Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chitin và chitosan là các polymer sinh học tự nhiên dồi dào, chiếm từ 14% đến 35% trọng lượng khô trong vỏ của các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ. Hàng năm, ngành công nghiệp chế biến giáp xác toàn cầu sản xuất khoảng 1,9 triệu tấn thành phẩm nhưng thải ra đến 1,4 triệu tấn phế liệu. Tại Việt Nam, riêng các nhà máy chế biến thủy hải sản mỗi năm thải bỏ hơn 70.000 tấn phụ phẩm vỏ tôm cua. Việc xử lý bằng biện pháp đốt, chôn lấp hoặc xả thải trực tiếp gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và lãng phí nguồn vật liệu hữu cơ có giá trị cao.

Thủy phân chitosan thành các đoạn oligomer mạch ngắn có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp hóa học (sử dụng acid vô cơ đậm đặc như HCl 35%) bộc lộ nhiều nhược điểm: chi phí thiết bị cao do ăn mòn kim loại, hiệu suất không đồng đều, tạo nhiều sản phẩm phụ độc hại và gây ô nhiễm môi trường. Ngược lại, phương pháp thủy phân sinh học sử dụng enzyme chitosanase diễn ra trong điều kiện ôn hòa, thân thiện với môi trường và kiểm soát được cấu trúc sản phẩm. Chi nấm mốc Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme ngoại bào phong phú, sinh trưởng nhanh trên nguồn phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ (cám gạo, vỏ trấu). Vì vậy, đề tài nghiên cứu thu nhận enzyme chitosanase từ các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus bằng phương pháp lên men bán rắn được tác giả lựa chọn thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của đồ án gồm:

  1. Nghiên cứu thu nhận enzyme chitosanase từ các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus (Aspergillus spp.).
  2. Làm phong phú thêm nguồn thu nhận enzyme chitosanase từ vi sinh vật tại Việt Nam.
  3. Tận dụng hiệu quả nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, vỏ trấu) làm giá thể lên men nhằm giảm giá thành sản xuất.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ 5 chủng nấm mốc ban đầu (Aspergillus oryzae O1, Aspergillus oryzae O2, Aspergillus niger N1, Aspergillus niger N3, Aspergillus niger N7) và tuyển chọn chủng có hoạt tính cao nhất.
  2. Khảo sát các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn sinh tổng hợp chitosanase của chủng được chọn (nồng độ cơ chất cảm ứng chitosan, độ thoáng khí, độ ẩm môi trường, tỷ lệ cấy giống, thời gian nuôi cấy).
  3. Nuôi cấy thu nhận và xác định hoạt tính enzyme chitosanase thô trên môi trường lên men đã được tối ưu hóa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Hệ enzyme ngoại bào chitosanase sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc Aspergillus spp. (gồm 2 chủng A. oryzae và 3 chủng A. niger); cơ chất cảm ứng là bột chitosan; cơ chất mang rắn là cám gạo và vỏ trấu.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Đề tài thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh và Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (năm 2012).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

