Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cà chua (Solanum lycopersicum L. / Lycopersicon esculentum Miller) là một trong những loại cây rau thực phẩm có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, được mở rộng sản xuất tại nhiều vùng nông nghiệp ở Việt Nam với diện tích canh tác dao động từ 12.000 đến 13.000 ha/năm. Tuy nhiên, sản xuất cà chua thường xuyên đối mặt với áp lực dịch hại nghiêm trọng. Riêng tại khu vực Hà Nội, các kết quả điều tra đã ghi nhận 19 loài dịch hại, trong đó các bệnh do virus gây thiệt hại nặng nề nhất về năng suất và phẩm chất thương phẩm. Trong đó, bệnh xoăn vàng lá cà chua (Tomato yellow leaf curl disease) do các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) gây ra được đánh giá là đối tượng nguy hiểm hàng đầu, có khả năng làm giảm từ 60–70% đến 80–90% năng suất, thậm chí gây mất trắng mùa vụ nếu cây bị nhiễm sớm ở giai đoạn trước khi ra hoa.

Bệnh lây truyền tự nhiên trên đồng ruộng qua môi giới bọ phấn trắng (Bemisia tabaci) theo phương thức bền vững tuần hoàn. Quần thể begomovirus gây hại trên cây họ cà tại Việt Nam có tính đa dạng di truyền phức tạp, với sự hiện diện đồng thời của nhiều loài virus đơn bộ gen (monopartite) hoặc kép bộ gen (bipartite), kèm theo các phân tử DNA vệ tinh (DNA-β). Các loài virus khác nhau lại tạo ra những biểu hiện triệu chứng tương tự nhau trên đồng ruộng, khiến việc chẩn đoán hình thái gặp nhiều khó khăn. Để làm rõ đặc tính sinh học và khả năng lây nhiễm của các tác nhân này, đề tài được thực hiện nhằm giải quyết các nhiệm vụ cụ thể:

  1. Biến nạp các cấu trúc xâm nhiễm (infectious clones) mang bộ gen của các loài begomovirus và DNA vệ tinh phân lập tại Việt Nam vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 bằng kỹ thuật xung điện.
  2. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi PCR đã thiết kế để phục vụ công tác chẩn đoán phân tử chính xác các loài begomovirus gây hại cây họ cà.
  3. Đánh giá tính gây bệnh và khả năng lây nhiễm của 9 loài begomovirus và phân tử DNA-β bằng kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo qua vi khuẩn (Agroinoculation) trên các giống cây ký chủ thuộc họ Cà (Solanaceae).
  • Đối tượng nghiên cứu: 12 cấu trúc xâm nhiễm của 9 loài begomovirus hại cà chua và ớt (Tomato yellow leaf curl Vietnam virus - TYLCVNV, Tomato leaf curl Vietnam virus - ToLCuVV, Tomato leaf curl Hanoi virus - ToLCHanV, Tomato leaf curl Hainan virus - ToLCHnV, Tomato leaf curl China virus - ToLCuCNV, Mimosa yellow leaf curl virus - MiYLCV, Ageratum yellow vein virus - AYVV, Pepper yellow leaf curl Vietnam virus - PepYLCVNV, Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus - TYLCKaV) cùng 1 phân tử vệ tinh DNA-β; các dòng cây ký chủ thuộc họ Cà (cà chua giống Hồng Đào và cà chua vô hạn F1, cà pháo xanh, ớt chuông, thuốc lá K326, thuốc lá cảnh Nicotiana benthamiana).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trong thời gian từ tháng 12/2020 đến tháng 07/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại học

Đề tài dựa trên cơ sở phân loại học virus thực vật theo quy chuẩn của Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (ICTV). Chi Begomovirus thuộc họ Geminiviridae bao gồm các virus có hạt hình cầu đa diện kép (kích thước khoảng 18 x 30 nm), chứa bộ gen DNA sợi đơn dạng vòng có kích thước khoảng 2,6–2,8 kb.

