Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt

Luận án tiến sĩ phân tích nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt ứng dụng trong chẩn đoán, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng góp

• Tác giả: Đàm Thị Tú Anh
• Người hướng dẫn: PGS TS Phạm Thiện Ngọc
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Dị ứng và miễn dịch
• Đề tài: Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt ứng dụng trong chẩn đoán
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ Y học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT
• 1.2. Tình hình ung thư tuyến liền liệt trên thế giới
• 1.3. Tình hình ung thư tuyến tiền liệt tại Việt Nam
• 1.4. Yều cầu trong chẩn đoán và điều trị UTTTL
• 1.5. CÁC HIỂU BIẾT VỀ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT
• 1.5.1. Các phương pháp truyền thống chẩn đoán UTTTL
• 1.5.2. Các hiểu biết mới trong chẩn đoán và điều trị UTTTL
• 1.6. KHÁNG THỂ VÀ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT
• 1.6.1. Kháng thể. Kháng thể đơn dòng
• 1.6.2. CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
• 1.6.2.1. Kĩ thuật tái tổ hợp DNA
• 1.6.2.2. Kĩ thuật tạo kháng thể bằng gây miễn dịch trên động vật
• 1.6.2.3. Kĩ thuật phân lập albumine từ huyết thanh
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu của mục tiêu tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên UTTTL
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu tạo bộ sinh phẩm bằng kháng thể và bước đầu ứng dụng trong chẩn đoán UTTTL
• 2.4. HÓA CHẤT, SINH PHẨM NGHIÊN CỨU
• 2.5. TRANG THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
• 2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.7. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ KẾT QUẢ TRONG NGHIÊN CỨU
• 2.8. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU
• 2.9. CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
• 2.9.1. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp mang các epitope EPCA-2
• 2.9.2. Các kĩ thuật sử dụng gây miễn dịch cho thỏ tạo kháng thể đặc hiệu kháng EPCA-2
• 2.9.3. Kĩ thuật ELISA xác định EPCA-2
• 2.10. ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. TẠO GEN TÁI TỔ HỢP MANG CÁC EPITOPE EPCA-2 BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP
• 3.1.1. Tạo vector tái tổ hợp mang gen polEPCA-2
• 3.1.2. Biểu hiện vector tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli chủng BL21 (DE3)
• 3.2. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH Ở THỎ BẰNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP PolEPCA-2
• 3.2.1. Nồng độ kháng thể kháng polEPCA-2 ở huyết thanh thỏ
• 3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH EPCA-2 TRONG HUYẾT THANH 3 NHÓM NGHIÊN CỨU
• 3.3.1. Thông tin chung của nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt
• 3.3.2. Nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh 2 nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt được định lượng bằng kháng thể thỏ kháng EPCA-2 và kít CUSABIO
• 3.3.3. Nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh nam giới khỏe mạnh
• 3.3.4. So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của kháng thể thỏ đặc hiệu kháng EPCA-2 với kháng thể trong kít xác định EPCA-2 của CUSABIO
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. VỀ THIẾT KẾ GEN MÃ HÓA POLYEPITOPE CỦA KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT SỚM
• 4.1.1. Lựa chọn biểu hiện các epitope của kháng nguyên thay vì biểu hiện toàn bộ phân tử kháng nguyên
• 4.1.2. Thiết kế lặp nhiều lần trình tự các epitope
• 4.1.3. Thiết kế gen polEPCA-2 có trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn
• 4.1.4. Tạo vector tái tổ hợp mang gen polEPCA-2
• 4.1.5. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 4.2. VỀ KẾT QUẢ TẠO KHÁNG THỂ THỎ ĐẶC HIỆU KHÁNG PolEPCA-2
• 4.2.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH EPCA-2 TRONG HUYẾT THANH 3 NHÓM NGHIÊN CỨU
• 4.2.2. Một số thông tin của 2 nhóm bệnh nhân tuyến tiền liệt
• 4.2.3. Kết quả xác định EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt bằng kháng thể thỏ có đối chứng với kít thương phẩm
• 4.2.4. Kết quả xác định EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân u phì đại lành tính tuyến tiền liệt và nam giới bình thường bằng 2 phương pháp ELISA
• 4.2.5. So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của 2 phương pháp ELISA sử dụng kháng thể thỏ đặc hiệu kháng EPCA-2 và kháng thể trong kít xác định EPCA-2 của CUSABIO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu kháng thể ung thư tuyến tiền liệt

Nghiên cứu kháng thể đặc hiệu ung thư tuyến tiền liệt (UTTTL) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Kháng thể đặc hiệu giúp phát hiện sớm các dấu ấn phân tử, từ đó nâng cao khả năng chẩn đoán và điều trị hiệu quả. Việc phát hiện sớm UTTTL có thể cải thiện tỷ lệ sống sót của bệnh nhân. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng kháng nguyên sớm ung thư tuyến tiền liệt (EPCA-2) có thể được phát hiện trong huyết thanh, mang lại hy vọng cho việc chẩn đoán sớm.

1.1. Kháng thể và vai trò trong chẩn đoán ung thư

Kháng thể đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các dấu ấn ung thư. Chúng có khả năng nhận diện các kháng nguyên đặc hiệu, giúp xác định sự hiện diện của tế bào ung thư trong cơ thể. Việc sử dụng kháng thể trong chẩn đoán không chỉ giúp phát hiện bệnh sớm mà còn cung cấp thông tin về giai đoạn và mức độ xâm lấn của khối u.

1.2. Tình hình ung thư tuyến tiền liệt tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ung thư tuyến tiền liệt đang gia tăng với tỷ lệ mắc bệnh ngày càng cao. Theo thống kê, số lượng bệnh nhân UTTTL ngày càng tăng, đặc biệt ở nam giới trên 50 tuổi. Việc chẩn đoán sớm và chính xác là rất cần thiết để nâng cao hiệu quả điều trị.

II. Thách thức trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu kháng thể, nhưng việc chẩn đoán UTTTL vẫn gặp nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống như siêu âm và sinh thiết thường chỉ phát hiện bệnh khi đã ở giai đoạn muộn. Điều này dẫn đến tỷ lệ sống sót thấp cho bệnh nhân. Cần có những phương pháp mới để cải thiện khả năng phát hiện sớm.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như PSA và sinh thiết có nhiều hạn chế. Chúng thường không phát hiện được bệnh ở giai đoạn sớm, dẫn đến việc điều trị không hiệu quả. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để phát triển các phương pháp chẩn đoán mới.

