Khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm an toàn.

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Khánh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Xuân Cảnh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
• 1.1. Mục đích
• 1.2. Yêu cầu
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB)
• 2.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic
• 2.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn lactic
• 2.4. Tổng quan về bacteriocin
• 2.4.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển
• 2.4.2. Giới thiệu về bacteriocin
• 2.4.3. Phân loại bacteriocin được sinh tổng hợp bởi LAB
• 2.4.4. Các tính chất của bacteriocin
• 2.4.5. Cơ chế tổng hợp bacteriocin
• 2.4.6. Cơ chế hoạt động của bacteriocin
• 2.4.7. Ứng dụng của bacteriocin
• 2.4.8. Thực trạng nghiên cứu về bacteriocin trên thế giới
• 2.4.9. Thực trạng nghiên cứu về bacteriocin tại Việt Nam
• 3. PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
• 3.4. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 3.5. Nội dung nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Phương pháp thu thập mẫu
• 3.6.2. Phương pháp phân lập
• 3.6.3. Phương pháp giữ giống vi khuẩn (Lương Đức Phẩm, 2015)
• 3.6.4. Phương pháp khảo sát khả năng sinh bacteriocin đối kháng với vi khuẩn kiểm định
• 3.6.5. Phương pháp xác định bản chất yếu tố kháng khuẩn (Marwa et al.)
• 3.6.6. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm của các chủng vi khuẩn được chọn lọc
• 3.6.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lactic
• 4.2. Đánh giá khả năng sinh bacteriocin đối kháng với vi khuẩn kiểm định
• 4.3. Xác định cơ chế đối kháng
• 4.4. Xử lý với enzyme proteinase K
• 4.5. Đánh giá độ bền nhiệt của bacteriocin
• 4.6. Nghiên cứu một số đặc điểm của các chủng vi khuẩn được chọn lọc
• 4.7. Đánh giá khả năng di động
• 4.8. Đánh giá khả năng sinh acid lactic
• 4.9. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất bacteriocin của các chủng vi khuẩn
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu vi khuẩn sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men. Bacteriocin là các peptide hoặc protein kháng khuẩn được tổng hợp bởi vi khuẩn, có tiềm năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Mục tiêu của nghiên cứu là giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch và cải thiện chất lượng thực phẩm thông qua việc sử dụng các chất bảo quản tự nhiên. Nghiên cứu được thực hiện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, với sự hướng dẫn của các chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

1.1. Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu

Mục đích chính của nghiên cứu là phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men có khả năng sinh bacteriocin, hướng tới ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Yêu cầu cụ thể bao gồm việc phân lập từ 10-15 chủng vi khuẩn và tuyển chọn 2-3 chủng có khả năng sinh bacteriocin hiệu quả. Nghiên cứu này nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết trong việc tìm kiếm các chất bảo quản tự nhiên, an toàn cho sức khỏe con người.

II. Tổng quan về vi khuẩn lactic và bacteriocin

Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm, sản xuất acid lactic và các hợp chất kháng khuẩn như bacteriocin. Bacteriocin là các peptide kháng khuẩn được tổng hợp bởi vi khuẩn, có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu này tập trung vào việc khai thác tiềm năng của bacteriocin trong việc bảo quản thực phẩm, thay thế các chất bảo quản hóa học độc hại.

2.1. Đặc điểm hình thái và di truyền của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic bao gồm các chi như Lactobacillus, Streptococcus, và Leuconostoc, với đặc điểm chung là Gram dương, không hình thành bào tử và kỵ khí tùy ý. Chúng có khả năng lên men carbohydrate để sản xuất acid lactic và các sản phẩm phụ khác. Bộ gen của vi khuẩn lactic có hàm lượng GC thấp và chứa các gen mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình lên men và sản xuất bacteriocin.

2.2. Cơ chế tổng hợp và hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin được tổng hợp trong giai đoạn đầu phát triển của vi khuẩn, thông qua các cụm operon trong bộ gen hoặc plasmid. Cơ chế hoạt động của bacteriocin bao gồm việc gây rối loạn màng tế bào của vi khuẩn đích, dẫn đến sự mất cân bằng ion và tiêu diệt tế bào. Bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, từ các vi khuẩn cùng loài đến các chi khác nhau, làm cho chúng trở thành ứng cử viên tiềm năng trong bảo quản thực phẩm.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu được thực hiện bằng cách phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ 12 mẫu thực phẩm lên men như cà, cải bẹ, và cải thảo. Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng sinh bacteriocin thông qua các phương pháp như xử lý với enzyme proteinase K và đánh giá độ bền nhiệt. Kết quả cho thấy 12 chủng có khả năng đối kháng với Salmonella và Escherichia coli, trong đó 5 chủng được xác định có khả năng sinh bacteriocin.

