Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra

Luận án nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp từ vi sinh vật và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra, mở ra hướng đi mới trong công nghệ thực phẩm.

• Tác giả: Phạm Mỹ Dung
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Công Hoạt
• Trường học: Trường Đại học Vinh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin
• 1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá
• 1.3. Đặc điểm, chức năng của gelatinase
• 1.4. Phân loại gelatinase
• 1.5. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase
• 1.6. Tính chất chung của gelatinase
• 1.7. Nguồn sản xuất gelatinase
• 1.8. NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP
• 1.9. Sản xuất gelatinase tái tổ hợp
• 1.10. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase
• 2.4.2. Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp
• 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL
• 2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL
• 2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra
• 2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE
• 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao
• 3.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn
• 3.2. TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP
• 3.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E
• 3.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase
• 3.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE
• 3.2.4. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli tái tổ hợp mang gen gelE
• 3.3. ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL
• 3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL
• 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL
• 3.3.3. Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL
• 3.3.4. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp
• 3.4. THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL
• 3.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL
• 3.4.2. Đặc tính của gelatinase tái tổ hợp
• 3.5. ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA
• 3.5.1. Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL
• 3.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về gelatinase

Gelatinase (gelatinase) là một loại enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân gelatin, một sản phẩm có giá trị cao trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Enzyme này có khả năng phân giải các protein lớn thành các đoạn peptide và axit amin, từ đó tạo ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Việc nghiên cứu và phát triển gelatinase tái tổ hợp là cần thiết để nâng cao hiệu quả sản xuất và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Gelatinase có thể được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, nhưng việc sử dụng các chủng vi khuẩn tái tổ hợp như Escherichia coli mang lại nhiều lợi ích hơn về mặt an toàn và hiệu quả. Theo nghiên cứu, hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp thường cao hơn so với enzyme tự nhiên, giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng trong thực tiễn.

1.1. Đặc điểm và phân loại gelatinase

Gelatinase được phân loại thành nhiều loại khác nhau dựa trên cấu trúc và cơ chế hoạt động. Các loại gelatinase chính bao gồm gelatinase A và B, mỗi loại có đặc điểm riêng biệt về hoạt tính và ứng dụng. Gelatinase A thường có hoạt tính cao hơn và được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm. Việc phân loại này giúp các nhà nghiên cứu và kỹ sư có thể lựa chọn loại enzyme phù hợp nhất cho từng ứng dụng cụ thể. Nghiên cứu về đặc điểm, chức năng của gelatinase không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm enzyme có giá trị cao.

II. Nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp

Nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp từ vi khuẩn Enterococcus faecalis đã được thực hiện với mục tiêu tạo ra một chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme này với hoạt tính cao. Quá trình này bao gồm việc sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa gelatinase và tạo chủng E. coli tái tổ hợp. Các phương pháp hiện đại như kỹ thuật di truyền và công nghệ lên men được áp dụng để tối ưu hóa điều kiện sản xuất. Kết quả cho thấy, hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp đạt được cao hơn nhiều so với enzyme tự nhiên, mở ra cơ hội ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Việc sản xuất gelatinase tái tổ hợp không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất mà còn giảm thiểu rủi ro về an toàn thực phẩm.

2.1. Quy trình sản xuất gelatinase tái tổ hợp

Quy trình sản xuất gelatinase tái tổ hợp bao gồm nhiều bước quan trọng như thiết kế vector tái tổ hợp, nuôi cấy vi khuẩn và thu hồi enzyme. Đầu tiên, gen gelE được tách ra từ vi khuẩn và đưa vào vector biểu hiện. Sau đó, vi khuẩn E. coli mang vector này được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để sản xuất enzyme. Cuối cùng, enzyme được thu hồi và tinh sạch để đảm bảo chất lượng. Các nghiên cứu cho thấy, việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và nồng độ chất cảm ứng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của gelatinase. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc nghiên cứu và phát triển quy trình sản xuất enzyme hiệu quả.

III. Ứng dụng gelatinase trong thủy phân gelatin da cá Tra

Việc ứng dụng gelatinase tái tổ hợp trong thủy phân gelatin từ da cá Tra đã được nghiên cứu với mục tiêu tạo ra chế phẩm axit amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen. Kết quả cho thấy, enzyme này có khả năng thủy phân gelatin hiệu quả, tạo ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Thủy phân gelatin không chỉ giúp tận dụng nguồn nguyên liệu từ da cá mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, việc bổ sung chế phẩm axit amin từ gelatin vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giúp nâng cao hiệu quả tăng trưởng và sức khỏe của cá. Điều này chứng tỏ giá trị thực tiễn của việc ứng dụng gelatinase trong ngành nuôi trồng thủy sản.

3.1. Kết quả và hiệu quả ứng dụng

Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng gelatinase tái tổ hợp trong thủy phân gelatin da cá Tra mang lại hiệu quả cao trong việc sản xuất axit amin. Các thí nghiệm cho thấy, tỷ lệ thủy phân gelatin đạt được lên đến 90% trong điều kiện tối ưu. Hơn nữa, việc bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn cho cá Mú chấm đen đã cải thiện đáng kể tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống sót của cá. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả kinh tế cho người nuôi mà còn góp phần bảo vệ môi trường bằng cách tận dụng nguồn phụ phẩm từ chế biến cá. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm enzyme có giá trị trong ngành thủy sản.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Gelatinase (GEL) là một metalloprotease ngoại bào phụ thuộc ion kim loại (kẽm), có chức năng xúc tác quá trình thủy phân gelatin, collagen, pheromone, casein và fibrinogen thành các đoạn peptit ngắn cùng các axit amin tự do. Trong tự nhiên, gelatinase được tìm thấy ở nhiều chi vi khuẩn như Enterococcus, Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Aeromonas, Enterobacter. Tuy nhiên, đa số các chủng vi sinh vật tự nhiên sinh tổng hợp gelatinase là vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật, tiềm ẩn nguy cơ gây độc sinh học nên không thể đưa vào sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme quy mô lớn. Bên cạnh đó, hoạt tính sinh tổng hợp gelatinase ở các chủng hoang dại thường thấp. Để khắc phục các hạn chế này, giải pháp kỹ thuật di truyền nhằm tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa gelatinase (gelE) được xác định là hướng tiếp cận có khả năng loại trừ tính độc của chủng nguồn, nâng cao hoạt tính và cho phép sản xuất enzyme quy mô lớn. Trong các hệ thống biểu hiện, Escherichia coli được đánh giá là vật chủ có tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy và đạt hiệu suất biểu hiện cao.

