Luận án tiến sĩ về ứng dụng enzyme amylase, protease và nấm men trong sản xuất rượu vang nếp

Luận án tiến sĩ nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase, protease và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp, mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp rượu.

• Tác giả: Nguyễn Hoàng Anh
• Người hướng dẫn: Thầy Nguyễn Công Hà
• Trường học: Trường Đại học Trà Vinh
• Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
• Đề tài: Nghiên Cứu Ứng Dụng Enzyme Amylase, Protease Và Nấm Men Trong Sản Xuất Rượu Vang Nếp
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2010
• Địa điểm: Trà Vinh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM TẠ
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH BẢNG
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
• 2.1. Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu
• 2.2. Enzyme α-amylase (EC 3.2
• 2.3. Enzyme glucoamylase (EC 3.
• 2.4. Hoạt lực của enzyme amylase
• 2.5. Enzyme papain (EC 3.
• 2.5.1. Cấu tạo của enzyme papain
• 2.5.2. Hoạt tính của enzyme papain
• 2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain
• 2.6. Enzyme bromelain (EC 3.
• 2.6.1. Cấu tạo của enzyme bromelain
• 2.6.2. Hoạt tính enzyme bromelain
• 2.6.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain
• 2.7. Cấu tạo và thành phần của nấm men
• 2.8. Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men
• 2.9. Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang
• 2.10. Bánh men thuốc bắc
• 2.11. Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp
• 2.11.1. Quá trình hồ hóa tinh bột
• 2.11.2. Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp
• 2.11.3. Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp
• 2.11.4. Cơ chế của quá trình lên men rượu
• 2.11.5. Các giai đoạn của quá trình lên men rượu
• 2.11.6. Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu
• 2.11.7. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu
• 2.11.8. Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu
• 2.11.8.1. Sự tạo thành methalnol
• 2.11.8.2. Sự tạo thành aldehyde
• 2.11.8.3. Sự tạo thành các rượu bậc cao
• 2.11.8.4. Sự tạo thành các acid hữu cơ
• 2.11.8.5. Sự tạo thành các ester
• 2.11.8.6. Sự tạo thành furfurol
• 2.11.9. Quy trình sản xuất rượu vang nếp
• 2.11.9.1. Sơ đồ quy trình
• 2.11.9.2. Thuyết minh quy trình
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phương tiện nghiên cứu
• 3.1.1. Thời gian và địa điểm
• 3.1.2. Nguyên vật liệu
• 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu
• 3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp phân tích
• 3.4. Nội dung và bố trí thí nghiệm
• 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng
• 3.4.1.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp
• 3.4.1.2. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp
• 3.4.1.3. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân
• 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng
• 3.4.2.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp
• 3.4.2.2. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng
• 3.4.2.3. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân
• 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase
• 3.4.3.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 3.4.3.2. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp
• 3.4.3.3. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase
• 3.4.4.1. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 3.4.4.2. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein nếp
• 3.4.4.3. Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 3.4.5. Thí nghiệm 5: Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thành phần chính nguyên liệu nếp trắng
• 4.2. Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng
• 4.2.1. Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp trắng
• 4.2.2. Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp
• 4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân
• 4.3. Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng
• 4.3.1. Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp trắng
• 4.3.2. Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng
• 4.3.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân
• 4.4. Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase và glucoamylase
• 4.4.1. Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 4.4.2. Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp
• 4.4.3. Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 4.5. Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase
• 4.5.1. Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 4.5.2. Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein dịch nếp
• 4.5.3. Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp
• 4.6. Kết quả theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định
• 4.6.1. Kết quả thay đổi độ Brix trong quá trình lên men chính các loại rượu nếp
• 4.6.2. Kết quả thay đổi hàm lượng đường khử trong quá trình lên men chính các loại rượu nếp
• 4.6.3. Kết quả thay đổi độ rượu tạo thành trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
• 4.6.4. Kết quả thay đổi pH trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
• 4.6.5. Kết quả thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
• 4.6.6. Kết quả thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
• 4.6.7. Kết quả định tính fufurol trong quá trình lên men chính của các loại rượu nếp
• 4.6.8. Kết quả theo dõi chất lượng sản phẩm rượu nếp trong thời gian ổn định 3 tháng
• 4.6.9. Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan các sản phẩm rượu vang nếp
• 4.6.10. Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lí sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009
• 4.6.11. Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh sản phẩm rượu sử dụng bánh men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme amylase, bromelain, nấm men so với TCVN 7045:2009
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ THỰC TẾ NGHIÊN CỨU, KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG VÀ ĐỊA CHỈ ÁP DỤNG, GIÁ THÀNH SẢN PHẨM
• 5.1. Thực tế nghiên cứu so với bố trí thí nghiệm theo thuyết minh phê duyệt
• 5.2. Khả năng ứng dụng và địa chỉ áp dụng
• 5.3. Hạch toán giá thành 1 lít rượu vang nếp sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU Ở TRUNG TÂM PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM, SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ, TP
• DANH SÁCH KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng enzyme amylase, enzyme protease và nấm men trong quy trình sản xuất rượu vang nếp. Mục tiêu chính là cải thiện chất lượng sản phẩm và rút ngắn thời gian sản xuất. Rượu nếp truyền thống thường gặp khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng và thời gian sản xuất. Việc áp dụng công nghệ enzyme có thể giúp khắc phục những vấn đề này. Theo nghiên cứu, việc sử dụng enzyme amylase và enzyme protease có thể tối ưu hóa quá trình lên men và tăng cường hiệu suất sản xuất. Kết quả cho thấy rằng việc sử dụng enzyme có thể tạo ra sản phẩm rượu vang nếp với chất lượng cao hơn và an toàn hơn cho sức khỏe.

