MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [1]. Cũng như các bệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam dioxin do chiến tranh dé lại [2]. Đặc trưng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bao non ác tính lan at các tế bào tủy va máu ngoại vi bình thường. Đặc điểm của các tế bào này là có sự rỗi loạn về protein và cấu trúc tế bào.
Bệnh gồm nhiều thé loại khác nhau, theo tiêu chuẩn FAB thì được ký hiệu từ MO đến M7 và L1 đến L3 [16]. Việc xếp loại đúng, nhanh chóng và chính xác thé bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho người bệnh. Đặc biệt trong thé M3 có nguy cơ chảy máu cao thì việc chân đoán nhanh chóng, chính xác còn có ý nghĩa quyết định đến sinh mạng bệnh nhân [6]. Tiêu chuẩn FAB dựa trên kết quả xét nghiệm của ba phương pháp là miễn dịch, đi truyền và nhuộm hóa học tế bào.
Phương pháp miễn dịch và di truyền sử dụng các kỹ thuật đòi hỏi máy móc hiện đại đắt tiền và nguồn lao động có trình độ cao. Phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ gồm các kỹ thuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu ức chế với NaF và không ức chế. Esteraza đặc hiệu chỉ có mặt trên các tế bào dòng tủy còn các dòng khác âm tính hoặc dương tính với cường độ rất thấp. Esteraza không đặc hiệu có mặt ở nhiều dòng tế bào khác nhau nhưng ở dong monoxit thì bị ức chế bằng NaF.
Ngoài hai kỹ thuật nhuộm PAS và nhuộm Sudan dùng dé phát hiện glucozit và lipit thì sáu kỹ thuật còn lại là nhuộm phát hiện enzym. Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bảo theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dich và di truyền. Phương pháp xác định tế bào thuộc dòng tủy dựa chủ yếu vào kết quả nhuộm peroxidaza và esteraza đặc hiệu. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza thường không ồn định do dé bị phân hủy bởi ánh sang vi thé cần bồ sung thêm kỹ thuật nhuộm esteraza có độ ôn định hơn.
Hiện nay, cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu là naphtol AS-D cloaxetat được được hãng Sigma bán trên thị trường với giá thành rat cao (13 triệu/1 gam). Qua nghiên cứu tài liệu có thé thấy, cơ chất naphtol AS-D cloaxetat được tổng hop theo phương pháp truyền thống là ngưng tụ axit 3-hidroxi-2-naphtoic với o-toluidin, sau đó este hóa bằng cloaxetyl clorua. Phản ứng ngưng tụ cần thời gian dài, hiệu suất thấp; quá trình chuyên hóa naphtol AS-D thành dẫn xuất cloaxetat hiệu suất cũng không ổn định. 10 Do việc nghiên cứu thiếu hệ thong nên chưa xác định được mối tương quan giữa cau trúc và hoạt tính, chưa tìm được cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.
Quá trình nhuộm chưa được tối ưu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và tốn kém cho bệnh nhân. Nước ta chưa sản xuất được cơ chất, phải nhập ngoại. Cơ chất dé bị phân huỷ ở nhiệt độ > -20°C, là một trong những khó khăn lớn cho việc vận chuyên và bảo quản. Những thách thức đó đã làm cho phương pháp xét nghiệm này chưa được triển khai rộng rãi ở Việt Nam.
Vi vậy, đề tài nghiên cứu tổng hợp cơ chất, chế tao kit và tối ưu hóa quy trình nhuộm esteraza đặc hiệu dé phân loại tế bào bạch cầu phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc. Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp mới, hiệu quả cao đề tổng hợp cơ chất; khảo sát một cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao; tối ưu hóa các điều kiện nhuộm và chế tạo kít nhuộm esteraza đề phân loại tế bảo phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu. Nội dung nghiên cứu I- Nghiên cứu tổng hop các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu nguoi. 2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thé-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu nguoi.
3- Xác định cấu trúc của các hop chất điều chế được bang các phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phố IR, 'H-NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử. 4-Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người vả tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. 5- Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm esteraza. 6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương pháp đơn hình và ứng dụng dé chế tạo bộ kit nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu người từ cơ chất tong hợp được.
TONG QUAN TÀI LIEU HOA HỌC CAC HOP CHAT 3-HIDROXI-(N-THE)NAPHTALEN-2-CACBOXAMIT 3-Hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit có cau trúc như sau: R¿ là các vòng thom có các nhóm thế thường ở vị trí ocfo- hoặc para- Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit được ứng dụng rất rộng rãi trong thực tiễn. Trong công nghiệp chúng được dùng làm nguyên liệu đầu dé sản xuất phẩm màu, đặc biệt là mực in. Do quy trình sản xuất đơn giản, gam màu phong phú, độ bền cao, nên loại hợp chất này đã có lúc chiếm tỷ trọng rất lớn đối với thị trường phẩm màu thế giới. Vai trò của họ hợp chất này trở nên đặc biệt quan trọng khi người ta sử dụng chúng làm nguyên liệu sản xuất cơ chất để nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người.