3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn

Quá trình phân lập được thực hiện trên môi trường MRS agar bổ sung CaCO3, thu được 18 chủng vi khuẩn lactic. Các chủng này được đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định, và 12 chủng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn. Sau khi xử lý với proteinase K, 5 chủng được xác định có khả năng sinh bacteriocin.

3.2. Đánh giá hoạt tính bacteriocin

Hoạt tính bacteriocin được đánh giá dưới các điều kiện nhiệt độ khác nhau (30°C đến 100°C). Kết quả cho thấy chủng DD2.1 có hoạt tính ổn định và cao nhất. Chủng này cũng được đánh giá khả năng sản xuất bacteriocin trong các điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men. Các chủng này có tiềm năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch và cải thiện chất lượng thực phẩm. Nghiên cứu cũng đề xuất các hướng phát triển tiếp theo, bao gồm việc tối ưu hóa quy trình sản xuất bacteriocin và ứng dụng thực tế trong ngành công nghiệp thực phẩm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nông nghiệp giữ vị trí then chốt trong cơ cấu kinh tế Việt Nam. Dẫn chứng từ báo cáo Tình hình Kinh tế - Xã hội quý I năm 2021 của Tổng cục Thống kê cho thấy khu vực Nông, Lâm và Thủy sản chiếm 11,71% cơ cấu nền kinh tế; kim ngạch xuất khẩu nông lâm sản đạt 5,35 tỷ USD (tăng 7,9%) và thủy sản đạt 1,69 tỷ USD (tăng 3,3%). Tuy nhiên, công nghệ xử lý và bảo quản sau thu hoạch tại Việt Nam còn nhiều hạn chế, dẫn đến tỷ lệ thất thoát nông sản ở mức rất cao. Số liệu năm 2020 từ Phòng Thương mại và Công nghiệp Việt Nam chi nhánh Cần Thơ (VCCI Cần Thơ) ghi nhận tổn thất sau thu hoạch nông sản trong nước dao động từ 40% đến 45%. Riêng lúa gạo vùng Đồng bằng sông Cửu Long thất thoát 10-12% mỗi năm (tương đương 3.000–3.500 tỷ đồng); rau quả và trái cây chịu mức tổn thất lên tới 45%; thủy hải sản ở ngưỡng 35%. Cùng thời điểm, Văn phòng Ban chỉ đạo Quốc gia về chương trình hành động "Không còn nạn đói ở Việt Nam" cảnh báo tổn thất thực phẩm xảy ra trong quá trình sản xuất và thu hoạch chiếm 25%, trong khi giai đoạn xử lý, vận chuyển và bảo quản chiếm 6%.

Thực trạng phân phối nông sản tươi sống từ đồng ruộng tới hệ thống chợ truyền thống và siêu thị hiện nay phần lớn sử dụng phương thức bảo quản thô sơ, thiếu chuỗi cung ứng lạnh đạt chuẩn. Môi trường này tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật gây thối hỏng và vi khuẩn gây bệnh xâm nhiễm, phổ biến gồm Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Vibrio inaba, Streptococcus. Để hạn chế hư hỏng, việc lạm dụng chất bảo quản hóa học diễn ra phổ biến nhưng tiềm ẩn nguy cơ mất an toàn thực phẩm, ngộ độc và rối loạn tiêu hóa ở người tiêu dùng. Nhằm tìm kiếm giải pháp thay thế an toàn sinh học, hướng tiếp cận sử dụng vi khuẩn lactic (LAB) có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin — peptide hoặc protein kháng khuẩn có nguồn gốc ribosome — đang nhận được sự quan tâm lớn. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài "Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men" được thực hiện.

Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể:

1. Mục đích: Phân lập được một số chủng vi khuẩn từ thực phẩm lên men có khả năng sinh bacteriocin định hướng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.
2. Yêu cầu cụ thể:
   • Phân lập được từ 10 đến 15 chủng vi khuẩn từ các nguồn thực phẩm lên men.
   • Tuyển chọn được từ 2 đến 3 chủng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin đối kháng tốt với vi khuẩn kiểm định.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn lactic hiện diện trong các loại thực phẩm lên men truyền thống từ thực vật; hai chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh đường ruột gồm Escherichia coli và Salmonella.
• Phạm vi không gian: Mẫu thực phẩm lên men được thu thập tại 4 địa phương thuộc miền Bắc và miền Trung Việt Nam; các nội dung thực nghiệm được triển khai tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2020 đến tháng 8/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên cơ sở lý thuyết về vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) thuộc họ Lactobacteriaceae. Về mặt sinh lý, nhóm vi khuẩn này có đặc tính chung: Gram dương, không hình thành bào tử (hầu hết), kỵ khí tùy ý, phản ứng catalase âm tính, không khử nitrate và thu nhận năng lượng ATP thông qua quá trình lên men carbohydrate để tạo sản phẩm chính là acid lactic. Các chi LAB phổ biến được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm bao gồm Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Bifidobacterium.

Bacteriocin được định nghĩa là các phân tử peptide hoặc protein kháng khuẩn do vi khuẩn tổng hợp trên ribosome (sản phẩm chuyển hóa bậc một), có hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn khác, đặc biệt là các chủng có quan hệ phân loại gần gũi với loài sản sinh mà không làm tổn hại tế bào chủ nhờ cơ chế tự miễn dịch. Khóa luận phân tích hệ thống phân loại bacteriocin của LAB theo Klaenhammer và Desriac et al. gồm 4 lớp: Lớp I (Lantibiotic, trọng lượng phân tử < 5 kDa, chứa amino acid lanthionine như Nisin); Lớp II (Non-lantibiotic, < 10 kDa, bền nhiệt, không chứa lanthionine, gồm các phân lớp IIa, IIb, IIc); Lớp III (peptide khối lượng phân tử lớn > 30 kDa, không bền nhiệt như Helveticin J); Lớp IV (bacteriocin phức tạp gắn với lipid hoặc carbohydrate). Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin chủ yếu diễn ra qua việc hình thành lỗ thủng trên màng tế bào đích làm rò rỉ ion, tiêu tán động lực proton và làm chết tế bào, hoặc ức chế quá trình tổng hợp peptidoglycan qua việc bắt giữ phân tử Lipid II.

Tiêu chí	Bacteriocin	Kháng sinh (Antibiotics)
Ứng dụng chính	Thực phẩm, công nghệ sinh học	Y học, điều trị lâm sàng
Bản chất tổng hợp	Ribosome (sản phẩm chuyển hóa bậc 1)	Chuyển hóa bậc 2
Phổ hoạt tính	Phổ hẹp (hoặc rộng tùy phân lớp)	Phổ rộng
Cơ chế miễn dịch tế bào chủ	Có cơ chế miễn dịch chuyên biệt	Không có cơ chế miễn dịch tự thân
Dạng tác động	Tạo lỗ màng tế bào, ức chế Lipid II	Tác động màng hoặc can thiệp đích nội bào
Ảnh hưởng lên tế bào nhân chuẩn	Không ảnh hưởng	Có thể gây độc hoặc tác dụng phụ

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Thu thập mẫu: Thu thập 12 mẫu thực phẩm lên men từ rau củ quả tại 4 khu chợ truyền thống, bảo quản lạnh và vận chuyển trực tiếp về phòng thí nghiệm.

Địa điểm lấy mẫu	Loại mẫu thực phẩm	Số lượng mẫu
Chợ sinh viên Đường Y (Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội)	Dưa cải muối, Cà muối	4 (2 dưa cải, 2 cà)
Chợ Ngô Sĩ Liên (Đống Đa, Hà Nội)	Măng muối	2
Chợ Xép (Đông Hà, Quảng Trị)	Dưa giá hẹ muối	2
Chợ Hoà Mạc (Duy Tiên, Hà Nam)	Cải thảo muối, Sung muối	4 (2 cải thảo, 2 sung)
Tổng cộng		12 mẫu