2.2. Tìm kiếm dấu ấn phân tử mới

Việc tìm kiếm các dấu ấn phân tử mới có thể giúp cải thiện khả năng chẩn đoán. Các nghiên cứu hiện tại đang tập trung vào việc phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu như EPCA-2, giúp nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán.

III. Phương pháp nghiên cứu kháng thể đặc hiệu ung thư tuyến tiền liệt

Nghiên cứu kháng thể đặc hiệu ung thư tuyến tiền liệt sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra và xác định kháng thể. Các phương pháp này bao gồm kỹ thuật tái tổ hợp DNA, gây miễn dịch trên động vật và kỹ thuật ELISA. Những phương pháp này giúp phát hiện kháng thể đặc hiệu với độ chính xác cao.

3.1. Kỹ thuật tái tổ hợp DNA trong nghiên cứu

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép tạo ra các kháng nguyên tái tổ hợp mang các epitope của EPCA-2. Phương pháp này giúp tăng cường khả năng phát hiện kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh.

3.2. Gây miễn dịch và phân lập kháng thể

Gây miễn dịch trên động vật như thỏ giúp tạo ra kháng thể đặc hiệu. Sau đó, kháng thể được phân lập và xác định bằng các phương pháp như ELISA, đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong chẩn đoán.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kháng thể trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt

Kháng thể đặc hiệu kháng EPCA-2 đã được chứng minh có khả năng phát hiện sớm ung thư tuyến tiền liệt với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Việc ứng dụng kháng thể trong chẩn đoán không chỉ giúp phát hiện bệnh sớm mà còn hỗ trợ trong việc theo dõi tiến triển của bệnh.

4.1. Đánh giá khả năng ứng dụng kháng thể

Khả năng ứng dụng kháng thể trong chẩn đoán UTTTL đã được nghiên cứu và đánh giá. Các kết quả cho thấy kháng thể đặc hiệu có thể phát hiện bệnh sớm, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

4.2. Kết quả nghiên cứu và triển vọng

Nghiên cứu cho thấy kháng thể đặc hiệu kháng EPCA-2 có thể được sử dụng như một công cụ chẩn đoán hiệu quả. Triển vọng trong việc phát triển các bộ sinh phẩm từ kháng thể này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu kháng thể ung thư tuyến tiền liệt

Nghiên cứu kháng thể đặc hiệu ung thư tuyến tiền liệt đang mở ra nhiều cơ hội mới trong chẩn đoán và điều trị. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán mới dựa trên kháng thể sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện sớm và cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong y học.

5.1. Tương lai của nghiên cứu kháng thể

Nghiên cứu kháng thể sẽ tiếp tục được phát triển với mục tiêu tạo ra các sản phẩm chẩn đoán hiệu quả hơn. Các nghiên cứu mới sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và xác định kháng thể.

5.2. Định hướng phát triển trong y học

Định hướng phát triển trong y học sẽ tập trung vào việc ứng dụng kháng thể trong điều trị và chẩn đoán. Các nghiên cứu sẽ tiếp tục tìm kiếm các dấu ấn phân tử mới để cải thiện khả năng phát hiện và điều trị ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư tuyến tiền liệt (UTTTL) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ hai ở nam giới trên thế giới. Hiệu quả điều trị UTTTL phụ thuộc trực tiếp vào thời điểm phát hiện bệnh: ở giai đoạn khối u còn khu trú trong tuyến tiền liệt, tỷ lệ sống sau 10 năm của bệnh nhân có thể đạt từ 70% đến 85%; khi khối u xâm lấn ngoài vỏ bao vi thể, tỷ lệ sống sau 5 năm là 85% và 10 năm là 75%; tuy nhiên, khi tổn thương đã xâm lấn rộng qua bao tuyến, tỷ lệ sống sau 10 năm giảm mạnh xuống chỉ còn khoảng 40%.

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống trước đây chủ yếu dựa vào thăm khám lâm sàng (thăm trực tràng - DRE), chẩn đoán hình ảnh (siêu âm qua trực tràng - SAQTT), và xét nghiệm mô bệnh học từ mẫu sinh thiết. Tuy nhiên, các kỹ thuật này chỉ phát hiện được bệnh khi tổn thương cấu trúc khối u đã hình thành rõ rệt, thường rơi vào giai đoạn muộn. Về mặt hóa sinh và miễn dịch, xét nghiệm kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSA) huyết thanh là công cụ phổ biến nhất nhưng chỉ mang tính đặc hiệu cho mô tuyến tiền liệt chứ không đặc hiệu tuyệt đối cho ung thư. Nồng độ PSA thường gia tăng trong cả các bệnh lý lành tính như u phì đại lành tính tuyến tiền liệt (UPĐLTTTL), viêm hoặc chấn thương tuyến tiền liệt, tạo ra "vùng xám" chẩn đoán (4–10 ng/mL) với tỷ lệ sinh thiết âm tính cao.

Kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt sớm (EPCA-2) là một dấu ấn phân tử chất nền nhân tế bào ác tính có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, xuất hiện trong huyết thanh và mô tuyến tiền liệt từ rất sớm (thậm chí trước 2 năm so với các biến đổi hình thái học trên mô bệnh học). Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn về một công cụ chẩn đoán sớm và đặc hiệu tại Việt Nam, luận án của nghiên cứu sinh Đàm Thị Tú Anh tập trung giải quyết khoảng trống công nghệ trong việc tự chủ tạo nguồn kháng thể đặc hiệu phục vụ định lượng dấu ấn này.

