Nghiên cứu khả năng sản xuất enzyme ngoại bào của Lecanicillium lecanii HNL20 - ĐH Nông nghiệp

Nghiên cứu khả năng sản xuất enzyme ngoại bào của Lecanicillium lecanii HNL20 và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzym ngoại bào.

• Tác giả: Pham Manh Hung
• Người hướng dẫn: Assoc. Prof. Vu Van Hanh
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Microbial Biotechnology
• Đề tài: Study on the ability to produce extracellular enzymes of Lecanicillium lecanii HNL20 and factors affecting the exo-enzymatic activity
• Loại tài liệu: Graduation thesis
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEGDEMENT
• 1. PART I: INTRODUCTION
• 1.1. Introduction
• 1.2. Purposes
• 1.3. Requirements
• 2. PART II: OVERVIEW OF LECANICILLIUM LECANII
• 2.1. Introduction
• 2.2. Morphology characteristics of L. leacnii HNL20 on PDA medium after 6 days at 28oC and shaking 15rpm
• 2.3. Life cycle of L.
• 2.4. Geographical distribution of L.
• 3. PART III: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Materials and equipment
• 3.2. Location and time
• 3.3. Screening the morphology, the density of conidia and studying on the activity of extracellular enzymes of HNL20
• 3.4. Studying on the elements affecting to the activity of L. lecanii HNL20 extracellular
• 3.5. Determination the activity of chitinase through spectrophotometry
• 3.6. Determination the activity of cellulase through spectrophotometry
• 3.7. Determination the activity of protease through spectrophotometry
• 4. PART IV: RESULTS
• 4.1. Evaluating effects (Carbon sources, nitrogen sources, metals ion, pH, temperature and petroleum oil) affect to the activity of exoenzymes
• 4.2. The morphology of hyphae, conidia and the exoenzyme activity of L.
• 4.3. The results of testing exoenzyme’s activity of L. lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added Carbon sources (2% (w/v) molasses, 2% (w/v) glucose and 2% (w/v) sucrose)
• 4.4. The results of testing exoenzyme’s activity of L. lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added yeast extract
• 4.5. The results of testing exoenzyme’s activity of L. lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added (NH4)2SO4
• 4.6. The results of testing exoenzyme’s activity of L. lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added Urea
• 4.7. The effects of temperature (50oC, 60oC, 70oC and 80oC) to the activity of L. lecanii HLN20 crude enzyme
• 4.8. The effects of pH (pH=3,4,5,5,7 and 8) to the activity of L. lecanii HLN20 crude enzyme
• 4.9. The effects of petroleum oil (SK Enspray 99EC) at 0.2% (v/v) to the activity of L. lecanii HLN20 crude enzyme
• 4.10. The effects of metal ion (K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Zn2+ and Cu2+) to the activity of L. lecanii HLN20 crude enzyme
• 4.11. The results of testing exoenzyme’s activity of L. lecanii HNL20 cultured in improved medium
• 4.12. Determination the activity of extracellular enzymes through agar plate diffusion
• 4.13. Determination the activity of extracellular enzymes through spectrophotometry
• CONCLUSSIONS AND SUGGESTTIONS

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Lecanicillium lecanii HNL20

Lecanicillium lecanii HNL20 là một loại nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng, thuộc phân lớp Ascomycota, lớp Sordariomycetes. Nấm này được biết đến với khả năng sản xuất enzyme ngoại bào như cellulase, protease và chitinase. Những enzyme này có vai trò quan trọng trong việc phá vỡ hàng rào bảo vệ của côn trùng, cho phép nấm xâm nhập và tiêu diệt chúng. Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định khả năng sản xuất enzyme của chủng HNL20 và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Theo nghiên cứu, Lecanicillium lecanii có thể được sử dụng như một biện pháp sinh học thay thế cho thuốc trừ sâu hóa học, giúp bảo vệ mùa màng mà không gây hại cho môi trường.

