Tổng quan nghiên cứu

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là kỹ thuật then chốt trong sinh học phân tử, cho phép nhân bản hàng triệu bản sao của đoạn DNA mục tiêu trong ống nghiệm. Theo ước tính, PCR được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh di truyền, xác định huyết thống, tách dòng gen và nghiên cứu đột biến. Để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác của PCR, enzyme DNA polymerase bền nhiệt đóng vai trò quan trọng, đặc biệt là Pfu DNA polymerase được phân lập từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus. Pfu DNA polymerase giữ được hơn 95% hoạt tính ở 95°C trong một giờ, đồng thời sở hữu hoạt tính đọc sửa 3’-5’ exonuclease giúp tăng độ chính xác tổng hợp DNA, với xác suất gắn sai nucleotide chỉ khoảng 1,3×10⁻⁶, cao hơn 8 lần so với Taq DNA polymerase.

Tuy nhiên, việc thu nhận enzyme Pfu DNA polymerase trực tiếp từ vi khuẩn ưa nhiệt gặp nhiều khó khăn do yêu cầu môi trường sinh trưởng đặc biệt và sản lượng enzyme thấp. Do đó, công nghệ protein tái tổ hợp trên Escherichia coli trở thành giải pháp ưu việt để sản xuất enzyme này với hiệu suất cao và chi phí hợp lý. Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng quy trình sản xuất và tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ E. coli sử dụng hệ vector pMAL-c5X kết hợp đuôi His-tag, nhằm tạo ra enzyme chất lượng cao phục vụ nghiên cứu sinh học phân tử trong nước. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2014-2015 tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, với phạm vi tập trung vào biểu hiện, tinh sạch và đánh giá hoạt tính của Pfu DNA polymerase tái tổ hợp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Cấu trúc và chức năng DNA polymerase họ B: Pfu DNA polymerase thuộc họ B, có cấu trúc gồm 5 vùng chính gồm N-terminal, exonuclease 3’-5’, lòng bàn tay, các ngón tay và ngón tay cái. Cấu trúc này hỗ trợ hoạt tính tổng hợp và sửa sai DNA, đặc biệt vùng exonuclease đóng vai trò quan trọng trong cơ chế đọc sửa lỗi.

  • Hoạt tính đọc sửa 3’-5’ exonuclease: Đây là cơ chế giúp Pfu DNA polymerase loại bỏ nucleotide gắn sai trong quá trình tổng hợp, nâng cao độ chính xác của PCR.

  • Công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli: Sử dụng vector pMAL-c5X cho phép tạo protein dung hợp với maltose-binding protein (MBP), giúp tăng khả năng hòa tan và dễ dàng tinh sạch qua cột sắc ký ái lực amylose. Đuôi His-tag được gắn thêm để tinh sạch bổ sung qua cột Ni²⁺, đảm bảo độ tinh khiết cao.

Các khái niệm chính bao gồm: DNA polymerase bền nhiệt, hoạt tính exonuclease, vector biểu hiện pMAL-c5X, His-tag, sắc ký ái lực, và PCR.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Chủng E. coli mang plasmid pET11a chứa gen mã hóa Pfu DNA polymerase được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. DNA genome của Listeria monocytogenes EGD-e được sử dụng làm khuôn thử hoạt tính enzyme.

  • Phương pháp phân tích:

    • Tách chiết plasmid bằng phương pháp chuẩn, kiểm tra bằng điện di gel agarose 1%.
    • Nhân đoạn gen mã hóa Pfu DNA polymerase bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, xác định trình tự gen bằng phương pháp Sanger.
    • Thiết kế vector biểu hiện pMAL-c5X-His-Pfu, ghép nối gen vào vector qua enzyme giới hạn NcoI và XmnI, biến nạp vào E. coli Top 10 để chọn dòng tái tổ hợp.
    • Biểu hiện protein trong E. coli BL21(DE3) và BL21(DE3) pLysS, cảm ứng bằng IPTG.
    • Phân tích protein bằng SDS-PAGE 8-10%, tinh sạch protein qua sắc ký ái lực cột amylose và Ni²⁺ Magbeads.
    • Kiểm tra hoạt tính enzyme bằng phản ứng PCR nhân đoạn DNA 234 bp và 2,5 kb.
    • Timeline nghiên cứu kéo dài khoảng 12 tháng, từ tách chiết gen, xây dựng vector, biểu hiện protein đến tinh sạch và đánh giá hoạt tính.

