Luận án tiến sĩ về hypophyllanthin, niranthin và dược động học từ diệp hạ châu đắng

Luận án tiến sĩ y tế phân tích thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin niranthin và xác định một số thông số dược động học của, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm,

• Tác giả: Phạm Văn Sơn
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Ngọc Vinh
• Trường học: Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất
• Đề tài: Nghiên Cứu Hypophyllanthin Và Niranthin: Dược Động Học Từ Diệp Hạ Châu Đắng
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ dược học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ
• DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG
• 1.1.1. Tên gọi, phân loại
• 1.1.2. Đặc diểm thực vật
• 1.1.3. Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái
• 1.1.4. Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng
• ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về hypophyllanthin và niranthin

Nghiên cứu về hypophyllanthin và niranthin từ diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.) đã chỉ ra rằng hai hợp chất này có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ gan và kháng viêm. Hypophyllanthin và niranthin là các hợp chất lignan, được biết đến với nhiều tác dụng sinh học, bao gồm khả năng chống ung thư và cải thiện chức năng gan. Việc chiết xuất và phân lập hai hợp chất này từ diệp hạ châu đắng không chỉ giúp nâng cao giá trị dược liệu mà còn tạo ra các chất đối chiếu cần thiết cho việc kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa sản phẩm từ dược liệu. Theo nghiên cứu, hypophyllanthin có tác dụng bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương do các tác nhân gây hại, trong khi niranthin hỗ trợ trong việc giảm viêm và cải thiện sức khỏe gan.

1.1. Tác dụng sinh học của hypophyllanthin và niranthin

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hypophyllanthin và niranthin có tác dụng sinh học đáng kể. Hypophyllanthin được biết đến với khả năng bảo vệ gan, giúp giảm thiểu tổn thương tế bào do viêm gan. Nghiên cứu cho thấy rằng hợp chất này có thể làm giảm nồng độ enzyme gan trong máu, từ đó cải thiện chức năng gan. Niranthin, mặt khác, có tác dụng kháng viêm mạnh mẽ, giúp giảm viêm và cải thiện tình trạng sức khỏe tổng thể. Việc xác định các thông số dược động học của hai hợp chất này là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế tác động và khả năng hấp thu của chúng trong cơ thể.

II. Dược động học của hypophyllanthin và niranthin

Dược động học của hypophyllanthin và niranthin từ diệp hạ châu đắng đã được nghiên cứu để xác định các thông số như khả năng hấp thu, phân phối, chuyển hóa và thải trừ. Các nghiên cứu cho thấy rằng cả hai hợp chất này đều có khả năng hấp thu tốt qua đường tiêu hóa. Thời gian đạt nồng độ tối đa trong huyết tương (Tmax) của hypophyllanthin là khoảng 1-2 giờ sau khi sử dụng, trong khi niranthin có Tmax tương tự. Điều này cho thấy rằng cả hai hợp chất đều có khả năng được cơ thể hấp thu nhanh chóng, tạo điều kiện cho việc phát huy tác dụng sinh học của chúng. Hơn nữa, nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax) của hypophyllanthin và niranthin cũng cho thấy sự tương đồng, cho thấy rằng chúng có thể được sử dụng đồng thời trong các liệu pháp điều trị.

2.1. Khả năng hấp thu và chuyển hóa

Khả năng hấp thu của hypophyllanthin và niranthin là một yếu tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả điều trị. Nghiên cứu cho thấy rằng cả hai hợp chất này đều được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, với tỷ lệ hấp thu cao. Chuyển hóa của chúng diễn ra chủ yếu tại gan, nơi mà các enzym chuyển hóa có thể làm thay đổi cấu trúc hóa học của các hợp chất này, từ đó ảnh hưởng đến tác dụng sinh học của chúng. Việc hiểu rõ về quá trình chuyển hóa này sẽ giúp tối ưu hóa liều dùng và cải thiện hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

III. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu về hypophyllanthin và niranthin từ diệp hạ châu đắng không chỉ có giá trị trong lĩnh vực dược học mà còn có ứng dụng thực tiễn trong việc phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe. Việc thiết lập các chất đối chiếu cho hypophyllanthin và niranthin sẽ giúp nâng cao chất lượng kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa các sản phẩm từ dược liệu. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh ngày càng nhiều sản phẩm từ dược liệu được bày bán trên thị trường mà không có sự kiểm soát chất lượng chặt chẽ. Hơn nữa, việc xác định các thông số dược động học sẽ hỗ trợ trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn cho các bệnh liên quan đến gan.

3.1. Tiêu chuẩn hóa sản phẩm từ diệp hạ châu đắng

Tiêu chuẩn hóa sản phẩm từ diệp hạ châu đắng là một bước quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm dược liệu. Việc thiết lập các chất đối chiếu cho hypophyllanthin và niranthin sẽ giúp các nhà sản xuất có cơ sở để kiểm tra chất lượng sản phẩm của mình. Điều này không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng mà còn nâng cao uy tín của các sản phẩm dược liệu trên thị trường. Hơn nữa, việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ diệp hạ châu đắng có thể mở ra cơ hội mới trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến gan, từ đó cải thiện sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., họ Thầu dầu - Euphorbiaceae) là dược liệu được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền và y học hiện đại với tác dụng chính là cải thiện chức năng gan, hỗ trợ điều trị viêm gan, đặc biệt là viêm gan B. Dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ (USP) hiện hành đã xây dựng các chuyên luận kiểm tra chất lượng dược liệu và chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng; tuy nhiên, các tiêu chuẩn này chủ yếu sử dụng duy nhất một chất điểm chỉ là phyllanthin. Trên thực tế, tác dụng sinh học của Diệp hạ châu đắng không chỉ do phyllanthin mà còn có sự đóng góp quan trọng của các lignan khác như hypophyllanthin và niranthin với các hoạt tính bảo vệ gan, kháng viêm và chống khối u.