II. Khả năng sản xuất enzyme ngoại bào

Khả năng sản xuất enzyme ngoại bào của Lecanicillium lecanii HNL20 được đánh giá thông qua việc nuôi cấy trong môi trường PDB. Kết quả cho thấy, hoạt tính của các enzyme như cellulase, chitinase và protease phụ thuộc vào sự phát triển của hệ sợi và mật độ bào tử. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy có thể nâng cao đáng kể hoạt tính enzyme. Cụ thể, môi trường nuôi cấy cải tiến với các thành phần như rỉ mật và chiết xuất nấm men đã cho thấy sự gia tăng hoạt tính enzyme lên đến 70.237 U/ml cho cellulase. Điều này chứng tỏ rằng việc điều chỉnh các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng tích cực đến khả năng sản xuất enzyme của nấm.

III. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme

Nghiên cứu đã xác định nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của Lecanicillium lecanii HNL20, bao gồm nguồn carbon, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ và ion kim loại. Các thí nghiệm cho thấy, nguồn carbon như glucose và rỉ mật có tác động tích cực đến sự phát triển của nấm và hoạt tính enzyme. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm là từ 21 đến 24°C, trong khi pH từ 6 đến 7 cho thấy hoạt tính enzyme cao nhất. Ngoài ra, các ion kim loại như K+, Na+, Ca2+ cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, với các nồng độ khác nhau cho kết quả khác nhau. Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme trong tương lai.

IV. Giá trị và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về khả năng sản xuất enzyme ngoại bào của Lecanicillium lecanii HNL20 không chỉ có giá trị trong lĩnh vực sinh học mà còn có ứng dụng thực tiễn trong nông nghiệp. Việc phát triển các biện pháp sinh học như nấm Lecanicillium có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, từ đó bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Hơn nữa, việc sản xuất enzyme từ nấm có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như chế biến thực phẩm, sản xuất sinh học và xử lý chất thải. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm sinh học an toàn và hiệu quả trong nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nông nghiệp giữ vai trò thiết yếu trong nền kinh tế toàn cầu, tuy nhiên việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã và đang gây ra nhiều hệ lụy nghiêm trọng đến sức khỏe con người, làm mất cân bằng hệ sinh thái và gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí. Xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững và nông nghiệp hữu cơ theo các tiêu chuẩn Thực hành Nông nghiệp Tốt (GAP) đòi hỏi việc thay thế dần các hóa chất độc hại bằng các chế phẩm sinh học an toàn. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia (Lê Xuân Định & Đặng Bảo Hà, 2015), số lượng thuốc trừ sâu sinh học sản xuất trong nước mới chỉ chiếm khoảng 37,3% tổng lượng thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng, cho thấy năng lực nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp sạch trong nước vẫn còn nhiều dư địa phát triển.

Nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium lecanii (trước đây có tên là Verticillium lecanii) là một tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng có phổ ký sinh rộng trên nhiều bộ côn trùng gây hại như Homoptera (cánh đều), Coleoptera (cánh cứng), Orthoptera (cánh thẳng) và Lepidoptera (cánh vảy). Cơ chế xâm nhiễm của L. lecanii dựa trên việc tiết ra các enzyme ngoại bào phân giải lớp biểu bì bảo vệ (cuticle) của côn trùng như chitinase, protease và cellulase. Nhằm khai thác tiềm năng của chủng nấm này tại Việt Nam, đề tài "Nghiên cứu khả năng sản xuất enzyme ngoại bào của chủng nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium lecanii HNL20" (Study on the ability to produce extracellular enzymes of entomopathogenic fungus Lecanicillium lecanii HNL20) đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào (cellulase, protease, chitinase) của chủng Lecanicillium lecanii HNL20.
2. Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường (nguồn carbon, nguồn nitơ, ion kim loại, pH, nhiệt độ và dầu khoáng) đến hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng HNL20.
3. Xây dựng môi trường nuôi cấy cải tiến nhằm nâng cao hoạt tính enzyme ngoại bào của Lecanicillium lecanii HNL20.

