NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ YẾU TỐ PHIÊN MÃ NF-κB CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

Tìm hiểu nghiên cứu sàng lọc chất ức chế yếu tố phiên mã NF-κB, khám phá hoạt tính kháng viêm tiềm năng. Luận án tiến sĩ sinh học chuyên sâu.

• Tác giả: Đỗ Thị Thanh Huyền
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Hồng Vân
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sàng Lọc Chất Ức Chế Yếu Tố Phiên Mã Nf-κb Có Hoạt Tính Kháng Viêm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. RỐI LOẠN PHẢN ỨNG VIÊM VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN
• 1.1.1. Phản ứng viêm
• 1.1.1.1. Viêm cấp tính
• 1.1.1.2. Viêm mạn tính
• 1.1.2. Cơ chế phản ứng viêm
• 1.1.2.1. Kích hoạt các thụ thể bề mặt
• 1.1.2.2. Kích hoạt các con đường viêm
• 1.1.2.3. Giải phóng các chất trung gian của phản ứng viêm
• 1.1.2.4. Thu hút các loại tế bào miễn dịch đến vị trí viêm để loại bỏ tác nhân gây viêm
• 1.1.3. Rối loạn phản ứng viêm liên quan tới nhiều căn bệnh khác nhau
• 1.1.3.1. Bệnh tim mạch
• 1.1.3.2. Bệnh đường ruột
• 1.1.3.3. Bệnh tiểu đường
• 1.1.3.4. Bệnh viêm đường hô hấp
• 1.1.3.5. Bệnh viêm thận
• 1.1.3.6. Bệnh ung thư
• 1.2. CÁC CON ĐƯỜNG TRUYỀN TIN CHÍNH TRONG PHẢN ỨNG VIÊM
• 1.2.1. Con đường axit arachidonic
• 1.2.2. Con đường MAPK
• 1.2.3. Con đường NF-κB
• 1.2.3.1. Các yếu tố phiên mã NF-κB
• 1.2.3.2. Con đường truyền tin NF-κB
• 1.3. VAI TRÒ CỦA NF-κB TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÁC THUỐC KHÁNG VIÊM
• 1.3.1. Con đường NF-κB và các bệnh liên quan
• 1.3.1.1. Mối liên quan giữa NF-κB và các bệnh rối loạn phản ứng viêm
• 1.3.1.2. Mối liên quan giữa NF-κB và ung thư
• 1.3.2. Các đích tác dụng thuốc tiềm năng của con đường NF-κB
• 1.4. SÀNG LỌC CÁC CHẤT ỨC CHẾ YẾU TỐ PHIÊN MÃ NF-κB CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM
• 1.4.1. Sàng lọc các chất ức chế con đường NF-κB bằng gen chỉ thị
• 1.4.2. Sàng lọc chất ức chế con đường NF-κB bằng phương pháp in silico
• 1.4.3. Đánh giá khả năng ức chế protein NF-κB p50 và p65 bằng phương pháp EMSA
• 1.4.4. Đánh giá khả năng ức chế con đường NF-κB bằng mô hình tế bào RAW264
• 1.4.5. Đánh giá khả năng kháng viêm in vivo sử dụng mô hình động vật
• 1.5. NGUỒN DƯỢC LIỆU KHÁNG VIÊM TIỀM NĂNG TẠI VIỆT NAM
• 1.5.1. Cây xương sông – tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới
• 1.5.2. Cây giổi móc – tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG THỂ
• 2.3. SÀNG LỌC IN SILICO BẰNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING
• 2.3.1. Sàng lọc in silico thông lượng cao
• 2.3.1.1. Chuẩn bị cấu trúc 3D của protein p50 và p65 cho sàng lọc in silico
• 2.3.1.2. Chuẩn bị thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên
• 2.3.1.3. Sàng lọc ảo
• 2.3.2. Sàng lọc và đánh giá tương tác phân tử sử dụng Autodock Vina
• 2.3.2.1. Chuẩn bị cấu trúc 3D của protein đích thuộc con đường NF-κB, MAPK và AA
• 2.3.2.2. Chuẩn bị cấu trúc của các hợp chất tự nhiên
• 2.3.2.3. Phân tích docking
• 2.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTIEN NF-κB p50 VÀ p65 VỚI κB DNA
• 2.4.1. Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch NF-κB p50 và p65
• 2.4.1.1. Nhân dòng gen mã hóa protein NF-κB p50 và p65
• 2.4.1.2. Chèn đoạn gen vào vectơ biểu hiện
• 2.4.1.3. Đọc trình tự gen
• 2.4.1.4. Biểu hiện protein NF-κB p50 và p65 tái tổ hợp
• 2.4.1.5. Tinh sạch protein NF-κB p50 và p65 tái tổ hợp sử dụng sắc ký ái lực với niken
• 2.4.2. Đánh giá khả năng ức chế tương tác của protein NF-κB với κB DNA bằng phương pháp EMSA