  • Chitin và Chitosan: Chitin là polymer mạch thẳng cấu tạo từ các đơn phân N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) liên kết $\beta$-(1,4)-glycoside, công thức phân tử $(C_8H_{13}NO_5)_n$, khối lượng phân tử phân đoạn $M = (203,186)n$, tồn tại ở 3 dạng đồng hình $\alpha$, $\beta$, $\gamma$. Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, cấu tạo từ các gốc D-glucosamine (GlcN), công thức $(C_6H{11}NO_4)_n$, khối lượng phân tử phân đoạn $M = (161,151)_n$. Mức độ deacetyl hóa (Degree of Deacetylation - DD) là tỷ lệ nhóm amino tự do ($-NH_2$) thay thế nhóm acetyl amino ($-NHCOCH_3$); nếu $\text{DD} \ge 50%$, hợp chất được định danh là chitosan.
  • Hệ enzyme Chitosanase (EC 3.2.1.132): Enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác thủy phân liên kết $\beta$-(1,4)-glycoside nội mạch giữa GlcN-GlcN hoặc GlcNAc-GlcN trong phân tử chitosan. Phân loại theo cấu trúc gen và vị trí xúc tác gồm 5 họ glycosyl hydrolase (Family 5, 8, 46, 75, 80), trong đó chitosanase từ nấm mốc Aspergillus chủ yếu thuộc họ 75.
  • Lên men bán rắn (Solid State Fermentation - SSF): Quá trình nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt cơ chất rắn xốp trong điều kiện độ ẩm giới hạn, không có pha lỏng chảy tự do, pha khí liên tục xen giữa các hạt cơ chất.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp sàng lọc chủng giống: Sàng lọc sơ bộ bằng kỹ thuật cấy điểm trên đĩa thạch môi trường Czapek Dox bổ sung 1% chitosan, ủ ở nhiệt độ phòng; quan sát và đo đường kính vòng phân giải phân tử chitosan sau khi nhuộm Lugol. Sàng lọc thứ cấp bằng phương pháp khuếch tán đục lỗ thạch để định lượng sơ bộ hoạt tính phân giải dịch trích ly thô.
  • Phương pháp quan sát hình thái học vi nấm: Quan sát đại thể khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa PGA (màu sắc, cấu trúc bề mặt, mặt trên và mặt dưới); quan sát vi thể cấu trúc sợi nấm, cuống sinh bào tử và túi đỉnh ở vật kính 40x dưới kính hiển vi quang học có nhuộm và không nhuộm Methylene Blue.
  • Phương pháp xác định số lượng bào tử: Đếm trực tiếp mật độ bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu Malassez.
  • Phương pháp xác định độ ẩm cơ chất: Đo độ ẩm nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở $105^\circ\text{C}$.
  • Phương pháp lên men bán rắn: Nuôi cấy nấm mốc trên cơ chất rắn gồm cám gạo phối trộn vỏ trấu (tạo độ xốp) có bổ sung bột chitosan làm chất cảm ứng; kiểm soát độ dày lớp môi trường, độ ẩm ban đầu, tỷ lệ tiếp giống và thời gian nuôi cấy.
  • Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitosanase: Định phân lượng đường khử giải phóng từ phản ứng thủy phân cơ chất chitosan hòa tan (trong đệm acetate pH 5,5) bằng phương pháp so màu quang phổ kế với thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) ở bước sóng 540 nm; lập đồ thị đường chuẩn với D-glucosamine tinh khiết. Một đơn vị hoạt tính enzyme (U) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng $1,\mu\text{mol}$ đường khử glucosamine trong 1 phút ở điều kiện phản ứng tiêu chuẩn.
  • Phương pháp định lượng protein: Xác định hàm lượng protein tổng số trong dịch trích enzyme bằng phương pháp Bradford sử dụng thuốc thử Coomassie Brilliant Blue G-250, đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm; lập đường chuẩn với Bovine Serum Albumin (BSA).
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu: Thí nghiệm khảo sát từng yếu tố đơn lẻ (one-factor-at-a-time), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm MS Excel để tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn.

Nguồn nguyên liệu và hóa chất

  • Chủng giống: 5 chủng gồm Aspergillus oryzae (O1, O2) và Aspergillus niger (N1, N3, N7) lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP. HCM.
  • Cơ chất: Bột chitosan tinh khiết do Bộ môn Sinh hóa cung cấp; cám gạo và vỏ trấu lấy từ nhà máy xay xát tại Giồng Trôm, Bến Tre.
  • Thiết bị chính: Máy quang phổ CECIL - CE 1011, buồng đếm Malassez, máy ly tâm Universal 32 (Hettich Zentrifugen), tủ sấy điều khiển số WiseClause Digital Fuzzy Control System, cân phân tích Pioneer, máy đo pH Mettler Toledo.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến đề tài:

  • Trình bày lịch sử phát hiện, cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, các phương pháp sản xuất chitin, chitosan và các dẫn xuất chitooligomer. Phân tích các phương pháp phân cắt mạch chitosan bằng hóa học và sinh học.
  • Khái quát đặc tính sinh học của enzyme chitosanase: phân loại theo họ gen (5, 8, 46, 75, 80), khối lượng phân tử (dao động từ 10 kDa đến 100 kDa), tính đặc hiệu cơ chất (tác dụng chọn lọc trên cơ chất có độ deacetyl hóa khác nhau, thủy phân liên kết GlcN-GlcN hoặc GlcNAc-GlcN), động học phản ứng ($K_m, V_{max}$), khoảng pH tối ưu (4,0 - 8,0), nhiệt độ hoạt động tối ưu ($40 - 65^\circ\text{C}$), các ion kim loại hoạt hóa ($Mn^{2+}, K^{+}, Ca^{2+}$) và ức chế ($Hg^{2+}, Cu^{2+}, Pb^{2+}, Zn^{2+}, Ag^{+}$).
  • Nêu các ứng dụng thực tiễn của chitosan và sản phẩm thủy phân oligochitosan trong y dược (chỉ phẫu thuật tự tiêu, da nhân tạo Beschitin W, kháng ung thư, kháng oxy hóa), nông nghiệp (kích kháng nấm bệnh cây trồng, tăng tỷ lệ nảy mầm) và công nghiệp chế biến thực phẩm, mỹ phẩm.
  • So sánh quá trình lên men chìm (Liquid State Fermentation - LSF) và lên men bán rắn (Solid State Fermentation - SSF). Phân tích đặc điểm sinh học của nấm mốc chi Aspergillus cùng thành phần xơ, giá trị dinh dưỡng của nguồn nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu nội địa.
Tiêu chí so sánh Lên men chìm (LSF) Lên men bán rắn (SSF)
Trạng thái sợi nấm Chìm hoàn toàn trong pha lỏng Phân bố trên bề mặt và khe hở cơ chất rắn
Môi trường ẩm Thừa nước, độ ẩm rất cao Độ ẩm giới hạn, không có nước tự do
Kiểm soát nhiệt độ & pH Dễ dàng kiểm soát và điều chỉnh Khó điều khiển do truyền nhiệt kém
Tiêu hao năng lượng Cao (sục khí, khuấy đảo cơ học liên tục) Thấp, thiết bị nuôi cấy đơn giản
Nguy cơ tạp nhiễm Nguy cơ nhiễm khuẩn cao Nguy cơ nhiễm khuẩn thấp do nấm phát triển nhanh
Lượng nước thải phát sinh Lớn, xử lý tốn kém Rất ít hoặc không phát sinh nước thải

Chương 2: Vật liệu - Phương pháp

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất, chủng giống, thiết bị và quy trình thao tác thực nghiệm:

  • Công thức phối chế các môi trường nuôi cấy: môi trường giữ giống PGA (Potato Glucose Agar: 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar, 1000ml nước cất), môi trường nhân giống lúa (10g lúa bổ sung 10ml dịch khoáng Czapek), môi trường sàng lọc cấy điểm (Czapek Dox Agar bổ sung 1% chitosan hòa tan trong đệm acetate 0,5M pH 5,5), môi trường đục lỗ thạch (chitosan-agar) và môi trường lên men bán rắn (hỗn hợp cám gạo - vỏ trấu theo tỷ lệ thích hợp).
  • Quy trình dựng đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử giải phóng bằng thuốc thử DNS với chất chuẩn D-glucosamine và đường chuẩn định lượng protein bằng thuốc thử Bradford với chất chuẩn BSA.
  • Thiết kế các lô thí nghiệm khảo sát 5 yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitosanase trên môi trường bán rắn:
    1. Thí nghiệm 1: Nồng độ cơ chất cảm ứng chitosan (tỷ lệ 0%; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5% so với khối lượng cơ chất rắn).
    2. Thí nghiệm 2: Độ thoáng khí (thay đổi khối lượng cơ chất rắn nuôi cấy trong bình tam giác 250ml: 10g, 15g, 20g, 25g, 30g).
    3. Thí nghiệm 3: Độ ẩm môi trường ban đầu (khảo sát ở các mức 50%, 55%, 60%, 65%, 70%).
    4. Thí nghiệm 4: Tỷ lệ cấy giống bào tử ($0,5 \times 10^7; 1,0 \times 10^7; 1,5 \times 10^7; 2,0 \times 10^7; 2,5 \times 10^7$ bào tử/g cơ chất).
    5. Thí nghiệm 5: Thời gian nuôi cấy (thu mẫu đánh giá sau 24, 48, 72, 96, 120 giờ).
  • Quy trình trích ly enzyme: ngâm cơ chất lên men với dung dịch đệm acetate 0,1M (pH 5,5) theo tỷ lệ phù hợp, lắc chiết, lọc qua vải lọc và ly tâm lạnh 4000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch enzyme thô.

