MỞ ĐẦU Cytochrome P450 (P450) là họ enzyme phân bố rộng rãi và đa dạng nhất nhất, đóng vai trò quan trọng trong rất nhiều con đường chuyển hóa vật chất trong cơ thể cũng như trong tự nhiên. P450 có mặt ở hầu hết các giới trong hệ thống sinh vật học, rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, thậm chí các P450 của một loài cũng có thể có cấu trúc, chức năng và tính chất khác nhau, đặc biệt là tính đặc hiệu cơ chất. Chính vì vậy P450 được ứng dụng rộng rãi nhất trong tất cả lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, môi trường, y dược… Để đáp ứng được yêu cầu của các quy trình sản xuất một số các sản phẩm sinh học ở quy mô công nghiệp như thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao, trong sự có mặt của một số loại dung môi đòi hỏi các enzyme tham gia vào các quy trình này phải có tính chất đặc biệt như bền nhiệt, chịu dung môi, chịu áp… Vì vậy, việc tìm kiếm các P450 bền nhiệt mới từ tự nhiên hoặc gây đột biến định hướng để nâng cao tính bền nhiệt của các P450 đã được đặc biệt quan tâm nghiên cứu. Các enzyme bền nhiệt thường được thu nhận từ các vùng địa nhiệt như suối nước nóng, miệng núi lửa, giàn khoan dầu khí… Một trong những lợi thế của Việt Nam là có một mạng lưới hơn ba trăm suối nước nóng vô cùng phong phú, trải dài từ Bắc tới Nam.
Tuy nhiên, các nghiên cứu đánh giá về khu hệ vi sinh vật ưa nhiệt ở các suối nước nóng để có thể thấy được tiềm năng và vai trò của chúng đối với hệ sinh thái và con người còn hạn chế. Cho đến nay, những nghiên cứu về vi sinh vật ưa nhiệt và hệ enzyme của chúng đã được nghiên cứu tại Việt Nam, chủ yếu tập trung vào nhóm vi sinh vật phân lập được cũng như hệ enzyme thủy phân của chúng như amylase, protease, cellulase… Mặt khác, suối nước nóng thường có số lượng vi sinh vật rất thấp, chỉ 0,1% tổng số vi sinh vật có thể phân lập được trực tiếp bằng phương pháp truyền thống. Kỹ thuật metagenomic ra đời cho phép các nhà nghiên cứu tiếp cận sâu hơn với hệ gen của vi sinh vật không thông qua nuôi cấy. Trong những năm gần đây đã có rất nhiều công bố khai thác những gen mới, protein/enzyme mới của vi sinh vật nhờ kỹ thuật này.
Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đặt mục tiêu tìm kiếm gen mới mã hóa cho cytochrome P450 từ suối nước nóng Bình Châu – một trong những suối nước nóng có nhiệt độ nóng nhất tại Việt Nam với hy vọng sẽ tìm thấy P450 bền nhiệt mới bằng kỹ thuật không nuôi cấy. Để thực hiện được mục tiêu này, chúng tôi đã thực hiện những nội dung nghiên cứu như sau: - Thu nhận, tách chiết DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu, giải trình tự và xây dựng cơ sở dữ liệu về nhóm gen mã hóa cho P450. - Biểu hiện gen mã hóa P450 mới, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của P450 tái tổ hợp. - Nghiên cứu hệ thống truyền điện tử và xác định phổ cơ chất tiềm năng của enzyme thu được.
z 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. Hệ enzyme cytochrome P450 Cytochrome P450 (viết tắt là CYP hoặc P450) là các protein enzyme có chứa phân tử sắt, đã được phát hiện và nghiên cứu trên 55 năm nay. Có thể nói, P450 là họ enzyme phân bố rộng rãi nhất, đa dạng nhất và có mặt trong tất cả các giới trong hệ thống sinh vật học, từ vi sinh vật đến thực vật, động vật và con người [1]. Sở dĩ nhóm enzyme có tên gọi cytochrome P450 vì chúng có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 450 nm khi bão hòa trong khí CO.