Đề tài được thực hiện nhằm đạt 2 mục tiêu cụ thể:

1. Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp EPCA-2.
2. Đánh giá khả năng ứng dụng kháng thể đặc hiệu kháng EPCA-2 trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng sinh học thực nghiệm: Gen mã hóa polyepitope của EPCA-2 (polEPCA-2); vector biểu hiện $pET-28a(+)$; tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng $DH5\alpha$ và $BL21 (DE3)$; động vật thực nghiệm là thỏ khỏe mạnh được gây miễn dịch để sinh kháng thể.
• Đối tượng lâm sàng: Mẫu huyết thanh thu thập từ 3 nhóm đối tượng bao gồm: bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt, bệnh nhân u phì đại lành tính tuyến tiền liệt và nhóm nam giới khỏe mạnh làm đối chứng.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch (Trường Đại học Y Hà Nội), Phòng Công nghệ tế bào động vật (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Khoa Ngoại, Khoa Hóa sinh (Bệnh viện Hữu nghị Hà Nội), hoàn thành và bảo vệ năm 2016.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu dịch tễ học, các phương pháp chẩn đoán kinh điển, các tiến bộ công nghệ sinh học và các nghiên cứu liên quan đến chẩn đoán, điều trị UTTTL:

1. Dịch tễ học bệnh lý:

   • Trên thế giới: Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến hết năm 2012 toàn cầu ghi nhận khoảng 1.689.000 ca mắc và 307.481 ca tử vong do UTTTL. Bệnh có tỷ lệ mắc cao tại các quốc gia phát triển như Úc, New Zealand, Tây Âu, Bắc Âu và Bắc Mỹ (khoảng 913.000 trường hợp). Tại Mỹ, thống kê của Hiệp hội Ung thư năm 2015 ghi nhận 220.800 ca mắc mới và 158.040 ca tử vong. Bệnh có sự khác biệt rõ theo chủng tộc (người Mỹ da đen có tỷ lệ mắc cao nhất: 249/100.000; người da trắng: 157/100.000; người Mỹ gốc Á: 94/100.000 trong giai đoạn 2001–2005) và tăng nhanh theo độ tuổi (trên 65 tuổi chiếm 3/4 số ca mắc tại Anh).
   • Tại Việt Nam: Ước tính của WHO năm 2012 có khoảng 1.275 người mắc và 872 ca tử vong. Nghiên cứu của Nguyễn Văn Hưng (2005) trên 633 bệnh nhân phẫu thuật tuyến tiền liệt phát hiện tỷ lệ UTTTL qua mô bệnh học là 7,9%, trong đó 95,2% là ung thư biểu mô tuyến biệt hóa cao. Vũ Lê Chuyên (2010) sàng lọc 408 người tại Bệnh viện Bình Dân ghi nhận 87 người (21,3%) có chỉ định sinh thiết dựa trên PSA và siêu âm trực tràng, phát hiện 10 ca (2,5%) mắc UTTTL với điểm Gleason từ 5 đến 7. Số liệu phẫu thuật năm 2010 tại Bệnh viện Việt Đức là 56 ca, Viện K là 38 ca, Bệnh viện Bạch Mai là 20 ca và Bệnh viện Ung bướu Hà Nội là 16 ca.

2. Các phương pháp chẩn đoán và giới hạn:

   • Chẩn đoán hình ảnh và mô bệnh học: Siêu âm qua trực tràng (SAQTT) theo nghiên cứu của Lê Ngọc Bằng (2005, $n=53$) đạt độ nhạy 56,5% và độ đặc hiệu 76,7%. Sinh thiết làm giải phẫu bệnh có độ chính xác 96,2% theo thang điểm Gleason (từ 1 đến 5 cho từng vùng đại diện, tổng điểm 2 đến 10), song khó phân biệt ở các tổn thương tiền ung thư như tân sản nội biểu mô tuyến tiền liệt (PIN). Các kỹ thuật mới như siêu âm cắt lớp (ULT), chụp cắt lớp phát xạ positron kết hợp CT ($PET/CT$) sử dụng chất đánh dấu $^{11}C\text{-Choline}$ mang lại hình ảnh chuyển hóa chức năng nhưng giá thành cao.
   • Dấu ấn sinh học truyền thống: Kháng nguyên PSA (được Hara tìm thấy năm 1971 trong tinh dịch, Wang phân lập năm 1979 và Kuriyama định lượng năm 1980). Nghiên cứu của Thompson trên 2.950 nam giới ghi nhận 15,2% người có $PSA \le 4\text{ ng/mL}$ vẫn mắc UTTTL. Nghiên cứu của Catalon trên 6.630 bệnh nhân cho thấy hơn 80% trường hợp tăng PSA nằm trong khoảng 4–10 ng/mL, và 2/3 trong số đó có kết quả sinh thiết lành tính. Tại Việt Nam, Đỗ Khánh Hỷ, Hoàng Thị Phương Liên và Nguyễn Thị Phương Ngọc đều khẳng định tính không đặc hiệu của PSA trong "vùng xám".
   • Các dấu ấn sinh học mới: Dấu ấn EPCA (Getzenberg phát hiện năm 1991, 40 kDa); EPCA-2 (Leman và Getzenberg xác định năm 2007, cấp bằng sáng chế năm 2009, 30 kDa); PSCA; hexokinase 2 ($hK2$); human glandular kallikrein 2 ($huK2$); osteoprotegerin ($OPG$); $TGF\text{-}\beta 1$; $IL\text{-}6$ và $VEGF$.
   • Các hướng điều trị mới: Phương pháp siêu âm tập trung tăng cường (HIFU); liệu pháp tăng cường miễn dịch bằng $IL\text{-}15$ và $IL\text{-}15R\alpha$; virus Newcastle tái tổ hợp hoạt hóa bởi protease ($rNDV\text{-}PSA$); thuốc nội tiết thế hệ mới Xtandi (Enzalutamide) và Xofigo ($^{223}Ra$); các hệ dẫn thuốc điều trị trúng đích như phức hệ $12ADT\text{-}SSKYQ$, phức hệ nano-aptamer Cisplatin gắn PSMA, peptide 42 gắn GRP78 mang paclitaxel hoặc doxorubicin; các thử nghiệm tại Học viện Quân Y về kháng thể kháng nhân gắn xạ $ANA\text{-}^{131}I$ và virus sởi - quai bị trên chuột Nude.

