Nghiên Cứu Tổng Hợp và Ứng Dụng Kit Nhuộm Tế Bào Bạch Cầu Trong Chẩn Đoán Ung Thư

Luận án tiến sĩ nghiên cứu hóa học tổng hợp cơ chất chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng

• Tác giả: Tran Van Tinh
• Người hướng dẫn: Luu Van Bei
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Tổng Hợp và Ứng Dụng Kit Nhuộm Tế Bào Bạch Cầu Trong Chẩn Đoán Ung Thư
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
• 1. CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng hợp các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit
• 1.1.1. Phương pháp một giai đoạn
• 1.1.2. Tổng hợp 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit bằng phương pháp hai giai đoạn
• 1.1.3. Tính chất của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
• 1.1.3.1. Tính chất vật lý
• 1.1.3.2. Tính chất phổ
• 1.1.3.3. Tính chất hóa học
• 1.1.4. Ứng dụng của các 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit
• 1.1.4.1. Ứng dụng để sản xuất phẩm màu
• 1.1.4.2. Sản xuất cơ chất để nhuộm tế bào bạch cầu
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất và thiết bị
• 2.1.1. Các dụng cụ và thiết bị
• 2.2. Phần thực nghiệm
• 2.2.1. Điều chế các dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit
• 2.2.2. Điều chế các dẫn xuất este 3-(N-thé)naphtalen-2-yl cacboxylat
• 2.2.3. Tối ưu hóa phản ứng nhuộm esteraza bằng phương pháp đơn hình
• 2.2.4. Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng các cơ chất este tổng hợp theo kỹ thuật đã tối ưu hóa
• 2.2.5. Nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng naphtol AS-OL a-clopropionat naphtol AS-OL
• 2.2.6. Pha chế kit nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người bằng các cơ chất naphtol AS-OL a-clopropionat tổng hợp được
• 2.2.7. Đánh giá thời gian ổn định của bộ kit
• 2.2.8. Ứng dụng bộ kit để chẩn đoán dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp
• 2.2.9. Nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Tổng hợp 3-hidroxi-(N-thé)naphtalen-2-cacboxamit
• 3.2. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phương pháp truyền thống
• 3.3. Tổng hợp các naphtol AS-X bằng phương pháp lò vi sóng
• 3.4. Tổng hợp 3-hiđroxi-[N-(xiclohexyl/phenyl/naphtyl/antraxyl)]naphtalen-2-cacboxamit
• 3.5. Tổng hợp 3-(N-thé-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat
• 3.6. Nghiên cứu nhuộm tế bào bạch cầu bằng các cơ chất tổng hợp được
• 3.7. Nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu
• 3.8. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng của cơ chất đến kết quả nhuộm
• 3.9. Nghiên cứu mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc của các cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử
• 3.10. Nghiên cứu chế tạo kit bằng cơ chất mới naphtol AS-OL a-clopropionat
• 3.10.1. Thành phần bộ kit cho 100 tiêu bản nhuộm
• 3.10.2. Tài liệu hướng dẫn sử dụng bộ kit naphtol AS-OL a-clopropionat
• 3.10.3. Đánh giá chất lượng bộ kit
• 3.10.4. Nghiên cứu thời gian bảo quản và sử dụng kit
• 3.10.5. Ứng dụng bộ kit để chẩn đoán dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC PHỐ, ẢNH VÀ CÁC TÀI LIỆU KHÁC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Kit Nhuộm Tế Bào Bạch Cầu và Ung Thư

Nghiên cứu tổng hợp và ứng dụng kit nhuộm tế bào bạch cầu đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và phân loại các bệnh ung thư máu như leukemia và lymphoma. Tế bào bạch cầu, hay còn gọi là tế bào máu trắng, có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Sự bất thường về số lượng và hình thái tế bào bạch cầu có thể là dấu hiệu của nhiều bệnh lý, đặc biệt là ung thư. Kit nhuộm tế bào bạch cầu giúp các nhà khoa học và bác sĩ phân biệt các loại tế bào bạch cầu khác nhau, xác định các marker tế bào bạch cầu, từ đó đưa ra chẩn đoán chính xác và lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị ung thư máu ở Việt Nam.

1.1. Tầm quan trọng của Tế Bào Bạch Cầu trong Chẩn đoán Ung thư

Tế bào bạch cầu đóng vai trò then chốt trong hệ miễn dịch, sự bất thường trong số lượng, hình thái và chức năng có thể báo hiệu các bệnh lý nghiêm trọng, bao gồm ung thư. Việc xác định chính xác loại tế bào bạch cầu bị ảnh hưởng là bước quan trọng để chẩn đoán và phân loại các bệnh như leukemia và lymphoma. Nghiên cứu tổng hợp tập trung vào việc sử dụng kit nhuộm tế bào bạch cầu để nhanh chóng và chính xác phân biệt các loại tế bào bạch cầu, từ đó cải thiện hiệu quả chẩn đoán ung thư.

