Luận văn thạc sĩ về ứng dụng kỹ thuật cleas trong cố định enzyme lipase

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật phân tích công nghệ sinh học khảo sát và ứng dụng kỹ thuật cleas cố định enzyme lipase, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi

• Tác giả: Nguyễn Thị Như Nga
• Người hướng dẫn: Tiến Sĩ Huỳnh Ngọc Oanh
• Trường học: Đại Học Quốc Gia Tp. Hcm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Kỹ Thuật Cleas Trong Cố Định Enzyme Lipase
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN
• ABSTRACT
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• Danh mục hình
• Danh mục bảng
• Danh mục chữ viết tắt
• Mở đầu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nguồn thu nhận
• 1.2. Cấu trúc và khối lượng phân tử
• 1.3. Khả năng xúc tác và tính đặc hiệu của lipase
• 1.4. Cơ chế động học xúc tác của lipase
• 1.5. Các điều kiện thu nhận lipase từ vi sinh vật
• 1.6. Các phương pháp xác định hoạt tính lipase
• 1.7. Ứng dụng của lipase
• 1.8. Một số công trình nghiên cứu về lipase trên thế giới và Việt Nam
• 1.9. Kỹ thuật CLEAs
• 1.10. Tính chất CLEAs
• 1.11. Cấu trúc CLEAs
• 1.12. Độ ổn định CLEAs enzyme
• 1.13. Thiết bị sản xuất
• 1.14. Ứng dụng của kỹ thuật CLEAs
• 1.15. Phức hệ CLEAs enzyme
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Phương pháp
• 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase
• 2.2.2. Phương pháp cố định
• 2.2.3. Bố trí thí nghiệm
• 2.3. Khảo sát tác nhân tủa trong kỹ thuật CLEAs
• 2.4. Khảo sát tỉ lệ tác nhân tủa trong kỹ thuật CLEAs
• 2.5. Khảo sát nồng độ glutaraldehyde
• 2.6. Khảo sát thời gian cố định
• 2.7. Khảo sát khả năng hoạt động của CLEAs lipase
• 2.8. Khảo sát khả năng tái sử dụng của CLEAs lipase
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát tác nhân tủa trong kỹ thuật CLEAs
• 3.2. Khảo sát tỉ lệ tác nhân tủa trong kỹ thuật CLEAs
• 3.3. Khảo sát nồng độ glutaraldehyde
• 3.4. Khảo sát thời gian cố định
• 3.5. Khảo sát khả năng hoạt động của CLEAs lipase
• 3.6. Khảo sát khả năng tái sử dụng của CLEAs lipase
• 3.7. Kết quả chụp ảnh SEM của mẫu CLEAs lipase
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Giới thiệu về kỹ thuật CLEAs

Kỹ thuật CLEAs (Cross-Linked Enzyme Aggregates) là một phương pháp tiên tiến trong việc cố định enzyme, đặc biệt là enzyme lipase. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý tạo liên kết chéo giữa enzyme và các tác nhân liên kết, giúp tăng cường độ ổn định và khả năng tái sử dụng của enzyme. CLEAs không chỉ đơn giản trong quy trình thực hiện mà còn mang lại hiệu suất cao trong việc cố định enzyme. Theo nghiên cứu, việc sử dụng CLEAs cho phép enzyme duy trì hoạt tính cao trong nhiều lần tái sử dụng, điều này rất quan trọng trong các ứng dụng công nghiệp. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công trong nhiều lĩnh vực, từ sản xuất biodiesel đến chế biến thực phẩm, nhờ vào khả năng xúc tác hiệu quả của enzyme lipase.

1.1. Tính chất và ưu điểm của CLEAs

Một trong những ưu điểm nổi bật của CLEAs là khả năng tách biệt enzyme khỏi sản phẩm một cách dễ dàng. Điều này giúp giảm thiểu chi phí và tăng hiệu quả trong quy trình sản xuất. Hơn nữa, CLEAs có thể hoạt động hiệu quả trong các điều kiện khắc nghiệt, như nhiệt độ cao và pH thay đổi, mà không làm giảm hoạt tính của enzyme. Nghiên cứu cho thấy, enzyme lipase cố định bằng kỹ thuật CLEAs có thể duy trì hoạt tính lên đến 80% sau nhiều lần tái sử dụng. Điều này chứng tỏ rằng CLEAs không chỉ là một phương pháp cố định enzyme hiệu quả mà còn là một giải pháp bền vững cho các ứng dụng công nghiệp.

