Tổng quan nghiên cứu

U nguyên bào võng mạc (UNBVM) là bệnh u ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em dưới 5 tuổi, với tỷ lệ mắc khoảng 1/15.000 đến 1/20.000 trẻ em, tương đương khoảng 9.000 trường hợp mới mỗi năm trên toàn cầu. Tỷ lệ tử vong do UNBVM ở châu Á lên tới 39%, cao hơn nhiều so với các khu vực phát triển như châu Âu, Canada và Mỹ (3–5%), chủ yếu do hạn chế trong tiếp cận dịch vụ y tế. Ở Việt Nam, số bệnh nhân UNBVM nhập viện tại Bệnh viện Mắt Trung ương đã tăng từ 29 ca năm 2004 lên 68 ca năm 2016, tập trung chủ yếu ở trẻ từ 2-3 tuổi. Phần lớn bệnh nhân nhập viện muộn, làm giảm cơ hội điều trị bảo tồn mắt và ảnh hưởng nghiêm trọng đến thị lực và tính mạng.

UNBVM có liên quan mật thiết đến đột biến gen RB1, một gen ức chế khối u nằm trên nhiễm sắc thể số 13. Khoảng 40% trường hợp UNBVM là thể di truyền, trong khi 60% còn lại là thể không di truyền. Việc xác định đột biến gen RB1 thể di truyền đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán sớm, điều trị hiệu quả và tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân. Mục tiêu nghiên cứu là sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân UNBVM tại Việt Nam, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1, làm rõ cơ chế phân tử gây bệnh và hỗ trợ công tác chẩn đoán, điều trị cũng như tư vấn di truyền.

Nghiên cứu được thực hiện trên 30 bệnh nhi UNBVM tại Bệnh viện Mắt Trung ương trong giai đoạn 2013-2018, sử dụng các kỹ thuật PCR, giải trình tự gen và MLPA để phát hiện đột biến gen RB1. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả quản lý và điều trị UNBVM tại Việt Nam, đồng thời góp phần giảm tỷ lệ tử vong và bảo tồn thị lực cho bệnh nhân.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Giả thuyết "two-hit" của Knudson: UNBVM hình thành do hai lần đột biến mất chức năng trên cả hai alen của gen RB1, lần đầu là đột biến dòng mầm, lần hai là đột biến soma, dẫn đến mất kiểm soát chu kỳ tế bào và hình thành khối u.
  • Cơ chế hoạt động của protein RB1: Protein RB1 (pRB) là chất ức chế khối u, điều hòa chu kỳ tế bào bằng cách gắn với yếu tố phiên mã E2F, ngăn cản tế bào bước vào pha tổng hợp DNA. Đột biến gen RB1 làm mất chức năng pRB, gây tăng sinh tế bào không kiểm soát.
  • Mô hình phân tích đột biến gen RB1: Đột biến gen RB1 đa dạng, bao gồm đột biến điểm, mất đoạn/lặp đoạn lớn, phân bố trên vùng promoter, exon và vùng nối intron-exon. Việc kết hợp giải trình tự gen và kỹ thuật MLPA giúp tăng độ nhạy phát hiện đột biến.

Các khái niệm chính bao gồm: đột biến gen RB1, thể di truyền và không di truyền của UNBVM, kỹ thuật PCR, giải trình tự gen Sanger, MLPA, và tư vấn di truyền.

Phương pháp nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: 30 bệnh nhi được chẩn đoán UNBVM tại Bệnh viện Mắt Trung ương từ 2013 đến 2018, độ tuổi từ 3 đến 36 tháng, gồm 21 nữ (70%) và 9 nam (30%). Trong đó, 9 bệnh nhi thuộc thể gia đình (30%) và 21 bệnh nhi thể tự phát (70%).
  • Thu thập mẫu: Mẫu máu ngoại vi 2 mL được lấy từ bệnh nhân và người thân trong gia đình (bố, mẹ, anh chị em nếu có), bảo quản ở -20°C.
  • Tách chiết DNA: Sử dụng kit E.A Blood DNA mini (Promega) để tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi, xác định nồng độ DNA bằng Qubit Fluorometer BR.
  • Kỹ thuật PCR: Thiết kế 23 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn bộ vùng mã hóa và vùng điều khiển của gen RB1, bao gồm promoter và 27 exon. Chu trình PCR được tối ưu hóa với nhiệt độ biến tính, gắn mồi và kéo dài phù hợp.
  • Giải trình tự gen Sanger: Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự hai chiều để phát hiện đột biến điểm, đa hình và các biến thể gen.
  • Kỹ thuật MLPA: Sử dụng bộ kit SALSA MLPA P047-D1 RB1 Probemix để phát hiện mất đoạn hoặc thêm đoạn lớn trên gen RB1, phân tích dữ liệu bằng phần mềm Coffalyzer.net với chỉ số Dosage Quotient (DQ).
  • Phân tích dữ liệu: So sánh trình tự gen với trình tự chuẩn trong GenBank, đối chiếu với cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 để xác định tính gây bệnh của các biến thể. Kết quả MLPA được chuẩn hóa và so sánh với mẫu đối chứng khỏe mạnh để xác định sự thay đổi số bản sao.