  • Tổ chức bộ gen: Bộ gen begomovirus có thể ở dạng đơn phân tử (DNA-A) hoặc nhị phân tử (DNA-A và DNA-B). DNA-A mang 6 khung đọc mở (ORF) gồm AV1 (mã hóa protein vỏ CP), AV2 (protein cảm ứng triệu chứng và di chuyển hệ thống) trên sợi thuận; AC1 (protein tái sinh Rep), AC2 (protein hoạt hóa phiên mã TrAP), AC3 (protein tăng cường tái sinh REn), AC4 (protein liên quan đến phổ ký chủ và ức chế cơ chế câm gen của cây) trên sợi nghịch. Phân tử DNA-B chứa 2 ORF gồm BV1 (protein con thoi nhân NSP) và BC1 (protein vận chuyển tế bào MP).
  • Cơ chế tái sinh và vai trò phân tử vệ tinh: Virus tái sinh trong nhân tế bào ký chủ theo cơ chế vòng lăn (rolling circular replication - RCR) và cơ chế tái sinh phụ thuộc tái tổ hợp (RDR). Các phân tử DNA vệ tinh (DNA-β, kích thước khoảng 1,35 kb) phụ thuộc vào Rep của begomovirus chủ để sao chép và tham gia điều chỉnh mức độ nghiêm trọng của triệu chứng bệnh.
  • Kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo Agroinoculation: Dựa trên nguyên lý sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector nhị nguyên pCAMBIA2300 chứa đoạn lặp bộ gen virus (chứa 2 nguồn gốc tái sinh ori). Khi vi khuẩn xâm nhập vào mô cây, đoạn T-DNA mang bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào thực vật, protein Rep biểu hiện sẽ cắt - nối để giải phóng bộ gen virus vòng hoàn chỉnh, khởi động chu trình lây nhiễm nhân tạo mà không cần môi giới bọ phấn.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quá trình thực nghiệm được triển khai thông qua các phương pháp sinh học phân tử và bệnh cây học:

[Cấu trúc xâm nhiễm trên pCAMBIA2300] 
[Chuẩn bị dịch vi khuẩn lây nhiễm]
  1. Biến nạp xung điện (Electroporation): Sử dụng tế bào khả biến A. tumefaciens chủng LBA4404 (chứa Ti plasmid pAL4404 mang gen kháng Streptomycin, hệ gen mang gen kháng Rifampicin). Thiết lập xung điện bằng máy Multiporator ở điện thế 1400 V, thời gian xung 5 ms. Tế bào sau biến nạp được hồi sức trong môi trường SOC (150 µL) và chọn lọc trên đĩa thạch LB-agar bổ sung 3 loại kháng sinh: Rifampicin (34 µg/mL), Kanamycin (100 µg/mL) và Streptomycin (50–200 µg/mL) ở nhiệt độ 28°C.
  2. Kỹ thuật PCR và điện di kiểm tra:
    • Chuẩn bị khuôn DNA: Pha loãng plasmid xâm nhiễm tỷ lệ 1/100 hoặc phá vỡ vách tế bào vi khuẩn trong dung dịch NaOH 0,05 M rồi trung hòa bằng Tris-HCl 0,1 M.
    • Thành phần phản ứng: Tổng thể tích 10 µL gồm 4,3 µL H2O, 5 µL 2X MyTaq HS, 0,2 µL mồi xuôi (F), 0,3 µL mồi ngược (R) và mẫu khuôn.
    • Chu trình nhiệt PCR: Biến tính ban đầu ở 95°C trong 20 giây; 35 chu kỳ lặp lại gồm biến tính 95°C (10 giây), gắn mồi 56°C (10 giây), kéo dài 72°C (10 giây); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 5 phút.
    • Điện di: Sử dụng gel agarose nồng độ 0,5–1% trong đệm TAE 0,5X, nhuộm Ethidium bromide, chạy ở hiệu điện thế 100 V trong 15–20 phút và đọc kết quả dưới ánh sáng tia cực tím (UV).
  3. Kỹ thuật lây nhiễm Agroinoculation: Nuôi lắc dịch vi khuẩn A. tumefaciens mang cấu trúc xâm nhiễm trong môi trường LB lỏng có kháng sinh ở 28°C (250 vòng/phút, 48 giờ), thu sinh khối bằng ly tâm (3000 g trong 5 phút), điều chỉnh mật độ quang và tiến hành tiêm/lây truyền trực tiếp vào các vị trí mô lá và đỉnh sinh trưởng của cây thí nghiệm.
  4. Đánh giá bệnh học và kiểm tra huyết thanh học ELISA: Cây sau lây nhiễm được theo dõi diễn biến triệu chứng ngoại hình định kỳ trong 30 ngày. Đồng thời, kiểm tra sự hiện diện của kháng nguyên virus trong mô lá bằng phản ứng miễn dịch liên kết enzyme (Direct/Indirect ELISA) sử dụng hệ thống đệm chuẩn: đệm nghiền carbonate (pH 9,6), đệm rửa PBS-T (pH 7,4), đệm kháng thể PBS-TPO và cơ chất pNPP (đo độ hấp thụ quang học sau khi dừng phản ứng bằng NaOH 0,5 M).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tổng quan về vị trí ngành sản xuất cà chua tại Việt Nam, sự suy giảm năng suất do các bệnh virus hại, đặc biệt là nhóm begomovirus truyền qua bọ phấn trắng Bemisia tabaci. Đặt ra tính cấp thiết của việc áp dụng kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo bằng Agrobacterium và chẩn đoán phân tử bằng PCR để đánh giá chính xác độc lực của từng loài virus đơn lẻ và tổ hợp có DNA vệ tinh. Xác định mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

