MỞ ĐẦU Leptospirosis (bệnh xoắn khuẩn vàng da) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây ra bởi xoắn khuẩn thuộc chi Leptospira. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Leptospirosis là bệnh có khả năng lây truyền từ động vật sang người phổ biến nhất trên thế giới [1]. Hiện nay, các nhà khoa học đã định danh được 22 loài xoắn khuẩn, chia thành hơn 300 nhóm huyết thanh [2]. Ở Việt Nam đã phát hiện được 15 nhóm huyết thanh thường hay gây bệnh là: Leptospira interogans serovar Australis (L.
australis), Leptospira interogans serovar Autumnalis (L. autumnalis), Leptospira interogans serovar bataviae (L. bataviae), Leptospira interogans serovar Canicola (L. canicola), Leptospira interogans serovar grippotyphosa (L.
grippotyphosa), Leptospira interogans serovar icterohaemorrhagiae (L. icterohaemorrhagiae), Leptospira interogans serovar pomona (L. pomona), Leptospira interogans serovar saxkoebing (L. saxkoebing), Leptospira interogans serovar bratislava (L.
bratislava), Leptospira interogans serovar javancia (L. javancia), Leptospira interogans serovar panama (L. panama), Leptospira interogans serovar pyrogens (L. pyrogens), Leptospira interogans serovar hardjo (L.
hardjo), Leptospira interogans serovar tarassovi (L. tarassovi), và Leptospira interogans serovar patoc (L. Đặc điểm lâm sàng của Leptospirosis là hội chứng nhiễm khuẩn nhiễm độc toàn thân và tổn thương gan, thận [4]. Bệnh cũng có thể làm sảy thai và thai chết lưu ở động vật gây ra thiệt hại kinh tế rất lớn cho ngành chăn nuôi [5].
Bệnh lây sang người thông qua da, niêm mạc, hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vật mắc bệnh. Người nhiễm bệnh có thể có nhiều biểu hiện lâm sàng khác nhau, trong đó, biểu hiện nặng nhất là hội chứng Weil có thể gây tử vong [6]. Ở thời điểm hiện tại, Leptospirosis không còn là mối đe dọa nghiêm trọng cho sức khỏe con người mà chủ yếu gây thiệt hại cho ngày chăn nuôi đối với các nước nhiệt đới và các nước có mức độ ô nhiễm môi trường cao [7]. Do vậy, việc chế tạo một vắc xin đặc hiệu phòng bệnh xoắn khuẩn là rất cần thiết cho việc ổn định phát triển kinh tế nông nghiệp.
2 Hiện nay, tại Việt Nam mới chỉ có một đơn vị trong nước sản xuất được vắc xin nhược độc phòng bệnh Leptospirosis cho động vật. Loại vắc xin này có nhiều điểm yếu cố hữu như khả năng bảo hộ hẹp, có nguy cơ gây bệnh cho đối tượng tiêm và chất lượng chủng giống khó đảm bảo qua thời gian dài. Việc chế tạo vắc xin tái tổ hợp hiện đang là xu hướng mới của thế giới do có thể loại bỏ được các điểm yếu của các loại vắc xin truyền thống. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa protein OmpL1 của chủng Leptospira spp.
trong Escherichia coli ” nhằm góp phần nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra trên động vật tại Việt Nam. Mục đích Tách dòng và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp OmpL1 của 5 chủng vi khuẩn Leptospira, làm tiền đề cho chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis tại Việt Nam. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Năm chủng Leptospira gây bệnh và hiện đang được sử dụng chế vắc xin vô hoạt và nhược độc tại Việt Nam. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Vắc xin chống lại bệnh Leptospirosis chế tạo từ protein tái tổ hợp OmpL1là một sản phẩm đã được chứng minh có tiềm năng cao qua nhiều nghiên cứu trước đây.
Sản phẩm hứa hẹn thay thế cho vắc xin bất hoạt đang được sử dụng tại Việt Nam nhờ các ưu điểm như khả năng bảo hộ rộng, ít nguy cơ gây hại cho con vật và chất lượng ổn định. Đề tài này nghiên cứu chế tạo protein tái tổ hợp OmpL1 làm nguyên liệu cho phát triển sản suất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Leptospirosis cho động vật tại Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA VÀ BỆNH LEPTPSPIROSIS 1.