• 2.5. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM IN VITRO SỬ DỤNG MÔ HÌNH TẾ BÀO RAW264
• 2.5.1. Nuôi cấy tế bào RAW264
• 2.5.2. Đánh giá độc tính đối với tế bào RAW264
• 2.5.3. Đánh giá khả năng ức chế tổng hợp nitric oxide (NO) trong mô hình tế bào RAW264
• 2.5.4. Định lượng TNF-α và IL-6 bằng phương pháp ELISA
• 2.5.5. Định lượng protein bằng phương pháp Western blot
• 2.5.6. Phân tích định lượng mRNA của một số gen bằng RT-qPCR
• 2.6. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM IN VIVO SỬ DỤNG MÔ HÌNH CHUỘT SWISS
• 2.6.1. Nuôi động vật thí nghiệm
• 2.6.2. Đánh giá khả năng kháng viêm in vivo trên chuột Swiss
• 2.7. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM HƯỚNG ĐÍCH NF-κB TỪ DỊCH CHIẾT CÂY XƯƠNG SÔNG VÀ CÂY GIỔI MÓC
• 2.7.1. Thu thập mẫu cây xương sông và cây giổi móc
• 2.7.2. Phân tích thành phần dịch chiết bằng GC/MS
• 2.7.3. Đánh giá khả năng kháng viêm hướng đích NF-κB từ dịch chiết cây xương sông và cây giổi móc
• 2.8. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.9. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. SÀNG LỌC IN SILICO CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEIN NF-κB p50 VÀ p65 TỪ THƯ VIỆN HỢP CHẤT TỰ NHIÊN
• 3.1.1. Sàng lọc in silico chất ức chế protein NF-κB p50
• 3.1.2. Sàng lọc in silico chất ức chế protein NF-κB p65
• 3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN NF-κB p50, p65 VỚI κB DNA SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP EMSA
• 3.2.1. Nhân đoạn gen mã hóa NF-κB p50, p65 và chèn vào vectơ biểu hiện
• 3.2.1.1. Nhân đoạn gen mã hóa NF-κB p50 và chèn vào vectơ biểu hiện pET-M
• 3.2.1.2. Nhân đoạn gen mã hóa NF-κB p65 và chèn vào vectơ biểu hiện pET28a
• 3.2.2. Biểu hiện và tinh sạch protein NF-κB p50 và p65
• 3.2.2.1. Biểu hiện protein NF-κB p50 tái tổ hợp ở vi khuẩn E
• 3.2.2.2. Tinh sạch protein NF-κB p50 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột niken
• 3.2.2.3. Biểu hiện protein NF-κB p65 tái tổ hợp ở vi khuẩn E
• 3.2.2.4. Tinh sạch protein NF-κB p65 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột niken
• 3.2.3. Đánh giá khả ức chế tương tác giữa protein NF-κB với κB DNA sử dụng phương pháp EMSA
• 3.2.3.1. Khả năng ức chế protein NF-κB p50 tương tác với κB DNA của các chất 11- p50, 14-p50 và 24-p50
• 3.2.3.2. Khả năng ức chế protein NF-κB p65 tương tác với κB DNA của các chất 22- p65, 26-p65 và 31-p65
• 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA CHẤT 11-p50 VÀ CHẤT 14-p50 TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO RAW264
• 3.3.1. Đánh giá độc tính của các chất 11-p50 và 14-p50 với tế bào RAW264
• 3.3.2. Khả năng ức chế tổng hợp NO của 11-p50 và 14-p50 với tế bào RAW264
• 3.3.3. Khả năng ức chế tổng hợp TNF-α và IL-6 của các chất 11-p50 và 14-p50 trong mô hình RAW264
• 3.3.4. Thảo luận kết quả sàng lọc in silico và in vitro chất ức chế NF-κB
• 3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM THÔNG QUA ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA TINH DẦU CÂY XƯƠNG SÔNG SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH IN VITRO, IN VIVO VÀ IN SILICO
• 3.4.1. Thành phần hóa học của các loại tinh dầu xương sông (BEO)
• 3.4.2. Đánh giá độc tính của BEO đối với tế bào RAW264
• 3.4.3. Khả năng ức chế tổng hợp NO của BEO với tế bào RAW264
• 3.4.4. Khả năng ức chế sự biểu hiện mRNA và protein TNF-α và IL-6 của BEO trong mô hình tế bào RAW264
• 3.4.5. Khả năng ức chế sự biểu hiện gen iNOS và COX-2 của BEO trong mô hình tế bào RAW264
