Luận văn: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân ung thư tại Việt Nam

Nghiên cứu sàng lọc đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư tại Việt Nam, nhằm xác định tần suất đột biến và liên quan đến khả năng mắc bệnh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Thủy
• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Sàng lọc đột biến gen RB1: Phát hiện sớm ung thư di truyền ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC
• 1.2. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.3. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM
• 1.4. Phân loại UNBVM
• 1.5. Điều trị UNBVM
• 1.6. Tư vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc
• 1.7. Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc
• 1.8. GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1
• 1.9. CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Dụng cụ, trang thiết bị
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA genomic
• 2.4.3. Phương pháp khuếch đại gen (PCR)
• 2.4.4. Phương pháp giải trình tự gen
• 2.4.5. Phương pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
• 2.4.6. Phương pháp phân tích kết quả
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập mẫu nghiên cứu
• 3.2. Tách chiết DNA tổng số
• 3.3. PCR khuếch đại các đoạn gen RB1
• 3.4. Phát hiện đột biến bằng giải trình tự gen RB1
• 3.5. Phát hiện thay đổi cấu trúc gen bằng MLPA
• 3.6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về bệnh u nguyên bào võng mạc

U nguyên bào võng mạc (UNBVM) là một trong những loại bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em dưới 5 tuổi, chủ yếu do đột biến gen RB1 gây ra. Tỷ lệ mắc bệnh này khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ, với khoảng 9000 trường hợp mới mỗi năm. Tại Việt Nam, số lượng bệnh nhân UNBVM đang gia tăng, tuy nhiên, phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn, dẫn đến việc mất cơ hội điều trị hiệu quả. Việc phát hiện sớm đột biến gen RB1 có vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Theo thống kê, khoảng 40% trường hợp UNBVM là thể di truyền, cho thấy sự cần thiết của việc sàng lọc gen trong các gia đình có tiền sử bệnh. Việc hiểu rõ về gen di truyền này không chỉ giúp trong việc điều trị mà còn trong việc tư vấn di truyền cho các thành viên trong gia đình.

1.1 Tình hình u nguyên bào võng mạc ở Việt Nam

Tại Việt Nam, số liệu về tỷ lệ mắc UNBVM còn hạn chế. Tuy nhiên, tại Bệnh viện Mắt Trung ương, số bệnh nhân mắc UNBVM đã tăng từ 29 người vào năm 2004 lên 68 người vào năm 2016. Điều này cho thấy sự gia tăng đáng kể của bệnh. Hầu hết bệnh nhân đều nhập viện ở giai đoạn muộn, dẫn đến việc điều trị không hiệu quả. Việc sàng lọc gen RB1 cần được thực hiện thường xuyên để phát hiện sớm các trường hợp có nguy cơ cao, từ đó có thể can thiệp kịp thời và bảo tồn thị lực cho bệnh nhân.

II. Đột biến gen RB1 và vai trò của nó trong ung thư di truyền

Đột biến trên gen RB1 là nguyên nhân chính gây ra UNBVM. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 13 và có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của tế bào. Hơn 1750 đột biến gen RB1 đã được phát hiện, cho thấy sự đa dạng và phức tạp của bệnh. Việc xác định các đột biến gen này không chỉ giúp trong việc chẩn đoán mà còn trong việc tiên lượng bệnh. Các phương pháp như giải trình tự gen và Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) đã được áp dụng để phát hiện các đột biến di truyền. Điều này không chỉ giúp xác định nguy cơ mắc bệnh cho các thành viên trong gia đình mà còn hỗ trợ trong việc lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

2.1 Phát hiện đột biến gen RB1

Việc phát hiện đột biến gen RB1 có thể thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen, trong khi MLPA giúp phát hiện các đột biến lớn như mất đoạn hoặc lặp đoạn. Những phương pháp này đã cho thấy độ nhạy cao trong việc phát hiện đột biến di truyền ở bệnh nhân UNBVM. Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy rằng việc sàng lọc gen RB1 có thể giúp phát hiện sớm bệnh và cải thiện khả năng sống sót cho bệnh nhân.

