Luận án tiến sĩ: Tối ưu điều kiện biểu hiện gen nattokinase trong Bacillus subtilis BD170

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp, góp phần vào công nghệ sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Anh Thư
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Hoàng Lộc
• Trường học: Đại học Huế
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tối Ưu Biểu Hiện Gen Nattokinase Trong Bacillus subtilis BD170
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thừa Thiên Huế

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU VÀ NATTOKINASE
• 1.1.1. Đặc điểm của nattokinase
• 1.1.2. Nguồn sản xuất nattokinase
• 1.1.2.1. Vi khuẩn Bacillus
• 2. CHƯƠNG 2: BIỂU HIỆN Bacillus subtilis
• 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
• 2.2. Biểu hiện vector biểu hiện ở Bacillus
• 2.3. Biểu hiện tiết ở Bacillus
• 3. CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG Bacillus subtilis TRONG SẢN XUẤT ENZYME TÁI TẠO
• 3.1. Tinh sạch enzyme bằng hệ 2 pha nước
• 3.1.1. Cấu tạo và đặc tính của hệ 2 pha nước
• 3.1.2. Ứng dụng hệ 2 pha trong tinh sạch enzyme
• 4. CHƯƠNG 4: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 4.2. Phương pháp nghiên cứu
• 5. CHƯƠNG 5: PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis
• 5.1. Khuếch đại gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus
• 5.2. Tạo dòng gen nattokinase trong vector pCR®2
• 5.3. Tạo dòng gen nat05 và natC10 trong Bacillus subtilis BD170
• 6. CHƯƠNG 6: BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TẠO TRONG Bacillus subtilis BD170
• 6.1. Biểu hiện gen mã hóa nattokinase
• 6.2. Ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin
• 6.3. Thí nghiệm khả năng phân giải fibrin trong máu bằng nattokinase tái tạo
• 6.4. Tinh sạch nattokinase tái tạo bằng hệ hai pha nước
• 7. CHƯƠNG 7: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Nattokinase

Nattokinase là một enzyme quan trọng, được sản xuất chủ yếu từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Enzyme này có khả năng phân hủy fibrin, một protein chính trong quá trình đông máu. Nattokinase được biết đến với vai trò trong việc điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch, như nhồi máu cơ tim và đột quỵ. Nghiên cứu cho thấy nattokinase có thể làm giảm nguy cơ hình thành cục máu đông bằng cách phân hủy fibrin trong máu. Điều này làm cho nattokinase trở thành một ứng cử viên tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm chức năng hỗ trợ sức khỏe tim mạch. Theo các nghiên cứu, nattokinase có thể được chiết xuất từ các sản phẩm lên men như natto, một món ăn truyền thống của Nhật Bản. Việc tối ưu hóa biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 sẽ giúp tăng cường sản xuất enzyme này, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

II. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện gen

Quá trình tối ưu hóa điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 bao gồm việc điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ, pH, và nồng độ của các chất dinh dưỡng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy có thể ảnh hưởng đáng kể đến năng suất sản xuất enzyme. Việc sử dụng công nghệ sinh học hiện đại, như kỹ thuật tái tổ hợp DNA, cho phép tạo ra các dòng vi khuẩn có khả năng biểu hiện nattokinase với hiệu suất cao hơn. Các thí nghiệm cho thấy rằng việc sử dụng môi trường nuôi cấy tối ưu có thể làm tăng đáng kể hoạt tính của nattokinase, từ đó nâng cao khả năng phân hủy fibrin trong máu. Điều này không chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu mà còn trong ứng dụng thực tiễn, khi mà nhu cầu về các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe tim mạch ngày càng tăng.