Do những ứng dụng quan trọng như vậy, nên loại hợp chất này đã thu hút sự quan tâm to lớn của các nhà khoa học. Số công trình công bố trong lĩnh vực này rất lớn và đa dạng. Trong khuôn khổ tổng quan này chi đề cập các phương pháp tông hợp quan trọng, những tinh chất hóa lý cơ bản và một số ứng dụng phô biến liên quan đến họ hợp chất này. Tổng hợp các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit Theo tai liệu [45] người ta tổng hợp 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacbox- amit chủ yếu theo phương pháp trực tiếp một giai đoạn hoặc phương pháp gián tiếp hai giai đoạn.
Phương pháp một giai đoạn Phương pháp này lần đầu tiên được Schopf là nhà hóa học người Đức dùng dé tông hợp naphtol AS vào năm 1892 [45], dựa trên phan ứng ngưng tụ giữa axit 3-hidroxi-2-naphtoic với anilin có mặt PCl;. Phương pháp nay còn được dùng cho tới ngày nay với một số cải tiến, thay vì dùng PCI; vừa làm tác nhân vừa làm dung môi, người ta tiến hành phản ứng trong các dung môi dé tăng hiệu suất sản pham [11]. Đây còn được gọi là phương pháp tông hợp trực tiếp. Quá trình phản ứng được mô tảtrên sơ đồ 1.1 a ì HạN _" S i Clobenzen (Xylen) N S 2 | ——R + CTR —————> Ï ZA cl 70-80°C PS a~ a le > -R N WN COOH II CONH S + ĐH Clobenzen (Xylen) CIS | _" OH a 130-136°C/3h OH _ile ~! Phan ứng được thực hiện bằng cách khuấy hỗn hợp của anilin, axit 3-hiđroxi- 2-naphtoic va một lượng dư PCI, trong dung môi hữu cơ như clobenzen hoặc toluen ở nhiệt độ thấp, thường là dưới 40°C, tốt nhất là từ 0°C đến 25°C.
Khi phản ứng xảy ra, nhiệt độ sẽ tự tăng lên trên 40°C. Đề đuổi HCl người ta phải đun hỗn hợp ở nhiệt độ 75°C đến 180°C trong thời gian vài giờ. Hiệu suất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen- 2-cacboxamit đạt từ 60-70%. Theo phương pháp trực tiếp một giai đoạn, người ta còn có thể tổng hợp 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit bằng cách cho axit 3-hidroxi-2-naphtoic tác dụng với lượng dư SOCI;.
Sau khi khuấy 10 phút, người ta bắt đầu cho thêm dan xuất anilin thế vào hỗn hợp [14]. Dung môi sử dụng trong phương pháp này là axetonitrin. Quá trình phản ứng được mô tả trên sơ đồ 1.2 OH PCI;/SOCI; NH + ——> OH OH Tuy nhiên trong quá trình thêm anilin thé vào hỗn hợp, HCI tach ra từ SOCI; phản ứng rất mãnh liệt tạo kết tủa phenylamoni clorua làm cho hiệu suất 3-hiđroxi- (N-thé)naphtalen-2-cacboxamit thu được rất thấp. Tổng hợp 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit bằng phương pháp hai giai đoạn Ngoài phương pháp một giai đoạn, 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit còn được tông hợp bằng phương pháp gián tiếp hai giai đoạn [10, 33, 35].
Trong giai đoạn 1, người ta tiến hành phan ứng giữa axit 3-hiđroxi- 2-naphtoic với SOCI; dé điều chế sản phẩm trung gian 3-hiđroxi-2-naphtoyl clorua. Phan ứng được mô tả trên sơ đồ 1. COCI -- HCI ~SO;_ SO OH Ở giai đoạn 2, cho naphtoyl clorua tác dụng với anilin thé tạo ra san pham cuối là 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit. Quá trình phan ứng được mô ta bang sơ đồ 1.4 COCI — Anlin re) — -HỢ OH Do naphtoyl clorua dé phân huỷ trong không khí, nên phản ứng phải được thực hiện trong điều kiện bảo ôn rất nghiêm ngặt.
Hiệu suất phản ứng này cũng không cao, chỉ khoảng 60%. Kock-Yee Law và cs [59] đã thực hiện phản ứng hai giai đoạn theo cách khác. Ở giai đoạn một, các tac giả đã đun hỗn hợp 2,8-dihidroxi-3-naphtoic với phenol có mặt xúc tác ngưng tụ là POC; ở 125°C, dưới áp suất khí nitơ. Dé tránh phản ứng phụ đối với nhóm 8-OH, lượng dư phenol đã được sử dụng vừa làm tác nhân vừa làm dung môi.
Sau 2 giờ hiệu suất phenyl 2,8-dihidroxi-3-naphtoat đạt 76%. Ở giai đoạn 2, tiến hành đun hồi lưu hỗn hợp phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat và các dẫn xuất anilin thế tương ứng ở 250°C trong dung môi là N-metyl pyroliđinon (NMP) dưới áp suất nitơ. Sau 2 giờ hiệu suất N-thé-2,8-dihidroxinaphtalen-3-cacboxamit đạt trên 89%. Quá trình phan ứng được mô tả trên sơ đồ 1.5 Oo ` — oO - COOH —————> 0 OH POC];, 125 C OH x oO wt > ° S : € | —x OH NMP eG OH X =H, p-F, p-Cl, o-C;H;; NMP = N-metyl pyrolidinon.
Tính chất của các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit 1. Tính chất vật lý 3-Hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit là những chat ran có nhiệt độ nóng chảy 6n định và nhiệt độ sôi tương đối cao [45], như có thé thấy trên bang 1.