Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lý tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn cầu, với khoảng 17,7 triệu người chết mỗi năm theo báo cáo của WHO. Các rối loạn như nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu, tắc nghẽn mạch máu và các bệnh huyết khối khác đều liên quan mật thiết đến sự mất cân bằng trong quá trình phân hủy fibrin – thành phần chính của cục máu đông. Nattokinase, một enzyme serine protease được phân lập từ vi khuẩn Bacillus subtilis trong thực phẩm lên men Natto của Nhật Bản, đã được chứng minh có khả năng phân hủy fibrin mạnh mẽ, hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối và cải thiện sức khỏe tim mạch.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là phân lập và tạo dòng gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên, đồng thời tối ưu hóa điều kiện biểu hiện enzyme này trong dòng tái tổ hợp Bacillus subtilis BD170. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bệnh viện Đại học Khoa học, Đại học Huế trong năm 2023-2024, nhằm cung cấp nguồn enzyme tái tổ hợp chất lượng cao phục vụ cho các ứng dụng y học và công nghiệp.

Việc phát triển công nghệ biểu hiện và tinh sạch nattokinase có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme, giảm chi phí và mở rộng ứng dụng trong điều trị các bệnh lý tim mạch, huyết khối, cũng như các lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ enzyme. Nghiên cứu góp phần bổ sung dữ liệu khoa học về biểu hiện protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis, đồng thời phát triển quy trình tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật há hai pha nước, giúp tăng độ tinh khiết và hoạt tính enzyme.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

  • Lý thuyết về enzyme serine protease: Nattokinase thuộc nhóm serine protease, có trung tâm hoạt động gồm ba amino acid Asp32, His64 và Ser221, chịu trách nhiệm xúc tác phân hủy fibrin. Cấu trúc 3D của enzyme gồm 9 chuỗi xoắn α và các vị trí liên kết calcium giúp ổn định cấu trúc và hoạt tính enzyme.

  • Mô hình biểu hiện protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis: Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương có khả năng tiết protein mạnh ra môi trường, thuận lợi cho sản xuất enzyme tái tổ hợp. Vector biểu hiện pHT43 với promoter Pspac và tín hiệu peptide AmyQ được sử dụng để điều khiển biểu hiện gen nattokinase.

  • Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng hệ thống há hai pha nước (ATPS): Kỹ thuật này sử dụng sự phân tách pha giữa polyethylene glycol (PEG) và muối vô cơ (potassium phosphate) để tách và tinh sạch enzyme dựa trên tính chất hòa tan và kích thước phân tử, giúp thu được enzyme có độ tinh khiết cao với hiệu suất thu hồi lớn.

Các khái niệm chính bao gồm: gen mã hóa nattokinase (aprN), vector biểu hiện pHT43, Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp, hoạt tính phân hủy fibrin, và hệ thống há hai pha nước PEG/potassium phosphate.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: DNA tổng số được tách chiết từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10. Gen mã hóa nattokinase được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu NatF và NatR, sau đó được cloned vào vector pCR®2.1 và chuyển vào E. coli TOP10 để nhân bản.

  • Tạo dòng tái tổ hợp: Gen nattokinase được cắt và chuyển vào vector biểu hiện pHT43, sau đó biến nạp vào Bacillus subtilis BD170 để biểu hiện enzyme tái tổ hợp.

  • Phân tích hoạt tính enzyme: Hoạt tính phân hủy fibrin của nattokinase được đánh giá bằng phương pháp zymogram và các thử nghiệm phân hủy fibrin trong máu đông.

  • Tinh sạch enzyme: Sử dụng hệ thống há hai pha nước PEG 6000 và potassium phosphate 15% (pH 8) để tinh sạch nattokinase từ dịch nuôi cấy. Hiệu suất thu hồi và độ tinh khiết enzyme được xác định bằng hoạt tính enzyme và SDS-PAGE.