Tại Việt Nam, ngành chế biến xuất khẩu cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) phát triển mạnh với diện tích trên 6.078 ha, sản lượng xuất khẩu đạt trên 1,11 triệu tấn/năm và kim ngạch đạt 1,78 tỷ USD năm 2017. Quá trình chế biến cá phi-lê thải ra lượng phụ phẩm chiếm từ 1 đến 1,5 kg trên mỗi 2 đến 2,5 kg cá nguyên liệu, trong đó da cá chiếm từ 4% đến 6% tổng lượng phụ phẩm. Da cá Tra là nguồn giàu collagen và gelatin. Các phương pháp thủy phân da cá bằng axit hoặc kiềm đòi hỏi thiết bị chịu ăn mòn, gây ô nhiễm môi trường và làm chuyển dạng đồng phân quang học dẫn đến mất hoạt tính sinh học của các axit amin. Việc ứng dụng công nghệ enzyme để thủy phân gelatin da cá Tra thành bột axit amin chất lượng cao dùng trong sản xuất thức ăn thủy sản—đặc biệt cho cá biển như cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) vốn không tự tổng hợp được các axit amin thiết yếu—chưa được hoàn thiện về mặt công nghệ tạo enzyme tái tổ hợp tại Việt Nam. Đây là khoảng trống nghiên cứu chính mà luận án tập trung giải quyết.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án: Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axit amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả.

Bốn nội dung nghiên cứu chính của luận án gồm:

1. Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa gelatinase từ vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.
2. Tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh gelatinase và nghiên cứu điều kiện lên men biểu hiện rGEL.
3. Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật và nghiên cứu đặc tính của rGEL.
4. Ứng dụng rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra và đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương giống cá Mú chấm đen.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis MD4 sinh gelatinase, lưu giữ tại Bộ sưu tập vi sinh vật của Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội.
  • Các chủng vi khuẩn chủ Escherichia coli BL21(DE3) và E. coli XL1-Blue, tiếp nhận từ Phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học, Trường Đại học Quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.
  • Da cá Tra thu nhận từ Công ty Cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc, Thành phố Cần Thơ, bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ -20 ± 2°C.
  • Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) giai đoạn giống: cá khỏe mạnh, kích cỡ đồng đều với chiều dài trung bình 7 cm/con và khối lượng trung bình 7,067 g/con, thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp, huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An.
• Phạm vi không gian:
  • Nghiên cứu tạo enzyme gelatinase tái tổ hợp và tối ưu hóa điều kiện thủy phân da cá Tra thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội và Viện Di truyền Nông nghiệp.
  • Nghiên cứu ứng dụng bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn cho cá Mú chấm đen triển khai ở quy mô mô hình thử nghiệm tại Trại Thực nghiệm nuôi Hải sản – Trường Đại học Vinh (Trại thủy sản mặn lợ Nghi Xuân).
• Phạm vi thời gian: Toàn bộ các nội dung nghiên cứu thực nghiệm của luận án được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước trong và ngoài nước

Gelatin là sản phẩm biến tính từ collagen, bao gồm các chuỗi polypeptide có trọng lượng phân tử dao động lớn, chứa các đơn vị α, β (dimer) và γ (trimer) tương ứng với khối lượng xấp xỉ 90, 180 và 300 kDa (Budavari, 1996; Karim và cộng sự, 2009; Rbii và cộng sự, 2011). Trình tự axit amin lặp lại điển hình là Gly-Pro-Hyp, trong đó glycine chiếm tỷ lệ cao nhất (26–34%), proline chiếm 10–18% và hydroxyproline chiếm 7–15% (Poppe, 1997). Nghiên cứu của Gómez-Guillén và cộng sự (2002), Badii và Howell (2006) chỉ ra phụ phẩm da cá là nguồn thu nhận gelatin có giá trị cao, loại trừ hoàn toàn nguy cơ lây truyền bệnh não xốp bò (BSE) và phù hợp với tiêu chuẩn thực phẩm của cộng đồng Hồi giáo. Quy trình chiết xuất và thủy phân da cá đã được khảo sát qua nhiều công trình: Grossman và Bergman (1992), Montero và Gómez-Guillén (2000), Yang và cộng sự (2007), Nalinanon và cộng sự (2008), Sanaei Ardekani và cộng sự (2013). Các nghiên cứu thủy phân gelatin bằng enzyme thương mại như alcalase, neutrase, pepsin, trypsin, protex đã được Alemán và cộng sự (2011), Wachirattanapongmettee và cộng sự (2009) thực hiện, cho thấy enzyme bảo toàn được các axit amin không bị biến tính hay đồng phân hóa.

Về enzyme gelatinase, Makinen và cộng sự (1989, 1994) xác định đây là protease phụ thuộc kẽm thuộc họ M4 metalloendopeptidase. Ở người, gelatinase gồm MMP-2 (72 kDa) và MMP-9 (92 kDa) thuộc họ matrix metalloproteinases chứa kẽm và canxi (Zitka và cộng sự, 2010; Visse và Nagase, 2003). Ở vi khuẩn, enzyme gelatinase của Enterococcus faecalis được giải trình tự và nghiên cứu sâu bởi Su và cộng sự (1991), Del Papa và cộng sự (2007), Bourgogne và cộng sự (2006). Quá trình sinh tổng hợp gelatinase tự nhiên ở E. faecalis được kiểm soát bởi hệ thống cảm ứng mật độ fsrABCD thông qua phân tử pheromone GBAP (Nakayama và cộng sự, 2006; Nishiguchi và cộng sự, 2009; Teixeira và cộng sự, 2012).