Các P450 là các monooxygenase bên ngoài, do đó, chúng cần một chất cho điện tử để khởi động quá trình oxi hóa và hydroxyl hóa cơ chất (Bernhardt, 2006) như sơ đồ phản ứng sau: RH + O2 + NAD(P)H + H+ROH + H2O + NAD(P)+ Số lượng các gen mã hóa cho các P450 ở tất cả các loài trong hệ thống sinh vật học hiện nay là khoảng hơn 37.000 trình tự được công bố trên Ngân hàng gen và số lượng này tiếp tục được tăng lên khi các nhóm nghiên cứu tìm ra được các gen P450 mới ở các loài sinh vật khác nhau. Năm 2009, Nelson và cộng sự [2] đã tổng kết có khoảng 3282 gen P450 của động vật, 1015 gen P450 của vi khuẩn, 22 gen P450 của cổ khuẩn và 2 gen P450 từ virus thì hiện nay đã có 30171 gen P450 của động vật, 7606 gen P450 của vi khuẩn, 70 gen P450 của cổ khuẩn và 14 gen P450 của virus. Mặc dù có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau nhưng cytochrome P450 có một vài hạn chế như độ ổn định kém, hoạt tính thấp [3], [4]. Việc tìm ra cytochrome P450 bền nhiệt có thể cải thiện độ ổn định của enzyme này [5].
Sự phân bố rộng rãi của chúng trong tự nhiên là tiềm năng lớn cho việc khám phá và khai thác cytochrome P450 bền nhiệt từ các chủng vi sinh vật chịu nhiệt [6], [7]. Lý do số lượng các P450 mới tiếp tục tăng lên nhanh chóng, thu hút sự tập trung nghiên cứu của các nhà khoa học là do nhóm enzyme này có khả năng ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp, môi trường, y học, dược học, nông nghiệp khi chúng tham gia vào hơn 20 loại phản ứng xúc tác khác nhau bao gồm hydroxyl hóa các hợp chất hydrocarbon, các hợp chất vòng thơm, các hợp chất nitơ, dealkyl hóa các hợp chất nitơ, các hợp chất oxy, các hợp chất lưu huỳnh, epoxide hóa các hợp chất alkene, các hợp chất arene, oxy hóa các hợp chất nitơ, các hợp chất lưu huỳnh, các hợp chất alkyne, deamine oxy hóa, oxy hóa khử các hợp chất halogen, oxy hóa các hợp chất alcohol và aldehyde, dehydro hóa, dehydrate hóa, khử các hợp chất N-oxide, khử các hợp chất epoxide, khử NO, phân nhánh hóa và oxi hóa mối liên kết C-C… Tương ứng với sự đa dạng về chức năng xúc tác của các P450 là sự đa dạng về cơ chất của chúng, bao gồm các axit béo, các steroid, các prostaglandin cũng như các hợp chất khác như thuốc, thuốc mê, các dung môi hữu cơ, ethanol, các hydrocarbon alkylaryl, các chất trừ sâu và các chất gây ung thư [8]. Hệ enzyme cytochrome P450 ở vi sinh vật Với các đặc trưng như tốc độ phản ứng nhanh hơn so với các P450 khác, có khả năng hòa tan nên các enzyme P450 của vi khuẩn thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhóm nhà khoa học vì có thể dựa vào hệ enzyme P450 của vi khuẩn để phát triển các mô hình chuyển hóa sinh học trong tự nhiên. Cũng giống như các P450 của các giới sinh vật khác, P450 của vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các cơ chất khác nhau như để sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong tái tạo môi trường, dược phẩm và nông nghiệp [9].