Chương 3: Kết quả - Biện luận

Trình bày kết quả nghiên cứu thực nghiệm kèm phân tích, biện luận khoa học:

  • Tuyển chọn chủng nấm mốc: Khảo sát 5 chủng nấm mốc (A. oryzae O1, O2 và A. niger N1, N3, N7). Chủng Aspergillus oryzae O2 cho đường kính vòng phân giải chitosan trên đĩa thạch cấy điểm lớn nhất và hoạt tính enzyme trích ly cao nhất sau 24 giờ nuôi cấy, do đó được chọn làm chủng vi sinh vật cho toàn bộ các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.
  • Mô tả hình thái chủng O2: Khuẩn lạc trên môi trường PGA phát triển nhanh, sợi nấm khí sinh dày màu trắng sau chuyển sang vàng lục đặc trưng của A. oryzae; cuống sinh bào tử dài, vách nhẵn, túi đỉnh hình cầu mang các hàng bào tử đính hình tròn.
  • Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng: Nồng độ bột chitosan bổ sung có ảnh hưởng rõ rệt đến mức độ tiết enzyme ngoại bào. Môi trường không có chitosan cho hoạt tính rất thấp; khi tăng tỷ lệ chitosan, hoạt tính tăng dần và đạt giá trị cực đại ở nghiệm thức bổ sung 1,5% chitosan, sau đó giảm nhẹ ở nồng độ cao hơn do độ nhớt và cản trở truyền khối.
  • Ảnh hưởng của độ thoáng khí: Khối lượng cơ chất 15g trong bình tam giác 250ml tạo bề mặt tiếp xúc và độ xốp tối ưu cho hệ sợi nấm hô hấp hiếu khí, đạt hoạt tính enzyme và hàm lượng protein hòa tan cao nhất.
  • Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu: Độ ẩm môi trường 60% là điều kiện thích hợp nhất; độ ẩm quá thấp (<50%) làm hạn chế sự hòa tan dưỡng chất, trong khi độ ẩm quá cao (>65%) làm bết dính cơ chất, giảm độ thoáng khí và hạn chế sinh trưởng của nấm mốc.
  • Ảnh hưởng của mật độ cấy giống: Tỷ lệ tiếp giống $1,5 \times 10^7$ bào tử/g cơ chất cho hiệu quả sinh tổng hợp enzyme cao nhất; mật độ bào tử thấp kéo dài pha thích ứng, mật độ quá cao dẫn đến cạnh tranh dinh dưỡng gay gắt làm giảm năng suất sinh enzyme.
  • Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: Hoạt tính chitosanase tích lũy đạt đỉnh sau 72 giờ lên men; sau 96 - 120 giờ, hoạt tính giảm do cạn kiệt dinh dưỡng và sự xuất hiện của các enzyme protease nội bào làm phân hủy chitosanase.
  • Tổng hợp điều kiện lên men bán rắn: Xác định được bộ thông số tối ưu cho quá trình lên men thu nhận chitosanase từ chủng A. oryzae O2 trên giá thể cám gạo phối trộn vỏ trấu.

Chương 4: Kết luận - Kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về chủng giống và thông số công nghệ lên men bán rắn; nêu kiến nghị mở rộng nghiên cứu tinh sạch enzyme và thử nghiệm thủy phân chitosan thực tế.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính của đồ án

  • Đã sàng lọc từ 5 chủng nấm mốc chi Aspergillus và tuyển chọn được chủng Aspergillus oryzae O2 có khả năng sinh tổng hợp chitosanase ngoại bào cao nhất.
  • Xác định được điều kiện công nghệ tối ưu cho quá trình lên men bán rắn thu nhận chitosanase từ chủng A. oryzae O2 trên cơ chất cám gạo - vỏ trấu:
    • Nồng độ cơ chất cảm ứng: Bổ sung 1,5% bột chitosan.
    • Độ thoáng khí: 15g cơ chất rắn trong bình tam giác dung tích 250ml.
    • Độ ẩm môi trường ban đầu: 60%.
    • Tỷ lệ cấy giống: $1,5 \times 10^7$ bào tử/g cơ chất rắn.
    • Thời gian nuôi cấy tối ưu: 72 giờ ở nhiệt độ phòng.