  • Đặc điểm cây cà chua: Hệ thống hóa nguồn gốc Nam Mỹ, phân loại thực vật học (Solanum lycopersicum Miller), các dạng hình sinh trưởng (hữu hạn, vô hạn, bán hữu hạn, lùn) và thành phần dinh dưỡng (đặc biệt là hợp chất chống oxy hóa lycopene, khoáng chất và vitamin).
  • Tình hình nghiên cứu ngoài nước và trong nước: Lịch sử ghi nhận bệnh xoăn vàng lá cà chua từ những năm 1940 tại Israel, sự bùng phát trên quy mô toàn cầu và các công trình giải mã bộ gen begomovirus từ thập niên 1990. Tổng kết các nghiên cứu tại Việt Nam từ năm 1967 đến nay của các tác giả Nguyễn Thơ, Bùi Văn Ích, Hà Viết Cường, Vũ Triệu Mân, xác định mối quan hệ giữa mật độ bọ phấn và tỷ lệ bệnh, cũng như diễn biến của các loài ToLCVV, TYLCKaV, TYLCVNV.
  • Sinh học phân tử và dịch tễ học begomovirus: Phân tích chi tiết cấu trúc virion dạng hạt kép (110 tiểu phần protein vỏ, 22 capsomer), cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B và vùng liên gen IR chứa chuỗi lặp bảo thủ nonanucleotide (TAATATTAC). Trình bày cơ chế tương tác giữa protein Rep với protein kiểm soát chu kỳ tế bào ký chủ (pRBR), con đường truyền lan trong cơ thể bọ phấn (thời gian chích hút tối thiểu 15–20 phút, thời kỳ ẩn khoảng 8 giờ, virus tồn tại nhiều tuần đến suốt đời cá thể bọ phấn).
  • Biện pháp phòng trừ và cơ sở kỹ thuật: Đánh giá các biện pháp canh tác, hóa học, sinh học, chọn tạo giống kháng (sử dụng nguồn gen hoang dại L. pennellii, các dòng AVRDC như LA 1777, LA 1418), công nghệ RNAi; đồng thời giới thiệu nguyên lý chẩn đoán PCR và cơ chế lây nhiễm nhân tạo bằng Agroinoculation.