• Phương pháp phân lập và tuyển chọn: Đồng nhất mẫu trong nước muối sinh lý 0,9%, pha loãng bậc 10 đến nồng độ $10^{-8}$. Dùng 100 µl dịch mẫu ở nồng độ pha loãng $10^{-3}$, $10^{-4}$, $10^{-5}$ trải đều trên đĩa môi trường MRS agar bổ sung 0,5% $\text{CaCO}_3$, ủ ở 37°C trong 48 giờ. Tuyển chọn khuẩn lạc sinh vòng tan $\text{CaCO}_3$ (do sinh acid lactic hòa tan muối canxi), cấy ria làm thuần.
• Phương pháp giữ giống: Giữ giống ngắn hạn trên thạch nghiêng môi trường LB ở 4°C (cấy chuyển định kỳ mỗi tháng); bảo quản dài hạn trong dung dịch Glycerol 30% ở nhiệt độ âm sâu.
• Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn: Dùng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) trên môi trường LB agar chứa vi khuẩn chỉ thị (E. coli và Salmonella). Dịch nuôi cấy vi khuẩn phân lập sau 48 giờ trong môi trường MRS lỏng được ly tâm lạnh ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút tại 4°C. Thu dịch nổi và điều chỉnh pH về 6,5 bằng dung dịch NaOH 1M nhằm trung hòa hoàn toàn acid lactic, loại bỏ ảnh hưởng kháng khuẩn gây ra bởi acid hữu cơ. Tạo giếng thạch đường kính 5 mm, nạp 50 µl dịch nổi đã xử lý (đối chứng âm nạp 50 µl nước cất vô trùng).
• Phương pháp xác định bản chất bacteriocin: Xử lý dịch nổi với enzyme phân giải protein Proteinase K; nếu hoạt tính kháng khuẩn mất đi sau khi xử lý enzyme thì chứng minh yếu tố đối kháng có bản chất protein.
• Đánh giá độ bền nhiệt: Xử lý nhiệt dịch chiết ở các mức 30°C, 40°C, 60°C, 80°C trong 30 phút và 100°C trong 60 phút trước khi đo đường kính vòng kháng khuẩn.
• Phương pháp khảo sát sinh lý và điều kiện nuôi cấy: Thử nghiệm khả năng di động, đánh giá khả năng sinh acid lactic, khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Glucose (2%, 3%), Cao nấm men (Yeast extract 2%, 3%) và khả năng chịu muối NaCl (2%) đến năng lực sinh tổng hợp bacteriocin.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Tác giả nêu rõ cơ sở khoa học và áp lực thực tế của ngành nông nghiệp Việt Nam trước vấn đề thất thoát sau thu hoạch đối với nhóm hàng rau củ quả và nông sản tươi sống. Chương mở đầu phân tích hạn chế của các chất bảo quản hóa học hiện hành, đồng thời làm rõ tiềm năng của chất bảo quản sinh học tự nhiên từ vi khuẩn lactic. Mục tiêu nghiên cứu được lượng hóa thành hai chỉ tiêu cụ thể: phân lập 10–15 chủng vi khuẩn từ thực phẩm lên men và tuyển chọn 2–3 chủng có khả năng sinh bacteriocin có hoạt tính đối kháng tốt.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết lịch sử phát hiện và nghiên cứu vi khuẩn lactic từ năm 1780 (Scheele) và 1857 (Pasteur), phân tích đặc tính hình thái, sinh lý, di truyền học (hàm lượng GC thấp, hệ thống phosphotransferase phụ thuộc phosphoenolpyruvate - PTS, các cụm gen operon mã hóa tổng hợp bacteriocin). Tác giả hệ thống hóa các cột mốc nghiên cứu bacteriocin từ năm 1925 (A. Gratia phát hiện Colicin) đến khi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp chứng nhận GRAS cho Nisin và Colicin. Tài liệu phân tích chuyên sâu 4 lớp bacteriocin của LAB, cơ chế phân tử tác động lên thành tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm, cùng các ứng dụng thực tiễn trong công nghệ bao bì sinh học, y dược (sản phẩm chăm sóc khoang miệng chứa Streptococcus salivarius K12, điều trị mụn trứng cá bằng bacteriocin ESL5), thú y (điều trị viêm vú bò) và bảo quản thực phẩm. Phần cuối chương tổng hợp các nghiên cứu trong nước của Nguyễn Thị Hoài Hà (2002), Lê Thị Hồng Tuyết, Phạm Thùy Linh và Nguyễn Thúy Hương.