Quá trình nghiên cứu tuân thủ các quy định đạo đức nghiên cứu y sinh học, được Hội đồng Đạo đức Viện Nghiên cứu hệ gen phê duyệt, phù hợp với Tuyên bố Helsinki và tiêu chuẩn ARVO.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Đặc điểm lâm sàng và di truyền của bệnh nhân: Trong 30 bệnh nhi, 70% là nữ, 70% bị UNBVM hai mắt, 30% thể gia đình. Tỷ lệ thể gia đình cao cho thấy vai trò quan trọng của yếu tố di truyền trong bệnh lý này.

  2. Chất lượng và nồng độ DNA: DNA tổng số tách chiết có kích thước lớn (~20 kb) và độ tinh khiết cao, nồng độ DNA dao động trong khoảng 29-35 ng/µl, đảm bảo chất lượng cho các bước phân tích tiếp theo.

  3. Phát hiện đột biến gen RB1: Qua giải trình tự gen và MLPA, phát hiện nhiều đột biến điểm và mất đoạn lớn trên gen RB1 ở các bệnh nhân. Tỷ lệ phát hiện đột biến tăng lên khi kết hợp hai kỹ thuật, tương tự các nghiên cứu quốc tế với tỷ lệ phát hiện đột biến lên tới 52-78%.

  4. Mối liên hệ giữa đột biến và thể bệnh: Các bệnh nhân thể gia đình có tỷ lệ đột biến dòng mầm cao hơn, phù hợp với giả thuyết "two-hit". Một số trường hợp phát hiện đột biến mới chưa từng được báo cáo, góp phần mở rộng cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 tại Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định vai trò chủ đạo của đột biến gen RB1 trong cơ chế sinh bệnh UNBVM, đặc biệt là thể di truyền. Việc phát hiện đột biến dòng mầm giúp xác định nguy cơ mắc bệnh cho các thành viên trong gia đình, từ đó có thể thực hiện tư vấn di truyền và tầm soát sớm. So sánh với các nghiên cứu quốc tế, tỷ lệ phát hiện đột biến và phân bố kiểu hình tương đồng, chứng tỏ tính đại diện của mẫu nghiên cứu.

Việc kết hợp giải trình tự gen và MLPA đã nâng cao độ nhạy phát hiện đột biến, đặc biệt là các mất đoạn/lặp đoạn lớn mà giải trình tự đơn thuần khó phát hiện. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố đột biến trên gen RB1 và bảng thống kê tỷ lệ đột biến theo thể bệnh, giúp minh họa rõ ràng mối quan hệ giữa kiểu hình và kiểu gen.

Kết quả cũng cho thấy sự cần thiết của việc phát triển kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán sớm UNBVM tại Việt Nam, góp phần cải thiện tiên lượng và bảo tồn thị lực cho bệnh nhân. Đồng thời, nghiên cứu mở ra hướng đi cho các chương trình sàng lọc và tư vấn di truyền hiệu quả hơn trong tương lai.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai sàng lọc đột biến gen RB1 định kỳ cho bệnh nhân UNBVM và gia đình: Áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen kết hợp MLPA để phát hiện sớm đột biến dòng mầm, giảm thiểu tỷ lệ bệnh tái phát và hỗ trợ tư vấn di truyền. Thời gian thực hiện: ngay trong vòng 1 năm tới. Chủ thể thực hiện: các bệnh viện chuyên khoa mắt và trung tâm di truyền y học.

  2. Xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 tại Việt Nam: Tập hợp và cập nhật liên tục các đột biến phát hiện được để phục vụ nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng. Thời gian: 2 năm. Chủ thể: Viện Nghiên cứu hệ gen phối hợp với các bệnh viện.

  3. Đào tạo chuyên sâu cho cán bộ y tế về kỹ thuật phân tử và tư vấn di truyền: Nâng cao năng lực chẩn đoán và tư vấn cho bệnh nhân và gia đình, giúp họ hiểu rõ về nguy cơ và biện pháp phòng ngừa. Thời gian: 1-2 năm. Chủ thể: các trường đại học y khoa và viện nghiên cứu.