II. Cố định enzyme lipase

Quá trình cố định enzyme lipase là một bước quan trọng trong việc tối ưu hóa hoạt tính và độ ổn định của enzyme. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các yếu tố như nồng độ glutaraldehyde, thời gian cố định và loại tác nhân tủa có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất cố định enzyme. Cụ thể, việc sử dụng glutaraldehyde với nồng độ thích hợp giúp tạo ra liên kết chéo hiệu quả, từ đó tăng cường độ ổn định của enzyme. Kết quả cho thấy, hiệu suất cố định enzyme lipase từ vi sinh vật đạt 88,75% và từ tụy động vật đạt 89,52%. Điều này cho thấy rằng việc lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình cố định là rất quan trọng để đạt được hoạt tính cao nhất cho enzyme lipase.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme lipase bao gồm nồng độ của tác nhân tủa, thời gian và nhiệt độ. Nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng aceton làm tác nhân tủa, tỉ lệ enzyme/tác nhân tủa cần được điều chỉnh để đạt hiệu suất tối ưu. Thời gian cố định cũng đóng vai trò quan trọng; nếu thời gian quá ngắn, enzyme có thể không được cố định hoàn toàn, trong khi thời gian quá dài có thể dẫn đến sự phân hủy enzyme. Hơn nữa, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme sau khi cố định. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp nâng cao hiệu suất và độ ổn định của enzyme lipase trong các ứng dụng thực tiễn.

III. Ứng dụng của enzyme lipase trong công nghiệp

Enzyme lipase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt trong lĩnh vực sản xuất biodiesel và chế biến thực phẩm. Việc cố định enzyme bằng kỹ thuật CLEAs không chỉ giúp tăng cường hiệu suất mà còn giảm chi phí sản xuất. Trong sản xuất biodiesel, enzyme lipase có khả năng xúc tác phản ứng transesterification, giúp chuyển đổi triglycerides thành biodiesel một cách hiệu quả. Hơn nữa, enzyme lipase cũng được sử dụng trong chế biến thực phẩm để cải thiện hương vị và chất lượng sản phẩm. Nghiên cứu cho thấy, enzyme lipase cố định có thể duy trì hoạt tính cao trong nhiều lần tái sử dụng, điều này rất quan trọng trong các quy trình sản xuất quy mô lớn.

3.1. Lợi ích kinh tế từ việc sử dụng enzyme lipase

Việc sử dụng enzyme lipase trong công nghiệp mang lại nhiều lợi ích kinh tế. Đầu tiên, enzyme giúp giảm thiểu thời gian và chi phí sản xuất nhờ vào khả năng xúc tác nhanh chóng và hiệu quả. Thứ hai, việc cố định enzyme bằng kỹ thuật CLEAs giúp tăng cường độ ổn định và khả năng tái sử dụng, từ đó giảm thiểu lượng enzyme cần thiết cho mỗi quy trình. Cuối cùng, việc sử dụng enzyme lipase trong sản xuất biodiesel không chỉ giúp tiết kiệm chi phí mà còn góp phần bảo vệ môi trường nhờ vào việc sử dụng nguyên liệu tái tạo. Tất cả những yếu tố này cho thấy rằng enzyme lipase là một giải pháp bền vững cho ngành công nghiệp hiện đại.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Enzyme lipase là một trong những enzyme thủy phân quan trọng, có khả năng xúc tác các phản ứng thủy phân, ester hóa, chuyển hóa ester và amin hóa, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như sản xuất biodiesel, thực phẩm, dược phẩm và hóa chất. Theo ước tính, lipase chiếm khoảng 32% tổng lượng enzyme được sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, với nhu cầu hàng năm lên đến hàng nghìn tấn. Tuy nhiên, enzyme lipase tự do thường có tính ổn định thấp và chi phí cao, gây hạn chế trong ứng dụng thực tế. Do đó, việc cố định enzyme lipase nhằm tăng độ bền, khả năng tái sử dụng và giảm chi phí sản xuất là một vấn đề cấp thiết.

