Đồ án HCMUTE: Đánh giá đặc tính xúc tác của enzyme horseradish peroxidase biến tính bằng alginate

Đồ án nghiên cứu hcmute tổng hợp và đánh giá các đặc tính xúc tác giả enzyme horseradish peroxidase của hệ hemin, áp dụng công nghệ tiên tiến, tối ưu giải pháp kỹ thuật cho bài

• Tác giả: Lê Thị Như Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Đào Vĩnh Ái
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ vật liệu
• Đề tài: Đánh giá đặc tính xúc tác của enzyme horseradish peroxidase biến tính bằng alginate
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: Hydrogel
• 1.1. Hydrogel là các polymer ưa nước có cấu trúc không gian ba chiều (3D)
• 1.2. Liên kết hydro
• 1.3. Tương tác tại vị trí kỵ nước
• 1.4. Tương tác ion
• 1.5. Tương tác tạo phức lập thể
• 1.6. Tạo liên kết ngang bằng chất tạo liên kết ngang
• 1.7. Tạo liên kết ngang bằng cách polymer hóa gốc tự do
• 1.8. Tạo liên kết ngang bằng phản ứng cộng Michael
• 1.9. Tạo liên kết ngang bằng phản ứng Schiff–base
• 1.10. Tạo liên kết ngang bằng xúc tác enzyme
• 1.11. Hydrogel có nhiều tính chất ưu việt đặc biệt trong y sinh
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về enzyme horseradish peroxidase HRP và alginate

Bài nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá đặc tính xúc tác của enzyme horseradish peroxidase (HRP) sau khi được biến tính bằng alginate. HRP là một enzyme xúc tác quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh và công nghệ sinh học. Tuy nhiên, HRP có nhược điểm là chi phí cao và hoạt tính dễ bị mất đi trong một số điều kiện. Alginate, một loại polysaccharide tự nhiên, được lựa chọn là vật liệu biến tính enzyme do tính chất sinh học tốt, khả năng tạo gel và độ tương thích sinh học cao. Việc sử dụng alginate encapsulation giúp cải thiện độ ổn định và khả năng tái sử dụng của HRP, đồng thời mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi hơn. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình biến tính, nhằm tăng cường hiệu quả xúc tác và khả năng tái sử dụng của enzyme HRP biến tính. Phương pháp immobilization được sử dụng là alginate encapsulation, một phương pháp immobilization đơn giản và hiệu quả.

1.1 Đặc tính của enzyme horseradish peroxidase

Enzyme horseradish peroxidase (HRP) là một enzyme thuộc nhóm peroxidase, có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa khử với sự tham gia của hydrogen peroxide (H₂O₂). Cấu trúc của HRP chứa nhóm heme, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác. Hoạt tính xúc tác của HRP phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm pH, nhiệt độ, và nồng độ cơ chất. Khả năng xúc tác của HRP đã được chứng minh trong nhiều phản ứng hóa học và sinh học. Phân tích hoạt tính enzyme thường được thực hiện bằng phương pháp spectrophotometry, cụ thể là UV-Vis spectroscopy, để đo sự hấp thụ của sản phẩm phản ứng. Nghiên cứu về sinh hóa học enzyme và cơ chế xúc tác của HRP đã được thực hiện rộng rãi, tạo cơ sở cho việc ứng dụng enzyme này trong nhiều lĩnh vực. Nghiên cứu enzyme này đóng vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học enzyme và cộng nghệ sinh học nói chung. Tính ổn định enzyme là một yếu tố quan trọng cần được xem xét khi ứng dụng HRP trong các quy trình công nghiệp.

1.2 Đặc tính của alginate và cơ sở của phương pháp immobilization

Alginate là một polysaccharide tự nhiên, được chiết xuất từ tảo nâu. Alginate có cấu trúc gồm hai đơn vị monosaccharide là acid D-mannuronic và acid L-guluronic, liên kết với nhau bằng liên kết glycosidic. Sodium alginate là dạng phổ biến được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng. Alginate có khả năng tạo gel khi tiếp xúc với các cation đa hoá trị, như Ca²⁺. Gel alginate có tính chất sinh học tốt, độ tương thích sinh học cao và khả năng phân hủy sinh học. Trong nghiên cứu này, alginate được sử dụng làm vật liệu biến tính protein cho HRP, giúp cải thiện độ ổn định và khả năng tái sử dụng của enzyme. Phương pháp immobilization bằng alginate là một phương pháp immobilization đơn giản, hiệu quả và thân thiện với môi trường. Cơ chế biến tính enzyme dựa trên sự tạo gel của alginate bao bọc enzyme HRP, tạo nên một hệ thống ổn định hơn. Nồng độ alginate và các điều kiện quá trình biến tính ảnh hưởng đến hiệu quả của phương pháp immobilization.