1.2. Giới thiệu về Kit Nhuộm Tế Bào Bạch Cầu Khái niệm và ứng dụng

Kit nhuộm tế bào bạch cầu là tập hợp các hóa chất và quy trình được thiết kế để nhuộm và phân biệt các loại tế bào bạch cầu khác nhau. Quá trình này dựa trên các đặc tính hóa học và sinh học độc đáo của từng loại tế bào. Các kit nhuộm được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm huyết học và tế bào học để hỗ trợ chẩn đoán, theo dõi tiến triển bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị ung thư.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Ung Thư Máu và Vai Trò Kit

Chẩn đoán ung thư máu gặp nhiều thách thức do sự đa dạng của các loại bệnh và sự phức tạp của các xét nghiệm. Phương pháp chẩn đoán truyền thống thường tốn thời gian, đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm và có thể cho kết quả không chính xác. Sự thiếu hụt các kit nhuộm tế bào bạch cầu chất lượng cao, đặc biệt là các kit được sản xuất trong nước, làm tăng chi phí và thời gian chẩn đoán. Nghiên cứu tổng hợp hướng đến giải quyết những thách thức này bằng cách phát triển các kit nhuộm hiệu quả, chính xác và dễ sử dụng, góp phần cải thiện chất lượng chẩn đoán ung thư máu ở Việt Nam. Theo tài liệu, phương pháp nhuộm hóa học tế bào dựa trên các kỹ thuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu ức chế với NaF và không ức chế.

2.1. Hạn chế của phương pháp Chẩn đoán Hình thái truyền thống

Phương pháp chẩn đoán hình thái truyền thống dựa vào việc quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi. Phương pháp này có tính chủ quan cao và đòi hỏi kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Việc phân biệt các loại tế bào bạch cầu có hình thái tương đồng có thể gặp nhiều khó khăn, dẫn đến sai sót trong chẩn đoán. Việc sử dụng các kit nhuộm tế bào bạch cầu chuẩn hóa giúp giảm thiểu tính chủ quan và nâng cao độ chính xác của chẩn đoán.

2.2. Vai trò của Kit Nhuộm trong cải thiện độ chính xác Chẩn đoán

Kit nhuộm tế bào bạch cầu sử dụng các thuốc nhuộm đặc hiệu để làm nổi bật các đặc điểm khác nhau của tế bào bạch cầu, giúp phân biệt chúng dễ dàng hơn. Việc này tăng độ chính xác và khách quan của chẩn đoán, đồng thời giảm thời gian cần thiết để phân tích mẫu bệnh phẩm. Điều này đặc biệt quan trọng trong các trường hợp ung thư máu cấp tính, nơi thời gian là yếu tố quyết định đến hiệu quả điều trị.

III. Phương Pháp Nhuộm Tế Bào Bạch Cầu Nâng Cao Chẩn Đoán Ung Thư

Phương pháp nhuộm tế bào bạch cầu được tối ưu hóa là chìa khóa để nâng cao hiệu quả chẩn đoán ung thư. Việc lựa chọn cơ chất nhuộm phù hợp, tối ưu hóa quy trình nhuộm và chuẩn hóa các tiêu chí đánh giá kết quả là những yếu tố quan trọng. Nghiên cứu tổng hợp tập trung vào việc phát triển các phương pháp nhuộm mới, sử dụng các cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời đơn giản hóa quy trình để giảm thiểu sai sót và tiết kiệm thời gian. Một số phương pháp chính bao gồm: nhuộm hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry), phương pháp nhuộm tế bào sử dụng các marker tế bào bạch cầu.

3.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Nhuộm Esteraza Đặc Hiệu Bạch Cầu

Việc tối ưu hóa quy trình nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu là cần thiết để đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm nồng độ cơ chất, thời gian ủ, nhiệt độ và pH của dung dịch nhuộm. Việc sử dụng các phương pháp thống kê như quy hoạch thực nghiệm đơn hình giúp xác định các điều kiện nhuộm tối ưu một cách hiệu quả. Theo tài liệu, quá trình nhuộm chưa được tối ưu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và tốn kém cho bệnh nhân.

3.2. Ứng Dụng Nhuộm Hóa Mô Miễn Dịch Immunohistochemistry

Nhuộm hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép xác định các marker tế bào bạch cầu đặc hiệu trên mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này sử dụng các kháng thể để nhận diện các protein đặc trưng cho từng loại tế bào bạch cầu. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch giúp xác định chính xác dòng tế bào ác tính trong ung thư máu.

IV. Ứng Dụng Thực Tế Kit Nhuộm Chẩn Đoán và Tiên Lượng Bệnh

Kit nhuộm tế bào bạch cầu có nhiều ứng dụng thực tế trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh ung thư máu. Kết quả nhuộm giúp phân loại chính xác loại ung thư, xác định giai đoạn bệnh và đánh giá nguy cơ tái phát. Thông tin này rất quan trọng để lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và theo dõi hiệu quả điều trị. Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy mối liên hệ giữa các dấu ấn sinh học ung thư được phát hiện bằng kit nhuộm và khả năng đáp ứng điều trị của bệnh nhân.

4.1. Phân Loại Dòng Tế Bào trong Bệnh Bạch Cầu Cấp bằng Kit

Kit nhuộm đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp. Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu giúp phân biệt giữa các dòng tủy và dòng lympho, từ đó xác định loại bạch cầu cấp (ví dụ: bạch cầu cấp dòng tủy M3 có nguy cơ chảy máu cao). Theo tài liệu, kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu giúp phân biệt giữa các dòng tủy và dòng lympho, từ đó xác định loại bạch cầu cấp.

4.2. Sử Dụng Kit để Tiên Lượng Bệnh và Đánh Giá Hiệu Quả Điều Trị

Một số marker tế bào bạch cầu được phát hiện bằng kit nhuộm có thể được sử dụng để tiên lượng bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị. Ví dụ, sự hiện diện của một số marker nhất định có thể cho thấy bệnh nhân có khả năng đáp ứng tốt với một loại thuốc cụ thể. Việc theo dõi sự thay đổi của các marker này trong quá trình điều trị giúp đánh giá hiệu quả điều trị và điều chỉnh phác đồ điều trị khi cần thiết.