Hiện nay, phần lớn các sản phẩm lưu hành trên thị trường được bào chế từ cao toàn phần và công bố chất lượng theo tiêu chuẩn cơ sở. Các tiêu chuẩn này đa số chỉ định lượng hỗn hợp toàn phần bằng phương pháp không đặc hiệu, chưa định lượng được các hợp chất có hoạt tính sinh học cũng như chưa xác định mức hàm lượng cho các chất có hoạt tính trong liều điều trị. Thực trạng này bắt nguồn từ việc thiếu hụt các chất chuẩn đối chiếu (hypophyllanthin, niranthin chưa sẵn có, giá thành cao), thiếu cao đối chiếu và chưa có các nghiên cứu đầy đủ về dược động học của các hoạt chất chính trong chế phẩm. Nhằm giải quyết khoảng trống này, luận án tiến sĩ dược học của tác giả Phạm Văn Sơn với đề tài "Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin và xác định một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae)" (Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, Mã số: 62720410, người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Ngọc Vinh, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, năm 2021) được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho công tác kiểm tra chất lượng và ước định liều dùng.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 4 nội dung:

1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).
2. Thiết lập chất đối chiếu hypophyllanthin, niranthin từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).
3. Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).
4. Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa điều chế từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

• Đối tượng thực vật: Toàn cây (trừ rễ) Diệp hạ châu đắng thu hái vào tháng 4/2014 tại Vĩnh Long (được giám định tên khoa học là Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiaceae tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh). Các mẫu bổ sung thu hái tại Cần Thơ, Trà Vinh, Cà Mau (tháng 4/2017) được dùng để ứng dụng phương pháp định lượng đồng thời 4 lignan.
• Đối tượng động vật thực nghiệm: Thỏ thí nghiệm khỏe mạnh, khối lượng 2 ± 0,5 kg do Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
• Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm hóa thực vật, phân tích kiểm nghiệm và dược động học được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh (Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu, Khoa Thiết lập chất đối chiếu - chất chuẩn, Khoa Vật lý đo lường).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học, phân loại học, thành phần hóa học, tác dụng dược lý, các phương pháp chiết xuất, phân lập và định lượng lignan từ chi Phyllanthus. Cây Diệp hạ châu đắng thuộc hệ thống phân loại Takhtajan (2009): Giới Plantae, Ngành Magnoliophyta, Lớp Magnoliopsida, Bộ Euphorbiales, Họ Euphorbiaceae, Chi Phyllanthus, Loài Phyllanthus amarus Schum. Thành phần hóa học của cây bao gồm: alkaloid, flavonoid, lignan, tannin thủy phân (ellagitannin), polyphenol, triterpen, sterol và tinh dầu.

Trong nhóm lignan, các hợp chất chính đã được phân lập và xác định cấu trúc gồm có:

• Phyllanthin: $C_{24}H_{34}O_6$ (MW: 418,5 g/mol, CAS: 10351-88-9, $\log P_{ow}$: 3,2, điểm chảy: 96 °C).
• Hypophyllanthin: $C_{24}H_{30}O_7$ (MW: 430,5 g/mol, CAS: 33676-00-5, $\log P_{ow}$: 3,6).
• Niranthin: $C_{24}H_{32}O_7$ (MW: 432,5 g/mol, CAS: 50656-77-4, $\log P_{ow}$: 4,1).
• Nirtetralin: $C_{24}H_{30}O_7$ (MW: 430,5 g/mol, CAS: 50656-78-5, $\log P_{ow}$: 3,6).
• Phyltetralin: $C_{24}H_{32}O_6$ (MW: 416,5 g/mol, CAS: 123048-17-9, $\log P_{ow}$: 3,8).

Các nghiên cứu chiết xuất và phân lập lignan trên thế giới và trong nước được luận án điểm lại bao gồm:

• Kassuya và cộng sự (2003): Dùng n-hexan chiết bột lá P. amarus, sắc ký cột nhanh trên silica gel 60 thu được 5 lignan (nirtetralin, niranthin, hypophyllanthin, phyltetralin, phyllanthin).
• Maciel và cộng sự (2007): Ngấm kiệt với methanol, qua cột silica gel thu được 6 lignan.
• Srivastava và cộng sự (2008): Ngấm kiệt với ethanol, chiết phân đoạn với n-hexan, sắc ký cột và sắc ký lỏng điều chế thu được phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin.
• Sane và cộng sự (2010): Chiết Soxhlet bằng methanol và chiết CO2 siêu tới hạn (SFE).
• Lữ Thị Kim Chi và Nguyễn Ngọc Vinh (2012): Chiết nóng bằng dicloromethan quy mô 9,0 kg, phân lập phyllanthin tinh sạch và thiết lập chất chuẩn.
• Parvathaneni và cộng sự (2013): Chiết Soxhlet với n-hexan, sắc ký lỏng điều chế thu phyllanthin và hypophyllanthin (>95%).
• Yuandani và cộng sự (2013): Chiết methanol, sắc ký cột chân không và sắc ký cột, kết tinh lại thu phyllanthin và hypophyllanthin (>98%).
• Liu và cộng sự (2014): Chiết bằng ethanol 80%, sắc ký cột thu niranthin độ tinh khiết 99%.
• Garg và cộng sự (2016): Chiết hỗ trợ vi sóng (MAE) tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM).
• Noor và cộng sự (2019): Chiết phân đoạn hexan và ethanol, sắc ký điều chế pha đảo thu hypophyllanthin, niranthin và lintetralin.
• Huỳnh Ngọc Thụy (2008), Trần Anh Tuấn (2010): Chiết xuất phân đoạn và phân lập các alkaloid, flavonoid, lignan từ dược liệu trong nước.