II. Phương pháp và kỹ thuật đánh giá hoạt tính xúc tác

Nghiên cứu sử dụng phương pháp immobilization của enzyme horseradish peroxidase bằng alginate. Quá trình biến tính enzyme được thực hiện bằng cách trộn HRP với dung dịch sodium alginate ở nồng độ nhất định, sau đó tạo gel bằng phương pháp ionotropic. Kỹ thuật đánh giá hoạt tính của enzyme biến tính được thực hiện dựa trên khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa một số cơ chất mẫu. Các cơ chất mẫu được lựa chọn là những chất có khả năng phản ứng với HRP và tạo ra sản phẩm có thể đo được bằng phương pháp định lượng. Phương pháp định lượng chủ yếu dựa trên spectrophotometry ở vùng UV-Vis spectroscopy. Đo bện nhiệt độ và độ bền pH của hệ enzyme biến tính được tiến hành để đánh giá sự ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến hoạt tính của enzyme. Tỷ lệ alginate được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả biến tính enzyme cao nhất. Dữ liệu thu được được phân tích bằng các kỹ thuật phân tích thống kê để đánh giá hiệu quả xúc tác của hệ thống enzyme biến tính.

2.1 Phương pháp tổng hợp và đặc trưng hóa mẫu alginate

Mẫu alginate được sử dụng trong nghiên cứu cần được đặc trưng hóa đầy đủ về nồng độ alginate, phân bố khối lượng phân tử và độ tinh khiết. Quá trình sản xuất enzyme và tinh sạch enzyme cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo chất lượng enzyme HRP. Kỹ thuật phân tích được sử dụng bao gồm kỹ thuật sắc ký, phổ kế và các phương pháp phân tích khác để xác định các thông số đặc trưng của mẫu alginate. Tỷ lệ alginate ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả biến tính enzyme, do đó cần được tối ưu hóa. Khối lượng phân tử và độ tinh khiết của alginate cũng là yếu tố cần xem xét trong quá trình tối ưu hóa quá trình biến tính. Các phương pháp phân tích cần đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy cao.

2.2 Kỹ thuật đánh giá hoạt tính xúc tác và phân tích động học enzyme

Hoạt tính xúc tác của enzyme HRP biến tính được đánh giá dựa trên tốc độ phản ứng oxy hóa của các cơ chất mẫu. Phân tích hoạt tính enzyme được thực hiện bằng phương pháp spectrophotometry, sử dụng máy UV-Vis spectroscopy. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính toán các thông số động học của enzyme, như Km và Vmax, dựa trên mô hình Michaelis-Menten kinetics. Ảnh hưởng của biến tính lên động học enzyme được đánh giá bằng cách so sánh các thông số động học của enzyme HRP tự do và enzyme HRP biến tính. Điều kiện phản ứng như pH, nhiệt độ và nồng độ cơ chất cũng được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả xúc tác cao nhất. Mô hình động học giúp hiểu rõ hơn về cơ chế xúc tác của enzyme HRP biến tính và dự đoán hiệu quả xúc tác trong các điều kiện khác nhau. Kỹ thuật phân tích dữ liệu cần được lựa chọn phù hợp để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.

III. Kết quả và thảo luận

Phần này trình bày kết quả đánh giá đặc tính xúc tác của enzyme HRP biến tính bằng alginate. Kết quả về hoạt tính xúc tác, độ bền nhiệt, độ bền pH, và khả năng tái sử dụng của enzyme biến tính sẽ được trình bày chi tiết. Phân tích dữ liệu dựa trên các kỹ thuật thống kê thích hợp. So sánh giữa enzyme HRP tự do và enzyme HRP biến tính được thực hiện để đánh giá hiệu quả của phương pháp biến tính. Ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ alginate, điều kiện phản ứng đến hoạt tính xúc tác được thảo luận. Cơ chế biến tính enzyme và ứng dụng thực tiễn của enzyme HRP biến tính cũng được đề cập. Các kết quả nghiên cứu đóng góp vào sự hiểu biết về cộng nghệ sinh học enzyme và mở ra tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm ứng dụng công nghiệp và ứng dụng y tế.

3.1 Đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme HRP biến tính

Kết quả đánh giá hoạt tính xúc tác cho thấy sự thay đổi đáng kể so với enzyme HRP tự do. Hiệu quả xúc tác của enzyme HRP biến tính phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm nồng độ alginate, điều kiện phản ứng và phương pháp biến tính. Phân tích động học enzyme cho thấy sự thay đổi về các thông số động học, như Km và Vmax. So sánh với enzyme HRP tự do giúp đánh giá hiệu quả của phương pháp immobilization. Dữ liệu thực nghiệm được thể hiện dưới dạng biểu đồ và bảng số liệu. Phân tích thống kê được sử dụng để xác định ý nghĩa thống kê của các kết quả. Mô hình động học giúp giải thích cho sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzyme HRP biến tính.

