Tổng quan nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên toàn cầu. Theo thống kê năm 2012 của Globocan, UTĐTT đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc mới (9,7%) và thứ 4 về tỷ lệ tử vong do ung thư (8,5%). Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ 5 trong các loại ung thư phổ biến, với khoảng 4.561 ca mắc mới ở nam giới và 4.207 ca ở nữ giới mỗi năm. Bệnh có thể điều trị hiệu quả nếu được phát hiện sớm, tuy nhiên đa số bệnh nhân thường được chẩn đoán ở giai đoạn muộn, làm giảm khả năng điều trị thành công.

Nghiên cứu tập trung vào biến đổi gen MT-CO1 ty thể ở bệnh nhân UTĐTT nhằm đánh giá tình trạng biến đổi và mức độ dị tế bào chất của gen này trong các mẫu mô bệnh nhân. Gen MT-CO1 mã hóa cho tiểu phần cytochrome c oxidase I, đóng vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp ty thể và sản xuất năng lượng tế bào. Biến đổi gen MT-CO1 có thể ảnh hưởng đến chức năng ty thể, góp phần vào quá trình phát triển ung thư.

Đề tài được thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài quốc gia QG.05. Nghiên cứu có phạm vi từ năm 2015 đến 2017, sử dụng mẫu mô và máu của bệnh nhân UTĐTT tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội. Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ vai trò của biến đổi gen MT-CO1 trong UTĐTT, mở ra hướng phát triển các chỉ thị sinh học hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Di truyền ty thể và dị tế bào chất (heteroplasmy): Ty thể chứa hệ gen riêng (mtDNA) với đặc điểm không có protein histone bảo vệ, cơ chế sửa chữa ADN kém, dễ bị tổn thương bởi các gốc oxy phản ứng (ROS). Dị tế bào chất là hiện tượng tồn tại đồng thời các kiểu gen mtDNA khác nhau trong cùng một tế bào, ảnh hưởng đến biểu hiện bệnh lý.

  • Chuỗi hô hấp ty thể và phức hệ cytochrome c oxidase (COX): Phức hệ COX (phức hợp IV) là enzyme cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử, gồm các tiểu phần MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3 mã hóa bởi mtDNA. MT-CO1 chứa các trung tâm hoạt động quan trọng, chịu trách nhiệm chuyển electron và tạo nước, đồng thời ngăn ngừa hình thành ROS.

  • Biến đổi gen MT-CO1 và ung thư: Các đột biến điểm, mất đoạn và thay đổi số bản sao mtDNA có thể làm suy giảm chức năng chuỗi hô hấp, tăng ROS, ảnh hưởng đến quá trình apoptosis và phát triển ung thư. Nhiều nghiên cứu quốc tế đã xác định các biến đổi MT-CO1 liên quan đến ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và UTĐTT.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Nghiên cứu sử dụng 106 cặp mẫu mô (mô u và mô lân cận u) và 9 mẫu máu của bệnh nhân UTĐTT, cùng 99 mẫu máu người khỏe mạnh làm đối chứng. Mẫu được thu thập từ Bệnh viện K và Bệnh viện Việt Đức, Hà Nội.

  • Phương pháp phân tích:

    • Khuếch đại đoạn gen MT-CO1 bằng PCR với hai cặp mồi đặc hiệu (5851F-7595R và 6221F-6381R).
    • Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR để xác định các vị trí biến đổi nucleotide.
    • Phân tích PCR-RFLP sử dụng enzyme giới hạn BccI và TaaI để phát hiện biến đổi C6340T và T6253C.
    • Định lượng mức độ dị tế bào chất bằng phần mềm ImageJ dựa trên mật độ điểm ảnh của các băng ADN trên gel polyacrylamide.