  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: Sử dụng các dòng E. coli chuẩn có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp cao, lựa chọn dòng biểu hiện tối ưu dựa trên mức độ biểu hiện và hoạt tính enzyme.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Xác định trình tự gen mã hóa Pfu DNA polymerase:

    • Plasmid tách chiết từ E. coli mang vector pET11a chứa gen Pfu DNA pol có kích thước khoảng 2,5 kb, được xác nhận bằng PCR với cặp mồi T7-F/R và các cặp mồi đặc hiệu khác.
    • Trình tự gen giải mã có độ tương đồng 100% với trình tự gen Pfu DNA pol trên ngân hàng gen quốc tế (mã số KF836420).

  2. Thiết kế và xây dựng vector biểu hiện pMAL-c5X-His-Pfu:

    • Đoạn gen Pfu DNA pol được nhân bản bằng PCR, gắn thêm đuôi 8His và glycine để tạo tính linh động, sau đó ghép nối vào vector pMAL-c5X qua enzyme NcoI và XmnI.
    • Vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli Top 10, sàng lọc bằng PCR cho thấy khoảng 50% khuẩn lạc mang gen đích.
    • Giải trình tự xác nhận đoạn gen chèn đúng khung đọc và không có đột biến.

  3. Biểu hiện protein Pfu DNA polymerase tái tổ hợp:

    • Hai dòng E. coli BL21(DE3) và BL21(DE3) pLysS được sử dụng để biểu hiện protein.
    • Sau cảm ứng IPTG 5 giờ, protein dung hợp MBP-Pfu có kích thước khoảng 130 kDa được phát hiện rõ trên gel SDS-PAGE, chiếm khoảng 30-40% tổng protein tế bào.
    • Dòng BL21(DE3) pLysS cho mức biểu hiện cao hơn khoảng 15% so với BL21(DE3).

  4. Tinh sạch protein và kiểm tra hoạt tính:

    • Protein dung hợp được tinh sạch qua cột amylose, sau đó cắt tách MBP bằng Factor Xa và tinh sạch Pfu DNA pol qua cột Ni²⁺ Magbeads.
    • Protein thu được có độ tinh khiết cao, thể hiện rõ trên gel SDS-PAGE với băng protein khoảng 91 kDa.
    • Hoạt tính enzyme được kiểm tra qua PCR nhân đoạn DNA 234 bp và 2,5 kb, sản phẩm PCR rõ ràng, chứng tỏ enzyme tái tổ hợp giữ được hoạt tính tổng hợp DNA.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng vector pMAL-c5X kết hợp đuôi His-tag là phương pháp hiệu quả để biểu hiện và tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp trong E. coli. Việc gắn MBP giúp tăng khả năng hòa tan protein, giảm hiện tượng tạo thể kết tủa, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho tinh sạch qua cột amylose với chi phí thấp. Đuôi His-tag hỗ trợ tinh sạch bổ sung qua cột Ni²⁺, nâng cao độ tinh khiết của enzyme.

So với các nghiên cứu trước đây sử dụng hệ vector pET và các phương pháp tinh sạch phức tạp như cột P11 phosphocellulose hay Heparin Sepharose, quy trình này đơn giản hơn, tiết kiệm chi phí và thời gian, đồng thời thu được lượng enzyme cao với hoạt tính ổn định. Kết quả hoạt tính PCR chứng minh enzyme tái tổ hợp có khả năng kéo dài chuỗi DNA hiệu quả, phù hợp cho các ứng dụng sinh học phân tử đòi hỏi độ chính xác cao.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện protein giữa các dòng E. coli, bảng phân tích độ tinh khiết protein qua SDS-PAGE và hình ảnh gel agarose thể hiện sản phẩm PCR nhân đoạn DNA mục tiêu.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện protein: Điều chỉnh nồng độ IPTG, thời gian cảm ứng và nhiệt độ nuôi cấy để tăng hiệu suất biểu hiện Pfu DNA polymerase, hướng tới tăng sản lượng enzyme lên ít nhất 20% trong vòng 6 tháng. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

  2. Phát triển quy trình tinh sạch quy mô lớn: Áp dụng quy trình sắc ký ái lực kết hợp MBP và His-tag trên hệ thống tự động để nâng cao độ tinh khiết và thu hồi enzyme, giảm chi phí sản xuất trong vòng 1 năm. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

  3. Đánh giá hoạt tính enzyme trong các ứng dụng thực tế: Thử nghiệm enzyme trong các phản ứng PCR phức tạp như nhân bản gen dài, tạo đột biến có hướng, nhằm khẳng định tính ổn định và độ chính xác trong môi trường đa dạng. Thời gian thực hiện: 6 tháng. Chủ thể: các phòng thí nghiệm sinh học phân tử.

