CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Hiện nay, các nguồn năng lượng hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt dần nên nhu cầu tìm ra nguồn năng lượng thay thế trở thành mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới. Ethanol sinh học được xem là nguồn năng lượng sạch và có tiềm năng để thay thế năng lượng hóa thạch. Do đó, việc nâng cao hiệu quả kỹ thuật và giảm chi phí cho quy trình sản xuất ethanol sinh học đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong thời gian gần đây (Outlaw và cộng sự, 2005; Sanchez và Cardona, 2008; Wall và cộng sự, 2008; Vertes và cộng sự, 2010). Với mục đích nâng cao hiệu quả kỹ thuật quá trình lên men ethanol, nấm men cố định được xem là có nhiều ưu điểm so với nấm men tự do như làm tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men, dễ dàng tách nấm men cố định ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần trong phương pháp lên men chu kỳ và thích hợp cho phương pháp lên men liên tục (Kourkoutas và cộng sự, 2004).
Lên men ethanol là một quá trình tỏa nhiệt. Sự gia tăng nhiệt độ trong quá trình lên men sẽ gây ức chế nấm men, từ đó kéo dài thời gian lên men và làm tăng lượng đường sót trong canh trường. Hiện nay, các nhà sản xuất phải sử dụng tác nhân lạnh để ổn định nhiệt độ trong suốt quá trình lên men ethanol. Với mục đích làm giảm chi phí cho quy trình sản xuất, việc sử dụng nấm men chịu nhiệt để lên men ethanol là một giải pháp triển vọng, nhờ đó các nhà sản xuất không phải sử dụng tác nhân lạnh trong quá trình lên men.
Nấm men chịu nhiệt thường được nghiên cứu trong quá trình lên men ethanol là Kluyveromyces marxianus. Loài nấm men này có khả năng sử dụng được nhiều loại cơ chất như glucose, xylose, mannose, galactose, arabinose, sucrose, cellobiose.và có tốc độ sinh trưởng cao hơn hẳn so với nấm men Saccharomyces 1 GVHD: PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN SVTH: LÊ NGỌC HUYỀN TRANG cerevisiae truyền thống. Bên cạnh đó, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu giàu cellulose từ các phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm sẽ làm giảm chi phí cho quy trình sản xuất ethanol và không ảnh hưởng tới nhu cầu lương thực thế giới (Liu và cộng sự,2007). Thông thường, nguyên liệu giàu cellulose sẽ được tiền xử lý với acid để phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose nhằm tạo điều kiện cho quá trình thủy phân và lên men tiếp theo diễn ra nhanh (Chandel và cộng sự, 2010a; Chandel và Singh, 2011).
Tuy nhiên, quá trình tiền xử lý nguyên liệu cũng sinh ra nhiều chất hóa học ức chế quá trình lên men của nấm men. 5 - HMF là một trong những chất ức chế làm giảm mạnh hiệu quả lên men ethanol (Liu và cộng sự,2009). Dựa trên cơ sở những lập luận ở trên, chúng tôi đề xuất đề tài “Khảo sát khả năng trao đổi chất của nấm men Kluyveromyces marxianus được cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước (Nypa fruticans) trong điều kiện stress 5 - HMF”. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá sự sinh trưởng, khả năng sử dụng cơ chất và sinh tổng hợp ethanol, sự thay đổi thành phần acid béo trong màng tế bào chất, khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong môi trường có chứa 5 - HMF với những hàm lượng khác nhau.
Chúng tôi cũng thực hiện những mẫu đối chứng với nấm men tự do trong cùng các điều kiện thí nghiệm để so sánh. Hy vọng rằng, những nghiên cứu về nấm men cố định trên chất mang giàu cellulose sẽ tạo tiền đề phát triển cho việc ứng dụng nấm men cố định để sản xuất ethanol sinh học tại Việt Nam.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN SVTH: LÊ NGỌC HUYỀN TRANG CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2. Đặc điểm Kluyveromyces marxianus Từ những thập niên 80 thế kỷ 20, lên men ethanol ở nhiệt độ cao đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Nhiều loài nấm men chịu nhiệt được phát hiện như Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis… (Bollók và cộng sự, 2000).