  • Timeline nghiên cứu: Quá trình thực hiện kéo dài trong năm 2023-2024, bao gồm các giai đoạn tách chiết gen, tạo dòng tái tổ hợp, biểu hiện enzyme, tinh sạch và đánh giá hoạt tính.

  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: Sử dụng hai chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10 làm mẫu nghiên cứu chính, lựa chọn Bacillus subtilis BD170 làm vật chủ biểu hiện do khả năng tiết protein mạnh và ổn định.

  • Phương pháp phân tích: Kỹ thuật PCR, điện di gel agarose và SDS-PAGE, phân tích hoạt tính enzyme bằng phương pháp zymogram và thử nghiệm phân hủy fibrin, phân tích hiệu suất tinh sạch enzyme bằng các chỉ số thu hồi và độ tinh khiết.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và khuếch đại gen nattokinase: Gen aprN mã hóa nattokinase được khuếch đại thành công từ chủng Bacillus subtilis N05 và C10 với kích thước khoảng 900 bp, xác nhận bằng điện di gel agarose. Sản phẩm PCR tinh sạch đạt độ tinh khiết cao, phù hợp cho bước cloning.

  2. Tạo dòng tái tổ hợp và biểu hiện enzyme: Gen aprN được cloned vào vector pHT43 và biến nạp thành công vào Bacillus subtilis BD170. Sau khi cảm ứng bằng IPTG 1 mM ở 37°C, hoạt tính nattokinase trong dịch nuôi cấy đạt 848,52 IU/mL sau 4 giờ lên men, tăng gấp khoảng 5 lần so với chủng tự nhiên.

  3. Tinh sạch enzyme bằng hệ thống há hai pha nước: Sử dụng PEG 6000 20% kết hợp potassium phosphate 15% (pH 8) cho hiệu suất thu hồi enzyme đạt khoảng 80%, độ tinh khiết tăng lên 6,63 lần so với dịch nuôi cấy ban đầu. Hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch đạt 11507,92 IU/mg protein.

  4. Đặc điểm hoạt tính enzyme: Nattokinase tái tổ hợp có khả năng phân hủy fibrin mạnh mẽ, thể hiện qua các băng phân giải fibrin trên gel zymogram với các khối lượng phân tử 37, 27 và 21 kDa. Enzyme hoạt động tối ưu ở pH 8 và nhiệt độ 39°C, phù hợp với điều kiện sinh lý.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc phân lập và biểu hiện gen nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên trong dòng tái tổ hợp BD170 là khả thi và hiệu quả. Hoạt tính enzyme tăng đáng kể so với chủng gốc, chứng tỏ hệ thống biểu hiện và cảm ứng IPTG hoạt động tốt. Kỹ thuật tinh sạch bằng há hai pha nước PEG/potassium phosphate đã được tối ưu, mang lại hiệu suất thu hồi cao và độ tinh khiết enzyme phù hợp cho ứng dụng y sinh.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, hoạt tính nattokinase thu được tương đương hoặc cao hơn so với các dòng tái tổ hợp khác như B. subtilis WB800N hay các chủng Bacillus subtilis natto truyền thống. Điều này khẳng định tiềm năng của Bacillus subtilis BD170 trong sản xuất enzyme tái tổ hợp quy mô công nghiệp.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính enzyme theo thời gian lên men, bảng so sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh khiết enzyme trước và sau tinh sạch, cũng như hình ảnh gel SDS-PAGE và zymogram minh họa các băng protein và hoạt tính phân hủy fibrin.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa quy trình lên men: Điều chỉnh nồng độ IPTG, thời gian cảm ứng và điều kiện môi trường (pH, nhiệt độ) nhằm tăng hoạt tính nattokinase lên ít nhất 20% trong vòng 6 tháng. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu và phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

  2. Mở rộng quy mô sản xuất: Áp dụng quy trình biểu hiện và tinh sạch đã tối ưu vào quy mô pilot 10-100 lít để đánh giá tính ổn định và hiệu quả sản xuất enzyme trong 1 năm. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm và đối tác công nghiệp.