• 3.4.6. Khả năng ức chế con đường NF-κB của BEO trong mô hình tế bào RAW264
• 3.4.7. Khả năng kháng viêm của BEO trên mô hình phù bàn chân chuột bằng carrageenan
• 3.4.8. Đánh giá in silico khả năng kháng viêm của 30 chất trong tinh dầu cây xương sông sử dụng phương pháp docking
• 3.4.8.1. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp docking
• 3.4.8.2. Con đường chuyển hóa axit arachidonic
• 3.4.8.3. Con đường truyền tin NF-κB
• 3.4.8.4. Con đường truyền tin MAPK
• 3.4.9. Thảo luận tính kháng viêm của tinh dầu cây xương sông
• 3.5. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM THÔNG QUA ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA DỊCH CHIẾT METHANOL CÂY XƯƠNG SÔNG SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO, IN VIVO VÀ IN SILICO
• 3.5.1. Thành phần hóa học của dịch chiết methanol cây xương sông (Met_BL)
• 3.5.2. Đánh giá độc tính của dịch chiết Met_BL đối với tế bào RAW264
• 3.5.3. Khả năng ức chế tổng hợp NO của dịch chiết Met_BL trong mô hình tế bào RAW264
• 3.5.4. Khả năng ức chế sự biểu hiện của mRNA, protein TNF-α và IL-6 của dịch chiết Met_BL trong mô hình tế bào RAW264
• 3.5.5. Khả năng ức chế sự biểu hiện gen iNOS và COX-2 của dịch chiết Met_BL trong mô hình tế bào RAW264
• 3.5.6. Khả năng ức chế con đường NF-κB của dịch chiết Met_BL trong mô hình tế bào RAW264
• 3.5.7. Khả năng kháng viêm của dịch chiết Met_BL trên mô hình phù bàn chân chuột bằng carrageenan
• 3.5.8. Đánh giá in silico khả năng kháng viêm của 32 chất trong dịch chiết Met_BL sử dụng phương pháp docking
• 3.5.8.1. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp docking
• 3.5.8.2. Con đường chuyển hóa axit arachidonic
• 3.5.8.3. Con đường truyền tin NF-κB
• 3.5.8.4. Con đường truyền tin MAPK
• 3.5.8.5. Các interleukin gây viêm (IL-6, IL-23R)
• 3.5.9. Thảo luận tính kháng viêm của dịch chiết Met_BL
• 3.6. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM THÔNG QUA ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA TINH DẦU CÂY GIỔI MÓC SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO, IN VIVO VÀ IN SILICO
• 3.6.1. Thành phần hóa học của tinh dầu cây giổi móc
• 3.6.2. Đánh giá độc tính của tinh dầu cây giổi móc đối với tế bào RAW264
• 3.6.3. Khả năng ức chế tổng hợp NO của tinh dầu giổi móc trong mô hình tế bào RAW264
• 3.6.4. Khả năng ức chế biểu hiện protein iNOS và COX-2 của tinh dầu giổi móc trong mô hình tế bào RAW264
• 3.6.5. Khả năng ức chế con đường NF-κB của tinh dầu giổi móc trong mô hình tế bào RAW264
• 3.6.6. Khả năng kháng viêm của tinh dầu giổi móc trên mô hình phù bàn chân chuột bằng carrageenan
• 3.6.7. Đánh giá in silico khả năng kháng viêm của 62 chất trong tinh dầu giổi móc sử dụng phương pháp docking
• 3.6.7.1. Con đường chuyển hóa axit arachidonic
• 3.6.7.2. Con đường truyền tin NF-κB
• 3.6.7.3. Con đường truyền tin MAPK
• 3.6.7.4. Các interleukin gây viêm (IL-6, IL-23R)
• 3.6.8. Thảo luận tính kháng viêm của tinh dầu cây giổi móc
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Kết quả sàng loc ảo in silico thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên với protein p50
• Kết quả sàng lọc ảo in silico thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên với protein p65
• Hình ảnh phân tích tương tác giữa p50 với 40 chất phân tích bằng công cụ Autodock Vina
• Hình ảnh phân tích tương tác giữa p65 với 40 chất phân tích bằng công cụ Autodock Vina
• Kết quả tạo plasmid tái tổ hợp p50 và p65
• Dữ liệu của các biểu đồ và hình ảnh thu được trong các kết quả nghiên cứu