III. Tầm quan trọng của sàng lọc đột biến gen RB1

Sàng lọc đột biến gen RB1 có ý nghĩa quan trọng trong việc phát hiện sớm ung thư di truyền. Việc phát hiện sớm không chỉ giúp trong việc điều trị mà còn trong việc tư vấn di truyền cho các thành viên trong gia đình. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sàng lọc gen có thể giúp giảm tỷ lệ tử vong và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Hơn nữa, việc hiểu rõ về gen di truyền này cũng giúp các bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị chính xác hơn, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

3.1 Ứng dụng thực tiễn của sàng lọc gen

Việc áp dụng các phương pháp sàng lọc gen RB1 trong thực tiễn đã cho thấy nhiều lợi ích. Các bệnh nhân có nguy cơ cao có thể được theo dõi chặt chẽ hơn, từ đó có thể can thiệp kịp thời khi có dấu hiệu bệnh. Hơn nữa, việc tư vấn di truyền cho các gia đình có tiền sử bệnh cũng trở nên dễ dàng hơn, giúp họ hiểu rõ hơn về nguy cơ mắc bệnh và các biện pháp phòng ngừa. Điều này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe cho các thế hệ sau mà còn giảm gánh nặng cho hệ thống y tế.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

U nguyên bào võng mạc (UNBVM) là bệnh u ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em dưới 5 tuổi, với tỷ lệ mắc khoảng 1/15.000 đến 1/20.000 trẻ em, tương đương khoảng 9.000 trường hợp mới mỗi năm trên toàn cầu. Tỷ lệ tử vong do UNBVM ở châu Á lên đến 39%, cao hơn nhiều so với châu Âu, Canada và Mỹ (3-5%) do sự khác biệt trong tiếp cận y tế. Ở Việt Nam, số bệnh nhân mắc UNBVM tại Bệnh viện Mắt Trung ương đã tăng từ 29 ca năm 2004 lên 68 ca năm 2016, chủ yếu ở trẻ từ 2-3 tuổi. Phần lớn bệnh nhân nhập viện muộn, làm giảm cơ hội điều trị bảo tồn mắt. UNBVM có liên quan mật thiết đến đột biến gen RB1, một gen ức chế khối u nằm trên nhiễm sắc thể số 13, với hơn 1.750 đột biến đã được ghi nhận trên toàn thế giới.

Mục tiêu nghiên cứu là sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền ở trẻ em mắc UNBVM tại Việt Nam nhằm làm rõ cơ chế phân tử gây bệnh, hỗ trợ chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình. Nghiên cứu thực hiện trên 30 bệnh nhi được chẩn đoán UNBVM tại Bệnh viện Mắt Trung ương trong giai đoạn 2013-2018, sử dụng kỹ thuật PCR, giải trình tự gen và MLPA để phát hiện đột biến điểm và mất đoạn lớn trên gen RB1. Kết quả nghiên cứu góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 ở Việt Nam, nâng cao hiệu quả quản lý lâm sàng và dự đoán nguy cơ cho các thành viên trong gia đình bệnh nhân.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên giả thuyết "two-hit" của Knudson, cho rằng sự hình thành UNBVM cần hai lần đột biến mất chức năng trên cả hai alen của gen RB1. Protein pRB do gen RB1 mã hóa có vai trò ức chế chu kỳ tế bào bằng cách gắn với yếu tố phiên mã E2F, ngăn chặn tế bào bước vào pha tổng hợp DNA (pha S). Khi pRB bị bất hoạt do đột biến hoặc methyl hóa quá mức, tế bào tăng sinh không kiểm soát dẫn đến ung thư. Các đột biến gen RB1 bao gồm đột biến điểm (vô nghĩa, sai nghĩa, dịch khung), đột biến tại vị trí nối exon-intron và mất đoạn lớn. Mô hình phân tích kết hợp giải trình tự gen và kỹ thuật MLPA giúp phát hiện đa dạng các dạng đột biến, tăng độ nhạy trong chẩn đoán.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Gen RB1 và protein pRB
• Đột biến dòng mầm và đột biến soma
• Giả thuyết "two-hit"
• Kỹ thuật PCR, giải trình tự Sanger và MLPA
• Phân tích Dosage Quotient (DQ) trong MLPA

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành trên 30 bệnh nhi được chẩn đoán UNBVM tại Bệnh viện Mắt Trung ương từ 2013 đến 2018, độ tuổi từ 3 đến 36 tháng. Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và người thân trong gia đình được thu thập, bảo quản ở -20°C. DNA tổng số được tách chiết bằng kit E.A Blood DNA mini, xác định nồng độ bằng Qubit Fluorometer với nồng độ DNA dao động trong khoảng 20-50 ng/µl.