  • Timeline nghiên cứu:

    • Thu thập mẫu và tách chiết ADN: 2015-2016
    • Thực hiện PCR, giải trình tự và PCR-RFLP: 2016
    • Phân tích dữ liệu và viết luận văn: 2016-2017

  • Lý do lựa chọn phương pháp: PCR-RFLP là phương pháp đơn giản, chi phí thấp, phù hợp để phát hiện đột biến điểm. Giải trình tự trực tiếp giúp xác định chính xác vị trí biến đổi. Phân tích dị tế bào chất bằng ImageJ cho phép đánh giá mức độ biến đổi trong mẫu mô.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phát hiện 16 vị trí biến đổi trên gen MT-CO1:
    Trong 27 mẫu mô được giải trình tự, có 16 biến đổi nucleotide, trong đó 3 biến đổi làm thay đổi axit amin (T6253C, C6340T, A7299G). Biến đổi C7028T xuất hiện với tần suất cao nhất (85,2%). Phần lớn biến đổi tồn tại ở dạng đồng tế bào chất (13/16).

  2. Biến đổi C6340T tồn tại ở dạng dị tế bào chất:
    Qua PCR-RFLP và phân tích gel polyacrylamide, phát hiện 3 mẫu mô u có biến đổi C6340T, trong đó 2 mẫu ở dạng dị tế bào chất. Biến đổi này cũng xuất hiện ở mô lân cận u nhưng không có ở mẫu máu bệnh nhân, chứng tỏ đây là đột biến soma.

  3. Biến đổi T6253C xuất hiện với tần suất thấp:
    Chỉ 2/106 mẫu mô có biến đổi T6253C, cả hai đều ở dạng đồng tế bào chất. Biến đổi này được phát hiện ở bệnh nhân nam, vị trí đại tràng, khác nhau về tuổi và giai đoạn bệnh.

  4. Mức độ dị tế bào chất khác biệt giữa mô u và mô lân cận u:
    Phân tích bằng ImageJ cho thấy tỷ lệ biến đổi C6340T trên mô u cao hơn nhiều so với mô lân cận u (ví dụ: 89,7% trên mô lân cận u và 100% trên mô u ở bệnh nhân #16689).

Thảo luận kết quả

Biến đổi gen MT-CO1 có thể ảnh hưởng đến chức năng của phức hệ cytochrome c oxidase, làm suy giảm quá trình phosphoryl hóa oxy hóa và tăng sinh ROS, góp phần vào sự phát triển ung thư. Kết quả phát hiện biến đổi C6340T ở dạng dị tế bào chất phù hợp với các nghiên cứu quốc tế cho thấy một số đột biến mtDNA tồn tại không đồng nhất trong tế bào ung thư, liên quan đến mức độ nặng nhẹ của bệnh.

So với các nghiên cứu trước, biến đổi C6340T được xác định là đột biến soma ở bệnh nhân UTĐTT Việt Nam, khác với nghiên cứu ở ung thư tuyến tiền liệt cho thấy đây là đột biến dòng mầm. Điều này cho thấy sự đa dạng về kiểu đột biến mtDNA giữa các loại ung thư và quần thể khác nhau.

Tỷ lệ biến đổi đồng tế bào chất cao cho thấy phần lớn mtDNA trong tế bào ung thư không bị biến đổi, nhưng sự hiện diện của dị tế bào chất có thể ảnh hưởng đến chức năng ty thể và quá trình sinh học tế bào. Kết quả này có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tần suất các biến đổi và tỷ lệ dị tế bào chất trong các mẫu mô.

Nghiên cứu cũng góp phần bổ sung dữ liệu về biến đổi gen MT-CO1 ở bệnh nhân UTĐTT Việt Nam, lĩnh vực còn ít được khai thác. Tuy nhiên, số lượng mẫu máu bệnh nhân hạn chế là điểm cần cải thiện trong các nghiên cứu tiếp theo.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Mở rộng quy mô nghiên cứu biến đổi mtDNA:
    Thực hiện nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn hơn, bao gồm cả mẫu máu và mô để đánh giá toàn diện biến đổi gen MT-CO1 và các gen ty thể khác. Thời gian thực hiện: 2-3 năm. Chủ thể: các viện nghiên cứu và bệnh viện chuyên khoa ung bướu.

  2. Phát triển chỉ thị sinh học dựa trên biến đổi MT-CO1:
    Xây dựng bộ kit PCR-RFLP hoặc real-time PCR để sàng lọc nhanh các biến đổi đặc hiệu như C6340T phục vụ chẩn đoán sớm UTĐTT. Thời gian: 1-2 năm. Chủ thể: phòng xét nghiệm y học phân tử.