Phần 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết các nguyên liệu sinh học và quy trình thực nghiệm: danh mục 12 cấu trúc xâm nhiễm dòng hóa trên vector pCAMBIA2300, danh sách 12 cặp mồi đặc hiệu PCR, thành phần các dung dịch đệm hóa chất cho ELISA và điện di, quy trình biến nạp xung điện vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404, cùng các bước tiến hành lây nhiễm Agroinoculation trên 6 đối tượng cây ký chủ.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Tác giả trình bày các dữ liệu thực nghiệm đạt được qua 3 nhóm nội dung chính:

  1. Kết quả biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào A. tumefaciens: Thực hiện xung điện thành công cả 12 cấu trúc xâm nhiễm (9 begomovirus và 1 DNA-β). Sau khi chọn lọc trên môi trường LB-agar chứa 3 loại kháng sinh (Rif + Kan + Strep), các khuẩn lạc vi khuẩn phát triển bình thường và được kiểm tra khẳng định bằng PCR khuẩn lạc với các cặp mồi đặc hiệu tương ứng, cho vạch sản phẩm khuếch đại đúng kích thước lý thuyết.
  2. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi PCR: Sử dụng 12 plasmid cấu trúc xâm nhiễm làm khuôn chuẩn để kiểm tra chéo độ đặc hiệu của các cặp mồi thiết kế. Kết quả phân loại độ nhạy và độ đặc hiệu như sau:
    • Cặp mồi đặc hiệu cao (6/8 cặp): Gồm các cặp mồi phát hiện TYLCVNV (550 bp), ToLCVV (454 bp), ToLCHanV (179 bp), AYVV (889 bp), TYLCKaV (698 bp) và PepYLCVNV (391 bp). Các mồi này chỉ khuếch đại đúng virus mục tiêu, không có phản ứng chéo với các loài begomovirus khác.
    • Cặp mồi đặc hiệu thấp (2/8 cặp): Cặp mồi ToLCHnV-F1/R1 (1054 bp) và TB101-F1/R1 (phát hiện ToLCuCNV, 334 bp) xuất hiện hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu hoặc phản ứng chéo với các cấu trúc khác.
  3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo bằng Agroinoculation: Triển khai 18 công thức thí nghiệm lây nhiễm đơn lẻ và đồng lây nhiễm (kèm phân tử vệ tinh DNA-β) trên 6 loại cây ký chủ họ Cà:
    • Trên cây thuốc lá cảnh (Nicotiana benthamiana): Biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt sau 14–21 ngày lây nhiễm đối với hầu hết các cấu trúc begomovirus thử nghiệm (lá xoăn, biến vàng, gân nổi rõ, cây còi cọc).
    • Trên các cây trồng khác (cà chua Hồng Đào, cà chua vô hạn, ớt chuông, cà pháo, thuốc lá K326): Trong điều kiện thí nghiệm vụ xuân hè nhiệt độ cao, sau 30 ngày lây nhiễm, cây không biểu hiện triệu chứng xoăn vàng lá điển hình ra bên ngoài. Tuy nhiên, khi kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA, các mẫu lá đều cho kết quả dương tính với kháng nguyên virus, khẳng định virus đã xâm nhiễm hệ thống và nhân lên trong cây nhưng ở trạng thái ẩn triệu chứng (nhiễm không triệu chứng).

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt toàn bộ các kết quả đạt được về biến nạp dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm, tính đặc hiệu của bộ mồi chẩn đoán PCR và khẳng định N. benthamiana là cây chỉ thị mẫn cảm tối ưu cho các begomovirus hại cây họ cà tại Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và phát hiện chính

Nghiên cứu đã hoàn thành việc chuẩn bị nguồn vật liệu lây nhiễm chuẩn và đánh giá tính gây bệnh của tập đoàn begomovirus phân lập tại Việt Nam, được tổng hợp qua các bảng dữ liệu sau:

STT Tên viết tắt cấu trúc Tên loài Begomovirus / DNA vệ tinh Phân tử genome Ký chủ gốc / Nguồn phân lập
1 TY-5 Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) DNA-A Cà chua
2 β-3 Phân tử vệ tinh DNA-beta (TYLCVNV/ToLCVV) DNA-β Cà chua
3 To-3 Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCuVV) DNA-A Cà chua
4 100-3 Tomato leaf curl Hanoi virus (ToLCHanV) DNA-A Cà chua
5 TH7-5 Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV) DNA-A Cà chua
6 TB101-1 Tomato leaf curl China virus (ToLCuCNV) DNA-A Cà chua
7 TVN3-5 Mimosa yellow leaf curl virus (MiYLCV) DNA-A Cà chua / Trinh nữ
8 VB65-1 Ageratum yellow vein virus (AYVV) DNA-A Cà chua / Hoa ngũ vị
9 VNP1500-1 Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) DNA-A Ớt (Đồng Tháp, 2012)
10 VNP1500-20 Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) DNA-B Ớt (Đồng Tháp, 2012)
11 VNP843-4 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) DNA-A Cà chua (Đắk Lắk, 2012)
12 VNP843-6 Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) DNA-B Cà chua (Đắk Lắk, 2012)
Nhóm mồi PCR Cặp mồi Kích thước sản phẩm (bp) Virus đích phát hiện Đánh giá độ đặc hiệu
Nhóm đặc hiệu cao TYLCVNV-Sp-F2/R2 550 TYLCVNV Rất cao, không phản ứng chéo
ToLCVV-Sp-F2/R2 454 ToLCuVV Rất cao, băng rõ nét
To100-F1/R1 179 ToLCHanV Cao, chuyên biệt
VB65-F1/R1 889 AYVV Cao, chuẩn kích thước
TYKa-A-F1/R1 698 TYLCKaV Cao, phân biệt rõ DNA-A
VNP93-A-F1/R1 391 PepYLCVNV Cao, đặc hiệu trên mẫu ớt
Nhóm đặc hiệu thấp ToLCHnV-F1/R1 1054 ToLCHnV Thấp, xuất hiện sản phẩm phụ
TB101-F1/R1 334 ToLCuCNV Thấp, cần tối ưu lại mồi

Đóng góp học thuật và thực tiễn

  • Đóng góp học thuật: Xác lập bộ dữ liệu thực nghiệm so sánh tính gây bệnh của 9 loài begomovirus trên 6 loại cây ký chủ thuộc họ Cà tại Việt Nam. Chứng minh được hiện tượng nhiễm bệnh hệ thống không triệu chứng (asymptomatic systemic infection) trên cây cà chua và ớt trong điều kiện nhiệt độ cao thông qua kỹ thuật ELISA.
  • Đóng góp thực tiễn:
    • Khẳng định cây thuốc lá cảnh Nicotiana benthamiana là ký chủ chỉ thị mẫn cảm và hiệu quả nhất phục vụ cho các nghiên cứu nhân sinh khối, duy trì nguồn bệnh và sàng lọc tính độc của các begomovirus.
    • Tuyển chọn được 6 cặp mồi PCR có độ đặc hiệu cao, cung cấp công cụ chẩn đoán phân tử tin cậy giúp các cơ quan bảo vệ thực vật giám sát chính xác từng loài begomovirus gây hại ngoài đồng ruộng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo được tiến hành trong vụ xuân hè với điều kiện nhiệt độ môi trường cao, ảnh hưởng lớn đến mức độ biểu hiện triệu chứng bên ngoài của các giống cà chua, cà pháo và ớt (cây nhiễm bệnh nhưng không bộc lộ triệu chứng xoăn lá điển hình).
    • Thời gian theo dõi cây sau lây nhiễm giới hạn trong vòng 1 tháng; chưa theo dõi được trọn vẹn cả chu kỳ sinh trưởng và năng suất quả.
    • Cặp mồi chẩn đoán cho 2 loài (Tomato leaf curl Hainan virus và Tomato leaf curl China virus) chưa đạt độ đặc hiệu tuyệt đối, còn xuất hiện hiện tượng bắt cặp không mong muốn.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm Agroinoculation trong điều kiện phòng sinh trưởng kiểm soát nhiệt độ và ẩm độ tối ưu (nhiệt độ mát hơn hoặc các mức nhiệt độ đối chứng) để đánh giá chính xác ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện triệu chứng bệnh.
    • Thiết kế lại và tối ưu hóa các cặp mồi PCR đối với các loài virus có độ đặc hiệu chưa cao (ToLCHnV, ToLCuCNV).
    • Nghiên cứu sâu hơn về vai trò tương tác sinh học của phân tử vệ tinh DNA-β đối với khả năng tăng cường độc lực của các loài begomovirus đơn bộ gen trên các giống cà chua thương phẩm khác nhau.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu chuyên khảo phù hợp cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Bệnh cây học, Nông học và Công nghệ sinh học Nông nghiệp.
  • Nội dung giá trị:
    • Quy trình chi tiết về kỹ thuật biến nạp plasmid cấu trúc xâm nhiễm vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 bằng phương pháp xung điện.
    • Bảng trình tự mồi chuẩn và chu trình nhiệt PCR phục vụ chẩn đoán định danh các loài begomovirus phân lập tại Việt Nam.
    • Phương pháp lây nhiễm nhân tạo Agroinoculation không cần thông qua vector bọ phấn, hỗ trợ nghiên cứu sàng lọc tính kháng bệnh của các giống cây trồng họ Cà.