III. Phân tích gen và sản xuất nattokinase

Phân tích gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 cho phép xác định các yếu tố di truyền ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Việc tạo dòng gen nattokinase và đưa vào vector biểu hiện giúp tăng cường khả năng sản xuất enzyme trong môi trường nuôi cấy. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các vector biểu hiện thích hợp có thể làm tăng đáng kể năng suất sản xuất nattokinase. Hơn nữa, việc phân tích trình tự gen và protein của nattokinase giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của enzyme này. Điều này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu cơ bản mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm chức năng từ nattokinase, phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nattokinase

Nattokinase có nhiều ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong việc điều trị các bệnh liên quan đến đông máu. Enzyme này không chỉ giúp phân hủy fibrin mà còn có khả năng làm giảm huyết áp và cải thiện lưu thông máu. Nghiên cứu cho thấy nattokinase có thể được sử dụng như một liệu pháp bổ sung trong điều trị bệnh tim mạch, giúp giảm nguy cơ hình thành cục máu đông. Hơn nữa, việc sản xuất nattokinase từ Bacillus subtilis BD170 có thể tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào cho các sản phẩm chức năng, từ đó đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất nattokinase không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lý tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn cầu, với khoảng 17,7 triệu người chết mỗi năm theo báo cáo của WHO. Các rối loạn như nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu, tắc nghẽn mạch máu và các bệnh huyết khối khác đều liên quan mật thiết đến sự mất cân bằng trong quá trình phân hủy fibrin – thành phần chính của cục máu đông. Nattokinase, một enzyme serine protease được phân lập từ vi khuẩn Bacillus subtilis trong thực phẩm lên men Natto của Nhật Bản, đã được chứng minh có khả năng phân hủy fibrin mạnh mẽ, hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối và cải thiện sức khỏe tim mạch.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là phân lập và tạo dòng gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên, đồng thời tối ưu hóa điều kiện biểu hiện enzyme này trong dòng tái tổ hợp Bacillus subtilis BD170. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bệnh viện Đại học Khoa học, Đại học Huế trong năm 2023-2024, nhằm cung cấp nguồn enzyme tái tổ hợp chất lượng cao phục vụ cho các ứng dụng y học và công nghiệp.

Việc phát triển công nghệ biểu hiện và tinh sạch nattokinase có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme, giảm chi phí và mở rộng ứng dụng trong điều trị các bệnh lý tim mạch, huyết khối, cũng như các lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ enzyme. Nghiên cứu góp phần bổ sung dữ liệu khoa học về biểu hiện protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis, đồng thời phát triển quy trình tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật há hai pha nước, giúp tăng độ tinh khiết và hoạt tính enzyme.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Lý thuyết về enzyme serine protease: Nattokinase thuộc nhóm serine protease, có trung tâm hoạt động gồm ba amino acid Asp32, His64 và Ser221, chịu trách nhiệm xúc tác phân hủy fibrin. Cấu trúc 3D của enzyme gồm 9 chuỗi xoắn α và các vị trí liên kết calcium giúp ổn định cấu trúc và hoạt tính enzyme.

• Mô hình biểu hiện protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis: Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương có khả năng tiết protein mạnh ra môi trường, thuận lợi cho sản xuất enzyme tái tổ hợp. Vector biểu hiện pHT43 với promoter Pspac và tín hiệu peptide AmyQ được sử dụng để điều khiển biểu hiện gen nattokinase.

• Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng hệ thống há hai pha nước (ATPS): Kỹ thuật này sử dụng sự phân tách pha giữa polyethylene glycol (PEG) và muối vô cơ (potassium phosphate) để tách và tinh sạch enzyme dựa trên tính chất hòa tan và kích thước phân tử, giúp thu được enzyme có độ tinh khiết cao với hiệu suất thu hồi lớn.

Các khái niệm chính bao gồm: gen mã hóa nattokinase (aprN), vector biểu hiện pHT43, Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp, hoạt tính phân hủy fibrin, và hệ thống há hai pha nước PEG/potassium phosphate.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: DNA tổng số được tách chiết từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10. Gen mã hóa nattokinase được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu NatF và NatR, sau đó được cloned vào vector pCR®2.1 và chuyển vào E. coli TOP10 để nhân bản.