Xoắn khuẩn Leptospira Chi Leptospira gồm hơn 20 loài được xác định dựa trên các nghiên cứu lai tạo DNA [8, 9]. Trong đó, chúng được chia thành hai nhóm chính: nhóm không gây bệnh và nhóm gây bệnh (phổ biến nhất là Leptospira interrogans). Chúng giống nhau về hình thái và một số đặc tính sinh học nhưng khác nhau về cấu trúc kháng nguyên và khả năng gây bệnh trên động vật [10].1: Xoắn khuẩn Leptospira interrogans (Nguồn: Depositphotos) Leptospira interrogans thuộc giới Monera, ngành Spirochaetes, họ Leptospiraceae, chi Leptospira. Các loài vi khuẩn này có kích thước nhỏ, dạng mảnh, đường kính 0.
Xoắn khuẩn có dạng các vòng xoắn sát nhau (15-20 vòng) khi được quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10000 lần, hai đầu vi khuẩn uốn cong như móc câu, không có lông, di động mạnh, nhanh theo kiểu xoáy và bật thẳng như lò xo. Xoắn khuẩn có 4 thể được phát hiện bằng phương pháp nhuộm thấm bạc Morosop, chúng bắt màu nâu đen trên nền vàng hoặc đỏ tím khi dung phương pháp nhuộm Giemsa [4]. Leptospira là vi khuẩn hiếu khí, phát triển ở 28oC trong môi trường có pH từ 7,2 đến 7,6. Môi trường nuôi cấy là thạch máu hoặc thạch thường có bổ sung 5-10% huyết thanh thỏ hoặc các môi trường có huyết thanh bò (bovine serum albumin – BSA).
Leptospira tồn tại rất lâu trong bùn lầy, nước đọng và trong gan chuột mà vẫn giữ được độc tính, tồn tại được ở -30oC. Chúng đề kháng kém với nhiệt độ, có thể bị tiêu diệt ở 56oC trong 10 phút, 5 phút ở 60oC, bị tiêu diệt nhanh chóng ở 100oC và các chất sát trùng thông thường như phenol, javen,…[4]. Giống như hầu hết các vi khuẩn, Leptospira cần sắt để phát triển [12]. interrogans có khả năng thu nhận sắt ở các dạng khác nhau [13].
interrogans cũng có thể lấy sắt từ heme, chất liên kết với hầu hết sắt trong cơ thể con người. Protein liên kết với hemin HbpA, có thể tham gia vào quá trình hấp thu hemin, đã được phát hiện trên bề mặt của L. Mặc dù các loài gây bệnh khác thiếu HbpA, nhưng một protein liên kết hemin khác, LipL41, có thể giải thích cho khả năng sử dụng hemin như một nguồn sắt của chúng [14]. Leptospira phân bố ở hầu khắp các khu vực trên thế giới ngoại trừ ở vùng cực.
Chúng sống sót tốt nhất trong điều kiện ấm áp, ẩm ướt và phổ biến nhất ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Thực trạng dịch tễ bệnh Leptospirosis 1. Trên thế giới Bệnh xoắn khuẩn (Leptospirosis), do vi khuẩn Leptospira gây ra, là bệnh có khả năng lây truyền từ động vật sang người phổ biến nhất trên thế giới [1]. Nó gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi bởi khả năng tác động đến động vật đang mang thai [5].
Bệnh xoắn khuẩn có mặt ở cả vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới, xảy ra nhiều hơn vào mùa xuân và mùa thu. 5 Bệnh xoắn khuẩn đã được ghi nhận ở khắp nơi trên thế giới, tập trung ở châu Phi, Nam Mỹ, châu Á và gây ra nhiều thiệt hại cho sức khỏe con người cũng như ngành chăn nuôi. Trong số các tác nhân trung gian truyền bệnh, các loài gặm nhấm như chuột được cho là nguồn lây truyền nguy hiểm nhất do sự phổ biến của chúng [1]. Bên cạnh đó, các loài động vật có vú khác cũng có khả năng truyền bệnh cao: chó, bò, thỏ, hươu,… điều này dẫn đến nguy cơ nhiễm bệnh cao hơn ở các khu vực kém phát triển do tiếp xúc nhiều với các loài động vật.2: Con đường lây truyền của bệnh Leptospirosis (Nguồn: Vernon Ansdell, 2012, Leptospirosis) Trước đây, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã thống kê mỗi năm có khoảng 7 -10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da với tỉ lệ ước tính từ 0.1- 1/100000 ở vùng khí hậu ôn đới và 10-100/100000 ở vùng khí hậu nhiệt đới.