Về biểu hiện tái tổ hợp, Pourmotabbed và cộng sự (1994), Kröger và cộng sự (1997) đã biểu hiện thành công đoạn cDNA gelatinase người trong E. coli. Đối với vi khuẩn, các metalloprotease họ M4 như thermolysin của Bacillus thermoproteolyticus (Inouye và cộng sự, 2006), metalloprotease của Salinivibrio sp. AF-2004, empV của Vibrio vulnificus (Chuang và cộng sự, 1997), elastase lasB của Pseudomonas aeruginosa (Odunuga và cộng sự, 2015) đã được sản xuất trong E. coli.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu dừng lại ở việc sàng lọc các chủng vi khuẩn tự nhiên có hoạt tính gelatinase từ môi trường, chẳng hạn như chi Bacillus (Trần Quốc Đảm, 2013) hoặc chi Pseudomonas để xử lý phụ phẩm chăn nuôi (Phạm Công Hoạt và cộng sự, 2012). Nhóm nghiên cứu của Đào Thị Hồng Vân (2015) và Phạm Mỹ Dung và cộng sự (2015) đã có những bước dò dẫm đầu tiên về việc nhân dòng và khảo sát sơ bộ biểu hiện gelatinase tái tổ hợp.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Các công bố tại Việt Nam trước năm 2018 chưa có công trình nào hoàn chỉnh từ khâu phân lập gen gelE từ chủng vi khuẩn tự nhiên nội địa (Enterococcus faecalis MD4), thiết kế vector biểu hiện pET-22b(+), tinh sạch enzyme rGEL bằng sắc ký ái lực, xác định toàn diện các thông số động học enzyme đến việc ứng dụng trực tiếp rGEL để thủy phân gelatin da cá Tra quy mô phòng thí nghiệm và thử nghiệm thức ăn chứa dịch thủy phân trên đối tượng cá Mú chấm đen giai đoạn giống. Luận án này giải quyết trọn vẹn chuỗi liên hoàn từ nguồn gen, công nghệ sinh học phân tử đến ứng dụng thực tiễn trong nuôi trồng thủy sản.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết cấu trúc metalloproteinase họ M4: Gelatinase từ vi khuẩn Enterococcus faecalis là một endopeptidase phụ thuộc ion kim loại Zn²⁺ tại tâm xúc tác, có mô-típ bảo thủ HExxH (gồm His237, His331 và phối tử Glu351 liên kết với Zn²⁺; gốc Glu328 đóng vai trò xúc tác). Phân tử chứa các vị trí liên kết với ion Ca²⁺ để ổn định cấu trúc và tăng tính bền nhiệt.
• Cơ chế tiền enzyme và quá trình trưởng thành: Gen gelE phiên mã tạo chuỗi polypeptide tiền chất (preproenzyme) dài 509 axit amin. Quá trình hoạt hóa đòi hỏi sự cắt bỏ chuỗi tín hiệu đầu N (29 axit amin), tiếp theo là đoạn propeptide nội bào (từ vị trí 30 đến 191) tại liên kết His191↓Val. Phân tử enzyme sau đó trải qua quá trình tự cắt bỏ 14 axit amin ở đầu tận cùng C (Asp495↓Ile-Gln: chuỗi IQVNQPSESVLVNE, khối lượng ~1.556 Da) để tạo thành enzyme hoạt tính có kích thước thực tế xấp xỉ 33 kDa.
• Hệ thống điều hòa fsr operon: Sự biểu hiện của gen gelE tự nhiên được kiểm soát bởi operon fsrABCD thông qua cơ chế quorum-sensing với phân tử peptide vòng 11 axit amin GBAP. Việc tách dòng khung đọc mở gen gelE đưa vào vector có promoter T7 mạnh cho phép biểu hiện enzyme ngoại lai độc lập với cơ chế ức chế tự nhiên của vi khuẩn chủ.
• Hệ thống vector pET và chủng chủ E. coli BL21(DE3): Hệ thống plasmid pET-22b(+) mang promoter T7, vị trí bám ribosom mạnh, đoạn tín hiệu pelB và trình tự mã hóa đuôi 6xHis ở đầu C. Chủng chủ E. coli BL21(DE3) mang đoạn gen T7 RNA polymerase tích hợp trên nhiễm sắc thể dưới sự kiểm soát của lac promoter, đồng thời bị đột biến bất hoạt hai gen protease nội bào và ngoại bào quan trọng là lon và ompT, giúp hạn chế tối đa sự phân hủy protein tái tổ hợp.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm sinh học phân tử, hóa sinh học và thực nghiệm nuôi trồng thủy sản:

• Phương pháp sàng lọc và định danh vi sinh vật: Phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cá nước ngọt, kiểm tra khả năng làm tan chảy gelatin 7,5 g/L và đo đường kính vòng phân giải cơ chất trên đĩa thạch gelatin. Khảo sát đặc điểm sinh hóa, hình thái qua kính hiển vi điện tử quét và nhuộm Gram. Khuếch đại gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST.
• Phương pháp sinh học phân tử và tạo chủng tái tổ hợp:
  • Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn E. faecalis MD4.
  • Thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại toàn bộ gen gelE.
  • Biến nạp sản phẩm PCR vào vector tách dòng, giải trình tự nucleotide và suy diễn trình tự axit amin.
  • Cắt mở vòng vector biểu hiện pET-22b(+) và gen tinh sạch bằng hai enzyme giới hạn HindIII và SalI.
  • Nối ghép và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli XL1-Blue, sau đó chuyển vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3). Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR và cắt enzyme giới hạn.
• Phương pháp khảo sát điều kiện lên men biểu hiện rGEL: Nuôi cấy E. coli tái tổ hợp trong môi trường LB có bổ sung ampicillin (100 µg/mL). Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường, nhiệt độ nuôi cấy (so sánh 34°C và 37°C), nồng độ chất cảm ứng IPTG (từ 1 mM đến 6 mM) và theo dõi động thái mật độ quang OD₆₀₀ cùng hoạt tính enzyme theo thời gian lên men. Kiểm tra sự biểu hiện protein bằng điện di biến tính SDS-PAGE.
• Phương pháp thu hồi, tinh sạch và xác định đặc tính enzyme:
  • Phá vỡ tế bào bằng phương pháp siêu âm, ly tâm thu dịch chiết enzyme thô.
  • Tinh sạch rGEL mang đuôi His-tag qua cột sắc ký ái lực kim loại cố định Ni²⁺ (cột HiTrap), rửa giải bằng đệm chứa imidazole.
  • Xác định nồng độ protein theo đồ thị đường chuẩn BSA.
  • Xác định pH tối ưu và độ bền pH; nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt.
  • Đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại, hóa chất ức chế (EDTA, DTT, β-mercaptoethanol) và các chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính rGEL.
  • Xác định các thông số động học Km và Vmax bằng đồ thị Lineaweaver-Burk với cơ chất gelatin.
• Phương pháp thủy phân gelatin da cá Tra: Khảo sát các thông số công nghệ gồm tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S), nhiệt độ thủy phân, thời gian phản ứng và tỷ lệ nước bổ sung. Xác định hiệu suất thủy phân và phân tích thành phần axit amin trong dịch thủy phân bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Phương pháp thử nghiệm dinh dưỡng trên cá Mú chấm đen: Bố trí thí nghiệm nuôi trong hệ thống giai ương tại Trại Nghi Xuân, theo dõi các chỉ tiêu môi trường nước. Đánh giá tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG) về khối lượng và chiều dài, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR), hệ số biến động và tỷ lệ sống của cá ở các công thức thức ăn bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu khoa học về cấu trúc phân tử của gelatin và collagen, phân tích đặc tính lý hóa và thành phần axit amin của gelatin da cá so sánh với gelatin bì lợn và da bò. Dẫn liệu cho thấy gelatin da cá chứa hàm lượng cao glycine, proline, alanine, arginine nhưng hàm lượng methionine và imino axit (proline + hydroxyproline) dao động tùy loài cá nước lạnh hay nước ấm. Chương này tổng thuật chi tiết cấu trúc hóa sinh, phân loại của họ enzym M4 metalloprotease vi khuẩn và hệ thống MMPs ở người, cơ chế điều hòa sinh tổng hợp gelatinase thông qua hệ thống quorum-sensing operon fsrABCD ở Enterococcus faecalis. Đồng thời, chương 1 phân tích ưu thế của hệ thống biểu hiện E. coli BL21(DE3) mang promoter T7, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cuộn gập protein, giải pháp hạn chế tạo thể vùi và kỹ thuật tinh sạch protein tái tổ hợp gắn đuôi His-tag bằng cột ái lực Ni²⁺.