• Tạo dòng tái tổ hợp: Gen nattokinase được cắt và chuyển vào vector biểu hiện pHT43, sau đó biến nạp vào Bacillus subtilis BD170 để biểu hiện enzyme tái tổ hợp.

• Phân tích hoạt tính enzyme: Hoạt tính phân hủy fibrin của nattokinase được đánh giá bằng phương pháp zymogram và các thử nghiệm phân hủy fibrin trong máu đông.

• Tinh sạch enzyme: Sử dụng hệ thống há hai pha nước PEG 6000 và potassium phosphate 15% (pH 8) để tinh sạch nattokinase từ dịch nuôi cấy. Hiệu suất thu hồi và độ tinh khiết enzyme được xác định bằng hoạt tính enzyme và SDS-PAGE.

• Timeline nghiên cứu: Quá trình thực hiện kéo dài trong năm 2023-2024, bao gồm các giai đoạn tách chiết gen, tạo dòng tái tổ hợp, biểu hiện enzyme, tinh sạch và đánh giá hoạt tính.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Sử dụng hai chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10 làm mẫu nghiên cứu chính, lựa chọn Bacillus subtilis BD170 làm vật chủ biểu hiện do khả năng tiết protein mạnh và ổn định.

• Phương pháp phân tích: Kỹ thuật PCR, điện di gel agarose và SDS-PAGE, phân tích hoạt tính enzyme bằng phương pháp zymogram và thử nghiệm phân hủy fibrin, phân tích hiệu suất tinh sạch enzyme bằng các chỉ số thu hồi và độ tinh khiết.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và khuếch đại gen nattokinase: Gen aprN mã hóa nattokinase được khuếch đại thành công từ chủng Bacillus subtilis N05 và C10 với kích thước khoảng 900 bp, xác nhận bằng điện di gel agarose. Sản phẩm PCR tinh sạch đạt độ tinh khiết cao, phù hợp cho bước cloning.

2. Tạo dòng tái tổ hợp và biểu hiện enzyme: Gen aprN được cloned vào vector pHT43 và biến nạp thành công vào Bacillus subtilis BD170. Sau khi cảm ứng bằng IPTG 1 mM ở 37°C, hoạt tính nattokinase trong dịch nuôi cấy đạt 848,52 IU/mL sau 4 giờ lên men, tăng gấp khoảng 5 lần so với chủng tự nhiên.

3. Tinh sạch enzyme bằng hệ thống há hai pha nước: Sử dụng PEG 6000 20% kết hợp potassium phosphate 15% (pH 8) cho hiệu suất thu hồi enzyme đạt khoảng 80%, độ tinh khiết tăng lên 6,63 lần so với dịch nuôi cấy ban đầu. Hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch đạt 11507,92 IU/mg protein.

4. Đặc điểm hoạt tính enzyme: Nattokinase tái tổ hợp có khả năng phân hủy fibrin mạnh mẽ, thể hiện qua các băng phân giải fibrin trên gel zymogram với các khối lượng phân tử 37, 27 và 21 kDa. Enzyme hoạt động tối ưu ở pH 8 và nhiệt độ 39°C, phù hợp với điều kiện sinh lý.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc phân lập và biểu hiện gen nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên trong dòng tái tổ hợp BD170 là khả thi và hiệu quả. Hoạt tính enzyme tăng đáng kể so với chủng gốc, chứng tỏ hệ thống biểu hiện và cảm ứng IPTG hoạt động tốt. Kỹ thuật tinh sạch bằng há hai pha nước PEG/potassium phosphate đã được tối ưu, mang lại hiệu suất thu hồi cao và độ tinh khiết enzyme phù hợp cho ứng dụng y sinh.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, hoạt tính nattokinase thu được tương đương hoặc cao hơn so với các dòng tái tổ hợp khác như B. subtilis WB800N hay các chủng Bacillus subtilis natto truyền thống. Điều này khẳng định tiềm năng của Bacillus subtilis BD170 trong sản xuất enzyme tái tổ hợp quy mô công nghiệp.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính enzyme theo thời gian lên men, bảng so sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh khiết enzyme trước và sau tinh sạch, cũng như hình ảnh gel SDS-PAGE và zymogram minh họa các băng protein và hoạt tính phân hủy fibrin.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình lên men: Điều chỉnh nồng độ IPTG, thời gian cảm ứng và điều kiện môi trường (pH, nhiệt độ) nhằm tăng hoạt tính nattokinase lên ít nhất 20% trong vòng 6 tháng. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu và phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