3. Vị trí của luận án: Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lê Quang Huấn từng tách dòng gen mã hóa toàn bộ phân tử EPCA và tạo kháng thể đơn chuỗi $scFv$ qua phage display. Luận án của Đàm Thị Tú Anh định vị hướng tiếp cận mới: thay vì sử dụng toàn bộ kháng nguyên có kích thước lớn và cấu trúc phức tạp, tác giả lựa chọn thiết kế gen polyepitope nhân tạo chứa các trình tự epitope đặc hiệu của phân tử EPCA-2 ($EPCA\text{-}2.22$, $EPCA\text{-}2.19$, $EPCA\text{-}2.4$), biểu hiện protein tái tổ hợp trên vi khuẩn và gây miễn dịch trên thỏ để thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu, từ đó phát triển kỹ thuật ELISA định lượng phục vụ chẩn đoán lâm sàng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Cấu trúc và chức năng miễn dịch của kháng thể: Globulin miễn dịch (Ig) cấu tạo từ 2 chuỗi nặng ($H$) và 2 chuỗi nhẹ ($L$) liên kết bằng cầu nối disulfua ($S\text{-}S$), gồm vùng hằng định ($C$) và vùng biến đổi ($V$). Vùng $V$ tạo nên vị trí kết hợp kháng nguyên (paratope). Khi phân cắt IgG bằng enzyme Papain thu được 2 mảnh Fab và 1 mảnh Fc; khi phân cắt bằng Pepsin thu được 1 mảnh $F(ab')_2$ và 1 mảnh $Fc'$.
• Đặc tính phân tử của kháng nguyên EPCA-2: Kháng nguyên EPCA-2 có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa. Các epitope ngắn có tính sinh miễn dịch cao đã được xác định cấu trúc acid amin được trình bày tại Bảng 1.1:

Tên Epitope	Số lượng acid amin	Trình tự acid amin (Ký hiệu 1 chữ cái)	Trình tự acid amin (Ký hiệu 3 chữ cái)
EPCA-2.22	11	VIQPYPNFYMV	Val-Ile-Gln-Pro-Tyr-Pro-Asn-Phe-Tyr-Met-Val
EPCA-2.19	7	FAQDNDL	Phe-Ala-Gln-Asp-Asn-Asp-Leu
EPCA-2.4	6	SFGQVK	Ser-Phe-Gly-Gln-Val-Lys

Phương pháp nghiên cứu

1. Kỹ thuật sinh học phân tử và tái tổ hợp DNA:

   • Thiết kế trình tự gen nhân tạo $polEPCA\text{-}2$ chứa các đoạn lặp epitope của EPCA-2 và các điểm cắt của enzyme giới hạn $Nco\text{ }I$ và $Not\text{ }I$.
   • Cắt và nối gen $polEPCA\text{-}2$ vào vector biểu hiện $pET\text{-}28a(+)$.
   • Biến nạp plasmid tái tổ hợp $pET\text{-}28a(+)/polEPCA\text{-}2$ vào tế bào khả biến E. coli dòng $DH5\alpha$, kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi $T7F/R$ và giải trình tự gen.
   • Chuyển vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli $BL21\text{ }(DE3)$.

2. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp:

   • Cảm ứng sinh tổng hợp protein tái tổ hợp bằng Isopropyl $\beta$-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Khảo sát các điều kiện tối ưu: nồng độ IPTG, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ và đánh giá độ hòa tan của protein.
   • Điện di kiểm tra protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE.
   • Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực kim loại cố định sử dụng hệ thống dung dịch đệm biến tính (DBB, DWB) hoặc dung dịch đệm tự nhiên (NPB, NWB, NEB).

3. Kỹ thuật tạo kháng thể và tinh chế:

   • Gây miễn dịch trên thỏ bằng kháng nguyên tái tổ hợp $polEPCA\text{-}2$ theo phác đồ tiêm mẫn cảm đa mũi (mũi 1, mũi 2, mũi 3, mũi 4 kèm chất bổ trợ).
   • Thu thập huyết thanh thỏ ở các thời điểm sau tiêm mũi 3 và sau tiêm mũi 4 (ngày thứ 15 và ngày thứ 20).
   • Phân lập albumin và tinh sạch phân đoạn kháng thể thỏ bằng kết tủa muối và sắc ký.

4. Kỹ thuật phân tích miễn dịch ELISA và xử lý số liệu:

   • Thiết lập quy trình kỹ thuật ELISA gián tiếp/sandwich sử dụng kháng thể thỏ đặc hiệu kháng $polEPCA\text{-}2$ để định lượng kháng nguyên EPCA-2 trong huyết thanh.
   • Sử dụng bộ kit thương phẩm CUSABIO (Mã số CSB-EQ027679HU) làm đối chứng tiêu chuẩn để xây dựng đường chuẩn và đánh giá nồng độ EPCA-2.
   • So sánh các chỉ số nồng độ EPCA-2 và $tPSA$ giữa 3 nhóm: nhóm ung thư tuyến tiền liệt, nhóm u phì đại lành tính tuyến tiền liệt và nhóm đối chứng nam giới khỏe mạnh.
   • Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị chẩn đoán của kháng thể thỏ tự tạo so với kit chuẩn thương phẩm CUSABIO.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 cung cấp nền tảng lý thuyết và thực tiễn chuyên sâu về bệnh lý ung thư tuyến tiền liệt, bao gồm dịch tễ học toàn cầu và tại Việt Nam, phân loại giai đoạn bệnh, các tiêu chuẩn mô bệnh học Gleason và các phương pháp thăm dò cận lâm sàng. Tác giả phân tích chi tiết cơ chế bệnh sinh ở mức độ phân tử, sự hình thành các dấu ấn sinh học trong nhân và màng tế bào ung thư. Chương này làm rõ sự hạn chế của chỉ số PSA huyết thanh cổ điển, đồng thời phân tích cấu trúc, chức năng của các globulin miễn dịch, nguyên lý của các kỹ thuật tái tổ hợp DNA, kỹ thuật tạo kháng thể trên động vật thực nghiệm và nguyên lý các phương pháp ELISA trực tiếp, gián tiếp, sandwich và cạnh tranh.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và thiết kế nghiên cứu:

• Trình bày cụ thể tiêu chuẩn lựa chọn mẫu bệnh phẩm huyết thanh của bệnh nhân UTTTL, bệnh nhân UPĐLTTTL và người bình thường; điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc và sử dụng thỏ thí nghiệm.
• Chi tiết hóa danh mục hóa chất sinh phẩm, môi trường nuôi cấy, mồi PCR, enzyme cắt giới hạn, thang chuẩn kích thước DNA/protein và các hệ thống máy móc phân tích.
• Mô tả từng bước thiết kế gen $polEPCA\text{-}2$, tạo dòng trên vector $pET\text{-}28a(+)$, quy trình biến nạp, giải trình tự kiểm tra, tối ưu hóa biểu hiện trong E. coli $BL21\text{ }(DE3)$ và tinh sạch protein $polEPCA\text{-}2$.
• Trình bày quy trình gây miễn dịch trên thỏ, lịch trình tiêm chủng, công thức pha dịch tiêm, quy trình lấy mẫu máu kiểm tra hiệu giá kháng thể và quy trình thử nghiệm ELISA đối chiếu với kit thương phẩm CUSABIO.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Tạo dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp: Thiết kế thành công gen $polEPCA\text{-}2$ mang các epitope chọn lọc; cắt nối chính xác vào vector $pET\text{-}28a(+)$ bằng cặp enzyme $Nco\text{ }I$ và $Not\text{ }I$; kết quả PCR với cặp mồi $T7F/R$ và kết quả giải trình tự gen khẳng định trình tự chèn hoàn toàn chính xác với khung đọc mã dịch mã.
• Tối ưu hóa sản xuất protein: Khảo sát thành công sự biểu hiện protein tái tổ hợp $polEPCA\text{-}2$ trong E. coli $BL21\text{ }(DE3)$ theo các dải nồng độ IPTG, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy; xác định được dạng biểu hiện và điều kiện tinh sạch protein $polEPCA\text{-}2$ đạt độ tinh sạch cao.
• Đáp ứng miễn dịch trên thỏ: Nồng độ kháng thể đặc hiệu kháng $polEPCA\text{-}2$ trong huyết thanh thỏ tăng rõ rệt sau các mũi tiêm mẫn cảm; so sánh nồng độ kháng thể sau mũi 3 và mũi 4 cho thấy hiệu giá đạt đỉnh cao tại thời điểm ngày thứ 15 và ngày thứ 20 sau tiêm mũi 4 ở các độ pha loãng khác nhau.
• Định lượng EPCA-2 trên mẫu lâm sàng:
  • Tổng hợp đặc điểm tuổi và phân bố nồng độ $tPSA$ ở các nhóm nghiên cứu (nhóm UTTTL, nhóm UPĐLTTTL và nhóm nam giới khỏe mạnh).
  • Kết quả định lượng nồng độ EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân UTTTL bằng kháng thể thỏ tự tạo cho thấy sự gia tăng rõ rệt và có tương quan chặt chẽ với kết quả đo bằng kit thương phẩm CUSABIO.
  • Khảo sát nồng độ EPCA-2 ở nhóm UPĐLTTTL và nhóm người khỏe mạnh duy trì ở mức thấp, giúp phân biệt rõ ràng với nhóm ung thư.
  • Đánh giá so sánh khẳng định kháng thể thỏ đặc hiệu kháng EPCA-2 đạt độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với kháng thể trong bộ kit CUSABIO.

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

Chương 4 tập trung phân tích, biện giải các kết quả thu được:

• Bàn luận sâu sắc về chiến lược thiết kế gen mã hóa polyepitope thay vì biểu hiện toàn bộ phân tử protein tự nhiên: việc lựa chọn các epitope có tính sinh miễn dịch cao ($EPCA\text{-}2.22$, $EPCA\text{-}2.19$, $EPCA\text{-}2.4$) và thiết kế lặp lại nhiều lần giúp tăng cường khả năng kích thích hệ miễn dịch của động vật, giảm thiểu các phản ứng chéo không đặc hiệu do các vùng cấu trúc không mong muốn.
• Phân tích tính ưu việt của hệ thống biểu hiện $pET\text{-}28a(+)$ và chủng vi khuẩn E. coli $BL21\text{ }(DE3)$, phân tích ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ nuôi cấy đến độ hòa tan và cấu trúc của protein tái tổ hợp.
• Bàn luận về động học đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể ở thỏ sau các đợt tiêm nhắc lại mũi 3 và mũi 4.
• Biện luận về ý nghĩa lâm sàng của dấu ấn EPCA-2 trong việc khắc phục điểm yếu của chỉ số $tPSA$ trong "vùng xám", so sánh giá trị trung bình nồng độ EPCA-2 giữa bệnh nhân ung thư và bệnh nhân u lành tính/người khỏe mạnh, khẳng định tính khả thi của việc ứng dụng kháng thể tự sản xuất trong chẩn đoán sàng lọc UTTTL.

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp mới về mặt khoa học và công nghệ:

   • Đã thiết kế thành công trình tự gen nhân tạo mã hóa polyepitope của kháng nguyên EPCA-2 ($polEPCA\text{-}2$) chứa các trình tự epitope đặc hiệu ($EPCA\text{-}2.22$, $EPCA\text{-}2.19$, $EPCA\text{-}2.4$).
   • Xây dựng thành công quy trình công nghệ dòng hóa vector tái tổ hợp $pET\text{-}28a(+)/polEPCA\text{-}2$, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp $polEPCA\text{-}2$ trên hệ thống vi khuẩn E. coli $BL21\text{ }(DE3)$ với hiệu suất cao.
   • Thiết lập thành công phác đồ gây miễn dịch trên thỏ bằng protein tái tổ hợp $polEPCA\text{-}2$, thu nhận được kháng thể đa dòng thỏ có hiệu giá kháng thể cao và có tính đặc hiệu liên kết với kháng nguyên đích.

2. Đóng góp mới về mặt thực tiễn y học:

   • Bước đầu ứng dụng thành công kháng thể thỏ đặc hiệu kháng $polEPCA\text{-}2$ trong kỹ thuật ELISA để định lượng nồng độ dấu ấn EPCA-2 trên các mẫu huyết thanh lâm sàng tại Việt Nam.
   • Chứng minh được giá trị của kháng thể tự tạo trong việc phân biệt rõ rệt giữa nhóm bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt với nhóm u phì đại lành tính và nhóm nam giới khỏe mạnh.
   • Kết quả định lượng bằng kháng thể thỏ tự tạo có độ nhạy và độ đặc hiệu tương thích khi đối chứng với bộ kit thương phẩm chuẩn quốc tế CUSABIO, mở ra khả năng tự chủ nghiên cứu sản xuất các sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch trong nước với chi phí hợp lý.