Phương pháp phân tích gồm:

• Khuếch đại gen RB1 bằng PCR với 23 cặp mồi đặc hiệu bao phủ vùng promoter và toàn bộ 27 exon.
• Giải trình tự gen RB1 bằng kỹ thuật Sanger để phát hiện đột biến điểm và đột biến nhỏ.
• Kỹ thuật MLPA sử dụng bộ kit SALSA MLPA P047-D1 RB1 Probemix để phát hiện mất đoạn hoặc lặp đoạn lớn trên gen RB1.
• Phân tích kết quả giải trình tự bằng phần mềm BioEdit và đối chiếu với cơ sở dữ liệu RB1 Gene Mutation Database.
• Phân tích dữ liệu MLPA bằng phần mềm Coffalyzer.net, tính toán Dosage Quotient (DQ) để xác định sự thay đổi số bản sao gen.

Quy trình nghiên cứu tuân thủ các quy định đạo đức nghiên cứu y sinh học, được Hội đồng Đạo đức Viện Nghiên cứu hệ gen phê duyệt. Phương pháp chọn mẫu là toàn bộ bệnh nhi được chẩn đoán UNBVM trong giai đoạn nghiên cứu, đảm bảo tính đại diện. Phân tích dữ liệu sử dụng phương pháp mô tả và so sánh tỷ lệ đột biến giữa các nhóm bệnh nhân.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Trong 30 bệnh nhi UNBVM, tỷ lệ nữ chiếm 70%, nam 30%. Tỷ lệ UNBVM hai mắt là 70%, một mắt 30%. Về tính chất di truyền, 30% là thể gia đình, 70% thể tự phát.
2. DNA tổng số tách chiết đạt chất lượng cao với nồng độ trung bình khoảng 30-40 ng/µl, đảm bảo cho các bước phân tích tiếp theo.
3. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen RB1 gây bệnh là 60% (18/30 bệnh nhân). Trong đó, 72,22% bệnh nhân có đột biến ảnh hưởng cả hai mắt, 27,78% ảnh hưởng một mắt.
4. Phân loại đột biến: 33,33% là đột biến vô nghĩa, 33,33% đột biến dịch khung, 27,56% đột biến sai nghĩa. Hơn 83% đột biến tập trung ở các exon mã hóa domain A (exons 12-18) và domain B (exons 19-23) của protein pRB, vùng quan trọng trong điều hòa chu kỳ tế bào.
5. Kỹ thuật MLPA phát hiện các đột biến mất đoạn lớn trên gen RB1, góp phần tăng độ nhạy phát hiện đột biến so với chỉ giải trình tự gen.
6. Một số trường hợp đột biến dòng mầm được phát hiện ở người thân trong gia đình, cho thấy vai trò quan trọng của tư vấn di truyền.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo quốc tế về tỷ lệ đột biến gen RB1 trong UNBVM, đồng thời khẳng định tính đa dạng và phân bố không đồng nhất của các đột biến trên gen RB1. Tỷ lệ đột biến 60% tương đương với các nghiên cứu ở các nước phát triển, cho thấy kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự và MLPA là phương pháp hiệu quả để sàng lọc đột biến. Việc tập trung đột biến ở các exon mã hóa domain A và B của pRB phản ánh vai trò quan trọng của các vùng này trong chức năng ức chế khối u.