Kỹ thuật Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs) được phát triển như một phương pháp cố định enzyme đơn giản, hiệu quả và tiết kiệm chi phí. CLEAs giúp tăng đáng kể độ ổn định của enzyme trước tác động của nhiệt độ và dung môi hữu cơ, đồng thời dễ dàng tách thu hồi và tái sử dụng nhiều lần. Luận văn tập trung khảo sát và ứng dụng kỹ thuật CLEAs để cố định enzyme lipase thu nhận từ vi sinh vật và tụy tạng động vật, nhằm tối ưu hóa điều kiện cố định và so sánh hoạt tính cũng như độ bền của enzyme sau cố định.

Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh trong năm 2013, với mục tiêu đạt hiệu suất cố định enzyme lipase trên 88% và giữ lại hoạt tính enzyme cao sau nhiều lần tái sử dụng. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ enzyme cố định, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất công nghiệp sử dụng enzyme lipase.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết enzyme lipase: Lipase (EC 3.3) là enzyme thủy phân các ester của triacylglycerol, có cấu trúc α/β-hydrolase với tâm hoạt động gồm ba amino acid serine, histidine và aspartate/glutamate. Lipase có tính đặc hiệu cơ chất, vị trí và acid béo, ảnh hưởng đến hiệu quả xúc tác trong các phản ứng sinh học và công nghiệp.

• Mô hình cố định enzyme bằng kỹ thuật CLEAs: CLEAs là kỹ thuật cố định enzyme bằng cách tủa enzyme từ dung dịch bằng dung môi hữu cơ hoặc muối vô cơ, sau đó tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme bằng glutaraldehyde, tạo thành khối enzyme không hòa tan có kích thước từ 5-50 µm. CLEAs giúp tăng độ ổn định nhiệt, dung môi và khả năng tái sử dụng enzyme.

• Khái niệm chính:

  • Hiệu suất cố định enzyme: Tỷ lệ enzyme được giữ lại sau quá trình cố định so với enzyme ban đầu.
  • Hoạt tính enzyme CLEAs: Đơn vị hoạt tính enzyme trên ml dung dịch sau cố định.
  • Tái sử dụng enzyme: Khả năng giữ lại hoạt tính enzyme sau nhiều lần sử dụng liên tiếp.
  • Tác nhân tủa: Dung môi hoặc muối dùng để tủa enzyme trong quá trình tạo CLEAs (acetone cho vi sinh vật, (NH4)2SO4 cho tụy tạng động vật).
  • Glutaraldehyde: Tác nhân tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Enzyme lipase thu nhận từ hai nguồn chính là vi sinh vật (giống Bacillus subtilis) và tụy tạng heo tại chợ Gò Xoài, TP. Hồ Chí Minh. Hóa chất sử dụng gồm glutaraldehyde 25%, acetone, muối ammonium sulfate, dung dịch đệm Tris HCl pH 7.

• Phương pháp phân tích:

  • Xác định hoạt tính enzyme lipase bằng phương pháp đo độ đục (OD 500 nm) dựa trên phản ứng thủy phân Tween 20 tạo acid béo kết tủa với Ca2+.
  • Cố định enzyme bằng kỹ thuật CLEAs: tủa enzyme bằng acetone (vi sinh vật) hoặc (NH4)2SO4 (tụy tạng), sau đó tạo liên kết chéo với glutaraldehyde 25% trong điều kiện 40°C, lắc 160 vòng/phút trong 120 phút.
  • Đánh giá hiệu suất cố định, hoạt tính enzyme sau cố định và khả năng tái sử dụng qua nhiều lần sử dụng liên tiếp.
  • Quan sát cấu trúc CLEAs bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng 6 tháng, từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2013, bao gồm các giai đoạn thu nhận enzyme, cố định enzyme, đánh giá hoạt tính và phân tích kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của tác nhân tủa: Acetone là tác nhân tủa hiệu quả nhất cho enzyme lipase từ vi sinh vật, trong khi dung dịch muối (NH4)2SO4 bão hòa phù hợp với enzyme từ tụy tạng động vật. Hiệu suất cố định đạt 88,75% với vi sinh vật và 89,52% với tụy tạng.