3. Kiến nghị và đề xuất:

   • Ứng dụng phối hợp xét nghiệm định lượng EPCA-2 cùng với xét nghiệm PSA toàn phần ($tPSA$) nhằm nâng cao độ chính xác trong sàng lọc và chẩn đoán sớm UTTTL, đặc biệt đối với các trường hợp có nồng độ PSA nằm trong "vùng xám" (4–10 ng/mL).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Kháng thể tạo ra trong nghiên cứu là kháng thể đa dòng thu từ huyết thanh thỏ, phụ thuộc vào từng cá thể động vật thực nghiệm nên việc duy trì tính ổn định lâu dài giữa các lô sản xuất có thể gặp khó khăn.
  • Số lượng mẫu huyết thanh bệnh nhân thực nghiệm được thu thập và phân tích tại một cơ sở bệnh viện (Bệnh viện Hữu nghị) còn ở quy mô bước đầu.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục phát triển tạo dòng tế bào lai (hybridoma) để sản xuất kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) hoặc kháng thể đơn chuỗi ($scFv$) kháng EPCA-2 nhằm đảm bảo tính đồng nhất tuyệt đối về chất lượng sinh phẩm.
  • Mở rộng cỡ mẫu nghiên cứu trên các nhóm bệnh nhân UTTTL ở các giai đoạn mô bệnh học khác nhau (theo thang phân độ Gleason và giai đoạn TNM) tại nhiều trung tâm y tế.
  • Hoàn thiện quy trình công nghệ đóng gói bộ sinh phẩm (kit) ELISA hoàn chỉnh phục vụ thương mại hóa và ứng dụng thường quy tại các phòng xét nghiệm lâm sàng.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo giá trị cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên y sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật sinh học phân tử từ khâu thiết kế gen nhân tạo polyepitope, kỹ thuật tạo vector biểu hiện $pET\text{-}28a(+)$, tinh sạch protein dung hợp đến kỹ thuật gây miễn dịch tạo kháng thể trên động vật.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Miễn dịch học, Hóa sinh Y học, Công nghệ sinh học: Cung cấp phương pháp luận và dữ liệu thực nghiệm chuẩn mực về phát triển kháng thể chẩn đoán và thiết lập quy trình xét nghiệm ELISA.
• Bác sĩ lâm sàng Ngoại Tiết niệu và Ung bướu: Cung cấp cơ sở khoa học về các dấu ấn sinh học mới trong chẩn đoán sớm UTTTL, giúp hiểu rõ giới hạn của PSA và tiềm năng ứng dụng của EPCA-2 trong thực hành chẩn đoán phân biệt.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng nguyên EPCA-2 là gì và có cấu trúc các epitope như thế nào trong nghiên cứu?
EPCA-2 (Early prostate cancer antigen 2) là protein chất nền nhân tế bào có trọng lượng khoảng 30 kDa, biểu hiện đặc hiệu trong các tế bào ung thư tuyến tiền liệt. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 3 đoạn peptide epitope của EPCA-2 gồm: $EPCA\text{-}2.22$ (11 acid amin: Val-Ile-Gln-Pro-Tyr-Pro-Asn-Phe-Tyr-Met-Val), $EPCA\text{-}2.19$ (7 acid amin: Phe-Ala-Gln-Asp-Asn-Asp-Leu) và $EPCA\text{-}2.4$ (6 acid amin: Ser-Phe-Gly-Gln-Val-Lys).

2. Vì sao xét nghiệm PSA không phải là công cụ đặc hiệu tuyệt đối cho ung thư tuyến tiền liệt?
PSA là kháng nguyên đặc hiệu cho mô tuyến tiền liệt nhưng không đặc hiệu riêng cho ung thư. Nồng độ PSA huyết thanh cũng tăng trong các bệnh lý lành tính như u phì đại lành tính tuyến tiền liệt, viêm hoặc chấn thương tuyến tiền liệt. Trong "vùng xám" từ 4 đến 10 ng/mL, có khoảng 2/3 trường hợp sinh thiết cho kết quả mô lành tính, đồng thời vẫn có khoảng 15,2% người có $PSA \le 4\text{ ng/mL}$ mắc UTTTL.

3. Tác giả đã sử dụng hệ thống vector và tế bào chủ nào để biểu hiện protein tái tổ hợp?
Nghiên cứu sử dụng vector biểu hiện $pET\text{-}28a(+)$, dòng hóa và nhân bản trong vi khuẩn Escherichia coli chủng $DH5\alpha$, sau đó biến nạp và biểu hiện sinh tổng hợp protein tái tổ hợp $polEPCA\text{-}2$ trong chủng vi khuẩn E. coli $BL21\text{ }(DE3)$ dưới sự cảm ứng của IPTG.

4. Kháng thể thỏ đặc hiệu kháng polEPCA-2 được thu nhận và đánh giá hiệu giá tại các mốc thời điểm nào?
Kháng thể được tạo ra bằng phương pháp tiêm mẫn cảm thỏ bằng kháng nguyên $polEPCA\text{-}2$ đa mũi (mũi 1 đến mũi 4). Hiệu giá và nồng độ kháng thể trong huyết thanh thỏ được theo dõi và đánh giá sau mũi tiêm thứ 3 và mũi tiêm thứ 4 (tại các mốc ngày thứ 15 và ngày thứ 20 sau tiêm mũi 4) ở nhiều độ pha loãng khác nhau.

5. Kết quả ứng dụng kháng thể tự tạo trên mẫu huyết thanh lâm sàng có độ chính xác như thế nào so với bộ kit thương mại?
Kết quả định lượng nồng độ EPCA-2 bằng kháng thể thỏ tự tạo trong kỹ thuật ELISA cho thấy sự tương quan chặt chẽ với kết quả đo bằng bộ kit thương phẩm chuẩn quốc tế CUSABIO (CSB-EQ027679HU), thể hiện độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương trong việc phân biệt giữa nhóm UTTTL với nhóm u lành tính và nhóm nam giới khỏe mạnh.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đàm Thị Tú Anh đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu đề ra khi thiết kế và chế tạo thành công kháng nguyên tái tổ hợp polyepitope $polEPCA\text{-}2$, biểu hiện và tinh sạch protein trên hệ thống E. coli $BL21\text{ }(DE3)$. Công trình đã sản xuất thành công kháng thể đa dòng thỏ có độ đặc hiệu và hiệu giá cao kháng lại dấu ấn EPCA-2, đồng thời xây dựng quy trình ELISA định lượng cho kết quả tương đương với kit thương phẩm CUSABIO. Đây là công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học phân tử và miễn dịch học có giá trị khoa học và thực tiễn cao, đóng góp quan trọng vào định hướng nâng cao hiệu quả chẩn đoán sớm và chính xác bệnh lý ung thư tuyến tiền liệt tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIÊT Ung thư tuyến tiền liệt là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai trong các bệnh ung thư ở nam giới [7],[8]. Thực tế đã cho thấy UTTTL có thể điều trị khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện sớm. Tuy nhiên, giống như mọi ung thư, các triệu chứng lâm sàng của bệnh thường chỉ xuất hiện khi ung thư đã ở giai đoạn muộn, đây chính là nguyên nhân gây thất bại trong điều trị và dẫn tới tử vong của UTTLT [1],[2],[3].