Đóng góp của đề tài

  • Khẳng định khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase ngoại bào từ chủng nấm sợi Aspergillus oryzae phân lập trong nước bằng phương thức lên men bán rắn.
  • Xây dựng thành công quy trình tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến (cám gạo và vỏ trấu) làm môi trường lên men vi sinh vật, mở ra giải pháp giảm chi phí môi trường nuôi cấy và hạn chế ô nhiễm môi trường.
  • Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về động học tích lũy enzyme chitosanase và protein hòa tan trong điều kiện nuôi cấy bán rắn phục vụ nghiên cứu công nghệ sinh học enzyme vi sinh vật.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Tiếp tục nghiên cứu các bước tinh sạch chế phẩm enzyme chitosanase thô thu được từ dịch lên men bán rắn (bằng phương pháp tủa cồn, tủa muối amonium sulfate hoặc sắc ký trao đổi ion).
  • Nghiên cứu xác định các đặc tính hóa sinh chuyên sâu của enzyme chitosanase từ chủng O2: khối lượng phân tử (điện di SDS-PAGE), pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt và tính đặc hiệu đối với các loại cơ chất chitosan có độ deacetyl hóa khác nhau.
  • Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme thu được để thủy phân chitosan tạo các oligomer có khối lượng phân tử xác định phục vụ thử nghiệm hoạt tính sinh học.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  • Đề tài mới dừng lại ở bước nghiên cứu thu nhận dịch enzyme thô sau nuôi cấy, chưa tiến hành tinh sạch sâu để thu nhận enzyme đồng nhất.
  • Các khảo sát điều kiện nuôi cấy thực hiện theo phương pháp từng yếu tố đơn lẻ (one-factor-at-a-time), chưa áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm đa yếu tố (mô hình bề mặt đáp ứng - RSM) để đánh giá tương tác đồng thời giữa các thông số.
  • Chưa xác định cụ thể các thông số động học enzyme ($K_m, V_{max}$) và trọng lượng phân tử chính xác của chitosanase từ chủng A. oryzae O2.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Xây dựng quy trình tinh sạch enzyme chitosanase thô bằng phương pháp siêu lọc tiếp tuyến kết hợp sắc ký cột (sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel).
  • Khảo sát khả năng ứng dụng chế phẩm chitosanase thu được trong việc sản xuất chitooligosaccharide (COS) và glucosamine ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot.
  • Nghiên cứu giải trình tự gen mã hóa enzyme chitosanase từ chủng Aspergillus oryzae O2 để phục vụ công tác dòng hóa và biểu hiện gen nâng cao hiệu suất.

Giá trị tham khảo

Đồ án tốt nghiệp có giá trị tham khảo thiết thực cho:

  • Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Hóa sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp bố trí thí nghiệm lên men bán rắn (SSF), kỹ thuật nuôi cấy nấm sợi Aspergillus, phương pháp định lượng enzyme bằng thuốc thử DNS và định lượng protein bằng Bradford.
  • Các nhóm nghiên cứu về enzyme vi sinh vật và vật liệu sinh học: Cung cấp cơ sở dữ liệu về việc tuyển chọn chủng vi nấm sinh enzyme thủy phân polysaccharide, công thức môi trường cảm ứng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào từ nguồn cơ chất tự nhiên giá rẻ.
  • Các phần đáng tham khảo trực tiếp trong đồ án:
    • Chương 1: Phần tổng quan về hệ enzyme chitosanase (cơ chế phân cắt, phân loại họ gen, đặc tính thủy phân) và bảng so sánh chi tiết giữa lên men chìm và lên men bán rắn.
    • Chương 2: Quy trình thực nghiệm xác định hoạt tính chitosanase bằng phương pháp so màu DNS đo lượng D-glucosamine giải phóng và phương pháp nuôi cấy nấm mốc trên giá thể lúa/cám gạo.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đề tài lại lựa chọn phương pháp lên men bán rắn (SSF) thay vì lên men chìm (LSF) để thu nhận chitosanase?