2. Mở rộng quy mô sản xuất: Áp dụng quy trình biểu hiện và tinh sạch đã tối ưu vào quy mô pilot 10-100 lít để đánh giá tính ổn định và hiệu quả sản xuất enzyme trong 1 năm. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm và đối tác công nghiệp.

3. Nghiên cứu ứng dụng lâm sàng: Thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn của nattokinase tái tổ hợp trong điều trị bệnh huyết khối trong 2-3 năm tới. Chủ thể thực hiện: các trung tâm nghiên cứu y sinh và bệnh viện.

4. Phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng: Kết hợp nattokinase tái tổ hợp vào các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ sức khỏe tim mạch, đồng thời nghiên cứu tính ổn định và sinh khả dụng của enzyme trong sản phẩm trong vòng 1 năm. Chủ thể thực hiện: doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Học hỏi quy trình phân lập gen, tạo dòng tái tổ hợp và kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng há hai pha nước, áp dụng cho các nghiên cứu enzyme khác.

2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và dược phẩm: Áp dụng công nghệ biểu hiện và tinh sạch nattokinase để phát triển sản phẩm enzyme chất lượng cao, giảm chi phí sản xuất.

3. Bác sĩ và chuyên gia y học lâm sàng: Hiểu rõ cơ chế hoạt động và tiềm năng ứng dụng của nattokinase trong điều trị các bệnh huyết khối và tim mạch.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, y sinh: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân tích và ứng dụng enzyme tái tổ hợp trong thực tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Nattokinase là gì và có tác dụng gì trong y học?
   Nattokinase là enzyme serine protease phân hủy fibrin, giúp làm tan cục máu đông, hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối và cải thiện tuần hoàn máu. Ví dụ, nattokinase được dùng trong thực phẩm chức năng phòng ngừa đột quỵ và nhồi máu cơ tim.

2. Tại sao chọn Bacillus subtilis BD170 làm vật chủ biểu hiện?
   Bacillus subtilis BD170 có khả năng tiết protein mạnh ra môi trường, dễ dàng biến nạp gen và ổn định biểu hiện protein tái tổ hợp, giúp tăng hiệu quả sản xuất enzyme so với các vật chủ khác như E. coli.

3. Kỹ thuật há hai pha nước (ATPS) có ưu điểm gì trong tinh sạch enzyme?
   ATPS giúp tách và tinh sạch enzyme nhanh chóng, hiệu quả với chi phí thấp, giữ được hoạt tính enzyme cao và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất. Ví dụ, sử dụng PEG/potassium phosphate đã tăng độ tinh khiết nattokinase lên 6,63 lần.

4. Hoạt tính nattokinase được đánh giá như thế nào?
   Hoạt tính được đo bằng khả năng phân hủy fibrin trên gel zymogram và thử nghiệm phân hủy fibrin trong máu đông, thể hiện qua kích thước vùng phân giải và đơn vị hoạt tính IU/mL.

5. Nattokinase có an toàn khi sử dụng không?
   Nghiên cứu cho thấy nattokinase an toàn, không gây đột biến gen hay tác dụng phụ nghiêm trọng khi dùng liều thích hợp. Thí nghiệm trên chuột và người đều không ghi nhận tác hại đáng kể sau khi sử dụng nattokinase trong thời gian dài.