Về phương pháp phân tích, các tác giả quốc tế và trong nước đã áp dụng:

• Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC): Arvind (2006), Dhalwal (2006), Nayak (2010), Khabiya (2014), Ketmongkhonsit (2015).
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-UV/PDA/FL): Murugaiyah (2007), Rai (2009), Alvari (2011), Patel (2011), Lữ Thị Kim Chi (2012), Nguyễn Đức Hạnh (2013), Bhope (2013), Kandavel (2015), Harikrishnan (2018), Trần Thùy Trang (2010).
• Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC): Trần Thu Huyền (2018).
• Định lượng trong mẫu sinh học: Murugaiyah (2007 - HPLC-FL trong huyết tương chuột), Fan (2015 - HPLC-MS/MS định lượng 4 lignan trong huyết tương chuột), Nguyễn Văn Long (2019 - LC-MS/MS định lượng phyllanthin trong huyết tương chuột).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Quy trình phân lập và thiết lập chất đối chiếu cho hypophyllanthin và niranthin theo tiêu chuẩn quốc tế; quy trình điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng chứa đồng thời các lignan hoạt tính; và việc thẩm định quy trình LC-MS/MS để xác định các thông số dược động học của cao chuẩn hóa trên đối tượng động vật thực nghiệm là thỏ.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý luận về kiểm nghiệm dược liệu, thiết lập chất đối chiếu theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Dược điển Việt Nam V, cũng như nguyên tắc sử dụng cao đối chiếu (Reference Standard Extract) theo hướng dẫn của Dược điển Mỹ (USP) và Dược điển Châu Âu (EP). Đánh giá sinh khả dụng và dược động học được thực hiện dựa trên các thông số cơ bản ($C_{max}$, $T_{max}$, $AUC_{0-t}$, $AUC_{0-\infty}$, $T_{1/2}$) và các nguyên tắc thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinh học (Bioanalytical Method Validation).

Quy định thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học được đối chiếu giữa các hướng dẫn quốc tế:

Chỉ tiêu	Hướng dẫn US-FDA (2018)	Hướng dẫn EMA (2015)
Tính đặc hiệu	$\ge 6$ lô mẫu sinh học trắng; LLOQ đạt độ đúng và chính xác.	$\ge 6$ lô mẫu sinh học trắng; độ nhiễu tại LLOQ $\le 20%$; độ nhiễu tại chuẩn nội (IS) $\le 5%$.
Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)	Điểm thấp nhất đường chuẩn; đáp ứng LLOQ $\ge 5$ lần mẫu trắng; độ chính xác $\le 20%$, độ đúng $80 - 120%$.	Điểm thấp nhất đường chuẩn; LLOQ $\le C_{max}/20$; tín hiệu LLOQ $\ge 5$ lần mẫu trắng; độ chính xác $\le 20%$, độ đúng $80 - 120%$.
Đường chuẩn và khoảng tuyến tính	Ít nhất $6 - 8$ mẫu; tại LLOQ: $CV \le 20%$, các điểm khác $\le 15%$.	Ít nhất 6 mẫu; tại LLOQ: $CV \le 20%$, các điểm khác $\le 15%$; xây dựng $\ge 3$ đường chuẩn.
Mẫu kiểm tra chất lượng (QC)	3 mức nồng độ (LQC, MQC, HQC); độc lập với mẫu đường chuẩn.	3 mức nồng độ (LQC, MQC, HQC); độc lập với mẫu đường chuẩn.
Độ đúng và độ chính xác	Thực hiện ít nhất 3 nồng độ; CV tại LLOQ $\le 20%$, nồng độ khác $\le 15%$.	Thực hiện ít nhất 4 nồng độ (LLOQ, 3xLLOQ, MQC, HQC); CV tại LLOQ $\le 20%$, nồng độ khác $\le 15%$.
Hiệu suất chiết	Đánh giá tại 3 nồng độ (LQC, MQC, HQC); tỷ lệ thu hồi ổn định, chính xác, có tính tái lặp.	Không đề cập riêng biệt thành mục bắt buộc.
Độ ổn định mẫu thử	Khảo sát dung dịch chuẩn, chuẩn nội; độ ổn định trong huyết tương: ngắn hạn, dài hạn, đông - rã đông, sau xử lý.	Khảo sát ngắn hạn tại nhiệt độ phòng, dài hạn ($-20\ ^\circ C$ và $-70\ ^\circ C$), đông - rã đông, sau xử lý mẫu.
Ảnh hưởng của nền mẫu	Xem xét sự thay đổi nền mẫu trên $\ge 6$ lô.	$CV$ của nền mẫu đối với chất phân tích và IS $\le 15%$ ở mức $3\times LLOQ$ và HQC.
Lượng mẫu tồn dư (Carry over)	Không đề cập.	Tiêm mẫu trắng sau mẫu nồng độ cao; tồn dư $\le 20%$ ở LLOQ và $\le 5%$ với chuẩn nội.
Ảnh hưởng pha loãng	Pha loãng mẫu nồng độ $> ULOQ$; thẩm định độ đúng, độ chính xác.	Pha loãng mẫu $> ULOQ$ ($\ge 5$ mẫu/mức pha loãng); độ đúng và độ chính xác trong khoảng $\pm 15%$.