Trong số các loài nấm men chịu nhiệt, Kluyveromyces marxianus được đánh giá là chủng nấm men sinh trưởng tốt và lên men hiệu quả ở nhiệt độ cao. Nấm men này có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 45°C đến 52°C và lên men hiệu quả trong khoảng nhiệt độ từ 38°C đến 45°C (Nonklang và cộng sự, 2008; Suryawati và cộng sự, 2008). Khi được so sánh với loài nấm men Sacchromyces cerevisiae truyền thống, Kluyveromyces marxianus thể hiện khả năng sinh tổng hợp ethanol nhiều hơn khi lên men ở nhiệt độ cao (Rocha và cộng sự, 2011). Ngoài ra, Kluyveromyces marxianus còn có khả năng sử dụng được nhiều nguồn cơ chất.
Nhiều loại cơ chất như xylose, sucrose, lactose, cellobiose, dịch whey đã được nghiên cứu để ứng dụng lên men ethanol bởi nấm men Kluyveromyces marxianus.1: Hình dạng khuẩn lạc và tế bào Kluyveromyces marxianus 3 GVHD: PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN SVTH: LÊ NGỌC HUYỀN TRANG 2. Khái niệm về stress Trong quá trình trao đổi chất, nấm men gặp nhiều biến đổi diễn ra trong môi trường. Những biến đổi này có thể diễn ra trong thời gian ngắn hay thời gian dài. Những thay đổi cực đoan về điều kiện vật lý, hóa học và sinh học trong môi trường sống sẽ tác động lên tế bào nấm men và để tồn tại tế bào nấm men cần phải để thích nghi với điều kiện mới.
Những điều kiện như vậy được gọi là điều kiện stress và những biến đổi của nấm men để thích nghi với điều kiện thay đổi đó được gọi là đáp ứng stress (Hohman và Manger, 2003). Có 3 nhóm tác nhân chính gây stress lên nấm men là tác nhân vật lý, tác nhân hóa học và tác nhân sinh học. Chúng bao gồm những thay đổi về nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, bức xạ, pH, sự có mặt của một số chất hóa học, nồng độ oxy, nồng độ cơ chất, sự có mặt các loài vi sinh vật khác…Trong quá trình trao đổi chất, nấm men có thể chịu tác động một loại stress hay nhiều loại stress khác nhau. Ngoài ra, một tác nhân có thể gây ra nhiều tác động stress cùng một lúc lên tế bào nấm men.
Ví dụ muối NaCl tạo ra hai loại stress là stress ion và stress áp suất thẩm thấu lên tế bào vi sinh vật. Nấm men có thể tiếp xúc với nhiều loại stress cùng lúc hay tuần tự từ loại stress này qua loại stress khác. Ví dụ, khi lên men ethanol với nồng độ đường lớn hơn 250g/L, nấm men Saccharomyces cerevisiaechịu tác động của nhiều loại stress. Vào thời điểm đầu quá trình lên men, nấm men phải đối mặt với stress áp lực thẩm thấu.
Sau đó, khi đường được nấm men sinh tổng hợp thành ethanol thì stress áp lực thẩm thấu giảm nhưng lượng ethanol tạo thành lại tiếp tục gây stress lên tế bào nấm men. Để thích nghi với những loại stress khác nhau, nấm men cần có một hệ thống chuỗi gen đáp ứng stress (Zuzuarregui và Olmo, 2004). Một điều đặc biệt là khi tế bào được đặt trong điều kiện stress này lại có khả năng kháng chịu đối với một số điều kiện stress khác. Hiện tượng này được gọi là bảo vệ chéo và được giải thích là do nhiều loại stress khác nhau cùng 4 GVHD: PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN SVTH: LÊ NGỌC HUYỀN TRANG gây ra một số đáp ứng giống nhau trong tế bào, chẳng hạn như sự hiệu chỉnh về cơ chế trao đổi chất và năng lượng, sự sinh tổng hợp các protein bảo vệ (như protein chống sốc nhiệt), hoặc sự sinh tổng hợp các hợp chất có chức năng bảo vệ tế bào (như trehalose, glycerol) (Hohmann, 2003).