Phần III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày chi tiết địa điểm thu thập 12 mẫu thực phẩm lên men (dưa cải, cà, măng, dưa giá hẹ, cải thảo, sung muối) tại Hà Nội, Hà Nam, Quảng Trị; danh mục vi khuẩn kiểm định (E. coli, Salmonella); trang thiết bị thí nghiệm và công thức hóa chất, môi trường (MRS đặc, MRS dịch thể, LB đặc, LB dịch thể, hóa chất nhuộm Gram). Quy trình thực nghiệm được mô tả chuẩn hóa theo từng bước: đồng nhất mẫu, pha loãng bậc, cấy trang trên thạch MRS bổ sung 0,5% $\text{CaCO}_3$, ủ 48 giờ ở 37°C, kỹ thuật cấy ria làm thuần, ly tâm lạnh thu dịch nổi, hiệu chỉnh pH về 6,5 bằng NaOH 1M, kỹ thuật đục giếng thạch 5 mm, thử nghiệm enzyme Proteinase K và quy trình gia nhiệt ở các dải nhiệt độ 30–100°C.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương thực nghiệm phản ánh đầy đủ các kết quả định lượng đạt được:

• Phân lập vi khuẩn lactic: Từ 12 mẫu thực phẩm ban đầu, phân lập thành công 18 chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic tạo vòng phân giải $\text{CaCO}_3$ trên môi trường MRS agar.
• Sàng lọc khả năng kháng khuẩn: Sau khi loại bỏ tác dụng ức chế của acid lactic bằng cách chỉnh pH về 6,5, thử nghiệm khuếch tán giếng thạch ghi nhận 12/18 chủng duy trì khả năng tạo vòng ức chế đối với cả 2 chủng kiểm định Salmonella và E. coli.
• Xác định bản chất bacteriocin: Xử lý dịch nổi của 12 chủng này với enzyme Proteinase K đã xác định được 05 chủng bị mất hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn, khẳng định chất đối kháng do 5 chủng này sinh ra có bản chất peptide/protein (bacteriocin).
• Đánh giá độ bền nhiệt và tính di động: Đánh giá hoạt tính dịch nổi qua các chế độ xử lý nhiệt (30°C, 40°C, 60°C, 80°C trong 30 phút và 100°C trong 60 phút) kết hợp kiểm tra tính di động đã sàng lọc được 2 chủng vi khuẩn ưu tú là DD2.1 và DT1. Cả hai chủng đều không di động, có hoạt tính ức chế ổn định ở nhiệt độ cao. Trong đó, chủng DD2.1 (phân lập từ mẫu măng muối tại quận Đống Đa, Hà Nội) thể hiện đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất và ổn định nhất.
• Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy: Khảo sát trên chủng DD2.1 cho thấy khả năng sinh tổng hợp bacteriocin gia tăng đáng kể khi môi trường được bổ sung nguồn carbohydrate là Glucose ở tỷ lệ 2% và 3% (w/v), nguồn nitơ là Cao nấm men (Yeast Extract) ở mức 2% và 3% (w/v). Đồng thời, chủng DD2.1 có khả năng thích ứng và chịu được nồng độ muối NaCl 2%.

Phần V: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ kết quả nghiên cứu đối chiếu với mục đích ban đầu, khẳng định đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin đáp ứng yêu cầu đề ra. Đồng thời, tác giả đưa ra các đề xuất về việc tiếp tục định danh loài bằng công cụ sinh học phân tử và thử nghiệm ứng dụng bảo quản trên mẫu nông sản thực tế.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể:

Giai đoạn thực nghiệm	Số lượng / Kết quả ghi nhận	Đặc điểm và ý nghĩa
Thu thập mẫu	12 mẫu	Thu từ 4 địa phương (Hà Nội, Hà Nam, Quảng Trị)
Phân lập vi khuẩn lactic	18 chủng	Tạo vòng phân giải $\text{CaCO}_3$ trên môi trường MRS
Kháng khuẩn sau trung hòa pH	12 chủng	Ức chế đồng thời cả E. coli và Salmonella
Xác định bản chất protein	05 chủng	Mất hoạt tính sau khi xử lý bằng Proteinase K
Tuyển chọn chủng ưu tú	02 chủng (DD2.1, DT1)	Không di động, bền nhiệt ở 30–80°C/30 phút và 100°C/60 phút
Chủng tối ưu nhất	01 chủng (DD2.1)	Hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất, tối ưu ở 2–3% Glucose, 2–3% Yeast Extract, chịu 2% NaCl