Hệ thống thiết bị và phương pháp phân tích thực nghiệm bao gồm:

• Hệ thống thiết bị: Hệ thống sắc ký điều chế Shimadzu LC-20A; Hệ thống sắc ký lỏng đầu dò PDA Shimadzu UFLC SPD-M20A; Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực Shimadzu LC-MS/MS 8040; Máy phân tích nhiệt vi sai TGA/DSC 1 Stare System; Máy quang phổ FT-IR Nicolet Magna 760; Máy cộng hưởng từ hạt nhân Avance Bruker AC 500 MHz; Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu U-1800.
• Cột sắc ký sử dụng: Phenomenex C6-Phenyl 11A ($150 \times 4,6$ mm; $3\ \mu m$), Phenomenex Luna C18 ($250 \times 4,6$ mm; $5\ \mu m$), Phenomenex Gemini NX C18 ($150 \times 4,6$ mm; $5\ \mu m$), Phenomenex Gemini C18 với các kích thước ($100 \times 3$ mm; $5\ \mu m$), ($100 \times 2$ mm; $3\ \mu m$), ($50 \times 3$ mm; $5\ \mu m$); Cột điều chế pha thuận HiQ Sil-10 KYATECH ($21,2 \times 250$ mm; $10\ \mu m$); Cột điều chế pha đảo Aligent-Prep-C18 ($21,2 \times 250$ mm; $10\ \mu m$).
• Chất chuẩn và hóa chất: Chuẩn phyllanthin (hàm lượng 99,35%), diazepam (99,49%), carbamazepin (99,67%), cao chuẩn đối chiếu Phyllanthus amarus USP (lô F0K140).
• Phương pháp xác định cấu trúc: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D ($^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$, DEPT) và 2D ($COSY$, $HSQC$, $HMBC$, $NOESY$), phân tích nhiệt vi sai (DSC), phổ khối lượng (MS) và phổ hồng ngoại (IR).
• Thử nghiệm dược động học: Thực hiện trên thỏ uống cao chuẩn hóa; lấy máu tĩnh mạch tai tại các thời điểm quy định; chiết xuất hoạt chất từ huyết tương bằng kỹ thuật tủa protein và chiết lỏng - lỏng; phân tích định lượng bằng LC-MS/MS sử dụng chế độ giám sát phản ứng nhiều lần (MRM).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở dữ liệu về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.):

• Đặc điểm thực vật, sinh thái và phân bố: Cây thảo mọc hàng năm cao 40–80 cm, thân tròn phân nhánh nhiều, lá xếp hai dãy sít nhau, hoa đực và hoa cái mọc ở kẽ lá, quả nang tròn đường kính 1,8–2,0 mm chứa 6 hạt hình tam giác. Cây ưa sáng, ưa ẩm, vòng đời 3–5 tháng, phân bố tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Năng suất đạt 10–12 tấn tươi/ha/vụ.
• Thành phần hóa học và tác dụng sinh học: Cung cấp chi tiết các nhóm hoạt chất (alkaloid, flavonoid, lignan, sterol, tannin/polyphenol, terpenoid). Điểm lại các nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ tế bào gan, kháng viêm, chống khối u, chống oxy hóa, kháng virus HIV, kháng khuẩn, hạ đường huyết và hạ huyết áp. Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột với liều uống đến 5000 mg/kg không ghi nhận tử vong, không làm thay đổi các chỉ số sinh hóa (ALT, AST, albumin, triglycerid, cholesterol) và không gây tổn thương mô học gan thận.
• Phương pháp chiết xuất, phân lập và định lượng: Phân tích ưu nhược điểm của các kỹ thuật chiết dung môi hữu cơ, SFE, MAE, PLE; các kỹ thuật sắc ký cột, sắc ký điều chế để tinh sạch lignan. Tổng thuật các phương pháp định lượng HPTLC, HPLC-UV/PDA, HPLC-FL và LC-MS/MS trong mẫu dược liệu và mẫu sinh học.
• Cao đối chiếu và đánh giá sinh khả dụng: Nêu rõ khái niệm cao đối chiếu theo USP và EP; các thông số dược động học cơ bản ($C_{max}$, $T_{max}$, $AUC$, $T_{1/2}$) và các hướng dẫn thẩm định phương pháp định lượng trong dịch sinh học của US-FDA, EMA, Dược điển Việt Nam V.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất, động vật thực nghiệm và các quy trình kỹ thuật:

• Nguyên liệu và hóa chất: Dược liệu Diệp hạ châu đắng được thu hái tại Vĩnh Long (2014) và các tỉnh ĐBSCL (2017), làm sạch, sấy khô, xay bột thô; giám định định danh tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh. Các chất chuẩn đối chiếu (phyllanthin, diazepam, carbamazepin, cao chuẩn USP) và hệ dung môi, hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích, HPLC và LC-MS.
• Quy trình chiết xuất và phân lập: Chiết ngấm kiệt/chiết nóng với các dung môi khác nhau; phân đoạn cao bằng sắc ký cột cổ điển với chất hấp phụ silica gel (cỡ hạt 40–60 $\mu m$); tinh chế hoạt chất bằng hệ thống sắc ký điều chế pha thuận (HiQ Sil-10) và pha đảo (Prep-C18).
• Phương pháp thiết lập chất đối chiếu: Thẩm định tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ đúng; đánh giá liên phòng thí nghiệm và ấn định giá trị hàm lượng theo hướng dẫn quốc tế.
• Quy trình điều chế và tiêu chuẩn hóa cao: Khảo sát dung môi chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi, thời gian ngâm, số lần chiết ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot; xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao khô (mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn vi sinh vật, định lượng 4 lignan).
• Quy trình phân tích dược động học: Thiết kế nghiên cứu trên thỏ uống cao chuẩn hóa; xây dựng phương pháp xử lý mẫu huyết tương (khảo sát dung môi tủa protein, dung môi chiết lỏng - lỏng n-hexan, thể tích và số lần chiết); thẩm định phương pháp định lượng đồng thời trên LC-MS/MS 8040 (chế độ MRM); tính toán các thông số dược động học trung bình ($C_{max}$, $T_{max}$, $AUC_{0-t}$, $AUC_{0-\infty}$, $T_{1/2}$).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Nội dung kết quả nghiên cứu trong luận án được chia thành 4 phần chính tương ứng với 4 mục tiêu:

1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc, độ tinh khiết của các chất phân lập

Từ dịch chiết cao dicloromethan (DCM) và các phân đoạn sắc ký cột, tác giả đã phân lập và tinh chế được các hợp chất ký hiệu PA2, PA3, PA4, PA5, PA6:

• PA2: Được xác định là niranthin qua đối chiếu dữ liệu phổ NMR ($^1H$, $^{13}C$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY), DSC và HPLC.
• PA3: Được xác định là nirtetralin.
• PA4: Được xác định là hypophyllanthin.
• PA5: Được xác định là phyltetralin.
• PA6: Được xác định là phyllanthin.
• Độ tinh khiết của các chất phân lập được kiểm tra và chứng minh đạt yêu cầu bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích nhiệt vi sai (DSC).