Sự khác biệt về tỷ lệ tử vong và giai đoạn nhập viện muộn ở Việt Nam so với các nước phát triển nhấn mạnh nhu cầu nâng cao nhận thức và phát triển kỹ thuật chẩn đoán sớm. Kết quả cũng cho thấy tầm quan trọng của việc sàng lọc đột biến dòng mầm để tư vấn di truyền, giúp giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh ở thế hệ sau.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phân bố tỷ lệ đột biến theo loại và vị trí exon, bảng so sánh tỷ lệ đột biến giữa thể gia đình và thể tự phát, cũng như biểu đồ tỉ lệ bệnh nhân theo giới tính và số mắt bị ảnh hưởng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai rộng rãi kỹ thuật sàng lọc đột biến gen RB1 tại các cơ sở y tế chuyên khoa mắt trên toàn quốc nhằm phát hiện sớm bệnh nhân UNBVM, đặc biệt là các trường hợp thể di truyền. Thời gian thực hiện: 1-2 năm. Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế phối hợp với các bệnh viện mắt trung ương và địa phương.
2. Phát triển chương trình tư vấn di truyền chuyên sâu cho các gia đình có người mắc UNBVM, giúp nhận biết nguy cơ và hướng dẫn tầm soát sớm cho trẻ em trong gia đình. Thời gian: 6-12 tháng. Chủ thể: Trung tâm di truyền y học, bệnh viện mắt.
3. Tăng cường đào tạo và nâng cao nhận thức cho bác sĩ nhãn khoa và chuyên gia di truyền về vai trò của đột biến gen RB1 trong UNBVM và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử hiện đại. Thời gian: liên tục. Chủ thể: các trường đại học y, viện nghiên cứu.
4. Xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 của bệnh nhân UNBVM Việt Nam để phục vụ nghiên cứu và quản lý bệnh hiệu quả hơn, đồng thời hỗ trợ phát triển các phương pháp điều trị cá thể hóa. Thời gian: 2-3 năm. Chủ thể: Viện nghiên cứu hệ gen, Bộ Y tế.
5. Khuyến khích nghiên cứu ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để nâng cao độ nhạy và phát hiện các đột biến khảm, giúp cải thiện chẩn đoán và điều trị. Thời gian: 1-2 năm. Chủ thể: viện nghiên cứu, bệnh viện chuyên khoa.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ nhãn khoa và chuyên gia y tế: Nghiên cứu cung cấp kiến thức cập nhật về cơ chế phân tử và kỹ thuật chẩn đoán UNBVM, hỗ trợ trong việc lựa chọn phương pháp điều trị và tư vấn bệnh nhân.
2. Chuyên gia di truyền y học và tư vấn di truyền: Luận văn là tài liệu tham khảo quan trọng để hiểu rõ về đột biến gen RB1, giúp tư vấn chính xác nguy cơ di truyền cho gia đình bệnh nhân.
3. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành y học phân tử, di truyền học: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu hiện đại, làm nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về ung thư mắt và các bệnh di truyền.
4. Các cơ quan quản lý y tế và hoạch định chính sách: Thông tin về tỷ lệ mắc, đặc điểm đột biến và đề xuất giải pháp giúp xây dựng chính sách y tế phù hợp nhằm nâng cao hiệu quả phòng chống và điều trị UNBVM.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần sàng lọc đột biến gen RB1 ở bệnh nhân UNBVM?
   Sàng lọc giúp xác định thể di truyền của bệnh, từ đó tư vấn nguy cơ cho các thành viên trong gia đình và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp. Ví dụ, phát hiện đột biến dòng mầm giúp theo dõi và tầm soát sớm cho trẻ em trong gia đình.

2. Kỹ thuật MLPA có ưu điểm gì trong phát hiện đột biến gen RB1?
   MLPA giúp phát hiện các đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn lớn mà giải trình tự gen không thể phát hiện được, tăng độ nhạy chẩn đoán. Nghiên cứu cho thấy MLPA kết hợp giải trình tự làm tăng tỷ lệ phát hiện đột biến lên đến 78%.

3. Tỷ lệ đột biến gen RB1 ở bệnh nhân UNBVM Việt Nam như thế nào?
   Nghiên cứu cho thấy khoảng 60% bệnh nhân UNBVM có đột biến gen RB1 gây bệnh, tương đương với các nghiên cứu quốc tế, trong đó đa số đột biến tập trung ở các exon mã hóa domain chức năng của protein pRB.

4. Làm thế nào để phát hiện sớm UNBVM ở trẻ có nguy cơ cao?
   Phát hiện sớm dựa trên sàng lọc di truyền gen RB1 cho trẻ có tiền sử gia đình mắc UNBVM, kết hợp khám mắt định kỳ và sử dụng các kỹ thuật hình ảnh như soi đáy mắt, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính.

5. Việc phát hiện đột biến gen RB1 có ảnh hưởng đến phương pháp điều trị không?
   Có. Biết được loại đột biến giúp lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp, ví dụ hóa trị giảm tế bào, phẫu thuật bảo tồn mắt hoặc khoét bỏ nhãn cầu. Ngoài ra, phát hiện đột biến còn giúp theo dõi nguy cơ tái phát và di căn.