Các giải pháp và kiến nghị do tác giả đề xuất:

• Khai thác chủng vi khuẩn lactic DD2.1 và dịch chiết bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng này làm chế phẩm bảo quản sinh học tự nhiên, ứng dụng trong sơ chế, bao gói và kéo dài thời gian lưu trữ nông sản, rau củ quả tươi sống nhằm thay thế phụ gia hóa chất độc hại.
• Đề xuất ứng dụng chủng vi khuẩn này dưới dạng nuôi cấy lên men trực tiếp hoặc thu nhận dịch nổi thô bổ sung vào quy trình sản xuất màng bọc bảo quản thực phẩm.
• Kiến nghị thực hiện giải trình tự đoạn gen 16S rRNA nhằm định danh chính xác vị trí phân loại đến cấp loài của chủng DD2.1; tiếp tục tinh sạch bacteriocin bằng sắc ký để xác định trọng lượng phân tử và giải mã trình tự amino acid.

Đóng góp của khóa luận:

• Bổ sung dẫn liệu thực nghiệm về nguồn vi sinh vật bản địa có hoạt tính sinh học từ các món ăn lên men truyền thống của Việt Nam (dưa cải, cải thảo, măng muối, cà muối, sung muối, dưa giá hẹ).
• Chứng minh khả năng sinh bacteriocin có phổ ức chế hướng tới cả hai chủng vi khuẩn Gram âm nguy hiểm (E. coli và Salmonella), góp phần mở rộng hướng nghiên cứu bacteriocin từ LAB vốn thường chỉ tập trung đối kháng vi khuẩn Gram dương.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tồn tại một số hạn chế gắn liền với phạm vi triển khai thực tế:

• Tác giả chưa tiến hành định danh chủng vi khuẩn DD2.1 và DT1 bằng phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rRNA) để xác định chính xác tên loài khoa học, mới chỉ dừng lại ở các đánh giá hình thái, sinh lý và sinh hóa cơ bản.
• Hoạt chất bacteriocin mới được khảo sát dưới dạng dịch nổi thô sau ly tâm và trung hòa pH, chưa thực hiện các bước tinh sạch sâu (kết tủa muối, lọc gel, thẩm tách hoặc sắc ký lỏng cao áp HPLC) nên chưa xác định được khối lượng phân tử chính xác (kDa) cũng như cấu trúc peptide.
• Phổ đối kháng mới được thử nghiệm trên 02 chủng vi khuẩn chỉ thị Gram âm (E. coli, Salmonella), chưa mở rộng kiểm định trên các vi khuẩn Gram dương gây ngộ độc thực phẩm phổ biến (Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus). Các thí nghiệm đều tiến hành in vitro, chưa có dữ liệu thử nghiệm in situ trực tiếp trên nền nông sản thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen 16S rRNA để định danh phân loại học của chủng DD2.1.
• Tinh sạch bacteriocin, xác định trình tự chuỗi peptide và đánh giá hoạt tính trên dải vi sinh vật rộng hơn.
• Thử nghiệm phối hợp dịch chiết bacteriocin vào màng polymer sinh học hoặc ngâm tẩm trực tiếp trên rau quả để đánh giá hiệu quả kéo dài thời hạn bảo quản thực phẩm trong điều kiện bảo quản thường và bảo quản lạnh.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho các đối tượng:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh vật học ứng dụng đang triển khai các đề tài phân lập vi sinh vật hoặc tìm kiếm các chất kháng khuẩn tự nhiên.
• Các nhóm nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học bảo quản nông sản sau thu hoạch, phụ gia thực phẩm an toàn và công nghệ màng bao kháng khuẩn.