Nhiệm vụ nghiên cứu

1. Xác định khả năng sản xuất phức hệ enzyme ngoại bào (chitinase, protease, cellulase) của L. lecanii HNL20 theo thời gian nuôi cấy kết hợp quan sát hình thái hệ sợi và mật độ bào tử.
2. Khảo sát thực nghiệm các yếu tố ngoại cảnh tác động đến hoạt tính của dịch enzyme thô thu nhận được.
3. Thiết lập công thức môi trường tối ưu và định lượng chính xác hoạt độ enzyme bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium lecanii HNL20 được lưu giữ và cung cấp bởi Phòng Thí nghiệm Hợp chất có Hoạt tính Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
• Phạm vi không gian: Phòng Thí nghiệm Hợp chất có Hoạt tính Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học (VAST).
• Phạm vi thời gian: Khóa luận thực hiện trong thời gian 6 tháng, hoàn thành và nghiệm thu vào tháng 01/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và đối tượng sâu hại mục tiêu

Lecanicillium lecanii thuộc ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae. Chu trình xâm nhiễm bắt đầu khi bào tử đính (conidia) bám dính vào lớp vỏ ngoài (epicuticle) của côn trùng ký chủ. Bào tử nảy mầm hình thành ống mầm dài và tiết ra phức hệ enzyme ngoại bào gồm aminopeptidase, lipase, esterase, protease, chitinase và cellulase để thủy phân thành phần cấu trúc của vỏ côn trùng:

• Chitinase: Thủy phân liên kết $\beta$-1,4-glycosidic trong phân tử chitin (thành phần chính của lớp vỏ ngoài côn trùng) giải phóng $N$-acetyl-D-glucosamine hoặc các đơn vị dimer (chitobiose).
• Protease: Cắt các liên kết peptide trong chuỗi protein vỏ cutin, điển hình là protease kiềm loại subtilisin (Pr1) và protease loại trypsin (Pr2), giúp sợi nấm xuyên sâu vào mô bào ký chủ.
• Cellulase: Đóng vai trò cung cấp nguồn cơ chất phân giải hỗ trợ quá trình phát triển của nấm trong môi trường tự nhiên.

Khóa luận phân tích khả năng ứng dụng của chủng nấm đối với hai đối tượng côn trùng gây hại phổ biến trên cây trồng nông nghiệp: rệp muội đào (Myzus persicae thuộc họ Aphididae) và rệp bông/rệp dưa (Aphis gossypii thuộc họ Aphididae), những loài gây chùn ngọn, xoăn lá và là vector truyền nhiều loại virus nguy hiểm như CMV, PVY, TEV.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Chủng L. lecanii HNL20 (Bảo quản Glycerol 30% ở -21°C)

• Nguồn dữ liệu và hóa chất: Dữ liệu thực nghiệm thu thập từ các mẻ lên men lỏng in vitro. Hóa chất sử dụng có nguồn gốc từ Việt Nam, Đức, Nhật Bản và Trung Quốc (D-glucosamine, L-tyrosine, Carboxymethyl cellulose - CMC, Chitosan, Casein, thuốc thử DNS, thuốc thử Folin-Ciocalteu, muối khoáng tinh khiết).

Nội dung chính theo từng chương

Part I & Part II: Đặt vấn đề và Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa cơ sở lý luận về phân loại học, chu trình sống, cơ chế sinh học phân hủy biểu bì côn trùng và phân bố địa lý của nấm ký sinh Lecanicillium lecanii. Nghiên cứu chỉ ra rằng nấm phân bố rộng rãi tại châu Á và châu Mỹ nhưng chưa được ghi nhận phân bố tự nhiên phổ biến ngoài môi trường tại Việt Nam do khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Phần tổng quan cũng phân tích tác hại của rệp Myzus persicae và Aphis gossypii, cấu trúc hóa học của chitin/chitosan, cũng như vai trò xúc tác của enzyme chitinase (các họ glycosyl hydrolase 18, 19, 20) và protease ngoại bào (Pr1, Pr2) trong cơ chế gây bệnh của nấm côn trùng.