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Sàng Lọc Chất Ức Chế NF κB Cơ Sở Khoa Học 55 ký tự

Luận án tiến sĩ này tập trung vào nghiên cứu sàng lọc các chất ức chế NF-κB có khả năng kháng viêm. NF-κB là một yếu tố phiên mã quan trọng tham gia vào điều hòa các gen liên quan đến phản ứng viêm và miễn dịch. Sự kích hoạt quá mức của NF-κB có liên quan đến nhiều bệnh lý như bệnh viêm khớp, bệnh viêm ruột, ung thư và các bệnh tự miễn. Do đó, việc phát triển các chất ức chế NF-κB hiệu quả là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị các bệnh này. Luận án sử dụng các phương pháp tiếp cận đa dạng, từ sàng lọc in silico đến các thí nghiệm in vitro và in vivo, nhằm xác định và đánh giá tiềm năng kháng viêm của các hợp chất khác nhau. Mục tiêu cuối cùng là tìm ra các ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển các loại thuốc kháng viêm mới, nhắm mục tiêu vào con đường NF-κB. Nghiên cứu này đóng góp vào sự hiểu biết sâu sắc hơn về vai trò của NF-κB trong bệnh tật và cung cấp nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.

1.1. Vai trò NF κB trong Phản Ứng Viêm và Bệnh Tật

NF-κB đóng vai trò trung tâm trong việc điều hòa biểu hiện của nhiều gen liên quan đến phản ứng viêm. Khi được kích hoạt, NF-κB sẽ di chuyển vào nhân và kích hoạt phiên mã các gen mã hóa các cytokine gây viêm, chemokine, các phân tử kết dính và các enzyme như iNOS và COX-2. Sự kích hoạt liên tục của NF-κB có thể dẫn đến viêm mãn tính và góp phần vào sự phát triển của nhiều bệnh lý khác nhau. Nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan mật thiết giữa NF-κB và các bệnh như viêm khớp dạng thấp, bệnh Crohn, hen suyễn và ung thư. Việc ức chế hoạt động của NF-κB có thể giúp giảm viêm và cải thiện tình trạng bệnh.

1.2. Tiềm Năng của Chất Ức Chế NF κB trong Điều Trị Bệnh

Do vai trò quan trọng của NF-κB trong phản ứng viêm, việc phát triển các chất ức chế NF-κB đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn trong việc điều trị các bệnh liên quan đến viêm. Các chất ức chế NF-κB có thể tác động lên nhiều bước khác nhau trong con đường tín hiệu NF-κB, từ việc ngăn chặn sự kích hoạt của yếu tố phiên mã đến ức chế sự liên kết của NF-κB với DNA. Một số chất ức chế NF-κB đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc giảm viêm và cải thiện triệu chứng ở các mô hình bệnh in vitro và in vivo. Các nghiên cứu lâm sàng cũng đang được tiến hành để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của các chất ức chế NF-κB trong điều trị các bệnh viêm ở người.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Chất Ức Chế NF κB Kháng Viêm Hiện Nay 59 ký tự

Mặc dù tiềm năng của chất ức chế NF-κB trong điều trị bệnh là rất lớn, nhưng việc phát triển các loại thuốc nhắm mục tiêu vào con đường NF-κB cũng đối mặt với nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là tính đặc hiệu của chất ức chế. NF-κB tham gia vào nhiều quá trình sinh học quan trọng, do đó việc ức chế hoàn toàn NF-κB có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn. Thêm vào đó, việc phát triển các chất ức chế NF-κB có khả năng xâm nhập vào tế bào và tác động lên các mục tiêu cụ thể trong con đường tín hiệu NF-κB cũng là một thách thức lớn. Luận án này tập trung vào việc giải quyết một số thách thức này bằng cách sử dụng các phương pháp sàng lọc hiệu quả và đánh giá tiềm năng kháng viêm của các hợp chất tự nhiên từ dược liệu Việt Nam.

2.1. Tính Đặc Hiệu và Tác Dụng Phụ của Chất Ức Chế NF κB

Việc ức chế NF-κB một cách không chọn lọc có thể ảnh hưởng đến các quá trình sinh học quan trọng khác, dẫn đến các tác dụng phụ không mong muốn. Do đó, một trong những thách thức lớn nhất trong việc phát triển chất ức chế NF-κB là tìm ra các hợp chất có tính đặc hiệu cao, chỉ tác động lên NF-κB trong các tế bào viêm mà không ảnh hưởng đến các tế bào khỏe mạnh. Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào việc phát triển các chất ức chế nhắm mục tiêu vào các isoform cụ thể của NF-κB hoặc các protein tương tác với NF-κB, nhằm tăng tính chọn lọc và giảm tác dụng phụ.

2.2. Khả Năng Xâm Nhập Tế Bào và Tác Động Hướng Đích

Để có hiệu quả, chất ức chế NF-κB cần có khả năng xâm nhập vào tế bào và tác động lên các mục tiêu cụ thể trong con đường tín hiệu NF-κB. Tuy nhiên, nhiều hợp chất có tiềm năng kháng viêm lại có khả năng xâm nhập tế bào kém hoặc bị chuyển hóa nhanh chóng trong cơ thể. Do đó, việc cải thiện khả năng xâm nhập tế bào và dược động học của chất ức chế NF-κB là một thách thức quan trọng. Các nhà nghiên cứu đang sử dụng các phương pháp như thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, sử dụng các hệ thống vận chuyển thuốc nano và phát triển các tiền thuốc để giải quyết vấn đề này.

III. Phương Pháp Sàng Lọc In Silico Chất Ức Chế NF κB Mới 55 ký tự

Luận án này sử dụng phương pháp sàng lọc in silico để xác định các hợp chất có tiềm năng ức chế NF-κB. Sàng lọc in silico là một phương pháp hiệu quả để sàng lọc một số lượng lớn các hợp chất trong một khoảng thời gian ngắn, giảm thiểu chi phí và thời gian so với các phương pháp sàng lọc truyền thống. Trong nghiên cứu này, một thư viện gồm 200.000 hợp chất tự nhiên đã được sử dụng để sàng lọc các chất có khả năng liên kết với các protein đích trong con đường NF-κB, như p50 và p65. Các hợp chất có điểm số liên kết cao được chọn lọc và đánh giá thêm bằng các thí nghiệm in vitro và in vivo. Phương pháp docking được sử dụng để mô phỏng tương tác giữa các chất và protein, từ đó đánh giá khả năng liên kết và ức chế của các chất. Kết quả sàng lọc cung cấp một danh sách các ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển các chất ức chế NF-κB mới.