  3. Nghiên cứu ứng dụng lâm sàng: Thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn của nattokinase tái tổ hợp trong điều trị bệnh huyết khối trong 2-3 năm tới. Chủ thể thực hiện: các trung tâm nghiên cứu y sinh và bệnh viện.

  4. Phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng: Kết hợp nattokinase tái tổ hợp vào các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ sức khỏe tim mạch, đồng thời nghiên cứu tính ổn định và sinh khả dụng của enzyme trong sản phẩm trong vòng 1 năm. Chủ thể thực hiện: doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Học hỏi quy trình phân lập gen, tạo dòng tái tổ hợp và kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng há hai pha nước, áp dụng cho các nghiên cứu enzyme khác.

  2. Doanh nghiệp sản xuất enzyme và dược phẩm: Áp dụng công nghệ biểu hiện và tinh sạch nattokinase để phát triển sản phẩm enzyme chất lượng cao, giảm chi phí sản xuất.

  3. Bác sĩ và chuyên gia y học lâm sàng: Hiểu rõ cơ chế hoạt động và tiềm năng ứng dụng của nattokinase trong điều trị các bệnh huyết khối và tim mạch.

  4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, y sinh: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân tích và ứng dụng enzyme tái tổ hợp trong thực tế.

Câu hỏi thường gặp

  1. Nattokinase là gì và có tác dụng gì trong y học?
    Nattokinase là enzyme serine protease phân hủy fibrin, giúp làm tan cục máu đông, hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối và cải thiện tuần hoàn máu. Ví dụ, nattokinase được dùng trong thực phẩm chức năng phòng ngừa đột quỵ và nhồi máu cơ tim.

  2. Tại sao chọn Bacillus subtilis BD170 làm vật chủ biểu hiện?
    Bacillus subtilis BD170 có khả năng tiết protein mạnh ra môi trường, dễ dàng biến nạp gen và ổn định biểu hiện protein tái tổ hợp, giúp tăng hiệu quả sản xuất enzyme so với các vật chủ khác như E. coli.

  3. Kỹ thuật há hai pha nước (ATPS) có ưu điểm gì trong tinh sạch enzyme?
    ATPS giúp tách và tinh sạch enzyme nhanh chóng, hiệu quả với chi phí thấp, giữ được hoạt tính enzyme cao và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất. Ví dụ, sử dụng PEG/potassium phosphate đã tăng độ tinh khiết nattokinase lên 6,63 lần.

  4. Hoạt tính nattokinase được đánh giá như thế nào?
    Hoạt tính được đo bằng khả năng phân hủy fibrin trên gel zymogram và thử nghiệm phân hủy fibrin trong máu đông, thể hiện qua kích thước vùng phân giải và đơn vị hoạt tính IU/mL.

  5. Nattokinase có an toàn khi sử dụng không?
    Nghiên cứu cho thấy nattokinase an toàn, không gây đột biến gen hay tác dụng phụ nghiêm trọng khi dùng liều thích hợp. Thí nghiệm trên chuột và người đều không ghi nhận tác hại đáng kể sau khi sử dụng nattokinase trong thời gian dài.

Kết luận

  • Đã phân lập và tạo dòng gen mã hóa nattokinase từ các chủng Bacillus subtilis tự nhiên N05 và C10 thành công.
  • Biểu hiện nattokinase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis BD170 đạt hoạt tính cao, gấp nhiều lần so với chủng gốc.
  • Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng há hai pha nước PEG/potassium phosphate được tối ưu, thu hồi enzyme hiệu quả với độ tinh khiết cao.
  • Nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính phân hủy fibrin mạnh, phù hợp ứng dụng trong y học và công nghiệp enzyme.
  • Đề xuất mở rộng quy mô sản xuất, nghiên cứu ứng dụng lâm sàng và phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng trong các giai đoạn tiếp theo.

Hành động tiếp theo: Triển khai tối ưu quy trình lên men, mở rộng quy mô pilot và tiến hành thử nghiệm lâm sàng để đưa nattokinase tái tổ hợp vào ứng dụng thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.