Câu hỏi thường gặp

1. Những loài begomovirus nào đã được đưa vào đánh giá khả năng lây nhiễm trong khóa luận?
Nghiên cứu đánh giá 9 loài begomovirus phân lập trên cây họ cà tại Việt Nam gồm: TYLCVNV, ToLCuVV, ToLCHanV, ToLCHnV, ToLCuCNV, MiYLCV, AYVV, PepYLCVNV, TYLCKaV và 1 phân tử DNA vệ tinh (DNA-β).

2. Vi khuẩn và plasmid nào được sử dụng để làm vector lây nhiễm trong kỹ thuật Agroinoculation?
Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng LBA4404 (mang Ti plasmid pAL4404) cùng các cấu trúc xâm nhiễm được thiết kế trên nền vector nhị nguyên pCAMBIA2300 mang gen kháng Kanamycin.

3. Thông số kỹ thuật của phản ứng xung điện biến nạp vi khuẩn LBA4404 là gì?
Phản ứng được thực hiện trên máy Multiporator với cuvet xung điện chuyên dụng, hiệu điện thế thiết lập ở mức 1400 V và thời gian phóng điện là 5 ms, sau đó hồi sức tế bào trong 150 µL môi trường SOC.

4. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi PCR chẩn đoán begomovirus như thế nào?
Trong số 8 cặp mồi được đánh giá chéo trên các cấu trúc xâm nhiễm, có 6 cặp đạt độ đặc hiệu cao (phát hiện chuyên biệt TYLCVNV, ToLCVV, ToLCHanV, AYVV, TYLCKaV và PepYLCVNV) và 2 cặp có độ đặc hiệu thấp, xuất hiện sản phẩm phụ (ToLCHnV và ToLCuCNV).

5. Vì sao các giống cà chua và ớt thí nghiệm không biểu hiện triệu chứng xoăn lá sau 1 tháng lây nhiễm dù kết quả ELISA dương tính?
Do thời gian thực nghiệm diễn ra trong điều kiện vụ xuân hè có nhiệt độ môi trường cao làm ức chế hoặc làm chậm quá trình phát triển triệu chứng ra hình thái bên ngoài của cây, dẫn đến hiện tượng nhiễm virus hệ thống không triệu chứng (kháng nguyên virus vẫn nhân lên trong mô lá và cho kết quả dương tính khi kiểm tra ELISA).

Kết luận

Khóa luận của tác giả Nguyễn Thị Thanh Thắng đã hoàn thành việc biến nạp 12 cấu trúc xâm nhiễm của 9 loài begomovirus và 1 DNA vệ tinh vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404, đồng thời xác lập được 6 cặp mồi PCR có độ đặc hiệu cao phục vụ chẩn đoán phân tử. Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo bằng Agroinoculation khẳng định Nicotiana benthamiana là cây chỉ thị mẫn cảm tối ưu, trong khi các cây cà chua và cây họ cà khác ghi nhận hiện tượng nhiễm virus không biểu hiện triệu chứng dưới ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ cao. Công trình cung cấp nguồn tư liệu thực nghiệm và quy trình kỹ thuật sinh học phân tử có giá trị cho công tác nghiên cứu bệnh virus hại thực vật tại Việt Nam.