bào gan.2 Phản ứng này gây ly giải tế bào được thừa nhận là qua trung gian miễn dịch.

Kháng nguyên HBeAg vẫn còn dương, kháng nguyên HBsAg và HBV DNA vẫn chưa đủ thời gian giảm đáng kể. Mô học gan có viêm hoại tử trung bình hoặc nặng và xơ hoá gan tiến triển nhanh so với trước đó. Giai đoạn này thường xuất hiện từ 30 tuổi trở đi ở người nhiễm HBV chu sinh. Qua nhiều đợt phản ứng miễn dịch như trên, còn được gọi là đợt cấp viêm gan B mạn hay đợt bùng phát (có ALT tăng trên 5 đến 1000 lần và có khi kèm theo suy gan cấp, nặng), HBsAg và HBeAg giảm nhiều và có thể dẫn đến chuyển huyết thanh HBeAg, HBV DNA âm tính hay ở mức rất thấp.