Kết luận

• Đã phân lập và tạo dòng gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10 thành công.
• Biểu hiện nattokinase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis BD170 đạt hoạt tính cao, gấp nhiều lần so với chủng gốc.
• Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng há hai pha nước PEG/potassium phosphate được tối ưu, thu hồi enzyme hiệu quả với độ tinh khiết cao.
• Nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính phân hủy fibrin mạnh, phù hợp ứng dụng trong y học và công nghiệp enzyme.
• Đề xuất mở rộng quy mô sản xuất, nghiên cứu ứng dụng lâm sàng và phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng trong các giai đoạn tiếp theo.

Hành động tiếp theo: Triển khai tối ưu quy trình lên men, mở rộng quy mô pilot và tiến hành thử nghiệm lâm sàng để đưa nattokinase tái tổ hợp vào ứng dụng thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đ¾I HàC HU¾ TR£âNG Đ¾I HàC KHOA HàC NGUYÄN THÞ ANH TH£ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TÞI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN Mà HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TÞ HỢP LUÀN ÁN TI¾N S) CÔNG NGHÆ SINH HàC HU¾, 2024 Đ¾I HàC HU¾ TR£âNG Đ¾I HàC KHOA HàC NGUYÄN THÞ ANH TH£ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TÞI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN Mà HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TÞ HỢP LUÀN ÁN TI¾N S) CÔNG NGHÆ SINH HàC Ngành: CÔNG NGHÆ SINH HàC Mã sá: 9 42 02 01 Ng¤ãi h¤áng d¿n Khoa hác: GS. NGUYÄN HOÀNG LÞC HU¾, 2024 i Lời Cảm Ơn Trong sußt thßi gian hßc t¿p và hoàn thành lu¿n án, em ã nh¿n ±ÿc rçt nhißu sÿ quan tåm, giúp ÿ cÿa quý ban lãnh äo, quý thæy cô giáo, quý ßng nghißp và các anh chß hßc viên và sinh viên. Em xin chân thành câm ¡n sÿ giúp ÿ quý giá ó. ặc bißt, em xin bày tô lòng bi¿t ¡n chån thành và lßi câm ¡n såu sắc ¿n Thæy giáo GS.

Nguyßn Hoàng Lßc ã t¿n tình chỉ bâo và nh¿n näi vßi em trong sußt quá trình làm lu¿n án, ã giúp ÿ em hoàn thành lu¿n án này. N¿u không có sÿ giúp ÿ cÿa thæy, th¿t sÿ em không thß có ±ÿc nh± ngày hôm nay. Em xin câm ¡n các thæy cô giáo täi bß môn Công nghß Sinh hßc, tr±ßng äi hßc Khoa hßc, äi hßc Hu¿ ã nhißt tình giúp ÿ em thÿc hißn ß tài, ã ßng viên em chån thành và æy cßi mß ngay tÿ nhÿng ngày æu tiên. Em xin cám ¡n phòng ào täo Sau äi hßc tr±ßng äi hßc Khoa hßc, äi hßc Hu¿ ã có nhißu giúp ÿ quý báu, täo mßi ißu kißn tßt nhçt ß em hoàn thành lu¿n án này.

Em mußn gÿi lßi câm ¡n ¿n Thæy giáo TS. Nguyßn Minh Trí, Thæy ã giúp ÿ em rçt nhißu trong vißc hoàn thành các thÿ tÿc hß s¡ giçy tß ß em có thß bâo vß thành công lu¿n án. Em xin gÿi lßi câm ¡n ¿n Ban Giám ßc, Ban ào täo và Công tác Sinh viên äi hßc Hu¿; Ban Giám hißu, Phòng Tß chÿc Hành chính và Thanh tra Pháp ch¿, quý ßng nghißp Khoa C¡ bân, Tr±ßng äi hßc Y - D±ÿc, äi hßc Hu¿ ã luôn täo nhÿng ißu kißn tßt nhçt ß em có ißu kißn hoàn thành lu¿n án này. Tôi xin chån thành cám ¡n các bän hßc viên, sinh viên ngành Công nghß Sinh hßc ã hß trÿ rçt nhißu trong quá trình thÿc hißn các thí nghißm cÿa lu¿n án, ã ßng hành cùng tôi sußt thßi gian làm lu¿n án.