Part III: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết hệ thống thiết bị (tủ cấy vô trùng Laminar, máy lắc điều nhiệt, máy đo quang phổ, máy ly tâm, máy đo pH), danh mục hóa chất, công thức các môi trường nuôi cấy (PDA, PDB, Môi trường cải tiến 1, Môi trường cải tiến 2) và quy trình chuẩn bị đĩa thạch khuếch tán chứa cơ chất đặc hiệu. Thiết lập các phương trình đường chuẩn độ quang: đường chuẩn glucose (đo tại 540 nm) cho cellulase, đường chuẩn D-glucosamine (đo tại 535 nm) cho chitinase và đường chuẩn tyrosine (đo tại 660 nm) cho protease.

Part IV: Kết quả nghiên cứu và Thảo luận

1. Động học sinh trưởng và hoạt tính enzyme theo thời gian nuôi cấy

Chủng L. lecanii HNL20 nuôi cấy trong môi trường PDB ở điều kiện 28°C, lắc 150 rpm, pH=6 cho thấy:

• Hệ sợi phát triển mạnh vào ngày thứ 5, đạt mật độ tối đa vào ngày thứ 6 (hệ sợi màu trắng, phân nhánh dài, bào tử hình elip nhỏ), sau đó mật độ sợi và lượng bào tử giảm dần vào các ngày thứ 7 và 8.
• Hoạt tính phân giải của cả 3 loại enzyme ngoại bào trên đĩa thạch đạt giá trị cao nhất tại ngày nuôi cấy thứ 6. Do đó, thời điểm 6 ngày được chọn làm mốc thu dịch enzyme cho toàn bộ các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.

2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính enzyme ngoại bào

• Nguồn carbon (bổ sung 2% w/v vào PDB): Rỉ mật đường (molasses) cho hiệu quả vượt trội hơn so với glucose và sucrose. Đường kính vòng phân giải ($D - d$) của mẫu bổ sung rỉ mật trên cơ chất CMC đạt 10 mm, chitosan đạt 14 mm và casein đạt 9 mm (so với đối chứng PDB lần lượt là 10 mm, 13 mm và 7 mm).
• Cao nấm men (Yeast extract): Khi bổ sung từ 1% đến 1,5% (w/v), hoạt tính phân giải của cả ba enzyme tăng từ 2 đến 2,5 lần so với đối chứng. Hoạt tính cellulase đạt cực đại ở nồng độ 1,5% yeast extract ($D - d = 16\text{ mm}$), chitinase đạt 17 mm ở nồng độ $\ge 1%$ (đối chứng chỉ đạt 8 mm), protease đạt cực đại ($13\text{ mm}$) ở nồng độ 0,25%.
• Muối amon $(NH_4)_2SO_4$: Ở nồng độ $>0,75%$ (w/v), hoạt tính cellulase tăng mạnh gấp 2,6 lần so với đối chứng không bổ sung (8 mm so với 3 mm), trong khi hoạt tính chitinase và protease chỉ giảm nhẹ khoảng 1 mm.
• Urea: Ở nồng độ 0,25% (w/v), urea làm tăng hoạt tính cellulase (10 mm so với 7 mm đối chứng) và chitinase (13 mm so với 7 mm đối chứng), nhưng hoạt tính protease giảm nhẹ (8 mm so với 10 mm). Nồng độ urea cao hơn 0,25% làm tăng hoạt tính cellulase lên khoảng 1,1 lần nhưng làm bất hoạt các enzyme còn lại.