2. Xác định chất lượng và thiết lập chất đối chiếu

• Đã thẩm định đầy đủ phương pháp xác định độ tinh khiết cho các chất phân lập được (hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin) theo hướng dẫn ICH.
• Tiến hành đánh giá liên phòng thí nghiệm (liên PTN) tại các đơn vị kiểm nghiệm chuyên môn.
• Tính toán và ấn định giá trị hàm lượng cho chất đối chiếu hypophyllanthin và chất đối chiếu niranthin dùng trong công tác kiểm nghiệm.

3. Điều chế và tiêu chuẩn hóa cao Diệp hạ châu đắng

• Tối ưu hóa các thông số công nghệ chiết xuất: lựa chọn dung môi, thời gian ngâm, tỷ lệ dược liệu : dung môi và số lần chiết trên cả quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot.
• Xây dựng quy trình điều chế cao giàu lignan và cao khô Diệp hạ châu đắng.
• Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4 hợp chất lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin) bằng HPLC: khảo sát tính phù hợp hệ thống ($n = 6$), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng.
• Tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm các chỉ tiêu chất lượng của cao khô: mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, hàm lượng phyllanthin và hypophyllanthin, hàm lượng 4 lignan trong các mẫu cao và mẫu dược liệu thu hái tại các địa phương.

4. Đánh giá một số thông số dược động học của cao chuẩn hóa

• Phát triển và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp định lượng đồng thời các lignan trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ liên hợp (LC-MS/MS 8040):
  • Khảo sát tối ưu hóa thế phân mảnh, lựa chọn chất chuẩn nội (IS), loại cột sắc ký, thành phần pha động (methanol/acetonitril, dung dịch đệm amoni format 5 mM, pH, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm).
  • Tối ưu hóa điều kiện chiết mẫu huyết tương: dung môi tủa protein, thể tích dung môi n-hexan, số lần chiết.
  • Thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu theo hướng dẫn của US-FDA và EMA: tính đặc hiệu, LLOQ, đường chuẩn, độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày, hiệu suất chiết, độ ổn định mẫu thử, ảnh hưởng nền mẫu (matrix factor).
• Ứng dụng quy trình định lượng nồng độ các hoạt chất trong huyết tương thỏ sau khi uống cao chuẩn hóa theo thời gian; xây dựng đồ thị biểu diễn nồng độ thuốc trong máu theo thời gian và tính toán các thông số dược động học trung bình ($C_{max}$, $T_{max}$, $AUC_{0-t}$, $AUC_{0-\infty}$, $T_{1/2}$) của phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên các nội dung được trình bày trong luận án, các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn bao gồm:

1. Về mặt hóa thực vật và chuẩn hóa chất đối chiếu: Đã xây dựng thành công quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế các lignan chính từ Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.); thiết lập và ấn định giá trị chất đối chiếu cho hypophyllanthin và niranthin qua đánh giá liên phòng thí nghiệm, đáp ứng yêu cầu chất chuẩn đối chiếu phục vụ kiểm tra chất lượng thuốc và dược liệu.
2. Về mặt bào chế và tiêu chuẩn hóa cao dược liệu: Đã khảo sát tối ưu hóa quy trình điều chế cao giàu lignan ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot; xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng đồng thời 4 lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, nirtetralin); ban hành tiêu chuẩn kiểm nghiệm toàn diện cho cao khô Diệp hạ châu đắng.
3. Về mặt phân tích sinh học và dược động học: Đã phát triển và thẩm định phương pháp phân tích LC-MS/MS có độ nhạy và tính đặc hiệu cao để định lượng đồng thời các hợp chất lignan trong huyết tương thỏ; xác định được các thông số dược động học ($C_{max}$, $T_{max}$, $AUC$, $T_{1/2}$) của phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin sau khi uống cao chuẩn hóa.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Theo phạm vi nghiên cứu và nội dung thực nghiệm được đề cập trong văn bản:

• Hạn chế: Nghiên cứu đánh giá dược động học mới được thực hiện trên đối tượng động vật thực nghiệm (thỏ) với đường uống đơn liều; chưa tiến hành đánh giá dược động học lâm sàng trên người tình nguyện khỏe mạnh hoặc bệnh nhân. Các khảo sát quy trình điều chế mới dừng lại ở quy mô pilot phòng thí nghiệm.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu dược động học lâm sàng và sinh khả dụng của chế phẩm cao chuẩn hóa trên người.
  • Nghiên cứu sâu hơn về các chất chuyển hóa của hypophyllanthin và niranthin trong cơ thể.
  • Nâng cấp quy mô sản xuất cao chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng lên quy mô công nghiệp (nhà máy đạt chuẩn GMP).