II. Tác động của enzyme amylase

Enzyme amylase đóng vai trò quan trọng trong quá trình dịch hóa và đường hóa tinh bột. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng enzyme α-amylase với nồng độ 0,3% trong 31 phút tại pH 6,5 và nhiệt độ 87°C có thể tạo ra khoảng 6,46% đường khử. Tiếp theo, glucoamylase được sử dụng với nồng độ 0,6% trong 39 phút ở nhiệt độ 61°C và pH 4,0, cho hàm lượng đường khử lên đến 16,10%. Những kết quả này cho thấy rằng enzyme amylase không chỉ giúp tăng cường hiệu suất sản xuất mà còn cải thiện chất lượng sản phẩm rượu vang nếp.

2.1. Ứng dụng enzyme amylase

Việc ứng dụng enzyme amylase trong quy trình sản xuất rượu vang nếp đã cho thấy hiệu quả rõ rệt. Enzyme này giúp phân giải tinh bột thành đường, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng enzyme amylase có thể làm giảm thời gian lên men chính xuống còn 6 ngày, đồng thời tăng độ rượu tạo thành lên đến 12,6%. Điều này không chỉ cải thiện năng suất mà còn đảm bảo chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn TCVN 7045:2009.

III. Vai trò của enzyme protease

Enzyme protease cũng đóng một vai trò quan trọng trong quy trình sản xuất rượu vang nếp. Việc sử dụng papain và bromelain để thủy phân protein trong dịch nếp đã cho thấy sự gia tăng hàm lượng nitơ amin, cần thiết cho sự phát triển của nấm men. Kết quả cho thấy rằng khi sử dụng papain với nồng độ 0,35% trong 45 phút ở pH 5,9 và nhiệt độ 50°C, hàm lượng nitơ amin đạt 0,081%. Điều này cho thấy enzyme protease không chỉ giúp cải thiện chất lượng sản phẩm mà còn tăng cường khả năng lên men của nấm men.

3.1. Ứng dụng enzyme protease

Việc ứng dụng enzyme protease trong quy trình sản xuất rượu vang nếp đã chứng minh được hiệu quả của nó trong việc cải thiện chất lượng sản phẩm. Enzyme này giúp tăng cường sự phát triển của nấm men, từ đó nâng cao hiệu suất lên men. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng bromelain với nồng độ 0,5% trong 55 phút tại pH 5,7 và nhiệt độ 55°C cũng cho hàm lượng nitơ amin đáng kể, cho thấy sự cần thiết của enzyme protease trong quy trình sản xuất rượu vang nếp.

IV. Nấm men trong sản xuất rượu vang

Nấm men là một yếu tố không thể thiếu trong quy trình lên men rượu vang nếp. Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng trong nghiên cứu này đã cho thấy khả năng chuyển hóa đường thành rượu hiệu quả. Việc sử dụng nấm men thuần chủng giúp đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm. Kết quả cho thấy rằng nấm men không chỉ giúp tăng cường hiệu suất lên men mà còn cải thiện chất lượng cảm quan của sản phẩm rượu vang nếp.

4.1. Vai trò của nấm men

Nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu vang nếp. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng nấm men thuần chủng giúp tăng cường khả năng chuyển hóa đường thành rượu, từ đó nâng cao độ rượu và chất lượng sản phẩm. Kết quả cho thấy rằng nấm men không chỉ giúp cải thiện hiệu suất sản xuất mà còn đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Sản xuất rượu nếp truyền thống tại Việt Nam từ lâu chủ yếu được thực hiện theo phương thức thủ công, sử dụng nguồn bánh men thuốc bắc chứa hệ vi sinh vật tự nhiên không thuần khiết. Thực trạng này dẫn đến chất lượng sản phẩm không ổn định giữa các mẻ nấu, thời gian sản xuất kéo dài, khó kiểm soát các giai đoạn biến đổi sinh hóa và tiềm ẩn nguy cơ hình thành các tạp chất độc hại đối với sức khỏe người tiêu dùng do thiết bị thô sơ. Trong khi nhiều quốc gia trong khu vực đã chuẩn hóa và đưa các sản phẩm rượu cổ truyền vào sản xuất quy mô công nghiệp (như Sake của Nhật Bản, Mao Đài của Trung Quốc, Shochu của Hàn Quốc), quy trình chế biến rượu nếp ở quy mô công nghệ tại Việt Nam vẫn tồn tại khoảng trống lớn về việc chuẩn hóa kỹ thuật và kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm. Luận án "Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase, protease và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp" (đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, năm 2010, Trường Đại học Trà Vinh) của tác giả Nguyễn Hoàng Anh được thực hiện nhằm hoàn thiện quy trình kỹ thuật sản xuất rượu vang nếp trắng, ứng dụng chế phẩm sinh học hiện đại thay thế phương pháp cổ truyền.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

1. Xây dựng quy trình sản xuất rượu nếp sạch theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm TCVN 7045:2009.
2. Cải thiện quy trình sản xuất rượu nếp truyền thống theo phương pháp cổ truyền có thể sản xuất công nghiệp và cho ra sản phẩm chất lượng cao và an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm.

Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm 7 nhiệm vụ khảo sát:

1. Khảo sát ứng dụng enzyme $\alpha$-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần hồ tinh bột nếp trắng.
2. Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.
3. Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng.
4. Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng.
5. Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định.
6. Đánh giá chất lượng sản phẩm (về các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh vật).
7. Phân tích kết quả và tìm ra quy trình sản xuất tối ưu cho sản phẩm rượu vang nếp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Nguyên liệu gạo nếp thơm trắng (Oryza sativa); các chế phẩm enzyme thương phẩm gồm $\alpha$-amylase (Termamyl 120L), glucoamylase (AMG 300L), protease nguồn gốc thực vật gồm papain (chiết xuất từ đu đủ) và bromelain (chiết xuất từ thân dứa); chủng nấm men thuần Saccharomyces cerevisiae; bánh men thuốc bắc thương mại của Doanh nghiệp tư nhân Sản xuất Thương mại Hải Anh Quang.
• Phạm vi không gian: Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm (Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ) và Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Trung tâm Thí nghiệm (Khoa Nông nghiệp và Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh). Phân tích ngoại kiểm các chỉ tiêu protein, tinh bột và an toàn thực phẩm được thực hiện tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm thuộc Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM.
• Phạm vi thời gian: Quá trình nghiên cứu và phân tích thực nghiệm được tiến hành từ ngày 01/06/2009 đến ngày 01/08/2010.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan tài liệu, tác giả đã hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến nguyên liệu, enzyme học và công nghệ lên men rượu:

• Thành phần nguyên liệu: Trích dẫn số liệu của Nguyễn Đức Lượng (2003) về cấu trúc hóa học của hạt nếp trắng (Oryza sativa), bao gồm hàm lượng glucid (74,9%), protein (8,2%), nước (14,0%), lipid (1,5%), tro (0,8%) và acid hữu cơ (0,6%), cùng đặc điểm cấu tạo phân tử amylose (mạch thẳng liên kết $\alpha$-1,4 glycoside) và amylopectin (mạch nhánh liên kết $\alpha$-1,4 và $\alpha$-1,6 glycoside).
• Đặc tính và cơ chế enzyme amylase: Trích dẫn Bùi Thị Quỳnh Hoa (2004) về điều kiện pH và nhiệt độ hoạt động tối thích của $\alpha$-amylase từ malt (pH 5,5–5,7; 72–75°C), vi khuẩn (pH 5,0–6,0; 50–60°C), nấm mốc (pH 6,0–7,0; 60–70°C); Nguyễn Đức Lượng (2004) về độ bền nhiệt của $\alpha$-amylase và cơ chế phân cắt liên kết glycoside nội phân của enzyme; Shahina Naz (2002) về vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của ion $\text{Ca}^{2+}$, tác dụng hoạt hóa của ion đơn hóa trị ($\text{Cl}^- > \text{Br}^- > \text{I}^-$) và cơ chế kìm hãm của ion kim loại nặng ($\text{Cu}^{2+}, \text{Hg}^{2+}$) đối với amylase; Lý Nguyễn Bình (1997) và Novo Nordisk (2007) về cơ chế tác dụng của glucoamylase (AMG 300L từ Aspergillus niger) thủy phân tuần tự gốc glucose từ đầu không khử.
• Đặc tính enzyme protease: Trích dẫn nghiên cứu của R. Smith và Nguyễn Đức Lượng (2004) về cấu trúc chuỗi polypeptide 185 acid amin của papain, cấu tạo tâm hoạt động (Cys 25, His 159, Asp 175); Yamada và cộng sự (1976), Ota và cộng sự về điểm đẳng điện pI (4,6 ở bromelain quả và 9,6 ở bromelain thân) cùng phân tử lượng của bromelain (23–31 kDa); Phạm Thu Cúc (1999) về vùng nhiệt độ hoạt động của bromelain (45–60°C).
• Cơ chế lên men và hình thành sản phẩm phụ: Trích dẫn Nguyễn Đức Lượng (1996, 2002) về thành phần hóa học tế bào nấm men (Carbon 49,80%, CaO 12,40%, Nitơ 6,70%, Hydro 3,54%, $\text{P}_2\text{O}_5$ 2,34%) và đặc tính của Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini, Saccharomyces oviformis; Walker (1998) về sơ đồ trao đổi chất hiếu khí/yếm khí; Bùi Thị Quỳnh Hoa (2004) về động thái chuyển động của tế bào men dưới tác động giải phóng khí $\text{CO}_2$; Trần Thị Luyến (2004) về cơ chế hình thành các hợp chất bay hơi, methanol từ pectin, aldehyde từ khử carboxyl acid pyruvic, rượu bậc cao (dầu fusel) từ biến đổi amino acid, acid hữu cơ và ester.
• Phương pháp kiểm nghiệm: Dẫn chiếu phương pháp chuẩn độ đường khử Lane-Eynon, định lượng cồn và ester theo Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng (2007), định tính furfurol với anilin theo Lê Thanh Mai và cộng sự (2005), chuẩn độ formol xác định nitơ amin theo Nguyễn Văn Mùi (2001), và đánh giá cảm quan cho điểm theo Ngô Thị Hồng Thư (1998) cùng TCVN 3217-79.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án tập trung giải quyết là: Thiếu một nghiên cứu hoàn chỉnh xác lập các thông số động học Michaelis-Menten và điều kiện công nghệ tối ưu khi phối hợp đồng thời 4 enzyme thương mại ($\alpha$-amylase, glucoamylase, papain, bromelain) trên cơ chất thực tế là tinh bột và protein nếp trắng, nhằm kiểm soát các chỉ tiêu chất lượng và rút ngắn thời gian lên men của rượu vang nếp so sánh trực tiếp với phương pháp cổ truyền dùng men thuốc bắc.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên khung lý thuyết động học enzyme và hóa sinh lên men:

• Khung lý thuyết: Động học enzyme Michaelis-Menten xác định tốc độ phản ứng cực đại $V_{max}$ và hằng số ái lực $K_m$ qua phương trình: $$V = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]}$$ Lý thuyết phân cắt liên kết $\alpha-1,4$ và $\alpha-1,6$ glycoside của endoamylase và exoamylase; cơ chế thủy phân liên kết peptide giải phóng acid amin tự do và nitơ amin của cysteine protease (papain, bromelain); con đường đường phân Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) chuyển hóa glucose thành ethanol và $\text{CO}_2$ dưới tác dụng của hệ enzyme trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae.
• Phương pháp bố trí thí nghiệm: Phương pháp thực nghiệm định lượng, bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo thể thức thừa số với 2–3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), kiểm định sự khác biệt giữa các giá trị trung bình bằng trắc nghiệm LSD (Least Significant Difference), tối ưu hóa và xây dựng đồ thị bề mặt đáp ứng 3D và đường mức (Contour) trên phần mềm Statgraphics Plus.
• Hệ thống phương pháp phân tích:
  • Đo pH bằng máy đo pH điện cực thủy tinh.
  • Đo hàm lượng chất khô hòa tan (độ Brix) bằng chiết quang kế cầm tay ATAGO.
  • Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp chuẩn độ Lane-Eynon.
  • Xác định nồng độ ethanol (% thể tích) bằng phương pháp chưng cất và đo tỷ trọng kế/cồn kế.
  • Xác định độ chua (acid tổng số quy về acid acetic) bằng phương pháp chuẩn độ trung hòa với dung dịch $\text{NaOH } 0,1\text{N}$ sử dụng chỉ thị phenolphthalein.
  • Xác định hàm lượng ester bằng phương pháp xà phòng hóa định phân.
  • Xác định hàm lượng nitơ amin bằng phương pháp chuẩn độ formol theo Sorensen.
  • Định tính furfurol dựa trên phản ứng tạo màu hồng - da cam với anilin trong môi trường acid.
  • Đánh giá chất lượng cảm quan (màu sắc, độ trong, mùi, vị) theo phương pháp cho điểm thị hiếu dựa trên tiêu chuẩn TCVN 3217-79.
  • Phân tích hàm lượng protein theo tiêu chuẩn Ref AOAC 992.23 (2002) và hàm lượng tinh bột theo TCVN 4594-1988 tại Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TP.HCM.
  • Đánh giá chất lượng an toàn vệ sinh và vi sinh vật của sản phẩm theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7045:2009 đối với rượu vang.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này nêu bật tính cấp thiết của đề tài trong bối cảnh sản xuất rượu nếp truyền thống tại các địa phương (như Làng Vân, Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh) còn phụ thuộc vào công nghệ thô sơ và bánh men thuốc bắc không đồng nhất. Tác giả xác lập 2 mục tiêu nghiên cứu và cấu trúc thành 7 nội dung thực nghiệm chính nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất rượu vang nếp sạch đạt TCVN 7045:2009.

Chương 2: Lược khảo tài liệu

Tác giả tổng hợp cơ sở lý thuyết toàn diện về:

• Đặc tính hóa lý của hạt gạo nếp (Oryza sativa) với tỷ lệ tinh bột trên 70%, chủ yếu là amylopectin.
• Cơ chế tác dụng và tính chất động học của 4 loại enzyme: $\alpha$-amylase (Termamyl 120L chịu nhiệt từ Bacillus licheniformis, hoạt tính 120 KNU/g), glucoamylase (AMG 300L từ Aspergillus niger), papain (chiết xuất từ đu đủ, hoạt tính 21.000 USP units/mg) và bromelain (chiết xuất từ thân dứa, hoạt tính $\ge 2,0\text{ mAnsonU/mg}$).
• Sinh học nấm men Saccharomyces cerevisiae, tiêu chuẩn chất lượng bánh men giống Hải Anh Quang (độ ẩm $\le 8%$, glucid $\ge 80%$, protein $\ge 8,5%$, tổng tế bào nấm men $\ge 10^7\text{ cfu/g}$, không có nấm mốc độc hại).
• Động thái các giai đoạn sản xuất rượu vang nếp: hồ hóa nếp với tỷ lệ nước 1:4, dịch hóa, đường hóa, thủy phân protein, lên men chính (khoảng 6 ngày), lên men phụ và ủ ổn định (3–6 tháng), cùng cơ chế phát sinh các sản phẩm phụ như methanol, aldehyde, rượu bậc cao, acid hữu cơ, ester và furfurol.

Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết thời gian (06/2009–08/2010), địa điểm thực hiện (Đại học Cần Thơ, Đại học Trà Vinh, Sở KH&CN TP.HCM), danh mục thiết bị (máy nghiền JIYU MILL, chiết quang kế ATAGO, cân phân tích OHAUS $d=0,0001$, máy chuẩn độ điện thế, nồi ổn nhiệt water bath) và hóa chất. Tác giả thiết kế 5 khối thí nghiệm chính:

1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme Termamyl 120L, thời gian và nồng độ bột nếp đến hiệu quả dịch hóa và đường hóa một phần.
2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ AMG 300L, thời gian và tỷ lệ bột nếp đến hiệu quả đường hóa hoàn toàn.
3. Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và điều kiện thủy phân protein dịch nếp bằng papain (pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme, thời gian, nồng độ cơ chất để xác định $V_{max}$ và $K_m$).
4. Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và điều kiện thủy phân protein dịch nếp bằng bromelain (pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme, thời gian, nồng độ cơ chất để xác định $V_{max}$ và $K_m$).
5. Thí nghiệm 5: Theo dõi động thái lên men chính và giai đoạn ổn định 3 tháng của 4 mẫu rượu:
   • Mẫu TB: Lên men truyền thống bằng bánh men thuốc bắc Hải Anh Quang.
   • Mẫu ĐC (Đối chứng): Dịch nếp thủy phân bằng $\alpha$-amylase + glucoamylase, lên men bằng S. cerevisiae thuần chủng (tỷ lệ 0,2%).
   • Mẫu PA: Dịch nếp thủy phân bằng $\alpha$-amylase + glucoamylase + papain, lên men bằng S. cerevisiae.
   • Mẫu BR: Dịch nếp thủy phân bằng $\alpha$-amylase + glucoamylase + bromelain, lên men bằng S. cerevisiae.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp toàn bộ số liệu thực nghiệm và thảo luận kết quả nghiên cứu:

• Thành phần nguyên liệu nếp trắng: Xác định hàm lượng glucid, protein, ẩm, tro của nếp nguyên liệu.
• Thông số tối ưu hóa các phản ứng thủy phân enzyme:
  • Quá trình dịch hóa bằng $\alpha$-amylase: Nồng độ enzyme tối ưu là 0,3%, thời gian thủy phân 31 phút ở điều kiện pH 6,5 và nhiệt độ 87°C, hàm lượng đường khử tạo thành đạt 6,46%.
  • Quá trình đường hóa bằng glucoamylase: Nồng độ enzyme tối ưu là 0,6%, thời gian thủy phân 39 phút ở điều kiện pH 4,0 và nhiệt độ 61°C, hàm lượng đường khử tích lũy đạt 16,10%.
  • Quá trình thủy phân protein bằng papain: Nồng độ enzyme tối ưu là 0,35%, thời gian 45 phút ở pH 5,9 và nhiệt độ 50°C, thu được hàm lượng nitơ amin đạt 0,081%. Các thông số động học Michaelis-Menten xác định được là $V_{max} = 0,1065 \pm 0,0036$ và $K_m = 4,7822 \pm 0,7705$.
  • Quá trình thủy phân protein bằng bromelain: Nồng độ enzyme tối ưu là 0,5%, thời gian 55 phút ở pH 5,7 và nhiệt độ 55°C, hàm lượng nitơ amin thu được đạt 0,054%. Các thông số động học xác định được là $V_{max} = 0,0622 \pm 0,0013$ và $K_m = 3,5652 \pm 0,4280$.

Loại Enzyme	Nồng độ enzyme (%)	Thời gian (phút)	Nhiệt độ (°C)	pH tối thích	Kết quả chuyển hóa	Thông số động học ($V_{max}$, $K_m$)
$\alpha$-amylase (Termamyl 120L)	0,3%	31	87°C	6,5	Đường khử: 6,46%	—
Glucoamylase (AMG 300L)	0,6%	39	61°C	4,0	Đường khử: 16,10%	—
Papain	0,35%	45	50°C	5,9	Nitơ amin: 0,081%	$V_{max} = 0,1065 \pm 0,0036$ $K_m = 4,7822 \pm 0,7705$
Bromelain	0,5%	55	55°C	5,7	Nitơ amin: 0,054%	$V_{max} = 0,0622 \pm 0,0013$ $K_m = 3,5652 \pm 0,4280$

• Động thái lên men chính và chất lượng rượu thành phẩm:
  • Sau khi thủy phân, dịch nếp được lọc và điều chỉnh pH về 4,9 rồi cấy 0,2% nấm men thuần chủng Saccharomyces cerevisiae.
  • Giai đoạn lên men chính ở các mẫu sử dụng enzyme và men thuần chủng kết thúc sau 6 ngày, độ Brix và đường khử giảm mạnh, nồng độ cồn tích lũy đạt mức 12,6% thể tích.
  • Động thái biến đổi acid tổng và ester cho thấy mẫu có bổ sung protease (PA và BR) có sự tích lũy ester tạo hương tốt hơn, phản ứng định tính furfurol cho kết quả âm tính (không phát hiện).
  • Theo dõi chất lượng trong 3 tháng ổn định ghi nhận các chỉ tiêu hóa lý ổn định dần, dịch rượu trong và hài hòa về vị.
  • Đánh giá cảm quan theo TCVN 3217-79 cho thấy các mẫu vang nếp sử dụng enzyme kết hợp protease (đặc biệt là mẫu BR và PA) đạt điểm cảm quan vượt trội so với mẫu đối chứng ĐC và mẫu truyền thống TB.
  • Kết quả kiểm nghiệm tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm (Sở KH&CN TP.HCM) khẳng định các chỉ tiêu hóa lý (hàm lượng methanol, aldehyde, ester, acid bay hơi) và chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm rượu nếp ứng dụng enzyme đều đạt và thỏa mãn quy chuẩn kỹ thuật quốc gia TCVN 7045:2009 đối với rượu vang.

Chương 5: Kết quả thực tế nghiên cứu, khả năng ứng dụng và địa chỉ áp dụng, giá thành sản phẩm

• Tác giả so sánh mức độ hoàn thành giữa nội dung thực tế nghiên cứu với thuyết minh đề cương đã được phê duyệt.
• Đề xuất khả năng chuyển giao và địa chỉ ứng dụng quy trình công nghệ cho các cơ sở sản xuất rượu truyền thống, các hợp tác xã (HTX) và các doanh nghiệp tư nhân sản xuất thương mại (DNTN SXTM) tại địa phương nhằm cơ giới hóa và công nghiệp hóa sản xuất.
• Hạch toán chi tiết chi phí nguyên vật liệu, hóa chất, enzyme, nấm men, điện nước và khấu hao thiết bị để tính toán giá thành của 1 lít rượu vang nếp ở quy mô phòng thí nghiệm.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

• Xác lập được bộ thông số động học Michaelis-Menten hoàn chỉnh ($V_{max}$ và $K_m$) của hai enzyme protease thực vật (papain và bromelain) khi tác động trực tiếp trên cơ chất protein nếp trắng trong môi trường dịch đường sau dịch hóa và đường hóa.
• Làm sáng tỏ quy luật biến đổi sinh hóa (sự suy giảm độ Brix, sự chuyển hóa đường khử, tốc độ tích lũy ethanol, biến thiên pH, acid tổng và hàm lượng ester) trong suốt chu kỳ lên men chính và thời gian 3 tháng ủ ổn định rượu vang nếp không qua chưng cất.