Nội dung có giá trị tham khảo trọng tâm bao gồm quy trình thực nghiệm sàng lọc bacteriocin được mô tả chi tiết: kỹ thuật trung hòa pH dịch nổi để loại trừ tác dụng của acid lactic, phương pháp khẳng định bản chất protein bằng enzyme phân giải Proteinase K, kỹ thuật đục lỗ thạch khuếch tán, cùng quy trình kiểm tra độ bền nhiệt và khảo sát điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất. Bên cạnh đó, phần tổng quan tài liệu cung cấp bức tranh hệ thống về cơ chế phân tử và hệ thống phân loại bacteriocin của vi khuẩn lactic.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic bắt buộc phải điều chỉnh về pH 6,5 trước khi kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn?
Vi khuẩn lactic trong quá trình sinh trưởng tiết ra lượng lớn acid lactic và các acid hữu cơ làm giảm pH môi trường, bản thân môi trường acid này có khả năng ức chế mạnh vi sinh vật. Do đó, việc dùng dung dịch NaOH 1M để trung hòa dịch nổi về pH 6,5 là bước bắt buộc nhằm loại bỏ hoàn toàn tác động kháng khuẩn do acid sinh ra, đảm bảo vòng vô khuẩn hình thành sau đó chỉ xuất phát từ các hợp chất kháng khuẩn chuyên biệt như bacteriocin.

2. Mục đích và kết quả của thử nghiệm xử lý dịch nổi bằng enzyme Proteinase K là gì?
Bacteriocin có bản chất hóa học là các peptide hoặc protein. Thử nghiệm xử lý dịch nổi bằng enzyme phân giải protein Proteinase K nhằm xác định bản chất của yếu tố kháng khuẩn: nếu sau xử lý enzyme mà hoạt tính đối kháng bị mất hoàn toàn thì chất kháng khuẩn đó chính là bacteriocin. Trong khóa luận, qua xử lý Proteinase K trên 12 chủng có hoạt tính đối kháng, tác giả đã khẳng định được 05 chủng thực sự sinh tổng hợp bacteriocin.

3. Chủng vi khuẩn nào đạt kết quả tuyển chọn tốt nhất và có đặc điểm sinh học gì nổi bật?
Chủng vi khuẩn ký hiệu DD2.1 (được phân lập từ mẫu măng muối thu thập tại Chợ Ngô Sĩ Liên, Đống Đa, Hà Nội) là chủng ưu tú nhất. Chủng này không di động, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và bền vững nhất sau khi xử lý ở các ngưỡng nhiệt độ 30°C, 40°C, 60°C, 80°C trong 30 phút và 100°C trong 60 phút.

4. Đề tài đã sử dụng những loại mẫu thực phẩm lên men nào và thu thập từ đâu?
Đề tài thu thập tổng cộng 12 mẫu thực phẩm lên men truyền thống từ thực vật tại 4 địa phương: Dưa cải muối (2 mẫu) và Cà muối (2 mẫu) từ Chợ sinh viên Đường Y (Gia Lâm, Hà Nội); Măng muối (2 mẫu) từ Chợ Ngô Sĩ Liên (Đống Đa, Hà Nội); Dưa giá hẹ muối (2 mẫu) từ Chợ Xép (Đông Hà, Quảng Trị); Cải thảo muối (2 mẫu) và Sung muối (2 mẫu) từ Chợ Hòa Mạc (Duy Tiên, Hà Nam).

5. Thành phần dinh dưỡng nào kích thích khả năng sản xuất bacteriocin của chủng DD2.1?
Thực nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy cho thấy chủng DD2.1 sản xuất bacteriocin mạnh hơn rõ rệt khi môi trường được bổ sung nguồn carbohydrate là Glucose ở tỷ lệ 2% và 3% (w/v) kết hợp với nguồn nitơ là Cao nấm men (Yeast Extract) ở nồng độ 2% và 3% (w/v), đồng thời chủng có khả năng chịu nồng độ muối NaCl ở mức 2%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Ngọc Khánh đã phân lập thành công 18 chủng vi khuẩn lactic từ 12 mẫu thực phẩm lên men truyền thống thu thập tại 4 địa phương, qua đó tuyển chọn được 5 chủng sinh bacteriocin có khả năng ức chế hai vi khuẩn kiểm định Salmonella và Escherichia coli. Trong đó, chủng DD2.1 thể hiện tiềm năng ứng dụng cao nhất nhờ hoạt tính kháng khuẩn mạnh, không di động, bền vững qua các ngưỡng nhiệt độ từ 30°C đến 100°C và sinh tổng hợp bacteriocin tối ưu trong môi trường bổ sung 2–3% Glucose cùng Cao nấm men. Công trình cung cấp nguồn dẫn liệu thực nghiệm khoa học đáng tin cậy về vi khuẩn lactic bản địa, mở ra giải pháp phát triển chế phẩm bảo quản sinh học tự nhiên nhằm hạn chế thất thoát sau thu hoạch cho nông sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nông nghiệp là một trong những ngành kinh tế trọng yếu của nước ta. Bên cạnh việc sản xuất để phục vụ nhu cầu ngày càng tăng ở trong nước, Việt Nam còn là nước xuất khẩu lượng nông sản lớn mỗi năm. Cơ hội kinh doanh rộng mở ở tất cả các cấp của chuỗi giá trị nhờ trình độ sản xuất liên tục được nâng cao thông qua việc áp dụng khoa học - công nghệ tiên tiến. Theo báo cáo Tình hình Kinh tế - Xã hội quý I năm 2021 của Tổng cục Thống kê, khu vực Nông, Lâm và Thuỷ sản chiếm tỉ trọng (11.71%) về cơ cấu nền kinh tế.