Dưới đây là bảng tổng hợp dẫn liệu so sánh thành phần axit amin của gelatin từ da một số loài cá và bì lợn được tác giả tổng thuật trong Chương 1:

Loại axit amin (số dư lượng/1000)	Da cá Alaska pollock	Da cá Tuyết (Hake)	Cá Megrim	Cá Rô phi	Bì lợn
Alanine	96	108	119	123	112
Glycine	344	358	331	350	330
Hydroxyproline	50	55	59	60	91
Proline	106	95	114	115	132
Arginine	56	51	54	54	49
Lysine	29	26	28	27	27
Methionine	17	16	15	13	4
Leucine	22	20	23	21	24
Serine	64	63	49	41	35

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu thực nghiệm, thành phần hóa chất, môi trường nuôi cấy (môi trường LB lỏng, LB thạch, môi trường MPA, thạch gelatin 7,5 g/L), danh mục máy móc thiết bị sinh học phân tử và quy trình thao tác. Phương pháp nghiên cứu bao gồm:

• Quy trình phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S rRNA.
• Quy trình kỹ thuật khuếch đại gen gelE từ DNA bộ gen của chủng E. faecalis MD4, tinh sạch phân đoạn DNA, tạo dòng vào vector trung gian và gắn vào vector biểu hiện pET-22b(+) nhờ enzyme cắt giới hạn HindIII và SalI.
• Quy trình biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21(DE3), sàng lọc dòng tái tổ hợp mang plasmid tái tổ hợp pET-22b(+)-gelE trên môi trường thạch chọn lọc chứa ampicillin và kiểm tra hoạt tính phân giải gelatin trên đĩa thạch đục lỗ.
• Quy trình tối ưu hóa các điều kiện lên men: pH, nhiệt độ (34°C và 37°C), nồng độ chất cảm ứng IPTG (1, 2, 3, 4, 5, 6 mM).
• Quy trình phá vỡ tế bào bằng siêu âm, ly tâm tách dịch trong và tinh sạch rGEL qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA.
• Phương pháp xác định hoạt tính enzyme gelatinase, khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (20–80°C), độ bền nhiệt theo thời gian, ảnh hưởng của pH (pH 5–11), độ bền pH, tác động của các cation kim loại, các hóa chất ức chế enzyme và chất tẩy rửa.
• Quy trình công nghệ thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL và quy trình bố trí nghiệm thức thí nghiệm thức ăn trên cá Mú chấm đen giai đoạn giống (đo đạc các thông số chất lượng nước, sinh trưởng ADG, FCR, tỷ lệ sống).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm và thảo luận khoa học qua 5 phần nội dung chính:

1. Sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase: Khảo sát 11 chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh. Chủng ký hiệu MD4 thể hiện hoạt tính phân giải gelatin mạnh nhất sau 48 giờ nuôi cấy, tạo vòng thủy phân trong suốt lớn trên đĩa thạch và hóa lỏng hoàn toàn môi trường gelatin 7,5 g/L. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA và so sánh BLAST trên GenBank khẳng định chủng MD4 có độ tương đồng nucleotide cao nhất với loài Enterococcus faecalis, từ đó định tên chủng là Enterococcus faecalis MD4. Chủng này sinh trưởng tốt ở 37°C và có khả năng đồng hóa nhiều nguồn carbon và nitơ.

2. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen gelE: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại thành công gen gelE từ hệ gen của E. faecalis MD4. Trình tự gen gelE phân lập có độ dài tương ứng khung đọc mở 509 axit amin. So sánh trình tự nucleotide và trình tự axit amin suy diễn của gen gelE chủng MD4 với các trình tự đã công bố trên GenBank cho thấy độ tương đồng rất cao, bảo tồn nguyên vẹn mô-típ vùng tâm hoạt động xúc tác HExxH. Gen gelE sau đó được tinh sạch, cắt mở và gắn thành công vào vector biểu hiện pET-22b(+) tại hai vị trí nhận biết của enzyme HindIII và SalI. Vector tái tổ hợp pET-22b(+)-gelE được biến nạp thành công vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3). Kết quả điện di SDS-PAGE và kiểm tra trên đĩa thạch đục lỗ chứng minh chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp được protein tái tổ hợp rGEL có hoạt tính phân giải gelatin rõ rệt.

3. Nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL:

   • Ảnh hưởng của pH: Khảo sát dải pH nuôi cấy cho thấy pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng của chủng tái tổ hợp và mức độ biểu hiện rGEL. Hoạt tính biểu hiện đạt tối ưu ở vùng pH trung tính quanh pH 7,0.
   • Ảnh hưởng của nhiệt độ: So sánh biểu hiện ở 37°C và 34°C trên gel SDS-PAGE cho thấy ở 34°C, tỷ lệ protein rGEL ở trạng thái hòa tan cao hơn, giảm thiểu hiện tượng hình thành thể vùi không tan so với nuôi cấy ở 37°C.
   • Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG: Khảo sát các mức nồng độ IPTG từ 1 mM đến 6 mM. Kết quả cho thấy nồng độ IPTG 1 mM và 2 mM cho hoạt tính gelatinase cao nhất, trong khi nồng độ IPTG từ 3 mM đến 6 mM gây ức chế sinh trưởng tế bào và làm giảm hoạt tính sinh học của enzyme do gây độc và biểu hiện quá mức tạo thể vùi. Do đó, nồng độ IPTG 1 mM được lựa chọn là thông số tối ưu.
   • Động thái lên men: Theo dõi mật độ tế bào (OD₆₀₀) và hoạt tính enzyme theo thời gian nuôi cấy xác định được thời điểm thu nhận enzyme tối ưu sau khi bổ sung chất cảm ứng.