3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và các yếu tố môi trường

• Độ bền nhiệt: Xử lý dịch enzyme thô trong 10 phút ở các mức nhiệt độ 50°C, 60°C, 70°C và 80°C. Trong khoảng 50°C – 70°C, hoạt tính của cả 3 enzyme chỉ giảm nhẹ từ 1 – 2 mm. Khi xử lý ở 80°C, hoạt tính giảm mạnh: cellulase còn 2 mm (đối chứng 11 mm), chitinase còn 6 mm (đối chứng 8 mm) và protease còn 7 mm (đối chứng 10 mm). Do đó, khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp của dịch enzyme thô HNL20 là dưới 70°C.
• Khảo sát pH, ion kim loại và dầu khoáng: Hoạt tính enzyme được ghi nhận ở các dải pH (3–8), ion kim loại ($K^+$, $Na^+$, $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$ ở 5–15 mM) và dầu khoáng SK Enspray 99EC ở nồng độ 0,2% (v/v) nhằm xác định các thông số phối chế tối ưu.

Kết quả và đóng góp

Số liệu định lượng hoạt tính enzyme trong môi trường cải tiến

Dựa trên kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, tác giả đã thiết lập hai công thức môi trường nuôi cấy cải tiến:

• Môi trường 1 (Medium 1): Khoai tây 200g, Glucose 20g, Rỉ mật 2% (w/v), Cao nấm men 1% (w/v), Urea 1,25% (w/v), $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 10 mM, $\text{MgSO}_4$ 10 mM, 1 lít nước, pH = 6.
• Môi trường 2 (Medium 2): Khoai tây 200g, Glucose 20g, $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 0,02% (w/v), $\text{NH}_4\text{NO}_3$ 0,01% (w/v), 1 lít nước, pH = 6.

Kết quả định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang (Spectrophotometry) sau 6 ngày nuôi cấy được tổng hợp trong bảng dưới đây:

Loại enzyme	Cơ chất phản ứng	Bước sóng đo ($\text{nm}$)	Hoạt độ trong Môi trường 1 ($\text{U/ml}$)	Hoạt độ trong Môi trường 2 ($\text{U/ml}$)
Cellulase	CMC 0,5%	540	70,300 (70,237)	57,488
Chitinase	Chitosan keo	535	0,057	0,034
Protease	Casein 2%	660	0,237	0,139

Đóng góp thực tiễn của đề tài

1. Xác lập động học sinh tổng hợp enzyme: Chứng minh mối tương quan thuận giữa sự phát triển hệ sợi, mật độ bào tử và khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng L. lecanii HNL20, xác định thời điểm thu nhận enzyme tối ưu là 6 ngày nuôi cấy.
2. Tối ưu hóa dinh dưỡng: Tìm ra nguồn cơ chất giá rẻ (rỉ mật 2%) và nguồn nitơ hữu cơ (cao nấm men 1 - 1,5%) giúp nâng cao hoạt tính enzyme ngoại bào lên 2 đến 2,5 lần so với môi trường PDB cơ bản.
3. Phát triển môi trường lên men cải tiến: Môi trường 1 với sự kết hợp của rỉ mật, cao nấm men, urea và các muối khoáng ($\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{MgSO}_4$) cho hiệu suất sinh tổng hợp cellulase đạt 70,3 U/ml, chitinase đạt 0,057 U/ml và protease đạt 0,237 U/ml, vượt trội rõ rệt so với môi trường 2.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Nghiên cứu được thực hiện hoàn toàn ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác 250 ml), chưa thực hiện quy mô lên men pilot dạng bồn khuấy (bioreactor).
• Các đánh giá hoạt tính enzyme mới dừng lại ở dịch thô (crude enzyme), chưa tiến hành tinh sạch phân đoạn từng loại enzyme để xác định khối lượng phân tử và cấu trúc động học chi tiết.
• Chưa tiến hành thử nghiệm sinh học trực tiếp trên đồng ruộng hoặc trong nhà lưới đối với các loài sâu hại sống (Myzus persicae, Aphis gossypii).