2. Tỷ lệ tác nhân tủa và glutaraldehyde: Tỷ lệ thể tích enzyme/tác nhân tủa và enzyme/glutaraldehyde được tối ưu lần lượt là 1:1/2 và 1:1/2 cho vi sinh vật, 1:2 và 1:1 cho tụy tạng. Điều kiện này giúp giữ lại hoạt tính enzyme cao nhất.

3. Hoạt tính enzyme sau cố định và tái sử dụng: CLEAs lipase từ vi sinh vật có hoạt tính ban đầu 101,56 UI/ml, sau 6 lần tái sử dụng còn giữ lại 35,89 UI/ml (tương đương 35,3%). CLEAs lipase từ tụy tạng có hoạt tính ban đầu 155,56 UI/ml, sau 7 lần sử dụng còn 31,89 UI/ml (20,5%). Kết quả cho thấy enzyme từ tụy tạng có hoạt tính ban đầu cao hơn nhưng giảm nhanh hơn khi tái sử dụng.

4. Cấu trúc CLEAs: Quan sát SEM cho thấy các khối CLEAs có kích thước từ 0,1 đến 1 µm, cấu trúc siêu lỗ giúp hạn chế hiện tượng khuếch tán giới hạn, đảm bảo hoạt tính enzyme trong phản ứng.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất cố định enzyme lipase đạt gần 89% cho cả hai nguồn, cho thấy kỹ thuật CLEAs là phương pháp cố định hiệu quả, phù hợp với enzyme lipase từ vi sinh vật và tụy tạng động vật. Việc lựa chọn tác nhân tủa phù hợp (acetone cho vi sinh vật, (NH4)2SO4 cho tụy tạng) là yếu tố quyết định đến hiệu quả cố định và hoạt tính giữ lại.

Hoạt tính enzyme sau cố định và khả năng tái sử dụng cho thấy CLEAs lipase từ vi sinh vật có độ bền cao hơn so với tụy tạng, phù hợp cho các ứng dụng đòi hỏi tái sử dụng nhiều lần. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đây về độ ổn định của enzyme cố định bằng CLEAs, đồng thời khẳng định ưu điểm vượt trội của kỹ thuật này so với cố định trên chất mang rắn truyền thống.

Cấu trúc siêu lỗ của CLEAs giúp giảm thiểu hiện tượng khuếch tán giới hạn, tăng tốc độ phản ứng và giữ hoạt tính enzyme cao hơn. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hiệu suất cố định và hoạt tính giữ lại sau các lần tái sử dụng, cũng như hình ảnh SEM minh họa cấu trúc CLEAs.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình cố định enzyme: Áp dụng tỷ lệ tác nhân tủa và glutaraldehyde đã khảo sát (1:1/2 và 1:1/2 cho vi sinh vật; 1:2 và 1:1 cho tụy tạng) để đạt hiệu suất cố định trên 88% và giữ hoạt tính enzyme cao. Thời gian cố định 120 phút, nhiệt độ 40°C, lắc 160 vòng/phút là điều kiện tối ưu.

2. Phát triển quy trình tái sử dụng enzyme CLEAs: Khuyến khích sử dụng CLEAs lipase từ vi sinh vật cho các ứng dụng cần tái sử dụng nhiều lần do độ bền cao hơn, giúp giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu quả kinh tế.

3. Ứng dụng trong sản xuất công nghiệp: Áp dụng CLEAs lipase trong các quy trình tổng hợp hữu cơ, sản xuất biodiesel, chế biến thực phẩm và dược phẩm, tận dụng ưu điểm dễ tách thu hồi và khả năng hoạt động trong môi trường khắc nghiệt.

4. Nghiên cứu mở rộng: Khuyến nghị nghiên cứu thêm về cố định enzyme lipase từ các nguồn vi sinh vật khác, cũng như kết hợp CLEAs với các chất bảo vệ enzyme để tăng cường độ ổn định và hoạt tính trong các điều kiện phản ứng đa dạng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ enzyme: Luận văn cung cấp cơ sở lý thuyết và thực nghiệm về kỹ thuật CLEAs, giúp phát triển các phương pháp cố định enzyme hiệu quả, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và hóa chất sinh học: Thông tin về quy trình cố định enzyme lipase và khả năng tái sử dụng giúp doanh nghiệp tối ưu hóa chi phí sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm.