Kết luận

• Nghiên cứu đã xác định được tỷ lệ đột biến gen RB1 gây bệnh ở 60% bệnh nhi UNBVM tại Việt Nam, với đa dạng loại đột biến tập trung ở các exon mã hóa domain chức năng của protein pRB.
• Kỹ thuật kết hợp PCR, giải trình tự Sanger và MLPA là phương pháp hiệu quả để phát hiện đột biến điểm và mất đoạn lớn trên gen RB1.
• Kết quả nghiên cứu góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen RB1 tại Việt Nam, hỗ trợ chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình.
• Đề xuất triển khai rộng rãi kỹ thuật sàng lọc gen RB1 và chương trình tư vấn di truyền nhằm nâng cao hiệu quả quản lý bệnh UNBVM.
• Các bước tiếp theo bao gồm mở rộng nghiên cứu trên quy mô lớn hơn, ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới và phát triển các chính sách y tế hỗ trợ phòng chống UNBVM.

Hành động ngay hôm nay: Các cơ sở y tế và chuyên gia di truyền cần phối hợp triển khai sàng lọc đột biến gen RB1 để bảo vệ sức khỏe thị lực cho trẻ em Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU U nguyên bào võng mạc (retinoblastoma, UNBVM) là bệnh u ác tính mắt thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1). UNBVM xuất hiện với tỷ lệ khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ tƣơng ứng với khoảng 9000 trƣờng hợp mới mỗi năm, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-8]. Trên thế giới, ƣớc tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm. Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y tế [9].

Hầu hết các trƣờng hợp UNBVM đều liên quan đến sự mất chức năng của cả hai alen của gen áp chế khối u RB1 nằm trên nhiễm sắc thể số 13 [7]. Khoảng 40% trẻ UNBVM là thể di truyền trong khi 60% trƣờng hợp còn lại là thể không di truyền [10]. RB1 là gen áp chế khối u đầu tiên đƣợc tìm thấy, nằm tại vị tr 13q14.2, có k ch thƣớc DNA là 183 kb. Cho đến nay, hơn 1750 đột biến gen RB1 khác nhau phát hiện đƣợc ở bệnh nhân UNBVM và đã đƣợc công bố trên ngân hàng dữ liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene Mutation Database) [11], và các đột biến gen RB1 gây bệnh UNBVM không đồng nhất và xuất hiện rải rác trên vùng promoter và 27 exon.

Việc xác định đột biến gen RB1 gây bệnh trên bệnh nhân UNBVM và gia đình là cơ sở để thực hiện điều trị cho bệnh nhân hiệu quả và tƣ vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân. Việc chẩn đoán sớm và phƣơng pháp điều trị th ch hợp có vai trò quan trọng trong việc tiên lƣợng và khả năng sống sót của bệnh nhân UNBVM [12]. Ở các nƣớc phát triển, mục tiêu của điều trị là bảo tồn thị lực và việc kiểm tra gen RB1 đã đƣợc áp dụng nhƣ là một kiểm tra định kì ở nhóm bệnh nhân UNBVM [13-16]. Ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ cơ hội điều trị bảo tồn mắt.

Mặc dù rất nhiều kinh ph đã đƣợc đầu tƣ cho việc 1 phát triển các kỹ thuật điều trị lâm sàng nhƣng phát triển các kĩ thuật sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán sớm của bệnh UNBVM gần đây mới thực sự phát triển. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di truyền với khả năng sinh bệnh, do đó việc phát hiện sớm đột biến trên gen RB1 đóng vai trò quan trọng trong quản lý lâm sàng cũng nhƣ dự đoán nguy cơ mắc bệnh của các thành viên trong gia đình ngƣời bệnh. Cho đến nay, việc điều trị cho bệnh nhân UNBVM ở giai đoạn sớm đã đƣợc thực hiện khá hiệu quả ở Việt Nam, tuy nhiên hiểu biết về cơ chế phân tử và nguyên nhân di truyền đối với bệnh này còn rất hạn chế. Các công tác tƣ vấn di truyền hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện nhằm đem lại sự hiểu biết cần thiết cho gia đình bệnh nhân, đặc biệt trong các gia đình đã có ngƣời mắc bệnh nhƣ cha/mẹ hay anh/chị em ruột.