3.2 Thảo luận về ảnh hưởng của biến tính và tiềm năng ứng dụng

Ảnh hưởng của biến tính bằng alginate đến đặc tính xúc tác của enzyme HRP được thảo luận chi tiết. Độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme biến tính được so sánh với enzyme HRP tự do. Khả năng tái sử dụng của enzyme biến tính được đánh giá. Các kết quả được giải thích dựa trên cơ chế biến tính enzyme. Tiềm năng ứng dụng của enzyme HRP biến tính trong các lĩnh vực như xử lý môi trường, cảm biến sinh học và y tế được đề cập. Mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng của enzyme HRP biến tính được phân tích. Những hạn chế của nghiên cứu và hướng nghiên cứu trong tương lai cũng được đề cập.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong kỹ thuật y sinh hiện đại, vật liệu hydrogel có cấu trúc mạng lưới không gian ba chiều (3D) đóng vai trò trung tâm trong nhiều ứng dụng như dẫn truyền thuốc có kiểm soát, băng vết thương, kỹ thuật tái tạo mô và vận chuyển gen. Để hình thành cấu trúc hydrogel liên kết ngang bền vững từ các tiền chất polymer gắn nhóm phenol (như Gelatin–Tyramine, Hyaluronic acid–Tyramine, Dextran–Tyramine), phương pháp sử dụng xúc tác enzyme Horseradish Peroxidase (HRP) kết hợp chất oxy hóa Hydrogen Peroxide ($\text{H}_2\text{O}_2$) được ứng dụng rộng rãi nhờ khả năng gel hóa nhanh trong điều kiện sinh lý êm dịu và tính tương thích sinh học cao. Tuy nhiên, enzyme HRP tự nhiên có giá thành đắt đỏ và dễ bị biến tính, mất hoạt tính xúc tác khi nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ tăng cao.

Hemin (sắt protoporphyrin IX) là nhóm ngoại có cấu trúc tâm sắt tương đồng với vị trí hoạt động của enzyme HRP, sở hữu khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa tương tự, độ ổn định nhiệt cao, không bị bất hoạt ở nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ cao và giá thành thấp. Trở ngại lớn nhất của Hemin là tính kỵ nước, hoàn toàn không tan trong môi trường nước trung tính mà chỉ tan trong dung dịch kiềm mạnh, gây khó khăn cho các ứng dụng gel hóa y sinh. Nhằm khắc phục hạn chế này, nghiên cứu tận dụng polysaccharide tự nhiên Alginate (Alg) làm chất mang ưa nước, tương thích sinh học, kết hợp Histamine (His) chứa vòng imidazole làm cầu nối phối trí để cố định và phân tán Hemin (He) trong môi trường nước.

Đề tài đặt ra mục tiêu tổng hợp hệ xúc tác nano nhân tạo Alginate–Histamine–Hemin ($\text{AlgHis–He}$) mang đặc tính giả enzyme HRP, định hướng ứng dụng tạo liên kết ngang cho hydrogel Gelatin–Tyramine ($\text{Gel–Tyr}$) với định hướng tổng hợp xanh, không sử dụng dung môi hữu cơ độc hại.

Nhiệm vụ nghiên cứu được xác định qua 4 nội dung cụ thể:

1. Tổng hợp hệ xúc tác Alginate–Histamine–Hemin với các tỷ lệ phối trộn khác nhau.
2. Đánh giá hoạt lực của hệ xúc tác Alginate–Histamine–Hemin trên cơ chất Guaiacol và xác định các thông số động học enzyme.
3. Đánh giá hoạt tính xúc tác của hệ Alginate–Histamine–Hemin trên cơ chất Pyrogallol ở các nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ khác nhau.
4. Đánh giá độc tính tế bào trên nguyên bào sợi và khảo sát khả năng xúc tác tạo hydrogel trên nền Gelatin–Tyramine.

Đối tượng nghiên cứu bao gồm hệ xúc tác liên hợp $\text{AlgHis–He}$, enzyme tự nhiên HRP, Hemin hoạt hóa kiềm ($\text{He–Na}$), cơ chất Guaiacol, Pyrogallol, hydrogel $\text{Gel–Tyr}$ và dòng tế bào nguyên bào sợi người (Fibroblast). Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm FM&D (Đại học Duy Tân), Phòng Vật liệu Hóa dược (Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP. Hồ Chí Minh) và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh), hoàn thành vào tháng 09/2020.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết về cơ chế xúc tác peroxidase và hóa học tạo liên kết ngang của hydrogel:

• Cơ chế xúc tác peroxidase: HRP và Hemin chứa ion $\text{Fe}^{3+}$ ở trạng thái nghỉ. Khi phản ứng với $\text{H}_2\text{O}_2$, $\text{Fe}^{3+}$ bị oxy hóa thành hợp chất trung gian $\text{Fe}^{4+}\text{=O}$ (chứa gốc cation porphyrin), sau đó thực hiện 2 bước nhận điện tử liên tiếp từ các hợp chất phenol để trở về trạng thái nghỉ ban đầu, đồng thời tạo ra các gốc tự do phenolic. Các gốc phenolic này ghép đôi tạo liên kết cộng hóa trị carbon–carbon (C–C) hoặc carbon–oxygen (C–O) tại vị trí ortho, hình thành mạng lưới không gian hydrogel.
• Vật liệu cấu thành: Alginate là một copolymer mạch thẳng tạo bởi $\beta$-D-mannuronic acid (M) và $\alpha$-L-guluronic acid (G) liên kết qua cầu $1,4\text{-glycoside}$, mang các nhóm $-\text{COOH}$ hoạt động; Histamine cung cấp nhóm amine $-\text{NH}_2$ để tạo liên kết amide với Alginate và vòng imidazole để phối trí với ion sắt của Hemin.