3.1. Chuẩn Bị Thư Viện Hợp Chất Tự Nhiên và Protein Đích

Việc chuẩn bị thư viện hợp chất và protein đích là một bước quan trọng trong sàng lọc in silico. Thư viện hợp chất cần chứa một số lượng lớn các hợp chất đa dạng về cấu trúc và tính chất hóa học, bao gồm cả các hợp chất tự nhiên, bán tổng hợp và tổng hợp. Các protein đích cần được chuẩn bị ở dạng cấu trúc 3D chất lượng cao, có thể thu được từ các cơ sở dữ liệu protein hoặc bằng các phương pháp mô hình hóa cấu trúc protein. Trong nghiên cứu này, thư viện gồm 200.000 hợp chất tự nhiên đã được sử dụng và cấu trúc 3D của protein p50 và p65 đã được lấy từ Protein Data Bank.

3.2. Thực Hiện Sàng Lọc Ảo và Đánh Giá Tương Tác Phân Tử

Sau khi chuẩn bị thư viện hợp chất và protein đích, quá trình sàng lọc ảo được thực hiện bằng cách sử dụng các phần mềm docking như AutoDock Vina. Phần mềm docking sẽ mô phỏng quá trình liên kết giữa các hợp chất và protein đích, tính toán điểm số liên kết và dự đoán cấu trúc phức hợp. Các hợp chất có điểm số liên kết cao được chọn lọc và đánh giá thêm bằng các phương pháp phân tích tương tác phân tử, như phân tích các liên kết hydro, tương tác hydrophobic và tương tác tĩnh điện. Các phân tích này giúp xác định các tương tác quan trọng giữa các hợp chất và protein, từ đó đánh giá khả năng ức chế của các hợp chất.

IV. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Viêm In Vitro Trên Mô Hình Tế Bào 58 ký tự

Sau khi xác định được các ứng cử viên tiềm năng từ sàng lọc in silico, luận án tiến hành đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này trên mô hình tế bào in vitro. Tế bào RAW264.7, một dòng tế bào đại thực bào, được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sản xuất các cytokine gây viêm như TNF-α và IL-6, cũng như các enzyme như iNOS và COX-2. Các hợp chất có hoạt tính kháng viêm tốt trên mô hình tế bào sẽ được đánh giá thêm trên mô hình động vật in vivo. Phương pháp Western Blot và RT-qPCR được sử dụng để định lượng protein và mRNA của các gen liên quan đến phản ứng viêm. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng về khả năng kháng viêm của các hợp chất được sàng lọc và giúp xác định các cơ chế tác động của chúng.

4.1. Ức Chế Sản Xuất Cytokine Gây Viêm TNF α IL 6

Cytokine như TNF-α và IL-6 đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa phản ứng viêm. Việc ức chế sản xuất các cytokine này có thể giúp giảm viêm và cải thiện tình trạng bệnh. Các chất ức chế NF-κB có thể ức chế sản xuất TNF-α và IL-6 bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt của yếu tố phiên mã NF-κB hoặc bằng cách tác động lên các con đường tín hiệu khác liên quan đến sản xuất cytokine. Trong nghiên cứu này, các hợp chất được đánh giá về khả năng ức chế sản xuất TNF-α và IL-6 trong tế bào RAW264.7 được kích thích bằng LPS.

4.2. Giảm Biểu Hiện Enzyme iNOS và COX 2 Trong Tế Bào

iNOS và COX-2 là các enzyme xúc tác sản xuất NO và prostaglandin, các chất trung gian gây viêm quan trọng. Việc ức chế hoạt động của iNOS và COX-2 có thể giúp giảm viêm và giảm đau. Các chất ức chế NF-κB có thể ức chế biểu hiện của iNOS và COX-2 bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt của yếu tố phiên mã NF-κB hoặc bằng cách tác động lên các yếu tố phiên mã khác liên quan đến biểu hiện của các enzyme này. Nghiên cứu này đánh giá khả năng của các hợp chất trong việc giảm biểu hiện mRNA và protein của iNOS và COX-2 trong tế bào RAW264.7.

V. Đánh Giá Khả Năng Kháng Viêm In Vivo Trên Mô Hình Chuột 56 ký tự

Để xác nhận hoạt tính kháng viêm của các hợp chất được sàng lọc, luận án tiến hành đánh giá trên mô hình động vật in vivo. Mô hình chuột Swiss bị gây viêm bằng carrageenan được sử dụng để đánh giá khả năng giảm phù nề của các hợp chất. Các hợp chất được tiêm cho chuột trước khi gây viêm và mức độ phù nề được đo trong khoảng thời gian nhất định. Các kết quả từ mô hình động vật cung cấp bằng chứng về hiệu quả kháng viêm của các hợp chất trong điều kiện in vivo, và giúp xác định các ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển thuốc.