Hướng nghiên cứu tiếp

• Nghiên cứu tinh sạch và thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết từ dịch lên men của chủng L. lecanii HNL20.
• Đánh giá khả năng kết hợp giữa dịch enzyme ngoại bào và bào tử sống của nấm nhằm tạo chế phẩm sinh học phối hợp nâng cao độc lực diệt trừ rệp hại.
• Thử nghiệm độ tương thích của chế phẩm sinh học chủng HNL20 với các loại dầu khoáng bảo vệ thực vật và kiểm tra hiệu lực phòng trừ trên đồng ruộng thực tế.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành:

• Công nghệ Sinh học Vi sinh & Hóa sinh học: Tham khảo quy trình chuẩn độ quang hoạt tính các enzyme chitinase (DNS - 535 nm), cellulase (DNS - 540 nm) và protease (Folin-Ciocalteu - 660 nm) cùng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
• Bảo vệ Thực vật & Nông nghiệp Hữu cơ: Cung cấp thông số nuôi cấy và điều kiện tối ưu sinh khối/bào tử nấm ký sinh côn trùng làm tiền đề sản xuất thuốc trừ sâu sinh học thay thế hóa chất.

Câu hỏi thường gặp

1. Thời điểm nuôi cấy nào cho hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng HNL20 cao nhất?

Hoạt tính của cả ba enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase, protease) đạt mức cao nhất vào ngày nuôi cấy thứ 6 trên môi trường lỏng PDB (28°C, lắc 150 rpm). Đây cũng là thời điểm hệ sợi nấm phát triển tối đa và lượng bào tử đính sinh ra nhiều nhất trước khi suy giảm ở các ngày thứ 7 và 8.

2. Bổ sung nguồn carbon và nitơ nào giúp tăng cường hoạt tính enzyme ngoại bào tốt nhất?

Bổ sung 2% (w/v) rỉ mật đường làm tăng đường kính vòng phân giải trên cả ba cơ chất CMC, chitosan và casein. Về nguồn nitơ, cao nấm men ở nồng độ 1% – 1,5% (w/v) giúp gia tăng hoạt tính của cả 3 enzyme ngoại bào từ 2 đến 2,5 lần so với môi trường PDB đối chứng.

3. Dịch enzyme ngoại bào thô của chủng HNL20 có khả năng chịu nhiệt như thế nào?

Dịch enzyme thô duy trì hoạt tính ổn định khi xử lý nhiệt trong 10 phút từ 50°C đến 70°C (hoạt tính chỉ giảm nhẹ 1–2 mm đường kính phân giải). Tuy nhiên, khi nâng nhiệt độ lên 80°C, hoạt tính của cả ba enzyme bị suy giảm nghiêm trọng (cellulase chỉ còn 2 mm, chitinase còn 6 mm, protease còn 7 mm). Do đó, dịch enzyme thô được khuyến nghị làm việc ở nhiệt độ dưới 70°C.

4. Hoạt độ enzyme thu được từ Môi trường cải tiến 1 (Medium 1) đạt giá trị bao nhiêu?

Thông qua phép đo quang phổ hấp thụ, Môi trường cải tiến 1 (chứa khoai tây 200g, glucose 20g, rỉ mật 2%, cao nấm men 1%, urea 1,25%, $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 10 mM, $\text{MgSO}_4$ 10 mM) cho hoạt độ enzyme vượt trội: cellulase đạt 70,3 U/ml (hoặc 70,237 U/ml), chitinase đạt 0,057 U/ml và protease đạt 0,237 U/ml.

Kết luận

Khóa luận đã khảo sát thành công khả năng sinh tổng hợp ba enzyme ngoại bào quan trọng (cellulase, chitinase và protease) của chủng nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium lecanii HNL20. Nghiên cứu đã làm rõ động học sinh trưởng của hệ sợi, bào tử gắn liền với hoạt tính enzyme đạt đỉnh tại ngày nuôi cấy thứ 6, đồng thời xác định được tác động tích cực của rỉ mật đường, cao nấm men và các ion khoáng trong việc kích thích tiết enzyme. Công thức môi trường cải tiến 1 được xây dựng cho hoạt độ cellulase đạt 70,3 U/ml, chitinase đạt 0,057 U/ml và protease đạt 0,237 U/ml, cung cấp cơ sở khoa học và thực nghiệm quan trọng cho việc phát triển các chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY -------oOo------- GRADUATION THESIS STUDY ON THE ABILITY TO PRODUCE EXTRACELLULAR ENZYMES OF LECANICILLIUM LECANII HNL20 AND FACTORS AFFECTING THE EXO-ENZYMATIC ACTIVITY Student : Pham Manh Hung Department : Microbial Biotechnology Supervisor : Vu Van Hanh, Assoc. Prof : Nguyen Van Giang, Assoc. Prof HANOI, 01/2021 COMMITMENT I with this, declare that all the data and results that I have provided in this study are true, accurate, and not used in any other reports. I also assure that the literature cited in the thesis indicated the origin and all help is thankful.