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng thực tiễn và tham khảo học thuật đối với:

• Cán bộ kiểm nghiệm và nghiên cứu viên: Cung cấp quy trình chiết xuất, phân lập, phổ cấu trúc chi tiết ($NMR$, $DSC$, $IR$, $MS$) của các lignan; quy trình thẩm định chất đối chiếu liên phòng thí nghiệm và quy trình HPLC định lượng đồng thời 4 hoạt chất.
• Nhà nghiên cứu dược động học và phân tích sinh học: Quy trình chiết mẫu sinh học và phương pháp LC-MS/MS định lượng lignan trong huyết tương thỏ với đầy đủ các tiêu chí thẩm định theo US-FDA và EMA là tài liệu tham khảo trực tiếp cho các nghiên cứu tương đương sinh học và sinh khả dụng của thuốc từ dược liệu.
• Nhà sản xuất dược phẩm: Cung cấp thông số công nghệ chiết xuất pilot và tiêu chuẩn chất lượng của cao khô Diệp hạ châu đắng chuẩn hóa hàm lượng hoạt chất.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Đề tài luận án giải quyết khoảng trống nào trong công tác tiêu chuẩn hóa Diệp hạ châu đắng hiện nay?
Trả lời: Luận án giải quyết tình trạng thiếu hụt chất chuẩn đối chiếu hypophyllanthin và niranthin, khắc phục việc các tiêu chuẩn hiện hành (DĐVN V, USP) chỉ sử dụng duy nhất chất điểm chỉ phyllanthin, đồng thời cung cấp phương pháp định lượng đồng thời nhiều lignan và dữ liệu dược động học của cao chuẩn hóa.

2. Các hợp chất lignan nào đã được phân lập và xác định cấu trúc trong luận án?
Trả lời: Luận án đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc của 5 lignan gồm: niranthin (PA2), nirtetralin (PA3), hypophyllanthin (PA4), phyltetralin (PA5) và phyllanthin (PA6).

3. Những chất nào được thiết lập và ấn định giá trị làm chất đối chiếu trong luận án?
Trả lời: Luận án đã thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết, đánh giá liên phòng thí nghiệm và ấn định giá trị chất đối chiếu cho hypophyllanthin và niranthin (cùng khảo sát xác định độ tinh khiết cho nirtetralin).

4. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá dược động học của các lignan trong huyết tương thỏ?
Trả lời: Luận án sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ liên hợp (LC-MS/MS 8040) với chế độ giám sát phản ứng nhiều lần (MRM), sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi n-hexan sau khi tủa protein huyết tương.

5. Các thông số dược động học chính được xác định trong nghiên cứu là gì?
Trả lời: Các thông số dược động học chính gồm: Nồng độ đỉnh trong huyết tương ($C_{max}$), thời gian đạt nồng độ đỉnh ($T_{max}$), diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian ($AUC_{0-t}$ và $AUC_{0-\infty}$) và nửa đời thải trừ ($T_{1/2}$) của các hoạt chất sau khi uống cao chuẩn hóa.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Văn Sơn đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu từ chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các lignan đến thiết lập thành công chất đối chiếu hypophyllanthin và niranthin theo các hướng dẫn kiểm nghiệm chuẩn mực. Nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình điều chế và tiêu chuẩn hóa cao khô Diệp hạ châu đắng giàu hoạt tính sinh học trên quy mô phòng thí nghiệm và pilot. Đồng thời, phương pháp LC-MS/MS được phát triển đã xác định chính xác các thông số dược động học của các lignan chính trên động vật thực nghiệm, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc nâng cao chất lượng và xác định liều dùng điều trị của các chế phẩm từ Diệp hạ châu đắng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 1. Tên gọi, phân loại [1], [4] Tên thực vật: Diệp hạ châu đắng.

Tên khác: Chó đẻ răng cưa, chó đẻ thân xanh, cam kiềm, kiền đắng, cỏ trân châu, rút đất, trân châu thảo, lão nha châu, diệp hòa thái. Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan A. năm 2009 [94], cây Diệp hạ châu đắng có vị trí phân loại thực vật như sau: Giới (regnum) Plantae Ngành (division) Magnoliophyta (ngọc lan) Lớp (class) Magnoliopsida (ngọc lan) Bộ (ordo) Euphorbiales (thầu dầu) Họ (familia) Euphorbiaceae (thầu dầu) Chi (genus) Phyllanthus Loài (species) Phyllathus amarus Schum.

Phân bố - sinh thái Euphorbiaceae là một họ thực vật lớn bao gồm khoảng 6.500 loài trong 300 chi. Phyllanthus cũng là một chi lớn, có khoảng 200 loài ở Mỹ, 100 loài ở Châu Phi, 70 loài ở Madagascar, phần còn lại ở châu Á và châu Úc. Diệp hạ châu đắng là cây ưa sáng, ưa ẩm nhưng không chịu được ngập úng. Cây sống được trên nhiều loại đất (đất bazan, đất pha cát, đất cát, đất phù sa.) pH từ 5,0 đến 6,5.

Biên độ nhiệt thích hợp cho cây sinh trưởng là 25-30 oC. Cây ra hoa quả nhiều, tái sinh tốt từ hạt, vòng đời kéo dài 3-5 tháng. Trong tự nhiên, cây thường mọc trên đất ẩm ở ven đồi, trên nương rẫy, bãi hoang hay ven đường đi và quanh làng bản, ở cả miền núi lẫn trung du và đồng bằng [21]. Đặc diểm thực vật Cây thảo cao 40-80 cm, thân tròn, bóng, màu xanh, phân nhánh đều, nhiều.

Lá mọc so le xếp thành hai dãy sít nhau trông như lá kép hình lông chim. Phiến lá hình bầu dục, dài từ 5 mm đến 10 mm, rộng 3 mm đến 6 mm, màu xanh thẫm ở mặt trên, luan an 4 màu xanh nhạt ở mặt dưới. Hoa đực và hoa cái mọc thành cụm. Hoa đực có cuống ngắn 1 mm đến 2 mm, đài 5, có tuyến mật, nhị 3, chỉ nhị dính nhau.

Hoa cái có cuống dài hơn hoa đực. Quả nang, nhẵn, hình cầu, đường kính 1,8 mm đến 2 mm, có đài tồn tại. Quả chứa 6 hạt hình tam giác, đường kính 1 mm, hạt có sọc dọc ở lưng [1]. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum., Euphorbiacea (trái) và hoa (phải) Diệp hạ châu đắng Hình 1.