5.1. Sử Dụng Mô Hình Phù Bàn Chân Chuột Gây Viêm

Mô hình phù bàn chân chuột gây viêm bằng carrageenan là một mô hình thường được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất. Carrageenan là một polysaccharide có thể gây ra phản ứng viêm cấp tính ở bàn chân chuột, dẫn đến phù nề và tăng sinh các tế bào viêm. Các hợp chất có khả năng ức chế phản ứng viêm do carrageenan gây ra có thể được coi là có hoạt tính kháng viêm. Trong nghiên cứu này, mô hình phù bàn chân chuột được sử dụng để đánh giá khả năng giảm phù nề của các hợp chất được sàng lọc.

5.2. Đánh Giá Ảnh Hưởng Lên Các Dấu Ấn Sinh Học

Ngoài việc đánh giá mức độ phù nề, nghiên cứu cũng đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất lên các dấu ấn sinh học liên quan đến phản ứng viêm, như mức độ cytokine trong huyết thanh và biểu hiện của các gen liên quan đến viêm trong mô. Việc đánh giá các dấu ấn sinh học này cung cấp thông tin về cơ chế tác động của các hợp chất và giúp xác định các mục tiêu tác động của chúng. Các dấu ấn sinh học được đánh giá trong nghiên cứu này bao gồm TNF-α, IL-6, iNOS và COX-2.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về NF κB 53 ký tự

Luận án tiến sĩ này đã thành công trong việc xác định một số hợp chất có tiềm năng ức chế NF-κB và có hoạt tính kháng viêm trên cả mô hình in vitro và in vivo. Các kết quả này cung cấp cơ sở cho việc phát triển các loại thuốc kháng viêm mới, nhắm mục tiêu vào con đường NF-κB. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá đầy đủ tính an toàn và hiệu quả của các hợp chất này, cũng như để xác định cơ chế tác động chính xác của chúng. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc của các hợp chất, cải thiện khả năng xâm nhập tế bào và dược động học, và tiến hành các thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả của chúng trong điều trị các bệnh viêm ở người.

6.1. Tối Ưu Hóa Cấu Trúc và Cải Thiện Dược Động Học

Để phát triển các chất ức chế NF-κB hiệu quả hơn, cần có các nghiên cứu để tối ưu hóa cấu trúc của các hợp chất và cải thiện dược động học của chúng. Việc tối ưu hóa cấu trúc có thể giúp tăng khả năng liên kết của các hợp chất với protein đích, tăng tính đặc hiệu và giảm tác dụng phụ. Việc cải thiện dược động học có thể giúp tăng khả năng xâm nhập tế bào, kéo dài thời gian bán thải và tăng nồng độ của các hợp chất tại vị trí viêm.

6.2. Thử Nghiệm Lâm Sàng và Ứng Dụng Thực Tiễn

Sau khi các hợp chất đã được tối ưu hóa và đánh giá về tính an toàn và hiệu quả trong các mô hình tiền lâm sàng, cần tiến hành các thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả của chúng trong điều trị các bệnh viêm ở người. Các thử nghiệm lâm sàng cần được thiết kế cẩn thận để đảm bảo tính khách quan và tin cậy của kết quả. Nếu các thử nghiệm lâm sàng thành công, các hợp chất có thể được phát triển thành các loại thuốc mới để điều trị các bệnh viêm mạn tính.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Viêm là phản ứng quan trọng của hệ miễn dịch giúp chống lại các tổn thương mô hoặc các kích thích ngoại lai như mầm bệnh, chất gây dị ứng, hóa chất độc hại hoặc tia phóng xạ [106]. Các phản ứng viêm thường có lợi cho cơ thể, giúp cơ thể loại bỏ tác nhân gây viêm, sửa chữa tổn thương và đưa cơ thể trở về trạng thái cân bằng. Tuy nhiên, khi phản ứng viêm bị rối loạn sẽ gây khởi phát và tiến triển nhiều loại bệnh khác nhau như bệnh tim mạch, bệnh đường ruột, bệnh tiểu đường, bệnh hô hấp, bệnh thận, bệnh tự miễn và nhiều loại ung thư [12, 142, 180]. Các thuốc kháng viêm được sử dụng rộng rãi hiện nay đều tiềm ẩn nguy cơ gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn đối với dạ dày, thận, gan [37].

Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm và sàng lọc các loại thuốc mới có tác dụng kháng viêm và ngừa ung thư, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ thực vật, ít tác dụng phụ là nhu cầu cấp thiết. Đích đến của các loại thuốc kháng viêm là các con đường truyền tin chính gây ra phản ứng viêm như NF-κB (Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) và AA (Arachidonic acid). Trong các con đường truyền tin gây ra phản ứng viêm, con đường truyền tin NF-κB đóng vai trò quan trọng nhất. Do vậy, việc sàng lọc các chất có khả năng kháng viêm hướng đích NF-κB là hết sức cần thiết và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu [60].

