MỞ ĐẦU Hiện nay PCR là một kỹ thuật phô biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm lên hàng triệu bản sao. Kỹ thuật này có ứng dụng rất nhiều trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: chấn đoán bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống. Do tính chất lặp lại nhiều chu kỳ phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau, đặc biệt là sự biến tính DNA ở 95°C nên PCR đòi hỏi phải có các enzyme DNA polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác quá trình nhân bản DNA được thực hiện dễ dàng và đặc hiệu. Pfu DNA polymerase dugc tach từ vi khuẩn cô siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus sinh trưởng tối ưu ở 100°C.
Pfu DNA polymerase cuc ky bén nhiét, van giữ được hơn 95% hoạt d6 ban dau 6 95°C trong mét gid. Ngoai hoat tinh tong hop mach Pfu DNA polymerase còn có hoạt tính đọc stra 3’- 5’ exonuclease lam tang dé chính xác của quá trình tổng hợp DNA. Hién nay Pfu DNA polymerase thong mại có xác suất gắn sai một nucleotide khoảng 1,3. Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA của Pƒ¿ DNA polymerase cao hon nhiéu so voi Tag DNA polymerase va duge xem 1a mét trong sé it enzyme cé tốc độ tổng hợp ít lỗi nhất trong tat cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu.
Chính vi vay, Pfu DNA polymerase dugc sit dung phé bién dé khuyéch dai các sản phẩm dùng cho mục đích nhân dòng, biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến cũng như tổng hợp gen [25]. Pfu DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận enzyme nay từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết. Tuy vậy, việc thu nhận chế phâm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là không đơn giản vì các vi khuân này thường yêu cầu môi trường sinh trưởng đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp. Trên thế giới đã có nhiều các công trình khoa học nghiên cứu va tinh sach Pfu DNA polymerase tái tổ hợp nhưng vẫn gặp khó khăn do sử dụng các biện pháp tinh sạch chưa tối ưu như Heparin có giá thành đắt [22], cột PII phosphocellulose và cột mono Q qui trình sử dụng phức tạp [12].
Ở Việt Nam cho đến nay chỉ có công trình nghiên cứu sản xuất Pƒ¿ DNA pol từ E. coli của Giáo sư Phan Tuấn Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 1 Nghĩa được thực hiện vào năm 2005 với qui trình tĩnh sạch qua sắc ký ái lực với Ni”! và Heparin Sepharose [1, 2]. Tuy nhién Pfu DNA pol tao ra lai 6 dang dung hop voi 20 a.a của vector nên có thể ảnh hưởng đến khả năng kéo dài DNA trong phản ứng PCR và hơn nữa qui tình tỉnh sạch bằng Heparin khá tốn kém mà lại không đặc hiệu. Trước những nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sạch để thu được Pfu DNA pol tinh khiét, hién nay có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng hòa tan của protein tái tổ hợp trong tế bào E.
coli, cũng như khả năng tính sạch cao khi sử dụng hệ biểu hiện tạo hexahistidine-tagøed maltose-binding protein qua việc sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL [5, 39]. PMAL là hệ vector biểu hiện cho phép protein tạo ra ở trạng thái tan do được dung hợp với maltose - binding proein (MBP). Ngoài khả năng tạo dạng tan của protein, MBP có ái lực với amylose nên có thể dễ dàng tỉnh sạch protein dung hợp qua viêc sử dụng cột amylose. Điểm cắt của Factor Xa ngay trước Pƒ¿ DNA pol giúp hoàn nguyên Pƒ/¿ DNA pol.
Bên cạnh đó việc sử dụng Histag để tỉnh sạch bằng NÉ? ở đầu N lại không ảnh hưởng đến hoạt tinh cua Pfu DNA tai t6 hop [15]. Với những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL kết hợp đuôi His để thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất, tỉnh sạch Pƒu DNA polymerase tái tổ hợp từ Eseherichia eoli°? với mục tiêu sản xuất Pu DNA polymerase chất lượng cao góp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước. PHAN 1: TONG QUAN TAI LIEU 1. Tống quan vé DNA polymerase Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 2 DNA polymerase là nhóm enzyme xtc tac cho sự tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các cơ chất là DNA sợi đơn làm khuôn, cặp môi, các deoxyribonueleoside triphosphat (đNTPs) và trong môi trường có ion Mg?*.
Mỗi là một đoạn oligonucleotide dài từ 5 đến vài chục nucleotide có bản chất DNA hoặc RNA. Trong điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp, DNA polymerase kéo dài môi theo hướng 5°— 3’ bang cách nỗi các nucleotide qua liên kết phosphodiester theo trình tự bé sung với sợi làm khuôn tạo nên chuỗi DNA mạch kép. Ngoài hoạt tính kéo đài chuỗi oligonueleotide hay còn được gọi là hoạt tính DNA polymerase, một số DNA polymerase còn có hoạt tính của nuclease với vai trò sửa chữa hoặc giúp cho quá trình tổng hợp DNA được thực hiện chính xác. Trên thực tế dé dam bao tinh chuân xác cho quá trình sao chép DNA tế bào phải sử dụng không chỉ một loại DNA polymerase [8, 20, 25].
DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn Cho đến nay, rất nhiều loại DNA polymerase (DNA pol) khác nhau ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đã được phát hiện và nghiên cứu kỹ về tính chất, cấu trúc cũng như chức năng. Ở sinh vật nhân sơ điển hình là E. coli có tới 5 DNA pol khác nhau và được ký hiệu là DNA pol I, H, II, IV và V. Ở sinh vật nhân chuẩn các DNA pol được phát hiện sớm nhất là DNA pol a, B, ö, e và y.
Trong những năm gần đây, một loạt các DNA pol mới cũng được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn, đó là các DNA pol có khả năng sửa chữa các vị trí hỏng như DNA pol €, DNA pol n, DNA pol t, DNA pol k, Rev] và một nhóm các DNA pol khác duge goi la DNA pol 8, DNA pol 4, DNA pol tu, DNA pol ø, DNA pol ® thực hiện các chức năng khác. Việc phát hiện và nghiên cứu tính chất của các DNA pol khác nhau đã khẳng định rằng một loại DNA pol có thê không chỉ có một chức năng và quá trình tổng hợp DNA trong các cơ thê có thê cần đến không chỉ một DNA pol, mà tế bào có thê sử dụng đồng thời một số DNA pol khác nhau cùng thực hiện một chức năng [ 14]. Phần lớn các DNA pol ở dạng phức hệ gồm nhiều chuỗi polypeptide chứa các tiêu đơn vị chức năng khác nhau, trong đó không thê thiếu tiểu don vi polymer hoa. Cac tiéu đơn vị khác chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc tác khác ví dụ họat tính đọc sửa 3 ’-5’ exonuclease, 5’-3’ exonuclease, hoạt tính tổng hợp các mỗi RNA (primase) hay tương tác với yếu tô sao chép, phối hợp với kháng nguyên nhân tế bao đang phân hóa (proliferating Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 3 cell nuclear antigen - PCNA) với mục đích cuối cùng là làm cho quá trình tông hợp DNA diễn ra nhanh chóng và chính xác [20].
Dựa vào tính tương đồng về trình tự và sự giống nhau về cấu trúc, các DNA pol được chia thành 7 họ khác nhau là: A, B, C, D, X, Y và RT [40]. Mặc dù các DNA pol ở các họ khác nhau có sự sai khác về mặt cấu trúc nhưng chúng cũng có một vài đặc điểm chung, chúng cuộn gấp thành hình dạng giống với bàn tay phải của người bao gồm 3 vùng khác biệt: “lòng bàn tay” (palm), “ngón tay cái” (thumb) và “các ngón tay” (fingers). Trên cơ sở trình tự của DNA pol ơ, người ta đã phát hiện có 6 trình tự (-VD mang tính bảo thủ cao trên các DNA pol ở cả sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus với trật tự trên chuỗi polypeptide là IV-II-VI-II-I-V, còn khoảng cách giữa các trình tự bảo thủ là khác nhau ở các loài khác nhau. Trình tự I nằm ở vùng “lòng bàn tay” gần với vùng “ngón tay cái” và chứa một trong các gốc axit aspartic bảo thủ tạo thành trung tâm xúc tác của tất cả các DNA pol họ B đã biết (với motif YGDTDS).
Axit aspartic khác thuộc trình tự II có dạng DxxSLYPS nằm ở đầu của lá gấp B cũng thuộc vùng “lòng bàn tay”. Thuộc vùng này còn có SLYP-II mang tính bảo thủ cao, giữ vai trò quan trọng cho quá trình liên kết dNTP. Mặc dù các motif này là tuyệt đối bảo thủ ở các dưới họ DNA pol œ và DNA pol ð nhưng ở DNA pol e lại có sự khác nhau đáng ké, motif trinh tu I cla DNA pol e là ELDTDG còn trình tự II là DxxAMYPN. Các gốc khác có vai trò trong quá trình liên kết dNTP nam 6 trình ty III và chúng cuộn gấp thành xoắn ơ nằm ở đưới vùng “các ngón tay”.
Trình tự IV nằm ở đầu N thuộc vung có hoat tinh 3’- 5’ exonuclease. Hai trinh tu bảo thủ khác V và VI tương ứng nằm ở các dưới vùng “ngón tay cái” và “các ngón tay” [20, 24]. Mức độ bảo thủ cao về trình tự và cầu trúc của các vùng giữa các DNA pol sinh vật nhân chuân, sinh vật nhân sơ và virus chứng tỏ các DNA pol này xuất phát từ một gen tổ tiên chung. Cấu trúc của chúng đã được tối ưu hoá qua quá trình tiến hoá để thích hợp với các chức năng chuyên hoá mà mỗi DNA pol thực hiện trong tế bào.
Các vùng bảo thủ nhất chịu trách nhiệm cho các chức năng xúc tác cơ bản và cần thiết, trái lại các phần khác nhau giữa các DNA pol tiến hóa một cách độc lập để thực hiện các vai trò chuyên biệt [14,20]. Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 4 Việc ra đời và ứng dụng của kỹ thuật PCR để nhân bản gen in vitro đã tạo ra sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu đến các DNA pol bền nhiệt. Hàng loạt DNA pol bền nhiệt từ các vi khuẩn ưa nhiệt đã được phát hiện, nghiên cứu và sử dụng cho PCR cũng như các nghiên cứu khác của sinh học phân tử. Hầu hết các DNA pol này đều hoạt động tốt ở nhiệt độ cao và bền với nhiệt.