  4. Phát triển chương trình tầm soát sớm và tư vấn di truyền cho các gia đình có tiền sử UNBVM: Áp dụng kỹ thuật sinh thiết gai nhau và chọc ối để phát hiện đột biến gen RB1 ở thai nhi, giúp can thiệp kịp thời. Thời gian: 3 năm. Chủ thể: các trung tâm y tế sản khoa và di truyền.

  5. Tăng cường hợp tác quốc tế trong nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật mới: Học hỏi kinh nghiệm và cập nhật công nghệ giải trình tự thế hệ mới để nâng cao hiệu quả phát hiện đột biến. Thời gian: liên tục. Chủ thể: Viện nghiên cứu và các tổ chức y tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Bác sĩ chuyên khoa mắt và ung bướu nhi khoa: Nắm bắt kiến thức về cơ chế di truyền và kỹ thuật chẩn đoán phân tử để cải thiện quy trình điều trị và theo dõi bệnh nhân UNBVM.

  2. Chuyên gia di truyền y học và tư vấn di truyền: Sử dụng dữ liệu đột biến gen RB1 để tư vấn chính xác nguy cơ mắc bệnh cho các gia đình có tiền sử, hỗ trợ quyết định sinh sản và tầm soát sớm.

  3. Nhà nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử và ung thư học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân tích gen và kết quả để phát triển các nghiên cứu tiếp theo về đột biến gen và ung thư mắt.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học thực nghiệm, y học phân tử: Học tập quy trình nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR, giải trình tự gen và MLPA trong ứng dụng thực tiễn, nâng cao kỹ năng nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao cần sàng lọc đột biến gen RB1 ở bệnh nhân UNBVM?
    Sàng lọc giúp xác định thể di truyền của bệnh, từ đó tư vấn nguy cơ cho gia đình và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp. Ví dụ, phát hiện đột biến dòng mầm giúp tầm soát sớm cho các thành viên có nguy cơ cao.

  2. Kỹ thuật MLPA có ưu điểm gì so với giải trình tự gen?
    MLPA phát hiện được các mất đoạn hoặc thêm đoạn lớn mà giải trình tự gen không thể phát hiện hiệu quả. Kết hợp hai kỹ thuật giúp tăng độ nhạy và chính xác trong chẩn đoán.

  3. Tỷ lệ đột biến gen RB1 được phát hiện trong nghiên cứu là bao nhiêu?
    Tỷ lệ phát hiện đột biến tăng lên khoảng 52-78% khi kết hợp giải trình tự gen và MLPA, tương đương với các nghiên cứu quốc tế.

  4. Việc phát hiện đột biến gen RB1 có ảnh hưởng thế nào đến điều trị?
    Phát hiện đột biến giúp xác định thể bệnh, dự đoán tiên lượng và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp, đồng thời hỗ trợ tư vấn di truyền để phòng ngừa tái phát.

  5. Làm thế nào để tư vấn di truyền cho gia đình có người mắc UNBVM?
    Dựa trên kết quả xét nghiệm đột biến gen RB1, chuyên gia di truyền sẽ đánh giá nguy cơ cho các thành viên, hướng dẫn tầm soát sớm và các biện pháp phòng ngừa, bao gồm cả sàng lọc trước sinh.

Kết luận

  • Nghiên cứu đã sàng lọc thành công đột biến gen RB1 thể di truyền trên 30 bệnh nhân UNBVM tại Việt Nam, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 trong nước.
  • Kết hợp kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA nâng cao độ nhạy phát hiện đột biến, đặc biệt các mất đoạn/lặp đoạn lớn.
  • Phát hiện đột biến gen RB1 giúp xác định thể di truyền, hỗ trợ tư vấn di truyền và cải thiện hiệu quả điều trị, bảo tồn thị lực cho bệnh nhân.
  • Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển chương trình sàng lọc và tư vấn di truyền tại Việt Nam.
  • Đề xuất triển khai các giải pháp sàng lọc định kỳ, xây dựng cơ sở dữ liệu, đào tạo nhân lực và hợp tác quốc tế để nâng cao chất lượng chăm sóc bệnh nhân UNBVM.

Hành động tiếp theo là mở rộng nghiên cứu trên quy mô lớn hơn, áp dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới và phát triển chương trình tư vấn di truyền toàn diện nhằm giảm thiểu tác động của UNBVM tại Việt Nam. Các cơ sở y tế và viện nghiên cứu được khuyến khích phối hợp triển khai các giải pháp này để nâng cao chất lượng chăm sóc và điều trị bệnh nhân.