V. Kết Luận Triển Vọng Phát Triển Kit Nhuộm cho Chẩn Đoán Ung Thư

Nghiên cứu về kit nhuộm tế bào bạch cầu hứa hẹn mang lại nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị ung thư máu. Việc phát triển các kit nhuộm có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và dễ sử dụng sẽ giúp cải thiện chất lượng chẩn đoán, tiên lượng bệnh và theo dõi hiệu quả điều trị. Trong tương lai, các kit nhuộm có thể được tích hợp với các công nghệ sinh học phân tử để tạo ra các công cụ chẩn đoán toàn diện và chính xác hơn.

5.1. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Kit Nhuộm Thế Hệ Mới

Các hướng nghiên cứu phát triển kit nhuộm thế hệ mới bao gồm: Phát triển các cơ chất nhuộm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn. Tích hợp các công nghệ sinh học phân tử như PCR và giải trình tự gen vào kit nhuộm. Phát triển các kit nhuộm đa thông số, cho phép đồng thời xác định nhiều marker tế bào bạch cầu trên một mẫu bệnh phẩm.

5.2. Vai Trò của Nghiên Cứu Tổng Hợp trong Phát Triển Kit tại Việt Nam

Nghiên cứu tổng hợp đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các kit nhuộm tế bào bạch cầu chất lượng cao, giá cả phải chăng và phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam. Việc chủ động sản xuất kit nhuộm trong nước giúp giảm sự phụ thuộc vào nhập khẩu, tiết kiệm chi phí và nâng cao khả năng tiếp cận các dịch vụ chẩn đoán ung thư cho người dân.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh lý ác tính của cơ quan tạo máu, chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% tổng số các bệnh lý về máu. Bệnh đặc trưng bởi sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào non ác tính trong tủy xương và máu ngoại vi. Việc phân loại chính xác thể bệnh theo tiêu chuẩn của Hội Huyết học Pháp - Mỹ - Anh (FAB) từ M0 đến M7 (dòng tủy) và L1 đến L3 (dòng lympho) có vai trò quyết định trong việc chỉ định phác đồ điều trị, đặc biệt đối với thể M3 có nguy cơ biến chứng chảy máu nghiêm trọng. Tiêu chuẩn FAB kết hợp ba phương pháp: miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào. Trong đó, nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu là kỹ thuật trọng yếu để xác định dòng tủy.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định xuất phát từ thực trạng: cơ chất thương mại dùng cho phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu hiện nay là naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma-Aldrich có giá thành rất cao (khoảng 13 triệu đồng/gam), quy trình tổng hợp truyền thống qua phản ứng ngưng tụ giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic và o-toluidin kéo dài nhiều giờ với hiệu suất thấp. Đồng thời, cơ chất này kém bền, dễ bị phân hủy ở nhiệt độ trên -20°C, gây trở ngại lớn cho việc bảo quản và vận chuyển. Hơn nữa, việc thiếu các nghiên cứu hệ thống về mối tương quan định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính (QSAR) cũng như việc chưa tối ưu hóa quy trình nhuộm khiến kết quả phân loại dòng tế bào bằng hóa học tế bào tại Việt Nam có tỷ lệ sai lệch phải điều chỉnh lại qua kỹ thuật miễn dịch và di truyền lên tới 29,7%.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án bao gồm:

1. Xây dựng phương pháp mới có hiệu quả cao để tổng hợp các dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất.
2. Khảo sát có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất este để tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và độ bền nhiệt tốt hơn.
3. Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng nhuộm esteraza bằng phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm đơn hình (Simplex) và chế tạo bộ kit nhuộm phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu người.

Nội dung nghiên cứu được triển khai theo 6 nhiệm vụ cụ thể:

1. Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất.
2. Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu.
3. Xác định cấu trúc các hợp chất điều chế được bằng các phương pháp phổ (IR, $^{1}\text{H-NMR}$, MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa hoạt tính nhuộm với cấu trúc phân tử bằng phương pháp hóa lượng tử.
4. Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ chất mới.
5. Khảo sát ảnh hưởng của hiệu ứng điện tử nhóm thế, hiệu ứng không gian của gốc N-hiđrocacbon và gốc cacboxylat đến độ nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng nhuộm.
6. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương pháp đơn hình và chế tạo bộ kit nhuộm esteraza từ cơ chất mới tổng hợp được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Các dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit, các este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat, enzym esteraza trong tế bào bạch cầu người, mẫu máu người khỏe mạnh và mẫu tủy xương bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm hóa học được thực hiện tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội) và Viện Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Thử nghiệm hoạt tính sinh học, đánh giá bộ kit được tiến hành tại Bệnh viện 19-8 (Bộ Công an) trên mẫu máu người khỏe mạnh và 20 mẫu tủy bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp. Luận án hoàn thành năm 2012.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án điểm lại các mốc phát triển chính trong hóa học các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit (naphtol AS thế) và ứng dụng trong hóa học tế bào:

• Về phương pháp tổng hợp: Schopf (1892) lần đầu tổng hợp naphtol AS bằng phản ứng ngưng tụ giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với anilin có mặt $\text{PCl}_3$. Kock-Yee Law và cộng sự (1998) phát triển phương pháp hai giai đoạn qua este trung gian phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat trong dung môi N-metyl pyroliđinon (NMP) đạt hiệu suất trên 89%. Về phản ứng este hóa điều chế cơ chất este cacboxylat, Burston (1958, 1962) đã ứng dụng phản ứng Schotten-Baumann cho naphtol AS tác dụng với cloaxyl clorua trong môi trường kiềm loãng.
• Về enzym esteraza và phương pháp nhuộm: Gomori (1952) sử dụng phương pháp kết tủa muối kim loại; Barrnet và Seligman ứng dụng phẩm màu dẫn xuất indigo; Menten, Junge, Green và sau này là Catovsky (1980) hoàn thiện phương pháp tạo phẩm màu azo dựa trên phản ứng ghép đôi naphtol giải phóng từ quá trình thủy phân este với muối điazo (Fast Blue BB, Fast Blue RR, Fast Red Violet LB). Về cấu trúc enzym, Kaphalia và cộng sự xác định esteraza gồm hai chuỗi 60 kDa và 180 kDa; SM Gignac và cộng sự phân tách 5 isoenzym; Scott và cộng sự tìm ra hai isoenzym A và B; Zschunke F và cộng sự (1991) giải mã trình tự mRNA xác định cấu trúc bậc một gồm 503 axit amin mã hóa trên nhiễm sắc thể số 16.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết bao gồm: thay thế phương pháp tổng hợp truyền thống tốn nhiều thời gian bằng kỹ thuật vi sóng; cải tiến quy trình este hóa Schotten-Baumann; khảo sát toàn diện dãy cơ chất este mới (đặc biệt là dãy $\alpha$-clopropionat) kết hợp tính toán hóa lượng tử DFT để tìm ra cơ chất vượt trội hơn naphtol AS-D cloaxetat thương mại; xây dựng công thức bộ kit hoàn chỉnh tự chế tạo tại Việt Nam có độ bền nhiệt cao ở điều kiện bảo quản thông thường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên:

• Lý thuyết xúc tác enzym sinh học: Esteraza (EC 3.1.1.1) thuộc nhóm cacboxylesteraza thủy phân liên kết este. Tâm hoạt động của enzym gồm bộ ba axit amin Ser-His-Asp (hoặc Ser-His-Glu) hoạt động theo cơ chế tấn công nucleophin của nhóm -OH thuộc Serine vào nhóm cacbonyl của este, tạo trạng thái chuyển tiếp tứ diện ("oxianion hole") được bền hóa bởi liên kết hiđro với Glycine và Histidine.
• Nguyên lý nhuộm hóa học tế bào tạo màu azo: Cơ chất este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat bị esteraza trong bạch cầu dòng tủy thủy phân giải phóng dẫn xuất naphtol AS thế mang nhóm -OH tự do tại vị trí C3. Hợp chất này lập tức tham gia phản ứng ghép đôi điazo hóa ái điện tử tại vị trí C1 với muối điazo (Fast Blue RR salt) trong dung dịch đệm để tạo thành kết tủa phẩm màu azo không tan có màu xanh đen tại vị trí có enzym trong bào tương tế bào.
• Phân loại bệnh bạch cầu theo tiêu chuẩn FAB (1976): Tiêu chuẩn phân định các thể tủy (M0-M7) và lympho (L1-L3) dựa trên mức độ bắt màu của các phản ứng hóa tế bào (peroxidaza, sudan B, photphataza axit, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu).

Thể bệnh FAB	EST đặc hiệu (NASDCl)	EST không đặc hiệu	EST + NaF
M0	(-)	(-)	(-)
M1	(+)	(-)	(-)
M2	(++)	(-)	(-)
M3	(+++)	(-)	(-)
M4	(+)	(++)	(-)
M5	(-)	(++++)	(-)
M6, M7	(-)	(+)	(+)
L1, L2, L3	(-)	(-)	(-)

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và công cụ phân tích:

• Phương pháp tổng hợp: Tổng hợp hữu cơ hồi lưu nhiệt truyền thống và tổng hợp hỗ trợ vi sóng trên thiết bị lò vi sóng Q Pro M (cài đặt nhiệt độ chính xác đến từng °C).
• Phương pháp xác định cấu trúc: Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Stuart STP3; Sắc ký lớp mỏng silicagel 60 $\text{F}_{254}$ (Merck); Phổ hồng ngoại (FT-IR) trên máy PerkinElmer GX và Nicolet SIGNA (ép viên KBr); Phổ khối lượng (MS) trên hệ thống LC-MSD-Trap-SL (Agilent), GC-MS phân giải cao Micromass Waters (EI, 70 eV) và LC-MS-ORBITRAP-XL (Thermo Scientific); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^{1}\text{H-NMR}$) trên máy Bruker AVANCE 500 MHz (dung môi $\text{DMSO-d}_6$, chuẩn nội TMS).
• Phương pháp tối ưu hóa và thống kê: Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm đơn hình (Simplex) để xác định điểm tối ưu của 5 thông số kỹ thuật nhuộm.
• Phương pháp hóa lượng tử: Sử dụng phần mềm Gaussian 2003 với thuyết phiến hàm mật độ (DFT/B3LYP, bộ hàm 6-31G*) để tính toán cấu hình không gian tối ưu, góc nhị diện của nhóm este/amit và mật độ điện tích nguyên tử.
• Đánh giá hoạt tính sinh học: Ủ nhiệt tiêu bản trên máy Stat-Fax 2200; Quan sát vi thể trên kính hiển vi quang học Nikon (độ phóng đại 1.000 lần); Đối chứng song song với kit thương mại Sigma-Aldrich (mã 91C-1KT, lô 090M4337).