Mặt dưới của lá (trái) và các quả (phải) Diệp hạ châu đắng 1. Bộ phận dùng, gieo trồng, thu hái [4]. Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Phyllanthi amari Gieo trồng: Gieo hạt ở vườn ươm: tháng 1-2, trồng cây con: tháng 2-3, thu hoạch: tháng 4-5 (sau khi trồng 45-50 ngày). Nhìn chung, thời vụ trồng Diệp hạ châu đắng kéo dài cả mùa khô, tận dụng trời nắng để phơi.

Thu hái: Sau khi trồng khoảng 45-50 ngày, cây Diệp hạ châu đắng cao 60-70 cm là thu hoạch. Năng suất đạt 10-12 tấn tươi/ha/vụ. Một năm có thể trồng 2 vụ. Diệp hạ châu đắng là cây thuốc dễ trồng, cây không kén đất.

Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Thành phần hóa học của Phyllanthus amarus bao gồm: lignan, alkaloid, flavonoid, tannin thủy phân (Ellagitannin), polyphenol, triterpen, sterol và tinh dầu, như bảng liệt kê trong Bảng 1. luan an 5 Bảng 1. Thành phần hóa học trong Diệp hạ châu đắng Nhóm Hoạt chất Tài liệu Alkaloid Epibubbialin, isobubbialin, norsecurinin, securinin, securinol, [8], [46] 4-methoxy-nor-securinin, dihydrosecurinin, allo-securin, tetrahydrosecurinin, 4-methoxy dihydrosecurinin, 4-hydrosecurinin, 4-methoxy tetrahydrosecurinin Flavonoid Quercetin, rhamnocitrin, rutin, apigenin, luteolin, kaempferol, [5], [47], allocatechin, astragalin, quercetin-3-O-glucosid, quercitrin, [89] 4′,5,7-triethoxy-3,3′,6-trimethoxy flavon, phyllanthusiin Lignan Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, phyltetralin, [10], [53], nirtetralin, isonirtetralin, hinokinin, lintetralin, isolintetralin, [54], [81], demethylenedioxy niranthin, 5-demethoxy-niranthin, 7′- [84], [85], oxocubebin dimethyl ether, (3-(3,4-dimethoxybenzyl)-4-(7- [90], methoxybenzo[1,3]dioxol-5-yl-methyl)-dihydrofuran-2-on, và [91]. Sterol Amarosterol A, amarosterol B, cycloeucalenyl acetat, [47] macdougallin, ergosta-5,7,22-trien-3-ol acetat, 17-(1,5- dimethylhexyl)-6-hydroxy-5-methylestr-9-en-3-yl acetat, stigmasterol, β-sitosterol, daucosterol, stigmast-5-en-3-ol oleat, 6,7-epoxypregn-4-en-9,11,18-triol-3,20-dion, 11,18-diacetat, bufalin, 3-acetoxy-7,8-epoxylanostan-11-ol Tannin và Amariin, acid amariinic, amarulon, corilagin, geraniin, acid [47] phenol geranic, furosin, phyllanthusiin A, B, C và D, acid ellagic, acid repandusinic, elaeocarpusin, acid 4-galloyl quinic, acid gallic, gallocatechin, 1,6-digalloylglucopyranose, acid 4-O- galloylquinic, acid quicnic, acid geraniinic B, cidrepandusinic A, isocorilagin, melatonin.

Terpenoid Phyllanosid, 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, [47], [56] linalool, phytol, olean-13(18)-en, methyl ursolat, barringenol R1, Phenazin và dẫn chất phenazin 2Z, 6Z, 10Z, 14E, 18E, 22E-farnesyl farnesol, lupeol, phyllanthenol, phyllanthenon, phyllantheol, acid oleanolic, acid ursolic Nhóm Acid cinnamic, acid 4-hydroxy-3-methoxy-benzoic, acid [47] khác brevifolin carboxylic, rhodopin 1. Tính chất lý hóa một số hợp chất lignan 1. Phyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H34O6 Phyllanthin (IUPAC): 4-[(2S,3S)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-1,2-dimethoxybenzen CAS: 10351-88-9 Khối lượng phân tử: 418,5 g/mol luan an 6 Hệ số log Pow: 3,2 Tính tan: tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, methanol, ethanol, kém tan trong nước Điểm chảy: 96 C 1. Hypophyllanthin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Hypophyllanthin (IUPAC): (7R,8R,9S)-9-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy- 7,8-bis(methoxymethyl)-6,7,8,9-tetrahydrobenzo[g][1,3]benzodioxol CAS: 33676-00-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,6 Tính tan: Tan trong dung môi hữu cơ như cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton ~ 0,2 trong ethanol, ~10 mg/mL trong dimethylsulfoxid, ~ 30 mg/mL trong dimethylformamid.

Niranthin [105] Công thức phân tử: C24H32O7. Niranthin (IUPAC): 6-[(2R,3R)-3-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4- methoxy-2-(methoxymethyl)butyl]-4-methoxy-1,3-benzodioxol. CAS: 50656-77-4 Khối lượng phân tử: 432,5 g/mol Hệ số log Pow: 4,1 Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. Nirtetralin [105] Công thức phân tử: C24H30O7 Nirtetralin (IUPAC): (5R,6S,7S)-5-(3,4-dimethoxyphenyl)-4-methoxy-6,7- bis(methoxymethyl)-5,6,7,8-tetrahydrobenzo[f][1,3]benzodioxol CAS: 50656-78-5 Khối lượng phân tử: 430,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,6 luan an 7 Tính tan: Tan trong dung môi cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton.