Tình hình ung thư tuyến liền liệt trên thế giới Theo công bố của Tổ chức Y tế thể giới, tính đến hết năm 2012 trên toàn thế giới có khoảng 1.689 người mắc UTTTL, 307.481 người đã tử vong vì bệnh [7],[8]. Bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở các nước có nền kinh tế phát triển. Theo ước tính hiện nay có khoảng 913.000 đàn ông đã được chẩn đoán UTTTL ở Úc, Niu di lân, Tây Âu, Bắc Âu, và Bắc Mỹ. Bệnh có sự phân bố rộng ở những nước này là do ở đây việc sử dụng thử nghiệm PSA và sinh thiết trong chẩn đoán UTTTL rất phổ biến.

Chỉ tính riêng Châu Âu đã có 338.000 đàn ông được chẩn đoán UTTTL năm 2008. Trong đó tỷ lệ mắc thấp nhất ở các vùng Đông và Nam Âu, và cao nhất ở Bắc và Tây Âu [9].Theo thống kê của Hiệp hội ung thư Mỹ, năm 2015 ở Mỹ đã có khoảng 220.800 người mắc UTTTL mới và 158.040 người đã chết vì UTTTL [10]. Tỷ lệ mắc UTTTL có sự khác nhau đáng kể giữa các chủng tộc. Tỷ lệ mắc cao nhất ở người Mỹ da đen và thấp nhất ở người Mỹ gốc Á.

Trong 5 năm (2001-2005) tỷ lệ mắc UTTTL ở những người da đen cao nhất 249 người trên 100.000, ở tộc người da trắng là 157 người trên 100.000 và thấp nhất ở những người Mỹ gốc Á là 94 người trên 100. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 Tỷ lệ mắc UTTTL nhìn chung tăng nhanh theo tuổi hơn so với bất kỳ loại ung thư nào khác. Xu hướng mắc bệnh ngày càng tăng (từ năm từ 2001 đến 2008 tỷ lệ mắc tăng từ 32,624 người lên 37,051). Tỷ lệ bệnh có mối liên quan rõ ràng với tuổi.

Trong tổng số các trường hợp có bệnh ở đàn ông Anh trên 65 tuổi có tới 3/4 là UTTTL, còn ở lứa tuổi từ 70-74 thì UTTTL chiếm đa số [12],[13],[14]. Đàn ông Mỹ với tuổi dưới 65 có 57 ca trên 100.000, còn với tuổi trên 65 số mắc UTTTL tăng đến 975 ca tính trên 100. Tỷ lệ chết do UTTTL ở đàn ông Mỹ trên 65 tuổi hàng năm là 245 người trên 100. Tình hình ung thư tuyến tiền liệt tại Việt Nam Việt Nam tuy nằm trong số các nước có tỷ lệ UTTTL không cao.

Nhưng theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới số lượng mắc UTTTL ở Việt Nam hết năm 2012 là khoảng 1275 người. Trong đó số tử vong khoảng 872 người [7],[8]. Một nghiên cứu trong nước của Nguyễn Văn Hưng trên 633 bệnh nhân đã được phẫu thuật TTL. Kết quả mô bệnh họccho thấy tỷ lệ UTTTL được phát hiện là 7,9 % [16].

Trong đó chủ yếu gặp là dạng ung thư biểu mô tuyến biệt hóa cao (95,2%) [17].Ở một nghiên cứu khác công bố năm 2010, Vũ Lê Chuyên sàng lọc UTTTL cho 408 người tại bệnh viện Bình Dân- Thành phố Hồ Chí Minh có 87 người (21,3%) đã được tiến hành sinh thiết dựa trên mức PSA huyết thanh và kết quả siêu âm trực tràng. Có 10 người trong số đó (2,5%) được chẩn đoán là UTTTL, và những người này chủ yếu có điểm Gleason từ 5 tới 7 và bệnh ở giai đoạn sớm [18]. Ngoài ra, theo số liệu thống kê về số lượng bệnh nhân đã được chẩn đoán UTTTL năm 2010 của phòng hành chính tổng hợp các bệnh viện: Bệnh viện Việt Đức đã mổ là 56 ca, Viện K trung ương là 38 ca, Khoa u bướu bệnh viện Bạch Mai là 20 ca, và Bệnh viện u bướu Hà Nội năm 2010 có 16 ca đã được chẩn đoán và điều trị UTTTL. Qua các con số thống kê có thể thấy tuy tỷ lệ mắc UTTTL ở LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 Việt nam không cao, nhưng là bệnh đặc thù chỉ của nam giới, nên bệnh vẫn đứng hàng thứ ba trong các nguyên nhân gây chết do ung thư ở nam.

Yều cầu trong chẩn đoán và điều trị UTTTL Với sự hiểu biết ngày càng sâu về cơ chế phân tử, quá trình bệnh sinh, cơ chế di căn của UTTTL đã mang lại những tiến bộ trong việc chẩn đoán cũng như hoàn thiện thành công các phương thức điều trị UTTTL. Trước đây việc chẩn đoán UTTTL chủ yếu dựa vào các biểu hiện về: Lâm sàng như các rối loạn hay tắc nghẽn đường niệu; Siêu âm và nội soi đánh giá tình trạng, kích thước của tuyến tiền liệt; Phương pháp mô bệnh học tại các mẫu mô sinh thiết TTL. Nhìn chung các kĩ thuật sử dụng trong các phương pháp chẩn đoán cổ điển không tìm đến trực tiếp các tế bào bị ung thư vì vậy không chẩn đoán đặc hiệu ở giai đoạn sớm. Ngày nay, với việc tăng cường áp dụng công nghệ trong xác định cơ chế các bệnh lý khối u, các nghiên cứu đã chứng minh tế bào ác tính của TTL cũng như các tế bào ung thư nói chung được hình thành do sự tích lũy và phát triển thông qua một loạt các thay đổi về các yếu tố di truyền, các biến đổi nội bào, ngoại bào và yếu tố di truyền ngoài gen dẫn đến sự gia tăng bất thường của tế bào ác tính, sự tăng sinh mạch, lẩn tránh apoptosis, và di căn đến các cơ quan.

