mở đầu bước ngoặc quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên vẫn chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất [1]. 6 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Phân bố và đặc điểm sinh hóa 1. Phân bố Chitin là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được tổng hợp với năng suất trung bình là 20 g/năm/m2 bề mặt trái đất.
Trong tự nhiên, chitin hiện diện ở động vật và thực vật. Ở động vật, chitin được tìm thấy trong lớp vỏ ngoài của tôm, cua và các loài giáp xác; là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số loài động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể và giun tròn. Ở thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [11]. Đặc điểm sinh hóa Chitin là chất rắn vô định hình, bền, không tan trong nước, acid, kiềm, cồn và các dung môi hữu cơ khác.
Tuy nhiên, chitin cũng có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) hoặc bởi enzyme vi sinh vật [7]. Ngoài ra, chitin ít hiện diện ở trạng thái tự do, thường ở dạng phức hợp với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác [3]. Chitin là polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các đơn phân N – acetyl glucosamine (GlcNAc), có thể xem như là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (– OH) ở C2 được thay thế bằng nhóm acetyl amino (-NHCOCH3). Như vậy, chitin là poly N – acetyl – 2 – amino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose liên kết với nhau bởi các liên kết 1,4 – β – glycoside.
Trong đó, các mắc xích của chitin cũng được đánh số như glucose [3]. Công thức phân tử: [C8H13NO5]n Mchitin = (203,186)n Hình 1. Công thức cấu tạo của chitin 7 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Phụ thuộc vào nguồn gốc đặc điểm từng vùng, chitin có hai loại cấu trúc đặc trưng, gọi là dạng α và β.
Sự khác nhau giữa hai dạng này được nhận biết bằng các phương pháp phổ nghiệm như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chụp trạng thái rắn kết hợp với phân tích nhiễu xạ tia X (XRD). Dạng thứ ba ít phổ biến hơn là γ – chitin, nhưng xuất phát từ các số liệu phân tích, theo một số nhà phân tích thì dạng thứ ba chỉ là một dạng khác trong cấu trúc của α – chitin. α – chitin là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, cua, các loài nhuyễn thể là thức ăn của cá voi và trong biểu bì của các loại côn trùng… hiếm hơn là dạng β – chitin, được tìm thấy trong protein của mực ống [7]. Chitin là một nguyên liệu bền, giúp các loài giáp xác chống lại các tác nhân gây hại và áp suất của môi trường.
Để thủy phân hoàn toàn chitin, vi sinh vật có khả năng thủy phân chitin hầu hết đều có một hệ gồm 2 loại enzyme thủy phân là chitinase và chitobiase (β – N – acetylglucosaminidase hoặc β – N – acetylhexosaminidase) [13]. Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (–NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan có cấu trúc mạch thẳng được hình thành từ các đơn phân D – glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – β – glycoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly 1,4 – β – 2 – amino – 2 – deoxy – D – glucose hay poly 1,4 – β – D – glucosamin. Công thức phân tử: [C6H11NO4]n Mchitosan = (161,151)n Hình 1.
Công thức cấu tạo của chitosan. Chitosan được tạo thành từ quá trình hóa học hay enzyme đều không bị khử hoàn toàn nhóm acetyl. Tỷ lệ acetyl còn lại trong chitosan khác nhau tùy theo 8 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. phương pháp khử acetyl và tính nhạy cảm của enzyme.
Sự phân bố N – acetyl glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN) trên mạch chitosan cũng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme thủy phân chúng. Chitosan có hai dạng dị liên kết là GlcNAc- GlcN, GlcN – GlcNAc và hai đồng liên kết là GlcNAc – GlcNAc, GlcN – GlcN. Do vậy, sự thủy phân các liên kết này trong chitosan bằng enzyme cũng khác nhau [13]. Trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%).
Vì vậy, công thức chính xác của chitosan được thể hiện như Hình 1.3, trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitin [8]. Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan. Độ deacetyl hóa – DD (Degree of deacetylation), là tỷ lệ thay thế nhóm – NHCOCH3 bằng nhóm –NH2 trong phân tử chitin (Hình 1. Nếu DD < 50% thì là chitin, DD ≥ 50% thì là chitosan [7].
Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt chitosan Độ deacetyl hóa có thể được xác định dựa vào: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H – NMR). 9 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Phổ hồng ngoại IR. Chưng cất chitin, chitosan với acid phosphoric Phản ứng tạo màu với ninhydrin.
Xác định theo Nitơ [32]. Khi hòa tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà không bị tủa khi có mặt một số ion kim loại nặng như: Pb 2+, Hg+… chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một heteropolymer của “polycation”, có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, amino polysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (-NH2) [12]. Trong khi hầu hết các polysaccharide trong tự nhiên như cellulose, dextran, pectin, agar, agarose… đều trung tính hay có tính acid thì chitosan (chitin) lại có tính base cao [32]. Nhiệt độ nóng chảy của chitosan là 309 – 311oC.