4. Thu hồi, tinh sạch và xác định đặc tính của rGEL:

   • Tinh sạch: Dịch chiết sau siêu âm phá tế bào được nạp qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA. Phân đoạn rGEL gắn đuôi 6xHis được rửa giải bằng đệm chứa nồng độ imidazole thích hợp, cho vệt protein đơn băng rõ nét trên điện di SDS-PAGE với kích thước xấp xỉ 33–34 kDa. Quy trình tinh sạch giúp loại bỏ hầu hết protein tạp của tế bào chủ, nâng cao độ tinh sạch và hoạt tính riêng của enzyme.
   • Đặc tính enzyme: rGEL thể hiện hoạt tính tối ưu ở vùng nhiệt độ 35–40°C và duy trì độ bền nhiệt ổn định ở 40°C sau nhiều giờ. Về pH, enzyme hoạt động tối ưu trong môi trường kiềm yếu (pH 7,5–8,0) và có độ bền pH tốt trong dải pH 7,0–8,5. Hoạt tính enzyme phụ thuộc vào ion Zn²⁺ và Ca²⁺; bị ức chế mạnh bởi chất tạo phức chelat kim loại EDTA, chất khử DTT và β-mercaptoethanol. Các chất tẩy rửa ở nồng độ khảo sát ảnh hưởng ở các mức độ khác nhau đến hoạt tính enzyme. Đồ thị Lineaweaver-Burk xác lập được các giá trị hằng số Michaelis-Menten (Km) và vận tốc phản ứng cực đại (Vmax) của rGEL đối với cơ chất gelatin.

5. Ứng dụng rGEL thủy phân da cá Tra và thử nghiệm trên cá Mú chấm đen:

   • Tối ưu hóa quá trình thủy phân: Xác lập các điều kiện thủy phân tối ưu gồm tỷ lệ enzyme/cơ chất, nhiệt độ phản ứng, thời gian thủy phân và tỷ lệ nước bổ sung. Phân tích HPLC sản phẩm thủy phân cho thấy gelatin da cá Tra được phân cắt triệt để thành các đoạn peptide ngắn và các axit amin tự do, trong đó hàm lượng glycine, alanine, proline chiếm tỷ lệ vượt trội, không xảy ra hiện tượng mất hoạt tính sinh học hay biến tính quang học.
   • Thử nghiệm dinh dưỡng trên cá Mú chấm đen: Chế phẩm axit amin thu được từ dịch thủy phân gelatin da cá Tra được phối trộn vào thức ăn công nghiệp cho cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) giai đoạn giống (chiều dài ban đầu 7 cm, khối lượng ban đầu 7,067 g). Kết quả theo dõi các lô thí nghiệm cho thấy:
     • Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG) về khối lượng và chiều dài của cá ở các lô bổ sung chế phẩm axit amin cao hơn rõ rệt so với lô đối chứng không bổ sung.
     • Hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) ở các lô bổ sung giảm đáng kể, thể hiện hiệu quả sử dụng thức ăn tốt hơn.
     • Tỷ lệ sống của cá Mú chấm đen khi kết thúc thí nghiệm đạt mức cao, hệ số biến động kích cỡ trong đàn thấp, cá sinh trưởng đồng đều, các yếu tố môi trường nước trong hệ thống ương luôn nằm trong giới hạn cho phép.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

Văn bản luận án nêu rõ ba đóng góp mới chính về mặt khoa học và công nghệ:

1. Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam phân lập, giải trình tự và xác định đặc tính nguồn gen gelE mã hóa enzyme gelatinase từ chủng vi khuẩn tự nhiên Enterococcus faecalis MD4 phân lập từ nguồn bệnh phẩm cá nước ngọt nội địa.
2. Thiết kế thành công vector tái tổ hợp pET-22b(+)-gelE và tạo được chủng vi khuẩn tái tổ hợp Escherichia coli BL21(DE3)[pET-22b(+)-gelE] có khả năng sinh tổng hợp enzyme gelatinase tái tổ hợp (rGEL) với hoạt tính phân giải gelatin cao, đồng thời xác lập được hệ thống thông số công nghệ lên men và tinh sạch enzyme bằng sắc ký ái lực Ni-NTA.
3. Ứng dụng thành công enzyme rGEL thu nhận được vào quy trình công nghệ thủy phân gelatin da cá Tra tạo chế phẩm bột axit amin giàu dinh dưỡng; chứng minh thực nghiệm hiệu quả của việc bổ sung chế phẩm này vào thức ăn công nghiệp giúp nâng cao tốc độ tăng trưởng, cải thiện hệ số chuyển đổi thức ăn và duy trì tỷ lệ sống cao cho cá Mú chấm đen giai đoạn giống.

Đề xuất và kiến nghị

• Hoàn thiện quy trình công nghệ nuôi cấy E. coli BL21(DE3)[pET-22b(+)-gelE] trên hệ thống nồi lên men (fermentor) tự động quy mô pilot nhằm nâng cao mật độ tế bào và sản lượng enzyme thu nhận.
• Nghiên cứu mở rộng việc ứng dụng chế phẩm rGEL để thủy phân các nguồn phụ phẩm giàu collagen khác trong ngành chế biến thủy sản (như vảy cá, da các loài cá biển khác) nhằm đa dạng hóa nguồn nguyên liệu axit amin.
• Thử nghiệm bổ sung chế phẩm dịch thủy phân axit amin từ da cá Tra vào khẩu phần thức ăn cho các loài thủy sản có giá trị kinh tế khác ở các giai đoạn phát triển khác nhau.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

Dựa trên phạm vi và nội dung văn bản luận án trình bày, công trình tồn tại một số giới hạn thực nghiệm:

• Toàn bộ các công đoạn tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp, biểu hiện và tinh sạch enzyme gelatinase tái tổ hợp mới được triển khai ở quy mô bình tam giác trong phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm trên hệ thống nồi lên men công nghiệp dung tích lớn.
• Khâu thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL dừng lại ở quy mô khảo nghiệm phòng thí nghiệm; chưa đánh giá chi tiết chi phí năng lượng và tính toán bài toán kinh tế kỹ thuật ở quy mô sản xuất công nghiệp thương phẩm.
• Thử nghiệm bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn thủy sản mới chỉ thực hiện trên một đối tượng duy nhất là cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) trong giai đoạn giống (kích thước ban đầu 7 cm, khối lượng 7,067 g) tại một cơ sở thực nghiệm (Trại Nghi Xuân), chưa đánh giá trên cá thương phẩm nuôi ngoài lồng bè tự nhiên.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy giá rẻ và quy trình lên men fed-batch trên thiết bị lên men bán công nghiệp để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp rGEL.
• Nghiên cứu công nghệ cố định enzyme rGEL trên các chất mang thích hợp để tái sử dụng enzyme nhiều lần trong quá trình thủy phân gelatin da cá, giúp giảm giá thành sản xuất.
• Đánh giá ảnh hưởng dài hạn của chế phẩm axit amin đến hệ vi sinh đường ruột, chỉ số sinh lý máu và khả năng kháng bệnh của cá Mú chấm đen cũng như một số loài cá biển kinh tế khác.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học, Hóa sinh học: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật tạo dòng, biểu hiện gen ngoại lai bằng hệ thống vector pET trong E. coli, phương pháp tinh sạch protein ái lực và khảo sát động học enzyme metalloprotease họ M4.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu trong lĩnh vực chế biến thủy sản và dinh dưỡng thức ăn chăn nuôi: Công trình cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về điều kiện thủy phân gelatin bằng enzyme sinh học thay thế phương pháp hóa học, cùng thành phần axit amin chi tiết của phụ phẩm da cá Tra.
• Doanh nghiệp chế biến thủy sản và sản xuất thức ăn thủy sản: Tài liệu cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng công nghệ giá trị gia tăng, tận dụng hàng ngàn tấn phụ phẩm da cá Tra thải ra mỗi năm thành sản phẩm thức ăn bổ sung giàu axit amin cho ngành nuôi cá biển.