  4. Chuyển giao công nghệ sản xuất enzyme: Hợp tác với các doanh nghiệp công nghệ sinh học để sản xuất và thương mại hóa Pfu DNA polymerase tái tổ hợp, góp phần giảm giá thành và nâng cao khả năng tiếp cận enzyme chất lượng cao trong nước. Thời gian: 1-2 năm. Chủ thể: Viện và doanh nghiệp liên kết.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ gen: Sử dụng quy trình biểu hiện và tinh sạch enzyme để phục vụ các nghiên cứu về nhân bản gen, đột biến gen và biểu hiện protein.

  2. Phòng thí nghiệm chẩn đoán y sinh: Áp dụng enzyme Pfu DNA polymerase tái tổ hợp có độ chính xác cao trong các xét nghiệm PCR chẩn đoán bệnh di truyền và nhiễm trùng.

  3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình sản xuất enzyme tái tổ hợp để phát triển sản phẩm thương mại, giảm chi phí nhập khẩu enzyme ngoại.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học: Học tập quy trình thực nghiệm, kỹ thuật phân tích và ứng dụng công nghệ tái tổ hợp trong sản xuất enzyme.

Câu hỏi thường gặp

  1. Pfu DNA polymerase có ưu điểm gì so với Taq DNA polymerase?
    Pfu DNA polymerase có hoạt tính đọc sửa 3’-5’ exonuclease giúp giảm sai sót trong quá trình tổng hợp DNA, với tỷ lệ lỗi thấp hơn khoảng 8 lần so với Taq DNA polymerase, phù hợp cho các ứng dụng đòi hỏi độ chính xác cao như tạo đột biến có hướng.

  2. Tại sao sử dụng vector pMAL-c5X trong biểu hiện protein?
    Vector pMAL-c5X cho phép tạo protein dung hợp với maltose-binding protein (MBP), giúp tăng khả năng hòa tan protein tái tổ hợp, đồng thời dễ dàng tinh sạch qua cột sắc ký ái lực amylose với chi phí thấp và hiệu quả cao.

  3. Làm thế nào để kiểm tra hoạt tính của Pfu DNA polymerase tái tổ hợp?
    Hoạt tính được đánh giá qua phản ứng PCR nhân đoạn DNA mục tiêu (ví dụ 234 bp và 2,5 kb), sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di gel agarose để xác định khả năng kéo dài chuỗi và độ đặc hiệu của enzyme.

  4. Tại sao cần gắn thêm His-tag vào protein?
    His-tag giúp protein tái tổ hợp dễ dàng tinh sạch qua cột sắc ký ái lực Ni²⁺, nâng cao độ tinh khiết của enzyme, đồng thời không ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của Pfu DNA polymerase.

  5. Quy trình tinh sạch enzyme có thể áp dụng cho quy mô công nghiệp không?
    Quy trình sử dụng kết hợp sắc ký ái lực amylose và Ni²⁺ có thể được mở rộng quy mô, đặc biệt khi sử dụng hệ thống tự động, giúp tăng hiệu suất thu hồi enzyme và giảm chi phí sản xuất trong công nghiệp.

Kết luận

  • Đã xác định chính xác trình tự gen mã hóa Pfu DNA polymerase với độ tương đồng 100% so với trình tự quốc tế.
  • Thiết kế và xây dựng thành công vector biểu hiện pMAL-c5X-His-Pfu, biểu hiện hiệu quả protein tái tổ hợp trong E. coli BL21(DE3) và BL21(DE3) pLysS.
  • Quy trình tinh sạch kết hợp sắc ký ái lực amylose và Ni²⁺ cho ra enzyme tinh khiết, giữ được hoạt tính tổng hợp DNA cao.
  • Enzyme tái tổ hợp có khả năng nhân đoạn DNA dài và ngắn trong PCR với độ chính xác và hiệu quả cao.
  • Đề xuất tối ưu hóa biểu hiện, mở rộng quy mô tinh sạch và ứng dụng enzyme trong nghiên cứu và công nghiệp.

Tiếp theo, nghiên cứu sẽ tập trung vào tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và phát triển quy trình tinh sạch quy mô lớn. Đề nghị các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp công nghệ sinh học phối hợp để chuyển giao và ứng dụng công nghệ sản xuất enzyme này. Để biết thêm chi tiết và hợp tác nghiên cứu, vui lòng liên hệ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.