Trọng lượng phân tử chitosan thay đổi từ vài kDa đến hơn hai ngàn kDa, tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng. Trong tự nhiên, chitosan được tìm thấy trong vách tế bào một số loài nấm như Zygomycetes, trong tảo lục Chlorella sp., cũng như trong lớp vỏ của côn trùng, tôm, cua [33]. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin Nguyên liệu giàu chitin có nguồn gốc từ các loài giáp xác như: tôm, cua, mực, sam… được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ và ngâm trong dung dịch acid loãng (HCl 6 – 12%) để loại bỏ các khoáng canxi và tạp chất. Hỗn hợp này được nấu với dung dịch NaOH loãng (8 – 15%) để loại các protein tạp; sau đó ngâm lần lượt trong các hỗn hợp dung dịch KMnO4 0,5% và H2SO4 10% (1:1), oxalic acid 3% để tẩy màu, thu nhận sản phẩm là chitin.
Để thu nhận được chitosan thì phải qua quá trình khử nhóm acetyl của chitin bằng cách đun với dung dịch NaOH (40 – 50%) [9]. Việc thủy phân chitin thành oligomer có thể được thực hiện bằng phương pháp dùng acid [29], enzyme [3]. Sự thủy phân mạch polysaccharide của chitosan bằng acid sẽ cắt đứt các liên kết glycoside giữa các phân tử đường D – glucosamin 10 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. tạo ra một hỗn hợp các đoạn oligomer.
Một số loại acid mạnh như acid hydrochloric, acid nitric, acid phosphoric và hydrogen fluoride đã được sử dụng để thủy phân chitosan tạo oligomer ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau (Bảng 1. Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các oligomer của chitosan [9]. Nồng độ acid Nhiệt độ phản Thời gian Acid phản ứng ứng (oC) phản ứng Hydrochloric 35% 53 48 giờ 11% 100 34 giờ 35% 80 2 giờ 1% 100 5 giờ 35% 72 1 giờ Nitric 0,4 mM 37 15 giờ 70 mM 0 9 giờ Phosphoric 60% 70 4 giờ 85% 37 4 tuần Hydrogen fluoride 100% 20 19 giờ Các oligomer có kích thước mong muốn sẽ được phân đoạn và thu nhận bằng các phương pháp sắc ký trao đổi ion, HPLC và lọc gel. Tuy nhiên, những phương pháp này khó có thể áp dụng ở quy mô lớn, cũng như rất khó để tách được các oligomer có kích thước lớn.
Ngoài sắc ký, phương pháp tủa các oligomer có trọng lượng phân tử lớn ở nhiệt độ thấp cũng đã được nghiên cứu và sử dụng [20]. Quy trình thủy phân chitosan bằng HCl 35% trong 3 giờ ở 80oC được đề nghị bởi Tokutake và cộng sự (1986) hiện được sử dụng khá phổ biến. Nguyên tắc cơ bản của quy trình này là dùng acid mạnh để thủy phân chitosan trong một thời gian nhất định để tạo ra hỗn hợp chitosan polymer và chitosan oligomer. Sau đó dùng phương pháp tủa phân đoạn để thu nhận các sản phẩm chitosan oligomer tinh sạch có các kích thước khác nhau (Sơ đồ 1.
11 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer (Tokutake và cộng sự, 1986). Các phương pháp hóa học kể trên thường làm thay đổi trọng lượng phân tử, mức độ acetyl hóa sản phẩm và thoái biến những protein có giá trị dinh dưỡng cao 12 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. trong nguyên liệu, đồng thời tạo những sản phẩm phụ gây ô nhiễm môi trường.
Vì vậy, những quy trình khử khoáng và khử acetyl của chitin từ nguyên liệu giàu chitin bằng enzyme cũng đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Hiệu quả khử protein bằng enzyme tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu vỏ giáp xác và điều kiện tiến trình xử lý. Xử lý nhẹ nguyên liệu vỏ giáp xác bằng enzyme có thể loại bỏ 90% protein và carotenoid, sản phẩm carotenoprotein tạo thành này thường dùng làm chất bổ sung cho thức ăn gia súc [48]. Chitin và chitosan ở trạng thái rắn đều bị thủy phân bằng acid (như: HCl, HF, H3PO4…) ở nồng độ cao.
Thủy phân bằng enzyme đòi hỏi mức độ hòa tan cao của cơ chất trong môi trường. Sự phân cắt ngẫu nhiên nội mạch sẽ tạo những sản phẩm oligomer đa dạng. Phản ứng thủy phân chitosan bằng enzyme có tính đặc hiệu cơ chất (theo nhóm acetyl) nên vị trí phân cắt do thủy phân có thể được điều khiển tạo các chitooligosaccharide được quan tâm nhiều trong các ứng dụng thực tiễn. Vì độ hòa tan trong dung dịch của chitosan thường thấp nên nồng độ chitooligosaccharide tạo ra cũng thấp.
Như vậy, việc nghiên cứu enzyme có khả năng thủy phân chitosan hòa tan ở pH thấp vừa mang lại hiệu quả về kinh tế vừa an toàn với môi trường hiện đang là một thách thức lớn cho các nhà nghiên cứu [8].