Các phần nội dung đáng tham khảo

• Quy trình thiết kế mồi, nhân dòng gen gelE và xử lý enzyme giới hạn kép HindIII và SalI để gắn vào vector pET-22b(+).
• Các số liệu thực nghiệm về nồng độ chất cảm ứng IPTG (1 mM), nhiệt độ cảm ứng (34°C) giúp duy trì protein ở dạng hòa tan có hoạt tính sinh học.
• Bảng dữ liệu thành phần axit amin của sản phẩm thủy phân gelatin da cá Tra phân tích bằng HPLC.
• Quy trình bố trí thí nghiệm dinh dưỡng và các chỉ tiêu theo dõi tăng trưởng (ADG khối lượng, ADG chiều dài, FCR) trên cá Mú chấm đen giai đoạn giống.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án không sử dụng trực tiếp các chủng vi khuẩn tự nhiên để sản xuất gelatinase mà phải tạo chủng tái tổ hợp?

Theo trình bày của tác giả ở phần Mở đầu và Tổng quan, các chủng vi khuẩn tự nhiên sinh tổng hợp gelatinase phổ biến như Staphylococcus, Pseudomonas, Aeromonas, Enterobacter, Enterococcus đa số là các vi sinh vật gây bệnh, tiềm ẩn độc lực gây hại cho người và vật nuôi, không đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học để sản xuất enzyme ứng dụng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Hơn nữa, hoạt tính gelatinase ở các chủng tự nhiên thường thấp và chịu sự điều hòa phức tạp của hệ thống quorum-sensing operon fsrABCD. Việc tạo chủng tái tổ hợp trong E. coli BL21(DE3) loại trừ triệt để tính độc của chủng nguồn, cho phép biểu hiện enzyme dưới sự điều khiển của promoter T7 mạnh, tạo ra lượng lớn enzyme có hoạt tính cao và an toàn.

2. Gen mã hóa gelatinase phân lập từ chủng vi khuẩn nào và có đặc điểm cấu trúc phân tử ra sao?

Gen gelE được phân lập từ hệ gen của chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis MD4 (phân lập từ cá nước ngọt bị bệnh tại Việt Nam). Gen có khung đọc mở (ORF) mã hóa chuỗi tiền enzyme gồm 509 axit amin. Cấu trúc gồm chuỗi tín hiệu đầu N dài 29 axit amin, đoạn propeptide dài 162 axit amin (từ vị trí 30 đến 191). Phân tử enzyme trưởng thành bắt đầu từ vị trí axit amin 192 (Val-Gly-Ser-Glu-Val). Trong quá trình hoàn thiện, enzyme tiếp tục bị cắt bỏ 14 axit amin ở đầu tận cùng C (Asp495↓Ile-Gln: chuỗi IQVNQPSESVLVNE, khối lượng ~1.556 Da) để tạo thành gelatinase hoạt động có khối lượng phân tử thực tế xấp xỉ 33–34 kDa, chứa mô-típ tâm xúc tác HExxH liên kết ion Zn²⁺.

3. Điều kiện lên men nào là tối ưu để biểu hiện gen gelE tái tổ hợp trong E. coli BL21(DE3)?

Kết quả nghiên cứu ở Chương 3 xác định các điều kiện tối ưu để biểu hiện rGEL trong E. coli BL21(DE3)[pET-22b(+)-gelE] bao gồm: môi trường nuôi cấy duy trì ở pH trung tính (khoảng pH 7,0); nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng ở 34°C (giúp hạn chế tạo thể vùi không tan, tăng lượng protein hòa tan có hoạt tính so với ở 37°C); nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu là 1 mM (nồng độ IPTG cao từ 3–6 mM gây ức chế tế bào và làm giảm hoạt tính riêng của enzyme); nồng độ kháng sinh ampicillin duy trì ở mức 100 µg/mL.

4. Enzyme rGEL có những đặc tính hóa sinh quan trọng nào về nhiệt độ, pH và chất ức chế?

Enzyme gelatinase tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA có các đặc tính:

• Nhiệt độ hoạt động tối ưu trong khoảng 35–40°C, giữ được độ bền nhiệt tốt ở 40°C sau nhiều giờ phản ứng.
• Hoạt động tối ưu ở vùng kiềm yếu (pH 7,5–8,0), độ bền pH duy trì tốt trong khoảng pH 7,0–8,5.
• Hoạt tính phụ thuộc ion Zn²⁺ tại tâm hoạt động và ion Ca²⁺ bảo vệ cấu trúc; bị ức chế mạnh bởi tác nhân chelat kim loại EDTA, các chất khử cầu disulfide như DTT và β-mercaptoethanol.

5. Kết quả thử nghiệm bổ sung chế phẩm axit amin từ da cá Tra vào thức ăn cá Mú chấm đen cho thấy điều gì?

Thử nghiệm trên cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) kích cỡ ban đầu 7 cm và khối lượng 7,067 g tại Trại Nghi Xuân cho thấy: các nghiệm thức thức ăn được bổ sung chế phẩm axit amin thủy phân từ gelatin da cá Tra bằng rGEL giúp cá đạt tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG) về cả khối lượng và chiều dài cao hơn rõ rệt so với đối chứng; hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) giảm; tỷ lệ sống của cá đạt mức cao; đàn cá có hệ số biến động kích thước thấp, cho thấy chế phẩm axit amin cung cấp nguồn dinh dưỡng dễ hấp thu, đáp ứng nhu cầu axit amin thiết yếu của cá biển giai đoạn ương giống.