3. Chuyên gia trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm: Kết quả nghiên cứu hỗ trợ ứng dụng enzyme lipase cố định trong các quy trình sản xuất, cải thiện hiệu suất và độ ổn định sản phẩm.

4. Sinh viên và học viên cao học chuyên ngành công nghệ sinh học: Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá về kỹ thuật cố định enzyme, phương pháp phân tích hoạt tính enzyme và ứng dụng trong công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. CLEAs là gì và ưu điểm so với cố định enzyme truyền thống?
   CLEAs (Cross-Linked Enzyme Aggregates) là kỹ thuật cố định enzyme bằng cách tủa enzyme và tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme. Ưu điểm gồm quy trình đơn giản, chi phí thấp, không cần enzyme tinh khiết cao, tăng độ ổn định và dễ thu hồi tái sử dụng.

2. Tại sao chọn acetone cho vi sinh vật và (NH4)2SO4 cho tụy tạng làm tác nhân tủa?
   Acetone hiệu quả trong việc tủa enzyme lipase từ vi sinh vật do tính hòa tan và tương tác phù hợp, trong khi (NH4)2SO4 bão hòa phù hợp với enzyme từ tụy tạng động vật, giúp giữ cấu trúc enzyme và hoạt tính cao hơn.

3. Hoạt tính enzyme CLEAs giảm sau nhiều lần tái sử dụng có phải là vấn đề lớn?
   Hoạt tính giảm là hiện tượng phổ biến do tác động cơ học và mất enzyme trong quá trình sử dụng. Tuy nhiên, CLEAs lipase từ vi sinh vật vẫn giữ trên 35% hoạt tính sau 6 lần tái sử dụng, đủ đáp ứng yêu cầu công nghiệp.

4. Kích thước CLEAs ảnh hưởng thế nào đến hiệu quả cố định?
   Kích thước CLEAs từ 5-50 µm giúp cân bằng giữa hoạt tính enzyme và khả năng thu hồi. Kích thước nhỏ giúp tăng tốc độ phản ứng, kích thước lớn giúp dễ dàng tách thu hồi và giảm áp suất trong thiết bị phản ứng.

5. CLEAs có thể ứng dụng trong các ngành công nghiệp nào?
   CLEAs enzyme lipase được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất biodiesel, tổng hợp hữu cơ, công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, sản xuất chất tẩy rửa và biosensor nhờ tính ổn định cao và khả năng tái sử dụng.

Kết luận

• Kỹ thuật CLEAs là phương pháp cố định enzyme lipase hiệu quả, đạt hiệu suất cố định trên 88% với cả nguồn vi sinh vật và tụy tạng động vật.
• Hoạt tính enzyme CLEAs từ vi sinh vật đạt 101,56 UI/ml, giữ lại 35,89 UI/ml sau 6 lần tái sử dụng; từ tụy tạng đạt 155,56 UI/ml, giữ lại 31,89 UI/ml sau 7 lần sử dụng.
• Tác nhân tủa acetone và (NH4)2SO4 cùng tỷ lệ glutaraldehyde tối ưu giúp duy trì hoạt tính enzyme cao sau cố định.
• CLEAs enzyme có cấu trúc siêu lỗ, giảm thiểu hiện tượng khuếch tán giới hạn, phù hợp cho ứng dụng công nghiệp.
• Đề xuất áp dụng quy trình cố định và tái sử dụng enzyme CLEAs trong sản xuất công nghiệp, đồng thời nghiên cứu mở rộng để nâng cao hiệu quả và ứng dụng đa dạng.

Tiếp theo, nghiên cứu có thể tập trung vào phát triển CLEAs enzyme từ các nguồn khác và kết hợp với các chất bảo vệ enzyme để tăng cường độ bền và hoạt tính trong các điều kiện phản ứng phức tạp. Đề nghị các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm ứng dụng kỹ thuật CLEAs để nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme lipase.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.ðịnh nghĩa Lipase ( trialylglycerol acylhydrolase – EC 3.3) thuộc nhóm phụ enzyme thủy phân có serine ở tâm hoạt ñộng của tổng họ enzyme thủy phân α/β, xúc tác sự thủy giải các ester của triacylglycerol và không ñòi hỏi cần phải có cofactor. Liên kết lipase hiện diện rộng rãi và tham gia vào sự chuyển hóa sinh học của lipid trong tự nhiên. Lipase giữ một vị trí quan trọng trên thị trường enzyme thương mại do khả năng xúc tác các phản ứng ở bề mặt phân cách giữa pha dầu – nước trong môi trường nước. Ngoài ra lipase còn tham gia xúc tác các phản ứng không cần nước.