Đóng góp về mặt thực tiễn

• Xây dựng thành công quy trình công nghệ hoàn chỉnh sản xuất rượu vang nếp trắng bằng cách kết hợp 4 chế phẩm enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase, papain/bromelain) và nấm men thuần chủng Saccharomyces cerevisiae.
• Rút ngắn thời gian lên men chính xuống còn 6 ngày, nâng nồng độ cồn sản phẩm đạt 12,6% (v/v), kiểm soát và loại trừ các nguy cơ tạp chất độc hại (furfurol, methanol, aldehyde vượt mức), giúp sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm TCVN 7045:2009.
• Tạo tiền đề kỹ thuật để chuyển đổi mô hình sản xuất rượu nếp thủ công sang quy mô bán công nghiệp và công nghiệp tại các hợp tác xã và doanh nghiệp chế biến thực phẩm.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất áp dụng quy trình công nghệ tối ưu vào thực tế sản xuất tại các cơ sở, làng nghề truyền thống và doanh nghiệp đồ uống để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.
• Khuyến nghị duy trì thời gian ủ ổn định sản phẩm tối thiểu từ 3 đến 6 tháng trước khi đóng chai thương phẩm để hương vị đạt độ hài hòa cao nhất.
• Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện hệ thống thiết bị lên men bán tự động và tự động kiểm soát nhiệt độ, pH nhằm ổn định chất lượng ở quy mô mẻ nấu lớn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm với nguồn nguyên liệu nếp thơm trắng thu mua tại Cần Thơ; thời gian theo dõi ủ ổn định chất lượng sản phẩm thực tế trong đề tài là 3 tháng (trong khi chu kỳ hoàn thiện chất lượng rượu vang theo lý thuyết thường kéo dài 6 tháng trở lên).
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Thử nghiệm triển khai quy trình ở quy mô pilot và quy mô sản xuất công nghiệp tại các cơ sở sản xuất và doanh nghiệp thực phẩm.
  • Mở rộng nghiên cứu khảo sát trên các giống nếp đặc sản khác nhau của các vùng miền để đánh giá mức độ thích ứng công nghệ.
  • Kéo dài thời gian theo dõi chất lượng và tuổi thọ bảo quản sản phẩm trong thời gian 6 đến 12 tháng.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu này là nguồn tư liệu hữu ích cho các đối tượng:

• Cán bộ nghiên cứu, giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ sau thu hoạch, Công nghệ thực phẩm và Công nghệ sinh học: Có thể tham khảo phương pháp bố trí thí nghiệm thừa số, kỹ thuật khảo sát động học enzyme protease ($V_{max}, K_m$), và quy trình phân tích hóa sinh quá trình lên men cồn.
• Kỹ sư công nghệ và cán bộ R&D tại các doanh nghiệp chế biến thực phẩm, đồ uống: Có thể khai thác trực tiếp các thông số kỹ thuật tối ưu (nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ, thời gian) của 4 loại enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase, papain, bromelain) để ứng dụng vào dây chuyền sản xuất rượu vang ngũ cốc.
• Các cơ sở sản xuất rượu truyền thống, hợp tác xã và các nhà quản lý chất lượng thực phẩm: Tham khảo bảng hạch toán giá thành sản xuất, sơ đồ quy trình công nghệ và các tiêu chuẩn kiểm soát hóa lý, vi sinh theo TCVN 7045:2009 nhằm chuẩn hóa quy trình sản xuất đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện tối ưu cho quá trình dịch hóa bằng enzyme $\alpha$-amylase và đường hóa bằng glucoamylase trong nghiên cứu được xác định như thế nào?
Quá trình dịch hóa bột nếp bằng chế phẩm $\alpha$-amylase (Termamyl 120L) đạt hiệu quả tối ưu ở nồng độ enzyme 0,3%, thời gian thủy phân 31 phút, nhiệt độ 87°C và pH 6,5, thu được hàm lượng đường khử khoảng 6,46%. Tiếp theo, quá trình đường hóa bằng glucoamylase (AMG 300L) đạt tối ưu ở nồng độ enzyme 0,6%, thời gian thủy phân 39 phút, nhiệt độ 61°C và pH 4,0, đưa tổng hàm lượng đường khử sinh ra lên tới 16,10%.

2. Các thông số động học Michaelis-Menten ($V_{max}$ và $K_m$) của papain và bromelain trong thủy phân protein nếp là bao nhiêu?
Khi thủy phân protein trong dịch nếp, enzyme papain (nồng độ tối ưu 0,35%, 45 phút, pH 5,9, 50°C, hàm lượng nitơ amin 0,081%) có các thông số động học là $V_{max} = 0,1065 \pm 0,0036$ và $K_m = 4,7822 \pm 0,7705$. Trong khi đó, enzyme bromelain (nồng độ tối ưu 0,5%, 55 phút, pH 5,7, 55°C, hàm lượng nitơ amin 0,054%) có các thông số động học là $V_{max} = 0,0622 \pm 0,0013$ và $K_m = 3,5652 \pm 0,4280$.

