Luận án tiến sĩ về gen mã hóa protein ức chế protease từ vi sinh vật Spheciospongia vesparium ở miền Trung Việt Nam

• Tác giả: Trần Thị Hồng
• Người hướng dẫn: PGS.NCVCC Phạm Việt Cường
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu gen mã hóa protein ức chế protease từ vi sinh vật hải miên Spheciospongia vesparium tại miền Trung Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• 3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 4. CHƯƠNG I: Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên
• 4.1. Giới thiệu về hải miên
• 5. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. Vật liệu nghiên cứu
• 5.2. Đối tượng nghiên cứu
• 5.3. Dung dịch và môi trường sử dụng
• 5.4. Phương pháp nghiên cứu
• 5.4.1. Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên
• 5.4.2. Định danh hải miên bằng sinh học phân tử
• 5.4.3. Phân tích dữ liệu metagenomics
• 5.4.4. Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế plasmid mang gen PIs
• 5.4.5. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E. coli
• 5.4.6. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris
• 5.4.7. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease
• 5.4.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp
• 5.4.9. Phân tích thống kê
• 6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 6.1. Thu thập mẫu hải miên
• 6.2. Kết quả tách chiết DNA metagenome
• 6.2.1. Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị
• 6.2.2. Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử
• 6.2.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt Nam bằng tin sinh học
• 6.2.4. Lắp ráp reads của DNA metagenome
• 6.2.5. Kết quả dự đoán gen
• 6.2.6. Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen
• 6.2.7. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị
• 6.2.8. Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ liệu (CSDL) metagenomics
• 6.3. Nghiên cứu biểu hiện ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia coli
• 6.3.1. Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT
• 6.4. Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs
• 6.4.1. Biểu hiện gen PIs trong E. coli chủng BL21(DE3)
• 6.4.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT ở trạng thái tan cao nhất
• 6.4.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng khối phổ
• 6.4.4. Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease
• 6.5. Nghiên cứu biểu hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men Pichia pastoris
• 6.5.1. Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT
• 6.5.2. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT
• 6.5.3. Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men Pichia pastoris
• 6.5.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm men
• 6.5.5. Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 %
• 6.5.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện PIs
• 6.5.7. Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men P. pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B
• 6.5.8. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT
• 7. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên

Hải miên là một nhóm động vật đa bào nguyên thủy, có cấu trúc tế bào tách biệt và sống bám. Chúng có khả năng sống trong nhiều môi trường khác nhau, từ vùng cực đến hệ sinh thái rạn san hô nhiệt đới. Hải miên được chia thành bốn lớp chính: Calcarea, Demospongia, Hexactinellida và Homoscleromorpha. Đặc biệt, lớp Demospongia chiếm khoảng 83,4% tổng số loài. Vi sinh vật liên kết với hải miên đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, trong đó có các chất ức chế protease. Việc nghiên cứu các vi sinh vật này có thể giúp phát hiện và khai thác các gen có hoạt tính sinh học mới, phục vụ cho y dược và công nghệ sinh học.

1.1. Đặc điểm sinh học của hải miên

Hải miên có hình dạng và kích thước đa dạng, từ vài milimet đến vài mét. Chúng chủ yếu là động vật ăn lọc, xử lý hàng trăm lít nước biển mỗi ngày để lấy dinh dưỡng. Cấu trúc cơ thể của hải miên được giữ vững bởi mô liên kết và các thành phần khung như gai, canxi hoặc silic. Hải miên cũng có khả năng tạo ra các hợp chất hoạt tính sinh học, với khoảng 4851 hợp chất đã được phát hiện từ năm 2014, chiếm gần 30% tổng số hợp chất tự nhiên từ biển.

II. Nghiên cứu gen mã hóa protein ức chế protease

Nghiên cứu gen mã hóa protein ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium tại miền Trung Việt Nam đã được thực hiện nhằm phát hiện và sàng lọc các gen có hoạt tính sinh học. Phương pháp metagenomics được áp dụng để tách chiết DNA từ vi sinh vật, xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA. Dữ liệu metagenomics được phân tích để đánh giá đa dạng sinh học và khai thác các gen có hoạt tính ức chế protease. Việc biểu hiện gen trong hệ Escherichia coli và nấm men Pichia pastoris cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y dược.

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm tách chiết DNA metagenome từ vi sinh vật liên kết hải miên, phân tích dữ liệu metagenomics và đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp. Các gen có hoạt tính ức chế protease được khai thác từ cơ sở dữ liệu metagenomics và biểu hiện thành công trong hệ Escherichia coli và Pichia pastoris. Kết quả cho thấy protein PI-QT có khả năng ức chế các protease như trypsin và ɑ-chymotrypsin, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển thuốc điều trị.

III. Đánh giá và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam. Việc phát hiện gen mới PI-QT mã hóa cho protein ức chế protease có thể ứng dụng trong y dược, đặc biệt trong điều trị các bệnh liên quan đến protease. Các kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng lớn trong việc khai thác nguồn gen từ vi sinh vật biển để phát triển các sản phẩm sinh học mới.

3.1. Tác động sinh học và kinh tế

Việc phát hiện và khai thác các protein ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao. Các protein này có thể được sử dụng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến protease, mở ra cơ hội cho việc phát triển các loại thuốc mới. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng góp phần nâng cao nhận thức về đa dạng sinh học và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển tại Việt Nam.