Nguồn thu nhận Lipase có thể thu nhận ñược từ nhiều nguồn khác nhau như ñộng vật, thực vật và vi sinh vật, ñặc biệt từ vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, lipase từ thực vật không ñược sử dụng rộng rãi trong thương mại như lipase ñộng vật và vi sinh vật. Nguồn lipase thu từ ñộng vật quan trọng nhất là từ tụy tạng bò, heo, cừu. Lipase từ tụy tạng là một trong những lipase ñược biết sớm nhất và khá thông dụng.

Những enzyme này ñược tiết ra ở tá tràng xúc tác cho sự thủy phân triglyceride. Bản chất của loại lipase này là glycoprotein, phân tử lượng 50 kDa, không có hoặc có ít hoạt tính ñối với phospholipid và ñược hoạt hóa ở bề mặt phân cách pha dầu – nước, nhưng lại bị ức chế bởi muối mật. Lipase thu ñược từ thực vật ít ñược quan tâm. Nguồn lipase thu ñược chủ yếu từ những hạt có dầu.

Lipase thu từ vi sinh vật có ý ngĩa rất lớn và ñược ứng dụng rộng rãi trong thương mại trên qUI/ml mô công nghiệp. Lipase thu nhận từ vi sinh vật gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc là những lipase ngoại bào.1 Nguồn thu nhận enzyme lipase Nguồn ðối tượng thu nhận ðộng vật Tụy tạng bò, cừu, lợn Thực vật Hạt cây thầu dầu Nấm mốc Penicillium roqueforium Rhizopus oryzae Aspergillus niger Geotrichium candium Rhizopus delemmar Nấm men Candida rugosa Candida cylindracea Candida parapsilosis Torulopsis spp. Vi khuẩn Chromobacterium viscosu Pseudomonas flourescens Pseudomonas fragi Bacillus thermocatenulatus Bacillus spp. Trichoderma viride, Trichoderma spp.

Cấu trúc và khối lượng phân tử Cấu trúc không gian (3D) của lipase từ nấm Rhizomucor miehei và lipase từ tuến tụy của người ñã ñược xác ñịnh vào năm 1990, từ ñó ñến nay có hơn 11 cấu trúc lipase nữa ñược xác ñịnh. Ngoại trừ lipase từ tuyến tụy của người, tất cả các lipase còn lại ñều từ vi sinh vật. Các lipase này có khối lượng phân tử (19 – 60) kDa, ñều biểu hiện ñặc tính xoắn cuộn như xoắn α/β-hydrolase. Lõi trong của lipase ñược cấu thành từ phiến β trung tâm bao gồm 8 chuỗi β khác nhau (β1 – β8) nối với 6 xoắn α (A – F).1 Cấu trúc enzyme lipase a) Mô hình cấu trúc enzyme lipase b) Cấu trúc 3D của enzyme lipase từ P.aeruginosa Hiện nay có nhiều công trình nghiên cứu ñược thực hiện nhằm tìm hiểu cấu trúc của lipase.

Trong ñó cấu trúc ba chiều của lipase ñược coi là cơ sở ñể hiểu ñược phản ứng ñộng học, ñặc hiệu cơ chất, dự ñoán những ñặc ñiểm sinh hóa và hoạt ñộng của lipase tại bề mặt phân cách của pha dầu – nước. Lipase từ Rhizomucor miehei là enzyme thủy phân ñầu tiên có cấu trúc bậc banner ñược xác ñịnh bởi phương pháp tia X. Khi nghiên cứu về cấu trúc lipase dùng phương pháp tia X ñã phát hiện cấu 3 trúc α/β. Liên kết β song song làm cầu nối với cấu trúc xoắn ốc α ñể hình thành cấu trúc phức tạp.