Nguồn dữ liệu thực nghiệm:

• Mẫu máu ngoại vi của người khỏe mạnh khám sức khỏe tại Bệnh viện 19-8 dùng để tối ưu hóa điều kiện nhuộm, sàng lọc cơ chất và kiểm tra độ bền bộ kit.
• Mẫu tủy xương của 20 bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp đã được chẩn đoán xác định dòng tế bào tại Bệnh viện 19-8 dùng để thử nghiệm lâm sàng đối chứng.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết có hệ thống cơ sở lý thuyết và các công trình công bố về hóa học dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit và enzym esteraza bạch cầu. Tác giả phân tích hai phương pháp tổng hợp naphtol AS chính: phương pháp trực tiếp một giai đoạn ngưng tụ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với anilin có mặt $\text{PCl}_3$ hoặc $\text{SOCl}_2$ và phương pháp gián tiếp hai giai đoạn qua clorua axit hoặc este phenyl. Phân tích các tính chất vật lý, phổ đặc trưng (vùng dao động cộng hưởng IR của C=O amit ở 1695-1700 $\text{cm}^{-1}$, NH ở ~3400 $\text{cm}^{-1}$, OH ở ~3500 $\text{cm}^{-1}$; dịch chuyển hóa học $^{1}\text{H-NMR}$ của OH tại ~11,80 ppm và NH tại ~10,60 ppm) và các phản ứng hóa học cơ bản gồm este hóa Schotten-Baumann, phản ứng anion hóa tạo dinatri aminnolat trong kiềm nồng độ cao (>5%) và phản ứng ghép đôi điazo hóa tại C1.

Về mặt ứng dụng sinh học, chương 1 trình bày phân loại enzym esteraza (EC 3.1.1.1), cơ chế xúc tác thủy phân este qua bộ ba Ser-His-Asp/Glu và sự hình thành "oxianion hole". Chương tổng quan chi tiết bảng phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB (1976), so sánh các kỹ thuật nhuộm esteraza (kết tủa kim loại, indigo, tạo phẩm màu azo, hóa tế bào dòng chảy) và cấu trúc tiêu chuẩn của một bộ kit nhuộm gồm dung dịch cố định, dung dịch cơ chất đệm và dung dịch nhuộm nhân.

Chương 2. Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục hóa chất, trang thiết bị, quy trình thực nghiệm tổng hợp hóa học và thiết kế thực nghiệm:

• Trình bày quy trình điều chế các dẫn xuất naphtol AS-X theo phương pháp truyền thống và phương pháp vi sóng trong dung môi clobenzen với tác nhân $\text{PCl}_3$.
• Trình bày quy trình điều chế este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat bằng phản ứng Schotten-Baumann cải tiến trong dung môi tetrahydrofuran (THF) với dung dịch NaOH 5N làm lạnh ở 0°C.
• Thiết lập ma trận quy hoạch hóa thực nghiệm đơn hình $S_0$ gồm 6 đỉnh thí nghiệm để tối ưu hóa 5 yếu tố công nghệ của phản ứng nhuộm: nồng độ cơ chất ($Z_1$), nồng độ muối điazo ($Z_2$), pH dung dịch đệm ($Z_3$), nhiệt độ ủ ($Z_4$) và thời gian ủ ($Z_5$).
• Thiết lập quy trình pha chế bộ kit nhuộm hoàn chỉnh cho 100 tiêu bản, phương pháp theo dõi độ ổn định của kit theo thời gian và quy trình thử nghiệm nhuộm trên mẫu bệnh phẩm tủy xương.

Chương 3. Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các phát hiện thực nghiệm và số liệu phân tích chuyên sâu qua từng giai đoạn nghiên cứu:

1. Tổng hợp dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit: Ứng dụng vi sóng giúp rút ngắn thời gian phản ứng từ 180 phút (phương pháp truyền thống) xuống còn 10-20 phút, đồng thời tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm. Điều kiện tối ưu trong lò vi sóng cho phản ứng tổng hợp naphtol AS-D (Ia) là: công suất 200 W, nhiệt độ 130°C, thời gian 20 phút trong dung môi clobenzen với tỷ lệ mol axit : amin : $\text{PCl}_3$ = 1 : 1 : 0,3; hiệu suất đạt 80,8% (so với 69,8% của phương pháp đun hồi lưu truyền thống). Tổng cộng đã tổng hợp được 15 hợp chất trung gian dãy I và II, trong đó có 3 hợp chất mới chưa từng được công bố trong tài liệu tham khảo:

• Metyl 2-{[(3-hiđroxinaphtalen-2-yl)cacbonyl]amino}benzoat (Ik, hiệu suất 80%, nhiệt độ nóng chảy 174-176°C).
• Metyl 4-{[(3-hiđroxinaphtalen-2-yl)cacbonyl]amino}benzoat (Il, hiệu suất 82%, nhiệt độ nóng chảy 270-272°C).
• N-(antraxen-1-yl)-3-hiđroxinaphtalen-2-cacboxamit (Id, hiệu suất 58%, nhiệt độ nóng chảy 242-244°C).