Ở các vùng có nguy cơ bùng phát dịch cao như Đông Á, Nam Á, Đông Nam Á tỉ lệ này sẽ tăng lên trên 100/100000. Ở những nước đang phát triển, người mắc bệnh chủ yếu là nông dân và người nghèo [15]. Nhiều trận dịch Leptospirosis đã được ghi nhận và đặc biệt thường đi kèm các thảm họa thiên nhiên như tại Orrisa năm 1999, lũ lụt ở Jakarta năm 2002, Mumbai năm 2005, Srilanka năm 2008. Ngoài ra, một số nơi đã ghi nhận tình trạng bùng phát dịch bệnh theo mùa như ở Thái Lan và một số vùng khác của Ấn Độ.
Ngoài ra, năm 1995, một đợt dịch bệnh lớn đã xảy ra ở Nicaragua, một nước thuộc 6 vùng Trung Mĩ, do nước lũ mang mầm bệnh Leptospirosis có trong nước tiểu của chó. Sau mỗi đợt dịch bùng phát, bệnh Leptospirosis gây thiệt hại lớn về kinh tế và có diễn biến ảnh hưởng trực tiếp tính mạng của con người. Hiện nay, số ca nhiễm đã giảm đi rất nhiều nhưng con số tử vong vẫn lên tới 58. Chẩn đoán Leptospirosis được xác nhận thông qua các xét nghiệm miễn dịch như ELISA hoặc sinh học phân tử như PCR.
Nhưng biện pháp chính xác nhất là xét nghiệm huyết thanh học MAT (Microscopic Agglutination Test) [17]. Bệnh Leptospirosis lây truyền qua đường da, niêm mạc hoặc do tiếp xúc trực tiếp, gián tiếp với màng nhầy, nước tiểu, mẫu mô động vật đã nhiễm khuẩn. Như vậy, các đối tượng có thể nhiễm bệnh có thể là con người, động vật hoang dã, chuột, chó, gia súc, trong đó chuột là vật chủ lan truyền bệnh chính. Thời gian ủ bệnh của Leptospirosis kéo dài từ 2 đến 20 ngày, sau đó là hai giai đoạn chính là nhiễm trùng và miễn dịch.
Leptospirosis được đặc trưng bởi xuất huyết, vàng da, đau cơ, suy thận và viêm màng não vô trùng [18]. Khi đã nhiễm khuẩn, thể bệnh có các biểu hiện lâm sàng như nhiễm khuẩn thể ẩn, hội chứng nhiễm độc toàn thân, tổn thương gan, thận và hội chứng Weil ở người. Xuất huyết khuếch tán phổi (PDH), một loại leprospirosis lâm sàng nghiêm trọng, dẫn đến tử vong trong một phần tư bệnh nhân bị ảnh hưởng [19]. Một đặc điểm phổ quát của bệnh Leptospirosis là khả năng ký sinh trong ống thận các động vật hoang dã và vật nuôi.
Nhiễm trùng Leptosira spp. thích nghi với vật chủ có thể dẫn đến phá hủy hệ thống tiết niệu. Ở động vật, bệnh Leptospirosis gây tình trạng thai chết lưu, giảm khả năng sinh sản, giảm năng suất và gây tử vong qua đó thiệt hại lớn về kinh tế. Ở người, có từ 5 đến 15% các trường hợp nhiễm Leptospirosis xuất hiện biến chứng đa cơ quan nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong từ 5 đến 40%.
Ngoài nguồn lây nhiễm chính cho con người là từ nước tiểu động vật mắc bệnh, bùn đất và nước bị ô nhiễm ở sông, hồ, đồng ruộng, ao cũng là nguyên nhân thứ phát lan truyền bệnh.