Quy trình thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu được triển khai theo các bước:

Quy trình / Phép đo	Hóa chất, thông số và điều kiện thực nghiệm	Thiết bị & Phương pháp ghi nhận
Tổng hợp Alginate–Histamine (AlgHis)	$400\text{ mg}$ Alg trong $12\text{ mL } \text{H}_2\text{O}$; hoạt hóa bằng $548\text{ mg}$ EDC và $427\text{ mg}$ NHS trong $15\text{ phút}$; thêm $411\text{ mg}$ His ($\text{pH } 6$ chỉnh bằng $\text{HCl } 0{,}1\text{ M}$); phản ứng $24\text{ giờ}$ ở nhiệt độ phòng. Thẩm tách bằng màng $\text{MWCO } 12\text{–}14\text{ kDa}$ trong $3\text{ ngày}$, đông khô.	Máy đông khô FDU-1200, Máy khuấy từ Velp AREC
Tổng hợp Alginate–Histamine–Hemin (AlgHis–He)	$100\text{ mg}$ AlgHis trong $10\text{ mL NaOH } 0{,}1\text{ M}$; thêm Hemin tan trong $\text{NaOH } 0{,}1\text{ M}$ theo các tỷ lệ khối lượng $1\text{–}0{,}25$; $1\text{–}0{,}5$; $1\text{–}0{,}75$; $1\text{–}1$; phản ứng $12\text{ giờ}$. Thẩm tách $3\text{ ngày}$ ($\text{MWCO } 12\text{–}14\text{ kDa}$), đông khô.	Thẩm tách trong nước khử ion, đông khô mẫu
Phân tích cấu trúc hóa học	Xác định độ dịch chuyển hóa học, nhóm chức đặc trưng và liên kết phối trí.	$^{1}\text{H–NMR}$ (Bruker Avance 500), FT-IR (Frontier), Raman (XploraONE)
Đánh giá hiệu suất gắn Hemin	Xây dựng đường chuẩn Hemin trong đệm $\text{PBS pH } 10$ ở dải nồng độ $1\text{–}8\text{ ppm}$. Đo độ hấp thụ của AlgHis–He ở nồng độ $25\text{ ppm}$.	Quang phổ UV-Vis Shimadzu UV-1800
Động học xúc tác trên Guaiacol	Guaiacol $10\text{ mM}$, đệm $\text{PBS } 100\text{ mM (pH } 5\text{)}$, AlgHis–He $80\text{ ppm}$ (hoặc HRP $10\text{ ppm}$, He–Na $80\text{ ppm}$), kích hoạt bằng $\text{H}_2\text{O}_2\text{ } 21{,}35%$. Đo bước sóng $470\text{ nm}$ ($\varepsilon = 26{,}6\text{ mM}^{-1}\text{cm}^{-1}$).	UV-Vis, mô hình Lineweaver–Burk tính $V_{\max}$, $K_m$
Hoạt tính xúc tác trên Pyrogallol	Pyrogallol $0{,}2%$, AlgHis–He, khảo sát nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ từ $2\text{–}100\text{ mM}$. Đo độ hấp thụ tại bước sóng $420\text{ nm}$ ở thời điểm $t = 180\text{ s}$.	Quang phổ UV-Vis Shimadzu UV-1800
Thử nghiệm độc tính tế bào in vitro	Tế bào nguyên bào sợi người (Fibroblast da quy đầu) nuôi cấy $10^4\text{ tế bào/giếng}$. Đánh giá ở nồng độ chất thử $100\text{ }\mu\text{g/mL}$ sau $48\text{ giờ}$.	Phương pháp đo màu SRB (đọc ELISA OD $492\text{ nm}$ & $620\text{ nm}$) và nhuộm huỳnh quang AO/EB
Thử nghiệm tạo hydrogel Gelatin–Tyramine	Dung dịch Gel–Tyr $15%$, khảo sát hàm lượng AlgHis–He ($0{,}02\text{–}0{,}1%$) và $\text{H}_2\text{O}_2\text{ } 0{,}2%$ ($0{,}005\text{–}0{,}04%$). Ghi nhận thời gian gel hóa.	Phương pháp đảo ống nghiệm (Tube-inverting method)

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập trực tiếp từ hệ thống thiết bị phân tích tại các phòng thí nghiệm nghiên cứu chuyên sâu, đảm bảo tính chuẩn xác và độ lặp lại qua 3 lần thí nghiệm song song.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về vật liệu hydrogel, các phương pháp tạo mạng liên kết ngang (tương tác vật lý: liên kết hydro, kỵ nước, ion, phức lập thể; phương pháp hóa học: chất tạo lưới Glutaraldehyde, trùng hợp gốc tự do, phản ứng cộng Michael, phản ứng Schiff-base và xúc tác enzyme). Chương này đi sâu phân tích cơ chế xúc tác của enzyme HRP tự nhiên, cấu trúc phối trí của nhóm heme sắt protoporphyrin IX với phối tử $\text{His}170$, đồng thời chỉ rõ hạn chế về chi phí và tính bất hoạt của HRP trước nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ cao.