Do nhu cầu thực tiễn của bệnh nhân UNBVM, luận văn: “Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam” đƣợc tiến hành với muc tiêu: Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền gây bệnh ở trẻ em mắc u nguyên bào võng mạc. Nội dung nghiên cứu nhƣ sau:  Thu thập mẫu máu của những bệnh nhi UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung ƣơng, và ngƣời thân trong gia đình nhƣ mẫu bố/mẹ, anh chị em ruột (nếu có).  Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi DNA tại vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang mã của gen RB1.  Sử dụng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) nhằm phát hiện các đột biến thêm/mất đoạn lớn trên gen RB1.

 Phân t ch kết quả nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân UNBVM tại Việt Nam. 2  nghĩa của đề tài: Nghiên cứu này bƣớc đầu tao ra cơ sở dữ liệu đột biến gen của bênh nhân UNBVM ở Việt Nam. Kết quả thu đƣợc có thể làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh ở mức độ phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn đoán, chữa trị và tƣ vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình ngƣời bệnh UNBVM. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC 1. Tình hình u nguyên bào võng mạc trên thế giới và ở Việt Nam U nguyên bào võng mạc là bệnh ác tính nội nhãn phổ biến ở trẻ em phát sinh t các tế bào võng mạc nguyên thủy, bệnh thƣờng gặp ở trẻ em dƣới 5 tuổi, gây ra bởi đột biến trên gen RB1 (retinoblastoma 1). Có khoảng 9000 trƣờng hợp UNBVM mới đƣợc phát hiện mỗi năm, tỷ lệ xuất hiện khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ tƣơng ứng với, bệnh xảy ra ở cả hai giới tính nam và nữ, không phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-7]. Trên thế giới, ƣớc tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết do UNBVM hàng năm.000 ca UNBVM mắc mới đƣợc phát hiện ở các nƣớc đang phát triển, với tỷ lệ tử vong cao dƣới 15%.

Tỷ lệ tử vong ở châu Á (39%) cao hơn nhiều so với châu Âu, cao thứ hai thế giới (sau châu Phi 70%), Canada và Mỹ (3–5%) do khoảng cách về tiếp cận y tế [9]. Trong 100 năm qua, có sự tiến bộ đáng kể trong việc chẩn đoán và quản lý UNBVM theo nguyên tắc ƣu tiên: Sống sót, Toàn cầu & Thị lực (Life, Globe & Vision) [9, 17]. Ở Việt Nam, chƣa có số liệu đầy đủ về tỷ lệ mắc UNBVM hàng năm. Tại Bệnh viện Mắt trung ƣơng, số bệnh nhân mắc u nguyên bào võng mạc hàng năm tăng t 29 ngƣời (2004) lên 68 ngƣời (2016), chủ yếu tập trung ở trẻ em lứa tuổi t 2-3 tuổi (theo hội thảo quốc tế chuyên đề về UNBVM ở Bệnh viện Mắt Trung ƣơng năm 2017).

Tuy số lƣợng không nhiều so với các bệnh lý khác nhƣng đây là căn bệnh hiểm nghèo, nếu không đƣợc điều trị đúng, xử lý sớm sẽ ảnh hƣởng tới thị lực thậm tr t nh mạng ngƣời bệnh. Phần lớn bệnh nhân nhập viện ở giai đoạn muộn nên bị lỡ cơ hội điều trị bảo tồn mắt. Một số bệnh nhân đƣợc sinh ra trong gia đình có tiền sử bệnh UNBVM đã cho thấy vai trò của yếu tố di truyền 4 với khả năng sinh bệnh. Hiện nay, ở Việt Nam, chẩn đoán phân tử bệnh UNBVM đã bắt đầu phát triển và đã đạt đƣợc một số thành tựu.

Năm 2005, Nguyễn Công Kiệt và Nguyễn Tr Dũng đã sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào nghiên cứu 30 ca võng mạc ở Việt Nam và xác định đƣợc một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn ở vị tr nhiễm sắc thể 13q14 [1]. T năm 2013 nhóm nghiên cứu của chúng tôi, đứng đầu là tiến sỹ Nguyễn Hải Hà, đã bắt đầu xây dựng quy trình sàng lọc biến đổi di truyền cho bệnh nhân UNBVM Việt Nam sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp. Năm 2014, nhóm đã công bố hai đột biến gen thể di phát hiện đƣợc t mẫu máu của bệnh nhân UNBVM [2]. Năm 2016, nhóm đã xây dựng thành công phƣơng pháp sàng lọc đột biến gen RB1 thông qua phân t ch bản phiên mã của gen này [3].