Con xin gÿi ¿n ba m¿ yêu quý cÿa con nhÿng lßi bi¿t ¡n chån thành nhçt. Cám ¡n ba m¿ luôn ß bên cänh con ß chia sẻ, ßng viên con trong nhÿng ngày con làm lu¿n án. Cußi cùng xin gÿi lßi câm ¡n ¿n ng±ßi chßng yêu quý và hai con ã luôn bên cänh ßng viên, khuy¿n khích. Th¿t sÿ åy là nhÿng ßng lÿc to lßn ß tôi có thß i ¿n thành công này.

Mßt læn nÿa xin câm ¡n tçt câ vßi lòng bi¿t ¡n và chån thành nhçt! Thừa Thiên Huế, tháng 2 năm 2024 Nguyễn Thị Anh Thư ii LâI CAM ĐOAN Tôi cam oan ây là công trình nghiên cću cąa riêng tôi. Các sá liáu, kÁt quÁ nêu trong luÁn văn là trung thực và ch¤a tĉng ¤āc ai công bá trong bÃt kỳ công trình nào khác. Ng¤ãi cam đoan NguyÅn Thß Anh Th¤ iii DANH MĀC CHĀ VI¾T TÂT AchE Acetylcholinesterase ADAM10 A Disintegrin and Metalloproteinase Protein 10 ADAM9 A Disintegrin and Metalloproteinase Protein 9 ATP Adenosine triphosphate ATPS Aqueous two-phase system Há hai pha n¤ác BDNF Brain-derived neurotrophic factor YÁu tá thần kinh ngußn gác tĉ não BSA Bovine serum albumin cAMP Cyclic adenosine monophosphate CDS Coding Sequence cs Cßng sự ĐC Đái chćng DEAE Diethylaminoethyl DFP Diisopropyl fluorophosphate EDTA Ethylene diamine triacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuÁt sinh hóa ¤āc dùng trong mißn dách học GenBank Ngân hàng Gen GFP Green fluorescent protein HĐC Ho¿t ß chung HĐR Ho¿t ß riêng IGF-1 Insulin-like growth factor-1 YÁu tá tăng tr¤áng giáng Insulin-1 IPTG Isopropyl ³-D-1- iv thiogalactopyranoside JAK1 Janus kinase 1 KLPT Khái l¤āng phân tċ LB Luria Bertani ORF Open reading frame PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase chain reaction PhÁn ćng chuỗi Polymerase PEG polyethylene glycol pI ĐiÅm ẳng ián PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride PP Potassium phosphate RBS Ribosome binding site SBTI Self-Directed Biological Transformation Initiative SDS- Sodium dodecyl-sulfate PAGE polyacrylamide gel electrophoresis Sec SRP Signal recognition particle STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1 TCA Trichloroacetic acid TGF-³ Transforming growth factor beta uPA Urokinase-type plasminogen activator WHO World Health Organization Tá chćc Y tÁ ThÁ giái YPD Yeast peptone dextrose Zymogram Đián di c¢ chÃt v MĀC LĀC Lãi cÁm ¢n. ii LâI CAM ĐOAN.

iii DANH MĀC CHĀ VI¾T TÂT. vi DANH MĀC CÁC BÀNG. ix DANH MĀC CÁC HÌNH. TàNG QUAN TÀI LIÆU.

GIàI THIàU VÂ NATTOKINASE. Ngußn sÁn xuÃt nattokinase. Vi khuẩn Bacillus. Các nguồn sinh vật khác.

Ćng dăng cąa nattokinase. Āng dụng trong chống đông máu. Các āng dụng khác. Hà THàNG BIÄU HIàN Bacillus subtilis.