---

Kết luận

Luận án của tác giả Phạm Mỹ Dung đã hoàn thành trọn vẹn mục tiêu phân lập nguồn gen gelE từ chủng vi khuẩn tự nhiên Enterococcus faecalis MD4 tại Việt Nam và tạo thành công chủng tái tổ hợp Escherichia coli BL21(DE3)[pET-22b(+)-gelE] sinh tổng hợp gelatinase hoạt tính cao. Tác giả đã xác lập được hệ thống thông số công nghệ tối ưu cho quá trình lên men biểu hiện, thu hồi tinh sạch enzyme bằng sắc ký ái lực và xác định đầy đủ các đặc tính động học của rGEL. Đồng thời, công trình đã chứng minh tính khả thi và hiệu quả kinh tế - kỹ thuật của việc ứng dụng rGEL để thủy phân gelatin da cá Tra thành bột axit amin chất lượng cao, giúp cải thiện rõ rệt tốc độ sinh trưởng và hệ số chuyển đổi thức ăn ở cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu trúc và tính chất gelatin Gelatin là hỗn hợp không đồng nhất các protein hòa tan trong nước có trọng lượng phân tử cao (Budavari, 1996). Theo Karim và cộng sự (2009) gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật.

Với trọng lượng khô cơ bản, gelatin bao gồm từ 98 đến 99% protein. Trọng lượng phân tử của gelatin lớn, dao động từ 20. Trong các dung dịch nước, gelatin là hỗn hợp các chuỗi polypeptit khác biệt bao gồm các thành phần α, x (dimers của α-chain) và γ (trimers α-chain) có khối lượng khoảng 90, 180 và 300 x 103 g/mol tương ứng (Rbii và cộng sự, 2011). Giống như collagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi gồm những phân tử có kích thước nhỏ liên kết với nhau bằng liên kết hydro tạo thành mạng lưới.

Trong đó, mỗi phân tử gelatin là các chuỗi axít amin được liên kết bằng liên kết peptit. Trình tự axít amin của gelatin chủ yếu là Gly-Pro-Hyp (Poppe, 1997). Hàm lượng axít amin của gelatin tương đối cao: glycine (Gly) 26-34%; Proline (Pro) 10-18%; và hydroxy proline (Hyp) 7-15% (Veis, 1964, Poppe, 1997). Các axít amin quan trọng khác bao gồm: Alanin (Ala) 8-11%; Arginine (Arg) 8-9%; axít aspartic (Asp) 6-7%; và glutamic(Glu)10-12% (Hudson, 1994, Poppe, 1997).

Gelatin không chứa Tryptophan và chứa ít Isoleucin, Threonin và Methionin (Potter và Hotchkiss, 1998). Các tính chất quan trọng nhất của gelatin có thể được chia thành ba nhóm: i) đặc tính liên quan đến hoạt động của chất gel, ví dụ: sự hình thành gel, tăng cường kết cấu và tăng cường khả năng phụ thuộc nước, ii) Các tính chất hydrat hóa cơ bản như sưng và tan iii) các tính chất liên quan đến hoạt động bề mặt của chúng, bao gồm nhũ tương, tạo thành bọt, tính ổn định, sự bám dính, sự gắn kết, chức năng keo và khả năng tạo màng. Gelatin có nguồn gốc từ da cá Gelatin được sản xuất nhiều nhất từ da lợn (46%), da trâu, bò (29,4%), thịt lợn và xương gia súc (23,1%). Gelatin cá chiếm dưới 1,5% tổng sản lượng gelatin trong năm 2007, tỷ lệ này tăng gấp đôi vào năm 2002, cho thấy xu hướng sản xuất gelatin từ các động vật không phải là động vật có vú ngày càng gia tăng.

Gelatin từ cá loại bỏ nguy cơ lây nhiễm bệnh bò điên và có thể sử dụng cho các cộng đồng không sử dụng các sản phẩm tư gia súc như lợn, bò (Gómez-Guillén và cộng sự, 2011; Ahmad & Benjakul, 2011 ). Gelatin có nguồn gốc từ cá có thể được chiết xuất từ da và xương của cá. Phụ phẩm và chất thải trong quá trình chế biến thủy sản chiếm đến 75% tổng khối lượng nguyên liệu sản xuất gelatin từ cá (Shahidi, 1995). Khoảng 30% chất thải của da và xương có hàm lượng collagen cao có thể được sử dụng để sản xuất gelatin (Gómez-Guillén và cộng sự, 2002).

Việc chiết xuất gelatin từ da cá có thể cung cấp sản phẩm thay thế phục vụ cộng đồng Hồi giáo và nâng cao giá trị ngành sản xuất cá tuyết (Gudmundsson và Hafsteinsson, 1997;Montero và cộng sự, 1999), cá megrim (Montero và Gómez-Guillén., 2000) và cá rô phi (Grossman và Bergman., 1992; Jamilah và Harvinder. Năng suất và chất lượng gelatin bị ảnh hưởng không chỉ bởi các loài hoặc mô cá mà còn vào độ pH, nhiệt độ và thời gian trong quá trình tiền xử lý và chiết xuất (Montero và Gómez-Guillén, 2000). Da cá là sản phẩm phụ chủ yếu của ngành công nghiệp chế biến cá, gây lãng phí, ô nhiễm môi trường và có thể cung cấp một nguồn gelatin có giá trị (Badii và Howell, 2006). Da cá chứa một lượng lớn collagen.

Nagai và Suzuki (2000) công bố rằng hàm lượng collagen trong phụ phẩm da cá của cá Vược Nhật Bản, cá chẻ và cá mập lần lượt là 51,4%, 49,8% và 50,1% (khối lượng khô). Năm 2002, Gómez-Guillén và cộng sự đã công bố rằng 30% chất thải của cá ở dạng xương và da có collagen cao. Từ những năm 1960, gelatin đã được sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng axit làm tác nhân thủy phân (Norland, 1990). Năm 1992, quy trình sản 7 xuất gelatin từ cá và đặc tính gelatin thu được đã được mô tả bởi Grossman và Bergman (1992).

Kể từ đó, gelatin cá được chiết xuất từ da và xương của nhiều cá nước lạnh khác nhau như cá tuyết,cá hồi và các loài cá nước ấm như cá ngừ, cá da trơn, cá rô phi, cá Nile, cá mập và cá biển. Gelatin được sản xuất qua ba giai đoạn: tiền xử lý nguyên liệu thô, chiết xuất gelatin và làm sạch kết hợp làm khô. Tùy thuộc vào phương pháp mà collagen được xử lý trước, hai loại gelatin có thể được sản xuất. Chất gelatin loại A (điểm đẳng điện áp ở pH 6÷9) được sản xuất từ collagen được xử lý bằng axít và gelatin loại B (điểm đẳng điện khoảng pH 5) được sản xuất từ collagen bằng phương pháp xử lý kiềm (Stainsby, 1987).