Kết hợp hai phƣơng pháp x t nghiệm trên DNA và cDNA trong sàng lọc đột biến gen RB1 ở một gia đình có hai con mắc bệnh ung thƣ võng mạc đã phát hiện đƣợc ngƣời cha và hai con đều mang đột biến gây ảnh hƣởng tới sự tổ hợp lại mRNA của RB1. Năm 2017, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp MLPA nhằm phát hiện những đột biến mất đoạn/lặp đoạn lớn trên gen RB1 ở những bệnh nhân UNBVM [4]. Kết quả nghiên cứu cho thấy phƣơng pháp này hoàn toàn đáng tin cậy để áp dụng nhằm tăng độ nhạy trong chẩn đoán di truyền của bệnh UNBVM. Năm 2018, nhóm nghiên cứu đã công bố một số kết quả bƣớc đầu của nghiên cứu đặc điểm di truyền của gen RB1 của 34 bệnh nhân UNBVM trên tạp ch Molecular Vision (Mỹ), [18].

Cũng trên tạp ch này gần đây nhất, nhóm nghiên cứu ph a Nam của giáo sƣ Nguyễn Công Kiệt đã công bố kết quả kiểm tra di truyền trên mẫu máu và mẫu u của 50 bệnh nhân UNBVM điều trị tại Bệnh viện mắt thành phố Hồ Ch Minh. Với nghiên cứu này, các tác giả đã xác định dƣợc phổ đột biến gen RB1 bao gồm cả đột biến sinh dƣỡng và đột biến dòng mầm trên nhóm bệnh nhân này [19] 5 1. Biểu hiện lâm sàng của UNBVM. Biểu hiện UNBVM rất đa dạng bao gồm đồng tử có màu trắng, lác mắt, giảm thị lực và rung giật nhãn cầu, ngoài ra ở giai đoạn muộn có thể thấy các triệu chứng khác nhƣ: mắt đỏ, đau nhức do tăng nhãn áp thứ phát, nhìn mờ, lồi mắt, viêm tổ chức quanh hốc mắt, đồng tử giãn, mủ tiền phòng, mống mắt dị sắc, trẻ chậm phát triển.

Đồng tử trắng là dấu hiệu phổ biến nhất ở trẻ bị UNBVM chiếm 60%, khi nhìn vào mắt bé, cha mẹ thấy có ánh trắng (nhất là vào ban đêm hoặc trong phòng tối vì khi đó đồng tử giãn), cũng có thể thấy 1 hoặc 2 đồng tử màu trắng hay vàng khi chụp ảnh buổi tối có dùng đèn flash. Dấu hiệu nhận biết chính thứ hai là trẻ bị lác/lé, chiếm 20%. Đặc biệt, nếu bé bị lác trong vòng 6 tháng tuổi thì nên nghi ngờ có UNBVM [21]. Chẩn đoán UNBVM có thể tiến hành theo các phƣơng pháp sau: * Chẩn đoán lâm sàng: Soi đáy mắt là khám nghiệm quan trọng để chẩn đoán bệnh.

Tổn thƣơng ở võng mạc có biểu hiện khác nhau tùy theo hƣớng phát triển của u. Các phƣơng pháp chẩn đoán hình ảnh giúp xác định chẩn đoán. Khám siêu âm và chụp cắt lớp có thể thấy rõ k ch thƣớc và vị tr khối u hoặc thấy hình ảnh canxi hóa trong khối u-dấu hiệu đặc trƣng của UNBVM. Ngoài ra còn có thể xác định sự phát triển của khối u ra ngoài nhãn cầu hay vào nội sọ.

Chụp MRI cho ph p khảo sát hình ảnh nhãn cầu, hốc mắt và não [22]. Quét xƣơng toàn thân bằng Technetium-99m và chụp cắt lớp phát xạ positron Fluorine-18 pos ourodeoxyglucose (PET CT) cũng rất hữu ch để phát hiện sớm di căn [23]. Hầu hết trẻ em bị UNBVM không cần phải tiến hành chụp xƣơng. Phƣơng pháp này thƣờng chỉ sử dụng khi UNBVM bị nghi ngờ rằng có thể đã lan rộng ra khỏi mắt [11].1 Hình ảnh siêu âm của Hình 1.