Cùng một loại stress, tùy theo thời gian tác động của stress lên tế bào nấm men mà nấm men có cơ chế thích nghi khác nhau. Ví dụ, trong điều kiện ưu trương (hyperosmotic condition), nấm men Saccharomyces cerevisiae nhanh chóng mất nước và co tế bào chất (plasmolysis) để thích nghi với điều kiện stress. Sau đó, tế bào nấm men chuyển sang giai đoạn phục hồi (recovery phase) bằng cách sản xuất các chất tan tương thích và tích lũy trong tế bào đến khi có sự cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào. Khi điều kiện stress giảm tế bào nấm men phân giải những chất tích lũy nói trên để đảm bảo sự cân bằng áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào.
Do đó, để hiểu rõ sự thay đổi tế bào nấm men trong điều kiện stress, chúng ta phải tiến hành theo dõi trong thời gian dài. Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và vật chất nên nhiều thí nghiệm về stress chỉ được theo dõi trong thời gian ngắn. Ngoài ra, tác nhân gây stress càng mạnh thì thời gian pha phục hồi càng dài. Hai đặc điểm cơ bản của đáp ứng stress là: Thứ nhất, các đáp ứng stress sẽ giúp tế bào dần dần đạt được khả năng chịu stress mạnh hơn.
Khi tế bào sinh trưởng trong điều kiện có các yếu tố stress nhẹ thì chúng sẽ quen dần với các điều kiện đó và trở nên kháng chịu tốt hơn đối với các yếu tố stress khắc nghiệt. Chẳng hạn, nấm men quen sống điều kiện thường ở 25oC bị sốc nhiệt lên 45oC thì tỉ lệ tế bào sống sót thấp hơn so với nấm men đã qua giai đoạn xử lý trung gian ở 37oC. Hiểu rõ những đặc điểm đáp ứng stress của nấm men được sẽ đem lại nhiều lợi ích trong thực tế sản xuất.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN SVTH: LÊ NGỌC HUYỀN TRANG Thứ hai, các cơ chế diễn ra ở cấp độ phân tử. Điều này có nghĩa là, khi nấm men đã có sự thay đổi để tồn tại trong điều kiện stress, nấm men sẽ có những sự biến đổi ở cấp độ phân tử để sinh trưởng và phát triển trong điều kiện mới.
Ví dụ, trong điều kiện stress nhiệt, các protein trong tế bào có nguy cơ duỗi mạch và biến tính, khi đó tế bào cần phải sản xuất ra nhiều hơn các protein (chaperone proteins) có chức năng sửa lỗi cho các protein khác trong tế bào (Hohmann, 2003). Nhiều cơ chế đáp ứng với tress của nấm men được ghi nhận như tích lũy trehalose, tổng hợp các phân tử chaperone, các protein chống oxy hóa (antioxidant proteins), tích lũy các chất hòa tan (compatible solute), tổng hợp hydrophylin và một số thành phần của màng tế bào chất (plasma membrane).Trehalose giúp nấm men thích nghi với nhiều loại stress như nhiệt, thiếu nước (dehydration), sự có mặt của ethanol, áp suất thẩm thấu và oxy hóa (Fillinger và cộng sự, 2001; Alvarez-Peral và cộng sự, 2002). Các chaperone giúp giảm tối thiểu sự biến tính protein và sửa chữa những protein bị hư hỏng (François và Parrou, 2001).