Đồng thời các nghiên cứu cũng phát hiện một số các phân tử mới chỉ hiện diện trong các tế bào ung thư; Một số các phân tử mới được sản xuất bởi các tế bào ung thư; Và một số phân tử được cơ thể sản xuất ra như một phản ứng với khối ung thư. Tất cả các phân tử này được gọi là dấu ấn sinh học hoặc dấu ấn khối u. Việc xác định các dấu ấn này cho phép chẩn đoán sớm, đặc hiệu bệnh UTTTL. Các dấu ấn phân tử có đặc điểm là cung cấp các thông tin về đặc tính sinh học của khối u và có thể được định tính bằng phương pháp mô bệnh học tại khối u, hoặc có thể định lượng được bằng một số phương pháp khác trong huyết thanh hoặc các dịch sinh học [19].

LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 Vì vậy, các yêu cầu hiện nay đối với UTTTL là bệnh phải được chẩn đoán sớm và chính xác. Các biện pháp điều trị phải đạt 2 mục tiêu: (1) Loại bỏ sớm và triệt để các tế bào ung thư (2) Không gây ảnh hưởng các tế bào lành tính. CÁC HIỂU BIẾT VỀ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT 1. Các phương pháp truyền thống chẩn đoán UTTTL 1.Chẩn đoán lâm sàng UTTTL UTTTL chia làm 2 thể lâm sàng: Thể tiềm tàng chưa biểu hiện triệu chứng và thể có triệu chứng lâm sàng.

 Thể tiềm tàng: Thường diễn biến thầm lặng kéo dài 5 đến 10 năm, biểu hiện nghèo nàn. Bệnh thường được chẩn đoán tình cờ qua thăm trực tràng thấy khối bất thường ở TTL, PSA tăng > 10 ng/mL hoặc chẩn đoán qua kết quả mô bệnh học sau mổ nội soi cắt u, mổ bóc u.  Thể có triệu chứng lâm sàng: - Cơ năng: triệu chứng sớm là các rối loạn tiểu tiện với các mức độ khác nhau khiến bệnh nhân khó chịu và phải đi khám. Biểu hiện muộn khi đã xuất hiện các triệu chứng của ung thư di căn như: Tiểu máu, xuất tinh ra máu, đau nhức xương, phù chân, liệt 2 chân, đại tiểu tiện không tự chủ, ho, khó thở, đau ngực … - Toàn thân: Mệt mỏi, gầy sút cân, kém ăn, thiếu máu, hạch ngoại vi… - Thực thể: Khám thấy các triệu chứng của tắc nghẽn đường tiểu.

Thăm trực tràng: Điển hình là thấy TTL có một tổn thương cứng, không đồng đều, không đau, tổn thương tại tuyến hay đã vượt khỏi tuyến, mất tính đối xứng của tuyến, kém di động so với tổ chức xung quanh. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các thăm dò cận lâm sàng  Chẩn đoán hình ảnh - Siêu âm ổ bụng: Cho phép đánh giá TTL về kích thước, khối lượng, độ cản âm, các nhân bất thường; bàng quang; thận- niệu quản… - Siêu âm qua trực tràng (SAQTT): Phát hiện các tổn thương khu trú giảm âm không đồng nhất so với nhu mô lành xung quanh, chỉ khoảng 1% UTTTL là tăng âm. Mất ranh giới giữa trong và ngoài tuyến, dấu hiệu xâm lấn tạng lân cận [16].

Theo nghiên cứu của Lê Ngọc Bằng năm 2005 (n= 53) với phương pháp siêu âm qua trực tràng (SAQTT), UTTTL được chẩn đoán với độ nhậy là 56,5% và độ đặc hiệu là 76,7%. Nhìn chung các phương pháp siêu âm đều rất phụ thuộc vào chủ quan của người làm kĩ thuật nên phương pháp này được khuyến cáo sử dụng trong kiểm tra hình thái của hệ niệu [20]. - Sinh thiết và làm xét nghiệm mô bệnh học TTL là xét nghiệm có giá trị nhất để chẩn đoán UTTTL với giá trị chẩn đoán đúng tới 96,2% và còn giúp phân loại mô bệnh học [20]. Tuy nhiên, việc chẩn đoán phân biệt về hình thái giữa tổn thương lành tính và ác tính khá phức tạp rất dễ gây nhầm lẫn do những tổn thương lành tính giống ung thư, có cùng độ tuổi với ung thư và không hề có dấu hiệu lâm sàng đặc trưng để nhận biết [21].

Phương pháp sinh thiết và làm xét nghiệm mô bệnh học thường chỉ được thực hiện ở bệnh nhân đã mổ điều trị. - Giải phẫu bệnh học UTTTL Một số tổn thương tiền ung thư: + Tân sản nội biểu mô tuyến tiền liệt (PIN). Tổn thương gồm 2 loại: PIN độ cao (High-grade PIN) và PIN độ thấp (Low-grade PIN). Các tổn thương của PIN độ cao có thể phá hủy lớp màng đáy nhưng chưa xâm nhập lớp mô đệm, PIN độ thấp không được đưa vào chẩn đoán do không thể phân biệt được với mô TTL lành tính [22].

Một số tác LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 giả cho rằng PIN là giai đoạn đầu trong quá trình phát triển UTTTL nhưng tần số của sự chuyển biến này cũng như khoảng cách giữa hai quá trình là chưa được biết. PIN tạo nên một ung thư biểu mô tại chỗ nhưng chúng ta không biết được liệu nó có trở nên xâm nhập hay di căn không và khi nào [23]. Vì vậy PIN cần được theo dõi để phát hiện sớm ung thư xâm nhập bằng siêu âm, xét nghiệm PSA định kỳ và sinh thiết lặp lại.