Nấm sợi Aspergillus là loài vi sinh vật hiếu khí có khả năng phát triển rất tốt trên bề mặt cơ chất rắn ẩm, gần giống với môi trường sống tự nhiên của chúng. Lên men bán rắn sử dụng giá thể là phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ (cám gạo, vỏ trấu), tiêu tốn ít năng lượng (không cần hệ thống cánh khuấy và sục khí liên tục), ít nguy cơ tạp nhiễm do sợi nấm phát triển dày đặc, không sinh ra lượng lớn nước thải và thu được dịch chiết enzyme có nồng độ đậm đặc hơn so với lên men chìm.

2. Tiêu chí nào được dùng để tuyển chọn chủng nấm mốc tối ưu trong 5 chủng ban đầu?

Tác giả dựa trên hai tiêu chí định tính và định lượng:

  • Định tính: Kích thước đường kính vòng phân giải phân tử chitosan (vành khuyên sáng màu xung quanh khuẩn lạc) trên đĩa thạch môi trường Czapek Dox bổ sung 1% chitosan sau khi nhuộm chỉ thị Lugol.
  • Định lượng: Hoạt tính thủy phân chitosanase đo được trong dịch trích ly thô sau 24 giờ nuôi cấy. Chủng Aspergillus oryzae O2 thể hiện ưu thế vượt trội ở cả hai tiêu chí này nên được lựa chọn.

3. Cơ chất cảm ứng đóng vai trò gì trong quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase của nấm mốc?

Chitosanase là enzyme cảm ứng, sự sinh tổng hợp của nó phụ thuộc vào sự hiện diện của cơ chất đặc hiệu trong môi trường. Khi nuôi cấy trên môi trường chỉ có cám gạo và trấu mà không bổ sung chitosan, hoạt tính enzyme thu được rất thấp. Bổ sung chitosan (tối ưu ở mức 1,5%) kích thích mạnh mẽ tế bào nấm mốc kích hoạt gen tổng hợp và tiết chitosanase ngoại bào ra môi trường để phân giải cơ chất lấy nguồn dinh dưỡng carbon và nitơ.

4. Thành phần cơ chất rắn nuôi cấy gồm những nguyên liệu gì và tỷ lệ vỏ trấu có tác dụng gì?

Cơ chất rắn nuôi cấy chính là cám gạo phối trộn với vỏ trấu thu mua từ Giồng Trôm, Bến Tre. Cám gạo cung cấp nguồn dinh dưỡng phong phú gồm tinh bột, protein thô (12 - 14%), chất béo và khoáng. Vỏ trấu có hàm lượng cellulose và lignin cao, khó bị phân hủy nhưng đóng vai trò là chất đệm tạo độ xốp, giúp pha khí lưu thông liên tục trong khối cơ chất, tạo điều kiện hiếu khí thuận lợi cho khuẩn ty nấm mốc hô hấp và phát triển.

5. Phương pháp so màu DNS xác định hoạt tính chitosanase dựa trên nguyên lý nào?

Phương pháp dựa trên phản ứng giữa nhóm khử tự do (được tạo ra khi chitosanase cắt liên kết $\beta$-(1,4)-glycoside trong phân tử chitosan) với thuốc thử acid 3,5-dinitrosalicylic (DNS) trong môi trường kiềm ở nhiệt độ sôi. Phản ứng khử DNS tạo thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu nâu đỏ, đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Dựa vào đường chuẩn lập với dung dịch D-glucosamine tinh khiết ở các nồng độ đã biết, tác giả tính toán được số micromol đường khử giải phóng trên một đơn vị thời gian.

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Phạm Minh Sang đã giải quyết hoàn chỉnh mục tiêu tuyển chọn chủng vi nấm và khảo sát các điều kiện lên men bán rắn để thu nhận enzyme chitosanase ngoại bào. Kết quả thực nghiệm đã xác định chủng Aspergillus oryzae O2 là chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao nhất và thiết lập được bộ thông số công nghệ thích hợp (1,5% chitosan cảm ứng, độ ẩm 60%, độ thoáng khí 15g/250ml, mật độ giống $1,5 \times 10^7$ bào tử/g, thời gian nuôi cấy 72 giờ). Nghiên cứu mang tính thực tiễn cao khi kết hợp giải quyết bài toán tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, trấu) để tạo chế phẩm sinh học phục vụ chế biến phụ phẩm thủy hải sản (vỏ tôm, cua) thành các hợp chất có giá trị gia tăng.