3. Việc bổ sung protease và sử dụng nấm men thuần chủng mang lại ưu thế gì so với bánh men thuốc bắc truyền thống?
Việc bổ sung protease (papain hoặc bromelain) giúp phân giải protein nếp thành các chuỗi peptide ngắn và acid amin tự do, cung cấp nguồn nitơ amin cần thiết cho nấm men thuần chủng Saccharomyces cerevisiae phát triển sinh khối và chuyển hóa đường. Nhờ đó, thời gian lên men chính được rút ngắn xuống còn 6 ngày, nồng độ cồn đạt 12,6% (v/v), cải thiện độ trong, màu sắc và hàm lượng ester thơm, đồng thời loại trừ nguy cơ nhiễm tạp khuẩn và độc tố từ bánh men thuốc bắc.

4. Những tiêu chuẩn và phương pháp nào được sử dụng để kiểm soát chất lượng rượu thành phẩm?
Chất lượng rượu vang nếp được kiểm soát thông qua đánh giá cảm quan theo TCVN 3217-79, định lượng cồn bằng phương pháp chưng cất, định phân acid tổng số và ester theo phương pháp của Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng (2007), định tính furfurol bằng phản ứng màu với anilin theo Lê Thanh Mai và cộng sự (2005), cùng việc kiểm nghiệm các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh vật đối chiếu với Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045:2009.

5. Bốn loại rượu thử nghiệm trong đề tài được ký hiệu và phân biệt như thế nào?
Đề tài so sánh 4 mẫu rượu: TB (rượu nếp lên men bằng bánh men thuốc bắc Hải Anh Quang), ĐC (rượu nếp đối chứng sử dụng $\alpha$-amylase, glucoamylase và nấm men thuần chủng), PA (rượu nếp sử dụng $\alpha$-amylase, glucoamylase, papain và nấm men thuần chủng) và BR (rượu nếp sử dụng $\alpha$-amylase, glucoamylase, bromelain và nấm men thuần chủng).

---

Kết luận

Đề tài nghiên cứu khoa học của tác giả Nguyễn Hoàng Anh đã hoàn thiện thành công quy trình công nghệ sản xuất rượu vang nếp trắng thông qua việc ứng dụng đồng bộ 4 loại enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase, papain, bromelain) kết hợp nấm men thuần chủng Saccharomyces cerevisiae. Công trình đã xác định chính xác các điều kiện công nghệ tối ưu cho từng giai đoạn dịch hóa, đường hóa, thủy phân protein và xác lập các thông số động học Michaelis-Menten thực nghiệm. Kết quả nghiên cứu chứng minh quy trình mới giúp rút ngắn thời gian lên men chính xuống còn 6 ngày, nâng nồng độ cồn đạt 12,6% (v/v) và sản phẩm đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm theo tiêu chuẩn TCVN 7045:2009, mở ra hướng ứng dụng hiệu quả cho việc công nghiệp hóa nghề sản xuất rượu truyền thống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Rượu vang là loại thức uống được lên men từ nhiều nguồn liệu: nho, khóm, chuối, nếp… mang đậm đà bản sắc văn hóa dân tộc của từng địa phương. Từ xưa đến nay, rượu thường xuất hiện trong các lễ hội, đình đám, các cuộc gặp gỡ của người thân, bạn bè. Rượu được sử dụng với nhiều mục đích ý nghĩa khác nhau như để chúc mừng, nâng cao sức khỏe hay để giải bày tâm sự… Rượu trở thành một trong những thức uống không thể thiếu trong văn hóa ẩm thực cũng như trong đời sống hằng ngày. Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều sản phẩm lên men truyền thống đã được nghiên cứu sâu về mặt quy trình sản xuất, hiện nay ở các nước trong khu vực đã nghiên cứu, cải tiến thành công chất lượng rượu cổ truyền và được áp dụng sản xuất với qui mô công nghiệp, phân phối rộng rãi trên thế giới như rượu Sakê của Nhật, rượu Mao Đài của Trung Quốc, rượu Shochu ở Hàn Quốc.

Ở Việt Nam thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng từ: rượu nho, rượu Cần ở các dân tộc miền núi Tây Nguyên đến rượu nếp của người Kinh, nhiều địa phương đã sản xuất các loại rượu nổi tiếng như rượu Làng Vân ở miền Bắc và rượu Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh ở miền Nam được nhiều người ưa chuộng. Trong các loại rượu cổ truyền kể trên thì rượu nếp là một loại khá đặc biệt, sản phẩm là kết quả của quá trình lên men từ những hạt nếp mà thành. Tuy nhiên, phương pháp sản xuất rượu ở một số địa phương vẫn còn theo phương pháp cổ truyền, tức là quá trình đường hóa và lên men được thực hiện bởi nấm mốc và nấm men trong bánh men thuốc bắc và thiết bị sản xuất thô sơ, nên năng suất chưa cao và chất lượng chưa an toàn vì chứa nhiều độc tố, tạp chất ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, để nâng cao hơn nữa chất lượng sản phẩm truyền thống này chúng tôi đề ra quy trình sản xuất rượu theo phương pháp mới, thông qua kết hợp hài hòa giữa công nghệ cổ truyền và kỹ thuật hiện đại.

Với việc ứng dụng phương pháp enzyme và nấm men thuần chủng ở giai đoạn đường hóa, thủy phân protein và lên men để rút ngắn thời gian sản xuất cũng như ổn định được chi phí sản xuất, đảm bảo chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm rượu vang nếp. Từ những lý do trên việc nghiên cứu “Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” có ý nghĩa rất quan trọng.2 Mục tiêu của đề tài Xây dựng qui trình sản xuất rượu nếp sạch theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm TCVN 7045: 2009. Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 1 luan an Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Cải thiện quy trình sản xuất rượu nếp truyền thống theo phương pháp cổ truyền có thể sản xuất công nghiệp và cho ra sản phẩm chất lượng cao và an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm.3 Nội dung nghiên cứu Từ những mục tiêu trên, đề tài tiến hành các khảo sát sau: - Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần hồ tinh bột nếp trắng. - Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng.

- Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng. - Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein của dịch nếp trắng. - Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định. - Đánh giá chất lượng sản phẩm (cảm quan, hóa lí và vi sinh vật) - Phân tích kết quả và tìm ra qui trình sản xuất tối ưu cho sản phẩm rượu vang nếp.

Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 2 luan an Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu Tên khoa học của nếp là Oryza Sativa thuộc nhóm ngũ cốc, là loại nguyên liệu chứa tinh bột rất cao phù hợp với công nghệ lên men, trong đó nếp trắng với hàm lượng tinh bột lên đến hơn 70%, vì vậy nếp trắng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất rượu.1 Hạt nếp trắng Trong tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin, 2cấu tử này khác hẳn về tính chất hoá học và tính chất vật lý. Phân tử amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho m àu tím đỏ, amylose và amylopectin cũng khác nhau về tính hoà tan, amylose dễ hoà tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn amylopectin chỉ hoà tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao. Trong phân tử tinh bột tỉ lệ giữa amylose và amylopectin thay đổi tuỳ thuộc vào nguồn nguyên liệu, trong hạt gạo chủ yếu là amylose, còn trong hạt nếp là amylopectin.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu nếp trắng Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14,0 Protein 8,2 Lipid 1,5 Glucid 74,9 Acid hữu cơ 0,6 Tro 0,8 (Nguyễn Đức Lượng, 2003) Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 3 luan an Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh + Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000, được cấu tạo từ 200 ÷ 1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh. + Amylopectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷ 6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside tạo thành mạch phân nhánh.2 Enzyme amylase Enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, y học, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác, amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các polysaccharides.

Enzyme amylase sẽ thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin mạch dài thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn. Dựa vào đặc tính và cơ chế tác dụng lên phân tử tinh bột của enzyme amylase, người ta phân biệt chia enzyme amylase thành hai nhóm: - Endoamylase (enzyme nội phân): gồm α-amylase và nhóm enzyme khử mạch nhánh.2 Cơ chế tác dụng của enzyme amylase lên phân tử tinh bột 2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.1) Đặc tính: Enzyme α-amylase dễ tan trong nước, các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính acid yếu. Protein của α-amylase từ các nguồn sản Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 4 luan an Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh xuất có thành phần amino acid khác nhau.

Điều kiện hoạt động và độ bền của các enzyme α-amylase tùy thuộc vào nguồn chiết suất.2 Điều kiện hoạt động của enzyme α-amylase từ các nguồn khác nhau Nguồn gốc pH tối thích Nhiệt độ tối thích (0C) Malt 5,5 ÷ 5,7 72 ÷ 75 Vi khuẩn 5,0 ÷ 6,0 50 ÷ 60 Nấm mốc 6,0 ÷ 7,0 60 ÷ 70 (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004) Ion Ca2+ là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase, đồng thời nó còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein, nếu α-amylase bị mất ion Ca2+ thì nó hoàn toàn bị mất khả năng thủy phân cơ chất. Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi các ion đơn hóa trị như: Cl- > Br- > I-. Đồng thời chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+ (Shahina Naz, 2002). Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền ở môi trường nhiệt Bảng 2.3 Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn sản xuất khác nhau Hoạt tính (% so với hoạt tính ban đầu) Nhiệt độ (0C) Malt Nấm mốc Vi khuẩn 65 100 100 100 70 100 52 100 75 58 3 100 80 25 - 92 85 1 - 58 90 - - 52 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) * Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 5 luan an Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt liên kết 1,4 α-glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa.

Do đó, enzyme này được gọi là enzyme nội phân (endo).3 Cấu trúc không gian của enzyme α-amylase Giai đoạn dextrin hóa (dịch hóa): Dưới tác dụng của α-amylase, phân tử amylose bị phân cắt thành các oligosaccharides (6 ÷7 gốc glucose), độ nhớt của hồ tinh bột rất giảm nhanh. Giai đoạn đường hóa: Các oligosaccharides lại tiếp tục bị phân cắt tạo thành maltotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân α- amylase là 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của enzyme α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo thành là 72% maltose và 19% glucose, ngoài ra còn có các dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không cắt được liên kết 1, 6-glycoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin.4 Tác dụng của α-amylase lên phân tử amylose và amylopectin Đề tài nghiên cứu sẽ đề cập đến việc sử dụng Chế phẩm enzyme Termamyl 120L: ở dạng lỏng, chứa enzyme có khả năng chịu nhiệt ổn định α-amylase, được sản xuất từ một chủng loại vi sinh vật chọn lọc tên là Bacillus licheniformis.

Enzyme α-amylase nội bào phân cắt các liên kết α-1, 4-glucoside nằm ở bên trong phân tử cho ra dextrin và các oligosaccharides. Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch 6 luan an Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Trong dịch tinh bột hòa tan Termamyl 120L có hoạt tính 120 KNU/g (Kilo Novo α- amylase unit). Hoạt tính có thể bị hủy bằng xử lý nhiệt dung dịch ở pH thấp. Sản phẩm này không dễ bắt lửa, tan hoàn toàn trong nước và an toàn khi sử dụng theo như chỉ dẫn, sản phẩm Termamyl 120L có thể gây dị ứng đối với người nhạy cảm (Novo Nordisk, 2007).2 Enzyme glucoamylase (EC 3.3) Đặc tính: Glucoamylase là một exoamylase, còn được gọi là γ-amylase amyloglucosidae, có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột (Shahina Naz, 2002).

So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của ethylic, acetone, không bền với ion Cu2+, Hg2+… Glucoamylase có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn, hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5.