Vi khuẩn Bacillus subtilis. Há tháng vector biÅu hián á Bacillus. Há tháng tiÁt á Bacillus. ĆNG DĂNG Bacillus subtilis TRONG SÀN XUÂT ENZYME TÁI Tà HĀP.

TINH S¾CH ENZYME BÀNG Hà 2 PHA N£àC. CÃu t¿o và ặc tính cąa há hai pha n¤ác. Ćng dăng há hai pha trong tinh s¿ch enzyme. ĐàI T£þNG VÀ PH£¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU.

ĐàI T£ĀNG NGHIÊN CĆU. PH£¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU. Phân lÁp gen mã hóa nattokinase tĉ các chąng B. T¿o dòng gen mã hóa nattokinase trong tÁ bào E.

BiÁn n¿p vector pHT43/nat05 và pHT43/natC10 vào Bacillus subtilis BD170. BiÅu hián nattokinase bÁng há tháng vector pHT43. Xác ánh ho¿t tính nattokinase. Ành h¤áng cąa mßt sá yÁu tá lên ho¿t tính phân giÁi fibrin.

Thċ nghiám khÁ năng phân giÁi fibrin trong máu thß bÁng nattokinase tái tá hāp. Tinh s¿ch nattokinase tái tá hāp bÁng há hai pha n¤ác. PHÂN LÀP GEN Mà HÓA NATTOKINASE TĈ CÁC CHĄNG Bacillus subtilis………………………………………………………………………………………. KhuÁch ¿i gen mã hóa nattokinase tĉ các chąng B.

T¿o dòng gen nattokinase giÁ ánh trong vector pCR®2. Xác ánh trình tự gen nattokinase giÁ ánh tĉ các chąng B. T¾O DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG Bacillus subtilis BD170. T¿o dòng gen nat05 và natC10 vào vector pHT43.

BiÁn n¿p vector pHT43 tái tá hāp vào B. BIÄU HIàN NATTOKINASE TÁI Tà HĀP TRONG Bacillus subtilis BD170. subtilis BD170 biÅu hián nattokinase m¿nh. Đặc iÅm cąa nattokinase tái tá hāp á dòng R4.

TINH S¾CH NATTOKINASE BÀNG Hà HAI PHA N£àC. Ành h¤áng cąa khái l¤āng phân tċ PEG. Ành h¤áng cąa nßng ß potassium phosphate. Xác ánh khái l¤āng phân tċ cąa nattokinase tái tá hāp.

PHÂN LÀP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TĈ CÁC CHĄNG Bacillus subtilis. T¾O DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG VECTOR BIÄU HIàN pHT43 70 4. BIÄU HIàN NATTOKINASE TÁI Tà HĀP à Bacilus subtilis. BiÅu hián gen mã hóa nattokinase.

Ành h¤áng cąa mßt sá yÁu tá lên ho¿t tính phân giÁi fibrin. Thċ nghiám khÁ năng phân giÁi c¢ chÃt cąa nattokinase. TINH S¾CH NATTOKINASE BÀNG Hà HAI PHA N£àC. 79 K¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHÞ.

81 DANH MĀC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN Đ¾N LUÀN ÁN .82 TÀI LIÆU THAM KHÀO .83 viii DANH MĀC CÁC BÀNG BÁng 1. Mßt sá chąng vi khuẩn Bacillus sÁn xuÃt ¤āc phân lÁp tĉ thực phẩm lên men truyÃn tháng. Ngußn sinh vÁt sÁn xuÃt enzyme thąy phân fibrin. Trình tự các primer dùng Å khuÁch ¿i PCR gen nattokinase tĉ B.

Ho¿t ß protease cąa các dòng B. Ành h¤áng cąa nhiát ß lên ho¿t tính nattokinase cąa Nat05. Ành h¤áng cąa pH lên ho¿t tính nattokinase cąa Nat05. Ành h¤áng cąa các ion kim lo¿i và chÃt ho¿t ßng bà mặt lên ho¿t tính nattokinase cąa Nat05.