Tiếp đó, chương tổng kết các nghiên cứu chế tạo peroxidase nhân tạo từ Hemin như hệ micelle Gemini–SDS–Hemin–Imidazole, phức hợp Graphene–Hemin, hệ micelle $\text{PEG-b-P4VP/Hemin}$ và vật liệu Hemin–Montmorillonite. Các dẫn xuất hydrogel trên cơ sở Gelatin biến tính phenol (Gelatin–Ph, Gtn–HPA, Gelatin–Tyramine) và đặc tính hóa lý của Alginate (cấu trúc khối poly-G, poly-M, độ tan, khả năng tạo gel với ion đa hóa trị) được phân tích để xác lập tính khả thi của việc dùng Alginate–Histamine làm chất mang cho Hemin.

Chương 2. Hóa chất và phương pháp

Chương 2 trình bày chi tiết danh mục $13$ loại hóa chất tinh khiết cùng thông số kỹ thuật của các trang thiết bị phân tích ($^{1}\text{H–NMR}$ $500\text{ MHz}$, FT-IR Frontier, kính hiển vi Raman XploraONE, UV-Vis UV-1800, máy đông khô). Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt từ phản ứng ghép His vào Alg nhờ tác nhân EDC/NHS ở $\text{pH } 6$, phản ứng liên hợp Hemin trong dung dịch $\text{NaOH } 0{,}1\text{ M}$ ở các tỷ lệ $1\text{–}0{,}25$; $1\text{–}0{,}5$; $1\text{–}0{,}75$; $1\text{–}1$, cho đến quy trình hoạt hóa Hemin đối chứng ($\text{He–Na}$).

Chương này cũng thiết lập công thức và ma trận nồng độ để xác định hiệu suất gắn Hemin bằng UV-Vis, quy trình đo động học Michaelis–Menten trên Guaiacol ($470\text{ nm}$), khảo sát độ bền xúc tác trước $\text{H}_2\text{O}_2$ trên Pyrogallol ($420\text{ nm}$), quy trình cố định tế bào và nhuộm SRB/AO-EB trên nguyên bào sợi, cùng các bảng biến thiên thành phần để khảo sát thời gian gel hóa của hệ $\text{Gel–Tyr}$.

Chương 3. Kết quả và bàn luận

Chương 3 công bố và thảo luận các kết quả thực nghiệm:

• Đặc trưng cấu trúc: Phổ $^{1}\text{H–NMR}$, FT-IR và Raman khẳng định phản ứng ghép Histamine lên Alginate thành công thông qua sự xuất hiện của liên kết amide và các tín hiệu đặc trưng của vòng imidazole. Phổ FT-IR và Raman của sản phẩm $\text{AlgHis–He}$ ghi nhận sự dịch chuyển và xuất hiện của các dải dao động phối trí giữa nhóm imidazole của Histamine với tâm sắt $\text{Fe}^{3+}$ của Hemin. Phổ UV-Vis trong đệm $\text{PBS pH } 10$ xác nhận Hemin phân tán đồng nhất trên mạch polymer Alginate.
• Động học và hoạt lực xúc tác: Dựa trên phương trình Lineweaver–Burk từ phản ứng oxy hóa Guaiacol, tác giả xác định các thông số $V_{\max}$ và $K_m$ cho từng tỷ lệ tổng hợp. Tỷ lệ $\text{AlgHis–He (1–0,75)}$ đạt hoạt lực xúc tác tối ưu, vượt trội so với dạng Hemin kiềm hóa ($\text{He–Na}$). Khi so sánh với HRP tự nhiên, hệ $\text{AlgHis–He (1–0,75)}$ thể hiện hoạt tính xúc tác giả enzyme rõ rệt.
• Độ bền với $\text{H}_2\text{O}_2$: Thử nghiệm oxy hóa Pyrogallol ở dải nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ từ $2\text{–}100\text{ mM}$ chỉ ra rằng HRP nhanh chóng bị bất hoạt và suy giảm hoạt tính ở nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ cao, trong khi hệ $\text{AlgHis–He}$ duy trì hoạt tính xúc tác ổn định, chứng minh ưu thế vượt trội về độ bền trước tác nhân oxy hóa.
• Độc tính tế bào: Thử nghiệm SRB và quan sát hình thái huỳnh quang AO/EB trên nguyên bào sợi da người (Fibroblast) ở nồng độ $100\text{ }\mu\text{g/mL}$ sau $48\text{ giờ}$ cho thấy tỷ lệ sống của tế bào cao, hình thái tế bào nguyên vẹn, khẳng định vật liệu an toàn sinh học.
• Khả năng tạo hydrogel Gelatin–Tyramine: Hệ $\text{AlgHis–He (1–0,75)}$ xúc tác thành công quá trình tạo hydrogel $\text{Gel–Tyr } 15%$. Thời gian gel hóa tỷ lệ nghịch với hàm lượng xúc tác và hàm lượng $\text{H}_2\text{O}_2$, có thể kiểm soát linh hoạt trong khoảng vài chục giây, đáp ứng yêu cầu ứng dụng của hydrogel tiêm tại chỗ.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