Phyltetralin [105] Công thức phân tử: C24H32O6 Phyltetralin (IUPAC): ((1R,2S,3S)-1-(3,4-dimethoxyphenyl)-6,7-dimethoxy- 2,3-bis(methoxymethyl)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen CAS: 123048-17-9 Khối lượng phân tử: 416,5 g/mol Hệ số log Pow: 3,8 Tính tan: Tan trong: cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, dimethylsulfoxid, aceton. MeO OMe OMe MeO OMe OMe Phyllanthin Hypophyllanthin O MeO O OMe OMe OMe OMe OMe OMe O O MeO OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe Niranthin Nirtetralin Phyltetralin Hình 1. Công thức hóa học của một số lignan 1. Tác dụng sinh học Diệp hạ châu đắng là một thảo dược đã được sử dụng làm thuốc từ lâu đời.

Thành phần hóa học của cây rất phong phú, đa dạng, có chứa nhiều nhóm chất như alkaloid, flavonoid, lignan, tannin thủy phân (ellagitannin), polyphenol, triterpen, luan an 8 sterol và tinh dầu. Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng dược lý có ích trong điều trị bệnh, đã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Diệp hạ châu đắng như tác dụng bảo vệ tế bào gan, trị viêm gan, hoạt tính kháng khối u, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và ký sinh trùng. Ngoài ra, còn có hoạt tính kháng HIV, chống oxy hóa, hạ đường huyết và cholesterol trong máu. Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của Phyllanthus amarus trong nước cũng như trên thế giới, có thể liệt kê trong bảng sau: Bảng 1.

Tác dụng sinh học cây Diệp hạ châu đắng Tác dụng sinh học Tài liệu tham khảo Bảo vệ tế bào gan, trị viêm gan [36], [50], [56], [60], [68], [79], [83], [93], [96], [100] Hoạt tính kháng khối u [11], [35], [37], [45], [49], [68] Chống oxy hóa [39], [51], [104], [64], [65], [66], [87] Hoạt tính kháng HIV [32], [42], [57], [73] Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và ký sinh [14], [16], [70], [69], [71], trùng [77], [86], [99], [104] Kháng viêm, giảm đau [21], [30], [41], [42], [55], [68], [88] Tiểu đường [12], [13], [27], [72], [95] Tim mạch, hạ huyết áp [24], [33], [80] 1. Độc tính và chống chỉ định Diệp hạ châu đắng không có độc tính được ghi nhận. và cộng sự đã thực hiện thử nghiệm độc tính cấp với liều 300, 600, 2000 và 5000 mg/kg trọng lượng cơ thể trên chuột của dịch chiết Phyllanthus amarus bằng đường uống. Kết quả xác nhận không có trường hợp tử vong nào được ghi nhận và nghiên cứu cho thấy không có thay đổi đáng kể về hành vi chung, trọng lượng cơ thể, hình dáng tổng thể của các cơ quan nội tạng, các chỉ số huyết học và sinh hóa cũng như cấu trúc mô học của gan cũng cho thấy bản chất không độc hại của chế phẩm này.

Các nghiên cứu sinh hóa cho thấy không có sự thay đổi đáng kể về nồng độ ALT, AST, albumin, triglycerid, cholesterol và albumin. Không có bằng chứng nào được tìm thấy về xuất huyết, tổn thương tế bào gan, biến đổi mỡ, hoại tử trung tâm hay thay đổi số lượng tế luan an 9 bào Kupffer trong gan. Không có tăng huyết áp, không gây độc cấp tính cho thận hay nhiễm độc gan [48]. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT LIGNAN TỪ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG 1.

Các nghiên cứu về quy trình chiết xuất 1. Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ Dung môi hữu cơ là dung môi đầu tay trong các nghiên cứu chiết xuất hoạt chất từ dược liệu. Tùy vào nhóm hoạt chất mong muốn chiết xuất, bộ phận, loại dược liệu mà nhà nghiên cứu lựa chọn loại dung môi, kỹ thuật thích hợp. Một số tác giả nghiên cứu chiết bằng Soxhlet, đa số thì chiết bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ thường, áp suất thường.

Có một số tác giả ứng dụng biện pháp kỹ thuật đặc biệt có thể làm rút ngắn thời gian chiết như: siêu âm, phương pháp tạo dòng xoáy và phương pháp mạch nhịp [7]. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn Những năm gần đây, phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn (super-critical fluid extraction, SFE) thường được áp dụng để chiết xuất các hợp chất tự nhiên quý có trong các loài thực vật có chứa nhiều các hợp chất trong đó. và cộng sự đã dùng CO2 lỏng siêu tới hạn để chiết xuất phyllanthin và niranthin ở các áp suất khác nhau (10, 20, 30 MPa) và nhiệt độ (30, 40, 50 °C) và có so sánh với điều kiện có bổ sung 10 % kết hợp dung môi ethanol - nước (50: 50) nhận thấy rằng ở điều kiện có bổ sung kết hợp dung môi làm tăng tốc độ thu hồi các lignan nhưng tính chọn lọc giảm (nhiều tạp khác) và nhiệt độ, áp suất không ảnh hưởng đáng kể đến năng suất chiết trong trường hợp kết hợp dung môi [78]. Chiết hỗ trợ vi sóng Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (Microwave Assisted Extraction, MAE) ngày càng nhận được sự quan tâm như một phương pháp thay thế tiềm năng cho các phương pháp chiết lỏng - rắn truyền thống, chủ yếu do tiết kiệm đáng kể thời gian xử lý và lượng dung môi tiêu thụ.

Chiết xuất dưới hỗ trợ vi sóng (MAE) hay đơn giản là chiết xuất bằng vi sóng là một kỹ thuật chiết xuất tương đối mới kết hợp chiết xuất bằng vi luan an 10 sóng và dung môi. Trong quá trình gia nhiệt bằng vi sóng, sự truyền năng lượng xảy ra theo hai cơ chế: quay lưỡng cực và dẫn ion thông qua sự đảo ngược của các lưỡng cực và sự dịch chuyển của các ion tích điện có trong chất tan và dung môi. MAE là một quá trình sử dụng năng lượng vi sóng để làm nóng dung môi tiếp xúc với mẫu nhằm phân tách các chất phân tích từ nền mẫu vào dung môi.