Để tìm ra các thuốc kháng viêm tiềm năng cần có những mô hình sàng lọc và đánh giá khả năng kháng viêm thích hợp. Các hướng sàng lọc thuốc kháng viêm hiện nay tập trung vào 3 hướng chính: (1) sàng lọc in silico bằng công cụ tin sinh, (2) sàng lọc in vitro trên mô hình tế bào và (3) sàng lọc in vivo trên mô hình động vật. Mỗi mô hình sàng lọc có một lợi thế riêng. Mô hình sàng lọc in silico (sàng lọc ảo) dựa vào các công cụ tin sinh có ưu điểm là giá thành rẻ, cho kết quả nhanh, sàng lọc ở quy mô lớn.

Tuy nhiên, nhược điểm của mô hình này là có sai số giữa tính toán lý thuyết và kết quả thử nghiệm trên mô hình tế bào và mô hình động vật. Mô hình tế bào động vật, đặc biệt là mô hình đại thực bào RAW264.7 của chuột, được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sàng lọc và đánh giá hiệu quả của các chất kháng viêm tiềm năng ở mức độ in vitro [46]. Tuy nhiên, so với sàng lọc in silico, 16 mô hình này có nhược điểm là giá thành cao, khó đánh giá được lượng rất lớn các chất khác nhau trong thời gian ngắn. Mô hình động vật là mô hình quan trọng trong việc sàng lọc, phát triển các thuốc kháng viêm tiềm năng mới.

Trong các mô hình động vật, mô hình động vật gây viêm bằng carrageenan được sử dụng rộng rãi [103] do carrageenan gây viêm cấp tính tại chỗ, không sinh miễn dịch và cho kết quả có độ lặp lại cao [109, 129]. Để sàng lọc hiệu quả các chất kháng viêm tiềm năng thì việc kết hợp được cả ba hướng sàng lọc in silico, in vitro và in vivo là hết sức cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc và tìm kiếm các chất có tiềm năng kháng viêm và ngừa ung thư hướng đích NF-κB bằng việc kết hợp 3 mô hình sàng lọc in silico, in vitro và in vivo, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sàng lọc chất ức chế yếu tố phiên mã NF-κB có hoạt tính kháng viêm”. Mục tiêu nghiên cứu: 1.

Sàng lọc được ít nhất hai chất có khả năng ức chế protein NF-κB p50 hoặc p65 từ thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên bằng hai phương pháp sàng lọc (1) sàng lọc in silico và (2) sàng lọc in vitro. Đánh giá khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của dịch chiết cây xương sông, cây giổi móc ở Việt Nam sử dụng các phương pháp phân tích in silico, in vitro và in vivo. Nội dung nghiên cứu: 1. Tạo thư viện cấu trúc 200.000 hợp chất tự nhiên, từ đó sàng lọc in silico được ít nhất 6 chất có tiềm năng ức chế protein NF-κB p50 hoặc p65.

Đánh giá khả năng ức chế tương tác giữa protein NF-κB (p50 hoặc p65) với κB DNA của 6 chất ức chế tiềm năng (thu được từ sàng lọc ảo) trong điều kiện in vitro sử dụng phương pháp EMSA và mô hình tế bào RAW264.7 để tìm ra ít nhất hai chất có khả năng ức chế protein NF-κB p50 hoặc p65. Đánh giá khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của tinh dầu và dịch chiết methanol cây xương sông ở Việt Nam sử dụng các phương pháp phân tích in silico, in vitro và in vivo. Đánh giá khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của tinh dầu cây giổi móc sử dụng các phương pháp phân tích in silico, in vitro và in vivo. Đóng góp mới của luận án: 1.

Sàng lọc được 02 chất có tiềm năng ức chế protein NF-κB p50 từ thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên. Đây là nghiên cứu đầu tiên đánh giá được khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của tinh dầu, dịch chiết methanol cây xương sông và tinh dầu cây giổi móc ở Việt Nam sử dụng các phương pháp phân tích in silico, in vitro và in vivo. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Luận án đã sàng lọc được hai chất có tiềm năng kháng viêm thông qua việc ức chế protein NF-κB p50 từ thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên. Các kết quả này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc phát triển các loại thuốc kháng viêm mới.

Luận án đã đánh giá được khả năng kháng viêm của dịch chiết methanol cây xương sông, tinh dầu cây xương sông, tinh dầu cây giổi móc; đồng thời chỉ ra được đích kháng viêm của các chất có trong các dịch chiết là các protein đích của con đường NF-κB như TNF-α, IL-6, iNOS, COX-2, p-IκBα và p-p65. Các kết quả này cho thấy tiềm năng khai thác và ứng dụng dịch chiết cây xương sông và cây giổi móc trong việc điều trị các bệnh liên quan đến phản ứng viêm. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. RỐI LOẠN PHẢN ỨNG VIÊM VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN 1.