Các phát hiện thực nghiệm và thông số kỹ thuật được tổng hợp trong bảng sau:

Thông số / Chỉ tiêu khảo sát	Kết quả thực nghiệm ghi nhận
Tỷ lệ tổng hợp AlgHis–He tối ưu	Tỷ lệ khối lượng $\text{AlgHis : Hemin} = 1 : 0{,}75$ cho hoạt lực xúc tác cao nhất
Đặc trưng cấu trúc liên hợp	Phổ $^{1}\text{H–NMR}$, FT-IR, Raman và UV-Vis xác nhận liên kết amide giữa Alg và His cùng liên kết phối trí $\text{Fe–N}$ giữa Hemin và vòng imidazole
Độ ổn định trước $\text{H}_2\text{O}_2$ trên Pyrogallol	Duy trì hoạt tính xúc tác liên tục ở dải nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ từ $2\text{–}100\text{ mM}$ mà không bị bất hoạt (ngược lại HRP bị suy giảm mạnh)
Độc tính tế bào nguyên bào sợi ($100\text{ }\mu\text{g/mL}$)	Phương pháp SRB và AO/EB xác nhận không gây độc tế bào, duy trì mật độ và hình thái bình thường sau $48\text{ giờ}$
Khả năng tạo gel Gel–Tyr $15%$	Xúc tác tạo gel thành công; thời gian gel hóa biến thiên linh hoạt theo hàm lượng xúc tác ($0{,}02\text{–}0{,}1%$) và hàm lượng $\text{H}_2\text{O}_2$ ($0{,}005\text{–}0{,}04%$)

Đề xuất và giải pháp kỹ thuật

• Ứng dụng hệ xúc tác nhân tạo $\text{AlgHis–He}$ thay thế enzyme tự nhiên HRP trong việc chế tạo các hydrogel tiêm tại chỗ trên nền polymer gắn phenol ($\text{Gel–Tyr}$, $\text{HA–Tyr}$, $\text{Chitosan–HPA}$) phục vụ tái tạo mô và mang thuốc.
• Tận dụng khả năng xúc tác oxy hóa bền vững của $\text{AlgHis–He}$ trong môi trường $\text{H}_2\text{O}_2$ nồng độ cao để mở rộng sang lĩnh vực xử lý môi trường, cụ thể là phân hủy các hợp chất phenol độc hại và khử màu nước thải dệt nhuộm chứa phẩm màu azo.

Đóng góp mới của tác giả

• Phát triển thành công quy trình "tổng hợp xanh" hệ peroxidase nhân tạo hoàn toàn trong pha nước và kiềm loãng, không sử dụng dung môi hữu cơ độc hại, quy trình tinh chế đơn giản bằng thẩm tách và đông khô.
• Lần đầu tiên sử dụng Alginate tự nhiên kết hợp cầu nối Histamine để làm chất mang ưa nước phân tán Hemin, giải quyết triệt để bài toán không tan của Hemin ở môi trường nước trung tính nhằm mục đích xúc tác tạo hydrogel y sinh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của khóa luận: Nghiên cứu mới dừng lại ở việc đánh giá độc tính tế bào in vitro trên một dòng nguyên bào sợi (Fibroblast da người) và khảo sát thời gian gel hóa của hệ hydrogel $\text{Gel–Tyr}$. Các chỉ tiêu cơ lý chuyên sâu của hydrogel như mô đun đàn hồi lưu trữ ($G'$), mô đun tổn hao ($G''$), độ xốp vi cấu trúc (SEM), độ trương nở cân bằng và khả năng tương thích mô in vivo trên mô hình động vật chưa được thực hiện trong phạm vi đồ án.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Mở rộng đánh giá tương thích sinh học in vivo và thử nghiệm khả năng bao gói, tăng sinh tế bào $3\text{D}$ trong khối gel $\text{Gel–Tyr}$ xúc tác bởi $\text{AlgHis–He}$.
  2. Khảo sát khả năng xúc tác tạo hydrogel trên các dẫn xuất polysaccharide tự nhiên khác như Hyaluronic acid–Tyramine, Dextran–Tyramine hoặc Chitosan–Tyramine.
  3. Thử nghiệm ứng dụng hệ xúc tác $\text{AlgHis–He}$ trong xử lý nước thải công nghiệp thực tế để loại bỏ các hợp chất thơm và thuốc nhuộm.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo chuyên môn giá trị cho:

• Sinh viên và học viên cao học: Chuyên ngành Công nghệ Vật liệu, Kỹ thuật Hóa học, Vật liệu Y sinh, Hóa sinh và Công nghệ Sinh học quan tâm đến vật liệu nanozyme (enzyme nhân tạo) và hydrogel y sinh.
• Phần đáng tham khảo trọng tâm:
  • Quy trình tổng hợp liên hợp polymer sinh học Alginate–Histamine bằng phản ứng hoạt hóa EDC/NHS và kỹ thuật tinh chế màng thẩm tách ở Chương 2.
  • Phương pháp xây dựng đường chuẩn UV-Vis và phương pháp xử lý số liệu động học enzyme theo mô hình Lineweaver–Burk ($V_{\max}$, $K_m$) trên cơ chất Guaiacol.
  • Quy trình chuẩn đánh giá độc tính tế bào in vitro bằng phương pháp nhuộm so màu SRB và nhuộm huỳnh quang kép AO/EB.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Histamine đóng vai trò gì trong cấu trúc của hệ xúc tác Alginate–Histamine–Hemin?
Histamine đóng vai trò chất trung gian làm cầu nối giữa Alginate và Hemin. Nhóm amine ($-\text{NH}_2$) của Histamine phản ứng với nhóm carboxylate ($-\text{COOH}$) của Alginate thông qua phản ứng ghép đôi carbodiimide (EDC/NHS) tạo liên kết amide bền vững. Đồng thời, vòng imidazole của Histamine cung cấp nguyên tử nitơ phối trí với tâm sắt ($\text{Fe}^{3+}$) của phân tử Hemin (tương tự như gốc $\text{His}170$ trong enzyme tự nhiên HRP), giúp cố định Hemin và hoạt hóa tâm xúc tác.

2. Tại sao hệ xúc tác AlgHis–He lại vượt trội hơn enzyme tự nhiên HRP khi nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ tăng cao?
Enzyme tự nhiên HRP có bản chất là glycoprotein phức tạp, khi tiếp xúc với nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ cao sẽ nhanh chóng bị oxy hóa phá vỡ cấu trúc không gian bậc bốn (bất hoạt enzyme), làm mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác. Ngược lại, hệ $\text{AlgHis–He}$ là vật liệu nanozyme nhân tạo có khung Hemin bền vững, tâm sắt porphyrin không bị biến tính bởi nồng độ chất oxy hóa cao, do đó duy trì được hoạt tính xúc tác ổn định trên cơ chất Pyrogallol ở dải nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ lên đến $100\text{ mM}$.

3. Tỷ lệ phối trộn nào giữa AlgHis và Hemin cho hoạt lực xúc tác tối ưu nhất?
Trong 4 tỷ lệ khảo sát ($1\text{–}0{,}25$; $1\text{–}0{,}5$; $1\text{–}0{,}75$ và $1\text{–}1$), tỷ lệ khối lượng $\text{AlgHis–He (1–0,75)}$ cho hoạt lực xúc tác trên cơ chất Guaiacol cao nhất, được thể hiện qua các thông số động học Michaelis–Menten ($V_{\max}$ và tỷ số $V_{\max}/K_m$) và được chọn làm mẫu tối ưu để thực hiện các thử nghiệm tạo hydrogel tiếp theo.

4. Hai phương pháp nào được sử dụng để xác định độc tính của hệ xúc tác trên nguyên bào sợi?
Khóa luận sử dụng hai phương pháp: (1) Phương pháp nhuộm so màu Sulforhodamine B (SRB) nhằm định lượng tổng lượng protein tế bào qua độ hấp thụ quang học ELISA ở bước sóng $492\text{ nm}$ và $620\text{ nm}$; (2) Phương pháp nhuộm kép Acridine Orange / Ethidium Bromide (AO/EB) quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang để đánh giá trực tiếp tỷ lệ tế bào sống (phát huỳnh quang xanh lục) và tế bào chết/hoại tử (phát huỳnh quang đỏ). Cả hai phương pháp đều xác nhận mẫu ở nồng độ $100\text{ }\mu\text{g/mL}$ không gây độc tế bào.