2. Tổng hợp các dẫn xuất este cacboxylat: Tác giả phát hiện quy trình este hóa truyền thống của Burston (nhỏ kiềm sau khi đã trộn naphtol và clorua axit) không tạo thành sản phẩm este. Luận án đã cải tiến quy trình bằng cách cho NaOH 5N tác dụng trước với naphtol AS thế ở 0°C trong THF để tạo anion naphtolat natri ổn định, sau đó mới nhỏ từ từ dẫn xuất cloaxyl clorua. Quy trình cải tiến đã tổng hợp thành công 37 este thuộc 4 dãy cấu trúc:

• Dãy III: 11 dẫn xuất naphtol AS-X cloaxetat (hiệu suất 50 - 64%).
• Dãy IV: 11 dẫn xuất naphtol AS-X $\alpha$-clopropionat (hiệu suất 48 - 62%).
• Dãy V: 8 dẫn xuất 3-(xiclohexyl/aryl-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat (hiệu suất 45 - 58%).
• Dãy VI: 7 dẫn xuất của naphtol AS-D và naphtol AS-OL gắn các gốc cacboxylat khác nhau (butyrat, 2-clobutyrat, clo(phenyl)axetat).

3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng nhuộm bằng phương pháp đơn hình: Qua 14 bước dịch chuyển đơn hình từ ma trận $S_0$ đến $S_{14}$, tác giả xác định được bộ thông số tối ưu cho phản ứng nhuộm esteraza:

• Nồng độ cơ chất: 0,85 mM.
• Nồng độ muối điazo Fast Blue RR: 1,30 mM.
• pH dung dịch đệm photphat: 7,20.
• Nhiệt độ ủ tiêu bản: 37,0°C.
• Thời gian ủ: 35 phút. Tại đỉnh tối ưu này, tiêu bản cho điểm nhuộm cao nhất (trung bình 3,85/4,0 điểm), hạt nhuộm mịn, đồng nhất và bào tương không bị lắng cặn phẩm màu.

4. Khảo sát hoạt tính nhuộm và mối tương quan cấu trúc - hoạt tính (QSAR): Khảo sát 26 cơ chất trên bạch cầu máu ngoại vi người khỏe mạnh cho thấy:

• Dãy este $\alpha$-clopropionat (dãy IV) cho cường độ bắt màu và độ đặc hiệu đối với bạch cầu dòng tủy cao hơn rõ rệt so với dãy cloaxetat tương ứng (dãy III).
• Nhóm thế ở vị trí ortho trên vòng phenyl của nhóm amit thế làm tăng tính chọn lọc không gian. Dẫn xuất naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat (mang nhóm $-OCH_3$ ở vị trí ortho) đạt điểm nhuộm cao nhất (3,95 điểm), vượt trội hơn naphtol AS-D cloaxetat của Sigma-Aldrich (3,70 điểm).
• Tính toán hóa lượng tử bằng Gaussian 2003 (DFT/B3LYP) chỉ ra rằng độ nhạy của phản ứng nhuộm tương quan thuận với góc nhị diện giữa mặt phẳng nhóm cacboxylat và nhân thơm naphtalen ($\theta_1$) cũng như góc nhị diện của nhóm amit ($\theta_2$). Cấu hình không gian của naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat có độ xoay hình học và phân bố mật độ điện tích tại cacbon cacbonyl phù hợp nhất với kích thước và lực tương tác tĩnh điện của "oxianion hole" trong tâm xúc tác Ser-His-Asp.

Cơ chất khảo sát	Nhóm thế nhân thơm (X)	Gốc este (R)	Điểm nhuộm thực nghiệm	Góc nhị diện $\theta_1$ (độ)
Naphtol AS cloaxetat (IIIa)	H	$-\text{CH}_2\text{Cl}$	3,10	72,4
Naphtol AS-D cloaxetat (IIIb)	$o-\text{CH}_3$	$-\text{CH}_2\text{Cl}$	3,70	83,6
Naphtol AS-OL cloaxetat (IIIi)	$o-\text{OCH}_3$	$-\text{CH}_2\text{Cl}$	3,80	85,2
Naphtol AS $\alpha$-clopropionat (IVa)	H	$-\text{CH}(\text{CH}_3)\text{Cl}$	3,30	75,1
Naphtol AS-D $\alpha$-clopropionat (IVb)	$o-\text{CH}_3$	$-\text{CH}(\text{CH}_3)\text{Cl}$	3,85	86,4
Naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat (IVi)	$o-\text{OCH}_3$	$-\text{CH}(\text{CH}_3)\text{Cl}$	3,95	88,7

5. Chế tạo và đánh giá bộ kit nhuộm: Bộ kit hoàn chỉnh cho 100 tiêu bản gồm 3 phần: Dung dịch cố định (focmol - axeton trong đệm photphat pH 6,6); Dung dịch cơ chất (naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat hòa tan trong DMF kết hợp muối Fast Blue RR và đệm tris-HCl pH 7,2); Dung dịch nhuộm nhân (Nuclear fast red).

• Kiểm tra độ bền: Bộ kit tự chế tạo ổn định sau 12 tháng bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C (tủ lạnh thông thường) và giữ nguyên hoạt tính sau 30 ngày ở nhiệt độ phòng (25°C), vượt trội hơn cơ chất của Sigma-Aldrich vốn bắt buộc bảo quản dưới -20°C.
• Thử nghiệm lâm sàng: Đánh giá trên 20 mẫu tủy bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp (gồm các thể M1, M2, M3, M4, M5) cho thấy kết quả phân loại dòng tế bào bằng bộ kit naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat hoàn toàn phù hợp 100% với kết quả thu được từ kit thương mại của hãng Sigma-Aldrich và kết quả xét nghiệm miễn dịch, di truyền.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận khoa học và thực tiễn của luận án:

1. Về phương pháp tổng hợp: Đã ứng dụng thành công kỹ thuật vi sóng để tổng hợp 15 dẫn xuất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit, rút ngắn thời gian phản ứng từ 3 giờ xuống 10-20 phút, nâng hiệu suất phản ứng lên trên 80%. Đã cải tiến thành công quy trình este hóa Schotten-Baumann để điều chế 37 este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat với hiệu suất ổn định.
2. Về phát hiện chất mới: Đã tổng hợp, xác định cấu trúc và hằng số hóa lý của 3 dẫn xuất amit mới (Ik, Il, Id) cùng nhiều hợp chất este mới thuộc dãy $\alpha$-clopropionat.
3. Về mối tương quan cấu trúc - hoạt tính: Đã xác lập có hệ thống mối quan hệ giữa hiệu ứng điện tử, hiệu ứng không gian của các nhóm thế với hoạt tính sinh học của cơ chất. Bằng tính toán hóa lượng tử DFT (Gaussian 2003), luận án đã chứng minh sự tương quan định lượng giữa góc nhị diện phân tử với ái lực gắn kết tâm hoạt động của esteraza bạch cầu.
4. Về ứng dụng thực tiễn: Đã phát hiện cơ chất mới naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat có độ nhạy, tính đặc hiệu và độ bền nhiệt vượt trội so với cơ chất thương mại chuẩn naphtol AS-D cloaxetat; xây dựng thành công công thức và quy trình chế tạo bộ kit nhuộm esteraza đặc hiệu quy mô 100 tiêu bản/bộ với giá thành thấp, đã được thử nghiệm và kiểm chứng lâm sàng đạt độ chính xác tương đương sản phẩm nhập ngoại.

Kiến nghị của luận án:

• Triển khai ứng dụng rộng rãi bộ kit nhuộm naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat tại các khoa Huyết học - Truyền máu của các bệnh viện trong cả nước để phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu cấp.
• Tiếp tục nghiên cứu mở rộng sản xuất cơ chất và bộ kit ở quy mô công nghiệp để chủ động nguồn hóa chất xét nghiệm trong nước, thay thế hàng nhập ngoại.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế thực tế của luận án theo dữ liệu văn bản:

• Phạm vi thử nghiệm lâm sàng đối chứng của bộ kit mới dừng lại ở quy mô 20 mẫu tủy bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp tại một cơ sở y tế (Bệnh viện 19-8, Bộ Công an).
• Luận án mới chỉ tập trung nghiên cứu phản ứng nhuộm trên tiêu bản vi thể quang học truyền thống, chưa tích hợp thử nghiệm cơ chất mới trên hệ thống máy phân tích tế bào dòng chảy tự động (Flow cytometry).

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng thử nghiệm chẩn đoán lâm sàng trên số lượng mẫu tủy bệnh phẩm lớn hơn tại nhiều bệnh viện chuyên khoa huyết học trên toàn quốc.
• Nghiên cứu ứng dụng các cơ chất este tổng hợp được cho kỹ thuật nhuộm tế bào kết hợp phân tích dòng chảy tự động và các hệ thống chẩn đoán miễn dịch gắn enzym (ELISA, FPIA).

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn cao cho các nhóm đối tượng:

• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược: Giá trị tham khảo nằm ở quy trình tổng hợp vi sóng các hợp chất amit thơm, kỹ thuật cải tiến phản ứng este hóa Schotten-Baumann, tập dữ liệu phổ nghiệm chi tiết ($^{1}\text{H-NMR}$, IR, MS) của 37 dẫn xuất este và phương pháp ứng dụng phần mềm Gaussian 2003 trong nghiên cứu QSAR.
• Bác sĩ, kỹ thuật viên xét nghiệm và nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Huyết học - Truyền máu, Ung bướu: Giá trị tham khảo nằm ở bộ thông số tối ưu hóa kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu, bảng đối chiếu tiêu chuẩn FAB và công thức phối chế bộ kit chẩn đoán thay thế sản phẩm nhập ngoại.

Câu hỏi thường gặp

1. Cơ chất mới được luận án lựa chọn để chế tạo bộ kit là gì và có ưu điểm gì so với cơ chất thương mại của hãng Sigma-Aldrich? Cơ chất được luận án lựa chọn là naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat. So với cơ chất thương mại naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma-Aldrich, cơ chất mới cho điểm nhuộm cao hơn (3,95 so với 3,70), phản ứng bắt màu nhạy hơn, hạt phẩm màu lắng đọng mịn và rõ nét hơn. Đặc biệt, cơ chất mới có độ bền nhiệt cao hơn, bảo quản ổn định ở nhiệt độ 2-8°C trong 12 tháng và 30 ngày ở nhiệt độ phòng, khắc phục được nhược điểm dễ bị phân hủy ở nhiệt độ trên -20°C của cơ chất thương mại.

2. Kỹ thuật vi sóng đã cải thiện phản ứng tổng hợp naphtol AS-D (Ia) như thế nào so với phương pháp truyền thống? Phương pháp vi sóng (công suất 200 W, 130°C trong dung môi clobenzen) đã rút ngắn thời gian phản ứng từ 3 giờ xuống còn 20 phút, đồng thời tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm từ 69,8% lên 80,8%.

3. Luận án đã cải tiến quy trình este hóa Schotten-Baumann như thế nào để khắc phục hiện tượng phản ứng không xảy ra? Trong quy trình cũ do Burston đề xuất, khi trộn naphtol AS với cloaxetyl clorua rồi mới cho kiềm, phản ứng không tạo este. Tác giả đã cải tiến bằng cách cho dung dịch NaOH 5N vào dung dịch naphtol AS trong THF ở 0°C trước để chuyển hóa hoàn toàn nhóm -OH thành anion naphtolat natri, sau 10-15 phút mới nhỏ từ từ clorua axit vào hỗn hợp. Quy trình cải tiến này đạt hiệu suất este hóa từ 48% đến 64%.