Phản ứng viêm Viêm là phản ứng của hệ thống miễn dịch nhằm loại bỏ các kích thích có hại đối với cơ thể [106]. Các kích thích gây viêm có hại rất đa dạng bao gồm các tác nhân bên ngoài như vi sinh vật, tác nhân cơ học, vật lý, hóa học, hay các tác nhân bên trong cơ thể như các tổn thương tế bào, mô cơ thể (tắc mạch, xuất huyết), rối loạn thần kinh, phản ứng tự miễn, v. Phản ứng viêm là một quá trình bệnh lý phức tạp với các dấu hiệu gồm sưng, nóng, đỏ, đau và có thể gây rối loạn chức năng cơ thể [155]. Chức năng của phản ứng viêm là nhằm loại bỏ tác nhân gây viêm, sửa chữa các tổn thương và đưa cơ thể trở về trạng thái cân bằng ban đầu.

Phản ứng viêm có thể được chia làm hai loại là viêm cấp tính và viêm mạn tính. Viêm cấp tính Viêm cấp tính diễn ra trong thời gian ngắn từ vài phút đến vài ngày, có đáp ứng tức thời và sớm với tổn thương, có đặc điểm tiết dịch chứa nhiều protein huyết tương và xuất hiện nhiều bạch cầu đa nhân trung tính. Khả năng đáp ứng trong viêm cấp tính là huy động bạch cầu tới vị trí tổn thương để giúp làm sạch vi khuẩn và các tác nhân gây viêm khác, đồng thời tiêu hủy các mô hoại tử do viêm gây ra. Tuy nhiên, chính bạch cầu lại có thể kéo dài phản ứng viêm và gây tổn thương mô do giải phóng các enzyme, chất trung gian hóa học và các gốc oxi hóa có độc tính.

Những phản ứng cấp tính này là do sự can thiệp của hai yếu tố: yếu tố thần kinh là sự tê liệt các dây thần kinh co mạch ở các mao mạch và yếu tố thể dịch là sự giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, bradykinin…[30]. Viêm mạn tính Viêm mạn tính là quá trình viêm kéo dài, có thể từ vài tháng tới vài năm. Viêm mạn tính có thể xảy ra theo sau viêm cấp do đáp ứng viêm cấp không thành công, không loại bỏ được tín hiệu gây viêm. Có những trường hợp viêm mạn tính do sự tiếp xúc liên tục và kéo dài với hóa chất độc hại, khói, bụi.

Điều này góp phần gây ra viêm mạn tính và khởi phát nhiều bệnh liên quan. Viêm mạn tính bao gồm các biểu hiện như tiết dịch nhưng sưng đỏ và nóng không rõ ràng hoặc không có; chức năng mô và cơ quan ít bị ảnh hưởng hoặc chỉ suy giảm chậm chạp; hiện tượng huy động bạch cầu, tăng bạch cầu trung tính vẫn có nhưng không rõ rệt; vẫn có hiện tượng thực bào tại ổ viêm nhưng không mạnh mẽ, chỉ đủ sức khống chế yếu tố gây viêm mà không loại trừ được các yếu tố gây viêm [47]. Cơ chế phản ứng viêm Phản ứng viêm kích hoạt các con đường truyền tin và điều tiết các chất trung gian gây viêm trong các tế bào, mô. Phản ứng viêm rất đa dạng và phức tạp, phụ thuộc vào bản chất của các yếu tố kích thích ban đầu và vị trí kích thích viêm trong cơ thể.

Tuy nhiên, tất cả các phản ứng viêm đều bao gồm các bước như sau: 1) Kích hoạt các thụ thể bề mặt tế bào bởi các tác nhân gây viêm; 2) Kính hoạt các con đường viêm bên trong tế bào; 3) Giải phóng các sản phẩm của phản ứng viêm; và 4) Thu hút các tế bào miễn dịch đến vị trí viêm để loại bỏ tác nhân gây viêm, tiêu diệt mầm bệnh và sửa chữa tổn thương [98]. Kích hoạt các thụ thể bề mặt Khi xuất hiện các tác nhân gây viêm, phản ứng viêm trong cơ thể được kích hoạt thông qua các thụ thể trên bề mặt của các tế bào miễn dịch và tế bào không miễn dịch. Các nhóm thụ thể bề mặt bao gồm thụ thể giống Toll (TLR), thụ thể lectin loại C (CLR), thụ thể RIG và thụ thể giống NOD (NLR). Thụ thể TLR với hơn 10 thành viên đã được phát hiện cho đến nay là nhóm thụ thể bề mặt quan trọng kích hoạt các tín hiệu nội bào gây ra phản ứng viêm [30].

Kích hoạt các con đường viêm Các kích thích viêm kích hoạt các con đường truyền tin nội bào bao gồm (1) con đường MAPK, (2) con đường NF-κB, (3) con đường axit arachidonic (AA) và (4) con đường dẫn truyền tin Janus kinase (JAK).