Chính vì vậy, số lượng các P450 của vi sinh vật ngày càng tăng cao với khoảng hơn 1000 tên chú thích. Trong số các P450 của vi sinh vật thì P450cam (CYP101) từ loài Pseudomonas putida và P450BM3 (CYP102) từ loài B. megaterium được nghiên cứu đầy đủ nhất. P450cam xúc tác cho quá trình hydroxyl hóa từ (+)-camphor thành 5-exo-hydroxy camphor với sự tham gia của 2 enzyme trong chuỗi truyền điện tử là putidaredoxin reductase và putidaredoxin [10] trong khi P450BM3 có một chuỗi polypeptide đơn chứa đồng thời nhân sắt và enzyme khử (reductase) xúc tác quá trình hydroxyl hóa axit béo ω-2.
Các xạ khuẩn thường mang các gen P450 thuộc CYPome (cytochrome P450 complement) tham gia vào các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên ứng dụng trong y dược (các loài thuộc giống Streptomyces) như các hợp chất kháng sinh (erythromycin, vancomycin), các hợp chất kháng nấm (nystantin, amphotericin), hay hợp chất có tác dụng diệt sâu, côn trùng (avermectin). Các loài xạ khuẩn khác nhau có số lượng gen mã hóa cho các P450 khác nhau. Ví dụ các loài myxobacteria tham gia vào quá trình chuyển hóa lipid, ứng dụng trong quá trình sản xuất các loại thuốc chống ung thư như epothilone có số lượng các gen P450 lớn và đa dạng [11] trong khi loài xạ khuẩn Bifidobacterium longum chỉ có duy nhất một gen mã hóa cho một P450 mà hiện nay chưa rõ chức năng [12] Sự đa dạng của các P450 từ vi sinh vật trong quá trình tái tạo môi trường là rất có ý nghĩa. Bên cạnh sự tham gia của loài nấm trắng P.
chrysosporium, một số P450 của các sinh vật hoại sinh như Aspergillus oryzae, S. coelicolor hay Mycobacterium smegmatis cũng tham gia vào quá trình này [13], [14]. Malandain và cộng sự đã chứng minh được khả năng phân hủy các chất phụ gia dầu mỏ như methyl tert-butyl ether, ethyl tert-butyl ether và tert-amyl butyl ether là do CYP249 từ các chủng thuộc giống Rhodococcus và Gordonia[15]. Một trong những vai trò quan trọng nữa của các P450 từ vi sinh vật là tham gia vào chu trình chuyển hóa nitơ.
CYP55, một loại enzyme của nấm Fusarium oxysporum tham gia tích cực vào quá trình phản nitrite/nitrate hóa, do đó nấm mốc được ghi nhận là một trong những nhân tố tích cực tham gia vào quá trình phản nitrite/nitrate hóa ở các vùng đồng cỏ, đất bán khô cằn hoặc đất rừng làm tăng độ màu mỡ của đất. Gần đây, Pedrini và cộng sự [16] cho rằng các enzyme P450 của một số chủng nấm như Beauveria bassiana tham gia quá trình tổng hợp các hợp chất phân giải lớp biểu bì của côn trùng. Lớp biểu bì này là hỗn hợp của các hợp chất lipid bao z 4 gồm các alkane chuỗi dài, alkene, các ester sáp và các axit béo [16]. Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm của hệ P450 từ vi sinh vật là xúc tác tổng hợp nên những hợp chất có hoạt tính sinh học có lợi cho con người, những enzyme này cũng tham gia vào quá trình tổng hợp nên các độc tố.
Ví dụ CYP619 từ chủng nấm A. clavatus xúc tác quá trình tổng hợp patulin, là một loại độc tố vi nấm. Patulin thường có trong táo bị thối rữa, và trong quá trình chế biến các sản phẩm từ táo, hàm lượng patulin được coi là thước đo để đánh giá chất lượng táo nguyên liệu. Patulin có khả năng kháng khuẩn nhưng cũng có độc tính gen, do đó có thể gây ung thư [17].
Trong một ví dụ khác, Healy và cộng sự phát hiện ra quá trình sinh tổng hợp thaxtomin, một loại độc tố thực vật gây bệnh đóng vảy ở khoai tây, có sự tham gia của P450 từ chủng S.