4. Bộ thông số kỹ thuật tối ưu của phản ứng nhuộm esteraza được xác định qua phương pháp đơn hình là gì? 5 thông số tối ưu gồm: Nồng độ cơ chất 0,85 mM; Nồng độ muối điazo Fast Blue RR 1,30 mM; pH dung dịch đệm photphat 7,20; Nhiệt độ ủ 37,0°C; Thời gian ủ 35 phút.

5. Kết quả thử nghiệm bộ kit naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat trên 20 mẫu tủy bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp thể hiện như thế nào? Kết quả nhuộm phân loại dòng tế bào trên 20 mẫu tủy (gồm các thể bệnh từ M1 đến M5) bằng bộ kit naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat tự chế tạo cho kết quả tương thích 100% với kết quả thu được từ bộ kit của hãng Sigma-Aldrich và kết quả xét nghiệm miễn dịch, di truyền của bệnh nhân.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Trần Văn Tính đã giải quyết trọn vẹn chuỗi nhiệm vụ khoa học từ tổng hợp hữu cơ, xác định cấu trúc, nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính sinh học đến chế tạo sản phẩm ứng dụng y dược. Bằng việc ứng dụng phương pháp vi sóng và cải tiến phản ứng este hóa Schotten-Baumann, tác giả đã điều chế thành công 15 dẫn xuất amit (gồm 3 chất mới) và 37 dẫn xuất este cacboxylat. Luận án đã phát hiện cơ chất mới naphtol AS-OL $\alpha$-clopropionat có hoạt tính sinh học và độ bền vượt trội, tối ưu hóa thành công quy trình nhuộm bằng phương pháp đơn hình và chế tạo hoàn chỉnh bộ kit nhuộm esteraza đặc hiệu phục vụ chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu cấp đạt kết quả thử nghiệm lâm sàng tương đương sản phẩm nhập ngoại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [1]. Cũng như các bệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam dioxin do chiến tranh dé lại [2]. Đặc trưng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bao non ác tính lan at các tế bào tủy va máu ngoại vi bình thường. Đặc điểm của các tế bào này là có sự rỗi loạn về protein và cấu trúc tế bào.

Bệnh gồm nhiều thé loại khác nhau, theo tiêu chuẩn FAB thì được ký hiệu từ MO đến M7 và L1 đến L3 [16]. Việc xếp loại đúng, nhanh chóng và chính xác thé bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho người bệnh. Đặc biệt trong thé M3 có nguy cơ chảy máu cao thì việc chân đoán nhanh chóng, chính xác còn có ý nghĩa quyết định đến sinh mạng bệnh nhân [6]. Tiêu chuẩn FAB dựa trên kết quả xét nghiệm của ba phương pháp là miễn dịch, đi truyền và nhuộm hóa học tế bào.

Phương pháp miễn dịch và di truyền sử dụng các kỹ thuật đòi hỏi máy móc hiện đại đắt tiền và nguồn lao động có trình độ cao. Phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ gồm các kỹ thuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu ức chế với NaF và không ức chế. Esteraza đặc hiệu chỉ có mặt trên các tế bào dòng tủy còn các dòng khác âm tính hoặc dương tính với cường độ rất thấp. Esteraza không đặc hiệu có mặt ở nhiều dòng tế bào khác nhau nhưng ở dong monoxit thì bị ức chế bằng NaF.

Ngoài hai kỹ thuật nhuộm PAS và nhuộm Sudan dùng dé phát hiện glucozit và lipit thì sáu kỹ thuật còn lại là nhuộm phát hiện enzym. Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bảo theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dich và di truyền. Phương pháp xác định tế bào thuộc dòng tủy dựa chủ yếu vào kết quả nhuộm peroxidaza và esteraza đặc hiệu. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza thường không ồn định do dé bị phân hủy bởi ánh sang vi thé cần bồ sung thêm kỹ thuật nhuộm esteraza có độ ôn định hơn.

Hiện nay, cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu là naphtol AS-D cloaxetat được được hãng Sigma bán trên thị trường với giá thành rat cao (13 triệu/1 gam). Qua nghiên cứu tài liệu có thé thấy, cơ chất naphtol AS-D cloaxetat được tổng hop theo phương pháp truyền thống là ngưng tụ axit 3-hidroxi-2-naphtoic với o-toluidin, sau đó este hóa bằng cloaxetyl clorua. Phản ứng ngưng tụ cần thời gian dài, hiệu suất thấp; quá trình chuyên hóa naphtol AS-D thành dẫn xuất cloaxetat hiệu suất cũng không ổn định. 10 Do việc nghiên cứu thiếu hệ thong nên chưa xác định được mối tương quan giữa cau trúc và hoạt tính, chưa tìm được cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.

Quá trình nhuộm chưa được tối ưu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và tốn kém cho bệnh nhân. Nước ta chưa sản xuất được cơ chất, phải nhập ngoại. Cơ chất dé bị phân huỷ ở nhiệt độ > -20°C, là một trong những khó khăn lớn cho việc vận chuyên và bảo quản. Những thách thức đó đã làm cho phương pháp xét nghiệm này chưa được triển khai rộng rãi ở Việt Nam.