5. Những kỹ thuật quang phổ và phổ học nào đã được dùng để chứng minh cấu trúc hóa học của sản phẩm?
Tác giả đã sử dụng phối hợp 4 kỹ thuật phân tích hiện đại: phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^{1}\text{H–NMR}$) trên máy Bruker Avance $500\text{ MHz}$, quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên máy Frontier, quang phổ Raman trên hệ kính hiển vi XploraONE và quang phổ tử ngoại–khả kiến (UV-Vis) trên máy Shimadzu UV-1800.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã tổng hợp thành công hệ xúc tác nano nhân tạo Alginate–Histamine–Hemin ($\text{AlgHis–He}$) bằng quy trình hóa học xanh thân thiện với môi trường trong môi trường nước và kiềm loãng. Hệ vật liệu sở hữu đặc tính giả enzyme Horseradish Peroxidase vượt trội với độ ổn định cao trước nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ lớn, hoàn toàn không gây độc đối với nguyên bào sợi người ở nồng độ $100\text{ }\mu\text{g/mL}$. Kết quả chứng minh hệ $\text{AlgHis–He (1–0,75)}$ xúc tác hiệu quả quá trình gel hóa hydrogel Gelatin–Tyramine với thời gian kiểm soát linh hoạt, mở ra giải pháp chi phí thấp đầy triển vọng để thay thế enzyme tự nhiên trong các ứng dụng hydrogel y sinh và xử lý môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Hydrogel Hydrogel là các polymer ưa nước có cấu trúc không gian ba chiều (3D). Một hydrogel có thể được định nghĩa là một mạng lưới polymer liên kết ngang, trương trong nước, có khả năng giữ nước trong cấu trúc xốp của nó, cho phép khuếch tán và gắn các phân tử cũng như tế bào. Khả năng giữ nước của hydrogel chủ yếu do sự hiện diện của các nhóm ưa nước như các nhóm amino, carboxyl và hydroxyl trong chuỗi polymer.

Theo Hoffmann, hydrogel có khả năng hấp thụ lượng nước lớn gấp hàng nghìn lần khối lượng khô của chúng (xerogel). Một xerogel có thể được định nghĩa là một mạng lưới polymer không có nước. Khả năng giữ nước của xerogel phụ thuộc vào số lượng nhóm ưa nước và mật độ liên kết ngang. Số lượng các nhóm ưa nước càng cao, khả năng giữ nước càng cao.

Việc sử dụng hydrogel cho các ứng dụng y sinh bắt nguồn từ năm 1960 khi Forgeterle và Lim phát triển liên kết ngang poly (Hydroxyethyl Methacrylate). Tính chất hấp thụ nước của hydrogel khiến chúng trở nên có ích trong nhiều ứng dụng thực tế (lĩnh vực môi trường, điện tử, y sinh, sinh học,. Hydrogel được phân loại theo nhiều cách khác nhau, tuy nhiên phân loại dựa vào loại liên kết ngang là phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến. Hydrogel được tổng hợp bằng cách sử dụng các phương pháp tạo liên kết ngang như phương pháp vật lí (tương tác hydro, tương tác ion, phức lập thể, tương tác tại vị trí kỵ nước), phương pháp hóa học (tạo liên kết ngang bằng chất tạo liên kết ngang, phản ứng cộng Michael, xúc tác enzyme,.

Tương tác hydro: Hydrogel hình thành nhờ tương tác tạo liên kết hydro được thực hiện bằng cách tăng hoặc giảm nhiệt độ đến nhiệt độ đông đặc. Hyaluronic acid, poly (vinyl ancohol) và Methylcellulose là những hydrogel điển hình được tạo thành theo phương pháp này. Liên kết hydro cũng có thể được dùng để tổng hợp hydrogel tiêm được. Hỗn hợp của hai hay nhiều các polymer tự nhiên có thể có sự đồng bộ về tính lưu biến, nghĩa là các thuộc tính đàn hồi, độ nhớt của hỗn hợp polymer giống gel nhiều hơn so với các đặc tính này ở từng polymer riêng lẽ.

Sự đồng bộ này thường là kết quả của quá trình tương tác tạo các liên kết hydro giữa các chuỗi polymer tạo ra sự tương thích trong cấu trúc hình học của các polymer tham gia. Hydrogel được tạo từ các polymer tự nhiên như Gelatin–Agar, Starch–carboxymethyl cellulose và Hyaluronic acid–Methylcellulose thường thể hiện khả năng tương thích sinh học tuyệt vời [13]. 2 do an Liên kết hydro Hình 1. Tương tác tạo liên kết hydro của Hyaluronic acid và Methylcellulose [13] Tương tác tại vị trí kỵ nước: Các phân tử polymer có chứa một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước được tạo thành bằng phản ứng trùng hợp tạo ra khối copolymer.

Các polymer này có thể hòa tan trong nước ở nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng, phần kỵ nước có xu hướng xoay vào trong giảm thiểu diện tích bề mặt tiếp xúc trực tiếp với nước, xảy ra hiện tượng gel hóa. Khả năng gel hóa này phụ thuộc vào nồng độ của các polymer, độ dài đầu kỵ nước và cấu trúc hóa học của polymer [13]. Tương tác kỵ nước [13] Tương tác ion: Tương tác ion đã được nghiên cứu rộng rãi để tạo liên kết ngang trong quá trình gel hóa.

Một lợi thế của phương pháp này là sự phân hủy sinh học có thể xảy ra như sự phân ly ion trong ngoại bào, phá vỡ mạng lưới liên kết ngang. Tương tác ion có thể xảy ra giữa một phân tử polymer và một phân tử nhỏ hoặc giữa hai phân tử polymer trái dấu để tạo thành hydrogel [13]. 3 do an Hình 1.