Hanoi, January 2021 Pham Manh Hung i ACKNOWLEGDEMENT It is with great pride that I hereby present my graduation thesis. During this six- month long process, I have gained a lot of knowledge of this research and it has been beneficial to my development in furthering my career and my studies in the future. First and foremost, I would like to express absolute gratitude to teachers in the Faculty of Biotechnology and also the Department of Microbial Biology who have given me advantageous and valuable knowledge during time learning, practising and thesis. I had a lot of chances to develop professionally my skills in both academical and social environment.

I would like to express my appreciation to Dr. Nguyen Van Giang – Lecturer in the Faculty of Biotechnology. He not only has oriented themes, dedicated guide throughout the process of the thesis but also given me the in-time supporting to help me get many chances in my future career. I sincerely thank the staffs in the Functional Bio-compounds Laboratory, Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology for helping and providing the most favorable conditions for me during my thesis.

Especially, I extend my gratitude to Dr. Vu Van Hanh – Head of Functional Bio- compounds Laboratory for his valuable guidance and support on completion of this thesis. Finally, I would like to express profound thanks to my family and numerous friends who endured this long process with me, always offering support and love during the process of learning and research. Sincerely! ii CONTENTS COMMITMENT .iii LIST OF TABLES.

v LIST OF FIGURES. ix ABBREVIATION LIST. xv PART I: INTRODUCTION. Overview of Lecanicillium lecanii.

Morphology characteristics of L. Life cycle of L. Geographical distribution of L. 10 PART III: MATERIALS AND METHODS.

Materials and equipment. Location and time:. Screening the morphology, the density of conidia and studying on the activity of extracellular enzymes of HNL20. Studying on the elements affecting to the activity of L.

lecanii HNL20 extracellular. Determination the activity of chitinase through spectrophotometry. Determination the activity of cellulase through spectrophotometry. Determination the activity of protease through spectrophotometry.

21 PART IV: RESULTS. Evaluating effects (Carbon sources, nitrogen sources, metals ion, pH, temperature and petroleum oil) affect to the activity of exoenzymes. The morphology of hyphae, conidia and the exoenzyme activity of L. The results of testing exoenzyme’s activity of L.

lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added Carbon sources (2% (w/v) molasses, 2% (w/v) glucose and 2% (w/v) sucrose). The results of testing exoenzyme’s activity of L. lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added yeast extract. The results of testing exoenzyme’s activity of L.

lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added (NH4)2SO4. The results of testing exoenzyme’s activity of L. lecanii HNL20 cultured in PDB medium and PDB medium added Urea. The effects of temperature (50oC, 60oC, 70oC and 80oC) to the activity of L.

lecanii HLN20 crude enzyme. The effects of pH (pH=3,4,5,5,7 and 8) to the activity of L. lecanii HLN20 crude enzyme. The effects of petroleum oil (SK Enspray 99EC) at 0.2% (v/v) to the activity of L.

lecanii HLN20 crude enzyme. The effects of metal ion (K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Zn2+ and Cu2+) to the activity of L. lecanii HLN20 crude enzyme. The results of testing exoenzyme’s activity of L.

lecanii HNL20 cultured in improved medium. Determination the activity of extracellular enzymes through agar plate diffusion. Determination the activity of extracellular enzymes through spectrophotometry. CONCLUSSIONS AND SUGGESTTIONS.

51 v LIST OF TABLES Table 3.