Xử lý axít là thích hợp nhất cho collagen được tìm thấy trong da lợn hoặc cá, xử lý kiềm phù hợp cho các collagen phức tạp hơn được tìm thấy trong da bò. Gelatin từ da cá đã được chiết xuất bằng một số cách khác nhau. Thông thường, da cá được xử lý trong điều kiện axit yếu trước khi chuyển qua công đoạn tạo gelatin. Gómez-Guillén và Montero (2001) đã công bố quy trình sản xuất gelatin từ da cá bao gồm các công đoạn: tiền xử lý colagen trong dung dịch axit yếu, tiếp đó trích xuất trong nước ở nhiệt độ vừa phải (45 oC) và xử lý nhiệt ở nhiệt độ trên 40oC, toàn bộ quá trình mất khoảng 24 giờ.

Theo Yang và cộng sự (2007) gelatin được tạo thành từ cá da trơn bằng cách tiền xử lý da bằng dung dịch kiềm NaOH, tiếp theo là dung dịch axít acetic, sau đó 30g da được rửa sạch, xử lý với NaOH theo tỷ lệ 1: 6 ( w/v) cho thời gian biến đổi và rửa bằng nước máy lặp lại hai lần trước khi mẫu được xử lý bằng axit acetic (1: 6 w/v). Loại bỏ nước và rửa mẫu bằng nước máy theo tỉ lệ (1: 6 w/v), bước này lặp lại ba lần. Sau các bước xử lý trên, bổ sung nước không chứa ion vào mẫu và bảo quản ở 4°C. Năm 2008, quy trình tách chiết da cá da trơn được hai nhóm nghiên cứu cùng đưa ra.

Theo quy trình đó, da cá da trơn được ngâm trong dung dịch 50- mmol /L axít acetic theo tỉ lệ 1:8 v/w ở 15 oC trong 18 giờ. Da được tiếp tục xử lý rửa bằng nước cất cho đến khi độ pH đạt 3,5÷4,0. Quá trình tách chiết 8 có sự tham gia của pepsin. Sự tách chiết gelatin được thực hiện trong nước cất ở 45oC trong 7 giờ (Nalinanon và cộng sự, 2008; Liu và cộng sự, 2008).

Theo Sanaei Ardekani và cộng sự (2013) đã công bố điều kiện tối ưu cho chiết xuất gelatin từ da cá da trơn thu được bằng cách sử dụng 0,13 mol/L NaOH và 0,09 mol/L axit axetic xử lý trong thời gian 1 giờ và tiếp theo là chiết xuất nước nóng ở 64,92°C trong 3 giờ. Và nhóm nghiên cứu này cũng công bố rằng gelatin da cá da trơn khi được thủy phân với 6 mol/L HCl ở 110ºC trong 16 giờ. Sau đó, dịch thủy phân được hòa tan trong nước khử ion và được lọc. Thành phần axit amin đã được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC).

Kết quả thành phần axit amin của gelatin da cá da trơn (Clarias gariepinus) được trình bày ở bảng 1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias gariepinus) (Sanaei Ardekani và cộng sự, 2013) Axit amin Số dư lượng/1000 Alanine 86 Arginine 78 Aspartic acid 50 Cystine 0 Glutamic acid 85 Glycine 250 Histidine 11 Hydroxyproline 58 Isoleucine 13 Leucine 22 Lysine 33 Methionine 92 Phenylalanine 16 9 Proline 115 Serine 38 Threonine 25 Tryrosine 6 Valine 22 Total 1000 Hydroxyproline + Proline 173 (Imino axit Thành phần axit amin trong gelatin của da cá da trơn (Bảng 1.1) cho thấy chủ yếu là glycine, chiếm 250 dư lượng /1000 dư lượng, sau đó là proline (115 dư lượng/1000), methionine (92 dư lượng/100), alanine (86 dư lượng/1000). Và axit imino (hydroxyprolinevà proline) của gelatin da cá da trơn chiếm 173 dư lượng trên 1000 dư lượng. Theo Kim và cộng sự (2000), khi thủy phân protein cá với các enzym thích hợp như alcalase, pronase, collagenase, pepsin, papain, protamex, bromelain, chymotrypsin và trypsin thu được các peptit hoạt tính sinh học và các axít amin.

Ưu điểm chính của enzym thủy phân protein là nó cho phép định lượng aspargine và glutamine và các thành phần có số lượng ít, thường bị phá hủy khi thủy phân protein bằng axít và kiềm. Theo Wachirattanapongmettee và cộng sự (2009) protein cá da trơn sẽ bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các axit amin khi được trộn với với nước cất theo tỉ lệ 1: 1,5 (w / v) và bổ sung enzym protex 0,5; 1,5 hoặc 3% v/w trong thời gian 60, 120 và 180 phút. Năm 2011, Alemán và cộng sự đã thử nghiệm thủy phân gelatin từ cá ngừ, cá bơn và mực để sản xuất chất chống oxy hóa. Gelatin 2,5% được hòa tan trong dung dịch đệm phosphate (0,01 M; pH 8) và bổ sung alcalase vào với tỷ lệ enzym/cơ chất gelatin là 1:20 và thủy phân ở 50 oC trong 3 giờ.

Gelatin từ mực và cá ngừ được thủy phân bằng enzym trypsin ở 37oC và trong dung dịch nước pH 7,5 và pepsin ở 37 oC và trong dung dịch 10 nước pH 4. Sau khi thủy phân các enzym bị bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở 90oC trong 10 phút. Quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase cho hiệu suất thủy phân cao nhất khi nồng độ cơ chất là 200 g/L, tỷ lệ E/S là 39,45 U/g protein, nhiệt độ thuỷ phân là 50oC, tại pH 7,0 và thuỷ phân trong thời gian là 3 giờ. Mức độ thuỷ phân tại điều kiện trên đạt 11,02%.

Khi thuỷ phân collagen bằng neutrase kết hợp với sóng siêu âm, với thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, cường độ sóng siêu âm 150W/ 20ml mẫu, cho hiệu suất thủy phân là 14,92%. Sản phẩm thuỷ phân bằng enzym kết hợp sóng siêu âm có phân tử lượng thấp hơn so với khi thuỷ phân bằng enzym. Hiệu suất thủy phân neutrase thu được có phân đoạn 19 ÷ 31 kDa, còn khi kết hợp neutrase và sóng siêu âm thì thu được phân đoạn 8,5 ÷12 kDa và 12 – 18kDa. Theo nghiên cứu của Karim và Bhat (2009), Go´mez-Guille´n và cộng sự (2002); Zhou và cộng sự (2006); Sarabia và cộng sự (2000); Eastoe và Leach (1977) đã công bố thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và bì lợn cho kết quả ở bảng 1.2 cho thấy các loại axít amin chính và hàm lượng của chúng ở da cá tương đương với các thành phần trong gelatin từ da lợn.