Các cầu nối disulphur ñược tìm thấy trong phân tử lipase có lẽ nhằm làm ổn ñịnh cấu trúc gấp nếp của enzyme. Trong cấu trúc này protein hình cầu chứa một nhân kị nước tạo nên một chuỗi không cực có ý nghĩa quan trọng cho sự ổn ñịnh phân tử. Bên cạnh ñó còn có vài nhóm có cực và những phân tử ñược liên kết. Sự có mặt của những phân tử nước ñã làm tăng lực liên kết Van der waals và lực phân tán trong trung tâm hoạt ñộng.

Vì vậy sự ổn ñịnh về cấu trúc không gian của phân tử enzyme ñược tăng lên. Tâm hoạt ñộng của lipase gồm 3 acid amin: serine, histidine và aspartate/glutamate. Phía trên trung tâm hoạt ñộng có vùng kị nước ñược hình thành sau khi lipase ñược hoạt hóa. Sự hiện diện của serine ở tâm hoạt ñộng ñược xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong chuỗi pentapeptide Gly (Ala) – Xaa – Ser – Xaa – Gly.

Các lipase ñều có những tính chất chung. Song chúng cũng khác nhau về một số tính chất như: tính ñặc hiệu cơ chất, mức ñộ phân giải cơ chất, khối lượng phân tử, thành phần acid amin và ñiều kiện hoạt ñộng. Sự khác nhau này không những giữa các loài mà ngay cả giữa các chủng trong cùng một loài. Khối lượng phân tử của lipase dao ñộng khá nhiều giữa các chủng vi sinh vật : Candida rugosa có 2 ñồng phân là LipA (58kDa) và LipB (62kDa), Geotrichum 1.

Khả năng xúc tác và tính ñặc hiệu của lipase 1.Khả năng xúc tác của enzyme lipase Lipase (triacylglycerol acylhyrolase – EC 3.3) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết ester trên chất nền lipid không tan trong nước. Lipase thực hiện chức năng cần thiết trong việc tiêu hóa, vân chuyển và xử lý các chất béo như triglyceride, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống. Enzyme này cắt ñứt liên kết ester giữa glycerol và acid béo do ñó phân giải các lipid ñã nhũ tương hóa thành acid béo và glycerol. Lipase có khả năng xúc tác 4 cho nhiều phản ứng khác nhau gồm: phản ứng thủy phân, ester hóa, chuyển hóa ester, acid hóa, rượu hóa và amin hóa.

Trong số các phản ứng trên, ñược quan tâm nhiều nhất là phản ứng thủy phân, chuyển hóa ester, acid hóa và rượu hóa. ðặc biệt lipase dùng trong việc xúc tác tạo ester mới, những ester ñược tạo bởi chuỗi acid béo ngắn ñược dùng làm chất tăng hương vị trong công nghiệp thực phẩm và những ester ñược tạo bởi chuỗi acid béo dài với gốc methyl hay ethyl ñược dùng làm nhiên liệu sinh học. Tính ñặc hiệu của lipase Sự ñặc hiệu của lipase ñược kiểm soát bởi những ñặc tính phân tử enzyme. Cấu trúc của cơ chất và những nhân tố ảnh hưởng ñến việc gắn enzyme với cơ chất.

Các loại ñặc hiệu của lipase gồm: cơ chất, vị trí, acid béo. Mỗi loại lipase thu nhận từ vi sinh vật sẽ có các vi trí cắt ñặc hiệu. Một số lipase có ái lực cao với các chuỗi acid ngắn ( acid acetic, acid butyric, acid caproic…). Một số lại có ái lực với các acid béo chưa bão hòa (acid oleic, acid linoleic, acid linolenic…).

Ngoài ra, một số khác không ñặc hiệu về cơ chất và có vị trí phân cắt ngẫu nhiên. Vì vậy, dựa vào tính ñặc hiêu, người ta chia lipase thành 3 nhóm: Nhóm thứ nhất gồm những enzyme không ñặc hiệu vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceric như lipase từ Candida cylindracea và Staphylococcus aureus. Nhóm thứ hai ñược xem là nhóm quan trọng nhất bao gồm những enzyme xúc tác ñặc hiệu vị trí 1 và 3 trên phân tử triglyceride. Trong ñó thông dụng là lipase từ A.oryzae, Rhizopus delemar, Mucor miehei và Pseudomonas fragi.

Nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác ñặc hiệu một số liên kết ester với acid béo nhất ñịnh như lipase từ Geotrichum candium. Enzyme này chỉ thủy phân liên kết ester với acid béo mạch dài hoặc acid béo không no dạng cis. 5 ðặc hiệu cơ chất acid béo: Sự ñặc hiệu acid béo của lipase chịu ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon của acid béo, số lượng cũng như vị trí của nối ñôi trong phân tử. Hơn nữa, sự ñặc hiệu này có thể thay ñổi không chỉ dưới những ñiều kiện khác nhau mà còn trong những phản ứng khác nhau.

Ví dụ, một lipase thể hiện sự ñặc hiệu acid béo mạnh trong sự ester hóa với lauryl alcohol và L-mentol so với sự thủy phân của triacylglycerol.  Ảnh hưởng của chiều dài mạch carbon: nhiều lipase có khả năng nhận biết acid béo có số carbon từ C8-C24 và phản ứng diễn ra nhanh chóng. Tuy nhiên, một số nhóm enzyme như Candida rugosa và G. candidum lại tỏ ra phản ứng chậm và yếu trên những acid béo có chiều dài mạch carbon C20 hoặc dài hơn.

 Ảnh hưởng của số nối ñôi: hoạt tính lipase của C. candidum trên acid béo C18 như trong acid stearic (18:0) < acid oleic (18:1 n-9) < acid linoleic (18:2 n-3) < acid α-linoleic (18:3 n-3). Nhìn chung, những lipase này hoạt ñộng yếu trên những acid béo không bão hòa ña như acid arachidonic (AA; 20:4 n-6), acid eicosapentaenoic (EPA; 20:5 n-3), vaf acid docosahexaenoic (DHA; 22:6 n-3).  Ảnh hưởng của vị trí nối ñôi: nhiều lipase hoạt ñộng yếu trên những acid béo có nối ñôi nằm gần nhóm carboxyl.

candidum, Rhizopus oryzae, R. miehei hoạt ñộng mạnh trên nối ñôi tại vị trí ∆9 của acid α-linolenic nhưng lại hoạt ñộng yếu trên acid béo có vị trí ∆6 của acid γ- linolenic. Hơn nữa, nhiều lipase hoạt ñộng yếu trên DHA với nối ñôi tại vị trí ∆4 hơn là ∆5. ðặc hiệu vị trí xúc tác của enzyme Sự ñặc hiệu vị trí của lipase rất quan trọng trong việc xử lý dầu.

Lipase ñược chia thành 2 nhóm: vị trí ñặc hiệu vị trí 1,3 và nhóm không ñặc hiệu. Lipase từ tuyến tụy của ñộng vật có vú và từ nấm như A.arrhizus ñặc hiệu vị trí 1,3. cadidum và 6 panicillium expansum ñặc hiệu vị trí và thủy phân liên kết ester tại vị trí 1,3 và 2 của triacylglyceride với cùng tốc ñộ. Lipase từ vi khuẩn như Pseudomonas, Burkholderia và Alcaligenes không ñặc hiệu vị trí và ưu tiên thủy phân liên kết ester tại vị trí 1,3 hơn là vị trí 2.

Nhìn chung, sự ñặc hiệu của lipase không chịu ảnh hưởng bởi ñiều kiện phản ứng nghĩa là không có sự thay ñổi từ ñặc hiệu vị trí 1,3 thành không ñặc hiệu vị trí và ngược lại.Cơ chế ñộng học xúc tác của lipase Tại tâm hoạt ñộng lipase gồm 3 amino acid tham gia chủ yếu vào quá trình xúc tác. Với các cơ chất không tan trong nước, hoạt tính của lipase ñạt ñược cực ñại chỉ khi nó ñược phân tán vào giữa bề mặt phân cách dầu-nước. Quá trình ñó ñược gọi là quá trình hoạt hóa phân pha. Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ phản ứng ester hóa ñược ưu tiên.

Trong trường hợp này những ñặc tính như tốc ñộ xúc tác và tính ñặc hiệu phụ thuộc nhiều vào ñiều kiện phản ứng và bản chất cơ chất.Các ñiều kiện thu nhận lipase từ vi sinh vật 1.Thành phần môi trường a.Nguồn carbon Nguồn carbon quyết ñịnh lượng lipase sinh ra khi vi sinh vật ñược cảm ứng.