  3. Nghiên cứu cơ chế sinh học của biến đổi MT-CO1:
    Thực hiện các nghiên cứu chức năng để làm rõ ảnh hưởng của biến đổi MT-CO1 đến hoạt động enzyme cytochrome c oxidase, sản xuất ROS và quá trình apoptosis trong tế bào ung thư. Thời gian: 3 năm. Chủ thể: các nhóm nghiên cứu sinh học phân tử.

  4. Tăng cường đào tạo và hợp tác quốc tế:
    Đào tạo kỹ thuật phân tích mtDNA hiện đại, hợp tác với các trung tâm nghiên cứu quốc tế để cập nhật công nghệ và dữ liệu mới. Thời gian: liên tục. Chủ thể: trường đại học, viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền học:
    Luận văn cung cấp dữ liệu chi tiết về biến đổi gen MT-CO1 và phương pháp phân tích PCR-RFLP, giải trình tự, hỗ trợ nghiên cứu sâu về di truyền ty thể và ung thư.

  2. Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và y học phân tử:
    Thông tin về biến đổi mtDNA có thể giúp phát triển các chỉ thị sinh học mới, nâng cao khả năng chẩn đoán và theo dõi UTĐTT.

  3. Sinh viên cao học và nghiên cứu sinh:
    Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về thiết kế nghiên cứu, kỹ thuật phân tích gen và xử lý dữ liệu trong lĩnh vực ung thư và di truyền.

  4. Các phòng xét nghiệm y học phân tử:
    Hướng dẫn thực hành kỹ thuật PCR-RFLP, giải trình tự và phân tích dị tế bào chất bằng phần mềm ImageJ, giúp nâng cao chất lượng xét nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Biến đổi gen MT-CO1 có vai trò gì trong ung thư đại trực tràng?
    Biến đổi gen MT-CO1 ảnh hưởng đến chức năng enzyme cytochrome c oxidase, làm giảm hiệu quả chuỗi hô hấp, tăng ROS và góp phần vào sự phát triển ung thư.

  2. Phương pháp PCR-RFLP có ưu điểm gì trong phát hiện đột biến mtDNA?
    PCR-RFLP đơn giản, chi phí thấp, dễ thực hiện và cho phép phát hiện nhanh các đột biến điểm đặc hiệu trên mtDNA.

  3. Dị tế bào chất là gì và tại sao quan trọng?
    Dị tế bào chất là sự tồn tại đồng thời của mtDNA bình thường và đột biến trong cùng một tế bào, ảnh hưởng đến biểu hiện bệnh và mức độ nghiêm trọng của ung thư.

  4. Tại sao cần phân tích mức độ dị tế bào chất bằng phần mềm ImageJ?
    ImageJ giúp định lượng chính xác tỷ lệ mtDNA đột biến so với bình thường, cung cấp thông tin về mức độ biến đổi và liên quan đến tiến triển bệnh.

  5. Biến đổi C6340T có ý nghĩa gì trong nghiên cứu này?
    Biến đổi C6340T được phát hiện ở dạng dị tế bào chất trong mô u và mô lân cận u, là đột biến soma có thể liên quan đến sự phát triển UTĐTT, chưa từng được công bố ở bệnh nhân Việt Nam trước đây.

Kết luận

  • Phát hiện 16 vị trí biến đổi trên gen MT-CO1 trong mẫu mô bệnh nhân UTĐTT, trong đó 3 biến đổi làm thay đổi axit amin.
  • Biến đổi C6340T tồn tại ở dạng dị tế bào chất, có thể là đột biến soma liên quan đến UTĐTT.
  • Mức độ dị tế bào chất khác biệt rõ rệt giữa mô u và mô lân cận u, ảnh hưởng đến chức năng ty thể.
  • Kết quả nghiên cứu bổ sung dữ liệu về biến đổi gen MT-CO1 ở bệnh nhân UTĐTT Việt Nam, mở hướng phát triển chỉ thị sinh học mới.
  • Đề xuất mở rộng nghiên cứu, phát triển kỹ thuật chẩn đoán và nghiên cứu cơ chế sinh học liên quan đến biến đổi mtDNA.

Luận văn khuyến khích các nhà nghiên cứu và chuyên gia y học phân tử tiếp tục khai thác vai trò của biến đổi gen ty thể trong ung thư, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị UTĐTT.