Ành h¤áng cąa PEG 2000 và PP 20% Án sự phân tách nattokinase. Ành h¤áng cąa PEG 6000 và PP 20% Án sự phân tách nattokinase. Ành h¤áng cąa PEG 10000 và PP 20% Án sự phân tách nattokinase. Ành h¤áng cąa PP 15% Án sự phân tách nattokinase.

Ành h¤áng cąa PP 25% Án sự phân tách nattokinase. Đß tinh s¿ch và hiáu suÃt thu hßi enzyme khi sċ dăng há hai pha n¤ác cąa B.67 ix DANH MĀC CÁC HÌNH Hình 1. CÃu trúc không gian 3 chiÃu cąa nattokiase. C¢ chÁ ho¿t ßng cąa nattokinase trong cháng ông máu.

Hình Ánh kính hiÅn vi ián tự quét tÁ bào B. S¢ ß biÅu dißn há tháng m¿ng l¤ái các con ¤ßng tiÁt protein cąa B. S¢ ß mô tÁ há tháng tiÁt protein theo con ¤ßng Sec và các thành phần tham gia á B. S¢ ß phân tách quá trình chuyÅn hóa sinh học bÁng há hai pha.

Các giai o¿n phân tách và tinh s¿ch enzyme bÁng há hai pha PEG/muái. S¢ ß bá trí thí nghiám phân tách nattokinase bÁng há 2 pha. KhuÁch ¿i PCR vái cặp mßi NatF và NatR tĉ DNA táng sá. Tinh s¿ch sÁn phẩm PCR.

KiÅm tra khuẩn l¿c mang sÁn phẩm PCR vái cặp mßi ặc hiáu.1 mang gen mã hóa nattokinase. So sánh trình tự cąa các gen nat05 và natC10 phân lÁp ¤āc vái trình tự gen aprN tĉ chąng B. So sánh trình tự amino acid suy dißn cąa các gen phân lÁp ¤āc vái trình tự nattokinase tĉ chąng B. KiÅm tra sự hián dián gen mã hóa nattokinase trong vector pHT43 á chąng vi khuẩn E.

coli TOP10 bÁng phÁn ćng PCR. S¢ ß vector pHT43 mang gen mã hóa nattokinase. KiÅm tra sự hián dián cąa vector pHT43 tái tá hāp trong B. subtilis BD170 bÁng phÁn ćng PCR vái cặp mßi ặc hiáu.

Vòng phân giÁi sữa tách béo cąa các dòng B. subtilis BD170 tái tá hāp khi cÁm ćng IPTG á nßng ß 1 mM. Vòng phân giÁi fibrinogen cąa dòng R4 khi ¤āc cÁm ćng vái IPTG á các nßng ß khác nhau (1-5 mM). Đián di SDS-PAGE (A) và ián di c¢ chÃt (B) cąa dách enzyme ngo¿i bào.

Thċ nghiám khÁ năng phân giÁi căc máu ông thß bÁng enzyme tái tá hāp. Đián di sÁn phẩm tinh s¿ch trên polyacrylamide gel 12%. Đián di sÁn phẩm tinh s¿ch trên polyacrylamide gel có bá sung c¢ chÃt. Tính cÃp thi¿t căa đÁ tài Nhßi máu c¢ tim và các bánh tim m¿ch là những bánh rÃt nghiêm trọng, Ánh h¤áng lán Án sćc khße con ng¤ßi và là nguyên nhân chính gây ßt tċ á ng¤ßi.

Theo tháng kê cąa WHO, khoÁng 17,7 triáu ng¤ßi chÁt mỗi năm trên thÁ giái liên quan Án bánh tim m¿ch, trong ó chą yÁu bánh thiÁu máu căc bß, cao huyÁt áp và các bánh m¿ch máu não. Nhßi máu c¢ tim, ßt quỵ do thiÁu máu, t¿c ngh¿n phái, căc máu ông tĩnh m¿ch là các chćng bánh do rái lo¿n ông máu gây ra.