Về hoạt động xuất nhập khẩu, nhóm hàng Nông, Lâm sản đạt 5,35 tỷ USD, tăng 7,9%. Nhóm hàng Thuỷ sản đạt 1,69 tỷ USD, tăng 3,3%. Với những thông số trên ta có thể dễ dàng nhận thấy rằng Nông nghiệp sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển đổi sang nền kinh tế thị trường của Việt Nam. Song công nghệ trong và sau thu hoạch vẫn còn những điểm yếu khiến tổn thất của các mặt hàng nông sản ở mức cao.

Theo số liệu mới nhất (2020) từ Phòng Thương mại và Công nghiệp Việt Nam chi nhánh Cần Thơ (VCCI) Cần Thơ), hằng năm, thất thoát sau thu hoạch nông nghiệp ở Việt Nam lên tới 40-45%. Riêng lúa gạo ở Đồng bằng sông Cửu Long, mỗi năm tỷ lệ thất thoát ở mức 10-12%, tương đương 3000-3500 tỷ đồng bị mất đi.Tương tự đối với rau quả và trái cây mức độ tổn thất có thể lên tới 45% và các sản phẩm thuỷ, hải sản cũng đạt tỷ lệ tổn thất sau thu hoạch ở ngưỡng 35%. Năm 2020, Văn phòng Ban chỉ đạo Quốc gia về chương trình hành động “Không còn nạn đói ở Việt Nam” cảnh báo về tổn thất thực phẩm ở Việt Nam cao hơn so với các nước trong khu vực Đông Nam Á, trong đó các tổn thất xảy ra trong quá trình sản xuất và thu hoạch nông sản chiếm 25%. Trong khi tổn thất sau xử lý, vận chuyển và bảo quản chiếm 6%.

1 Hiện nay tại Việt Nam, việc cung ứng thực phẩm tươi chủ yếu từ đồng ruộng đi thẳng đến các chợ truyền thống, siêu thị với phương thức bảo quản hết sức thô sơ. Những kênh này thường không có hệ thống bảo quản khiến nhiều thực phẩm tươi như rau, củ, hoa quả… rất dễ thối hỏng, bởi sự tấn công của các vi sinh vật bên ngoài môi trường: Salmonella shigella, Escherichia coli, Vibro inaba, Streptococcus…), từ đó dẫn đến thất thoát, lãng phí lớn. Với mục tiêu giảm thiểu rác thải, cải thiện thất thoát thực phẩm sau thu hoạch nên việc sử dụng các chất bảo quản thực phẩm trong quá trình sản xuất và sau khi thu hoạch là điều cần thiết (Lương Đức Phẩm, 2005). Tuy nhiên, các hoạt chất bảo quản đang được sử dụng phổ biến trên thị trường hiện nay lại không đáp ứng được đầy đủ các tiêu chuẩn về an toàn cho con người, thường xuyên gây ra các hiện tượng ngộ độc thực phẩm, rối loạn hệ tiêu hoá,… ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng.

Năm 1986, báo cáo của Garvie et al. về kết quả nghiên cứu vi khuẩn lactic có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh nhờ hoạt chất bacteriocin đã nhận được sự quan tâm của cả giới khoa học. Hợp chất bacteriocin là các cấu trúc peptide hoặc protein kháng khuẩn được tổng hợp từ ribosome của vi khuẩn. Bacteriocin được sinh tổng hợp trong giai đoạn đầu phát triển của vi khuẩn vì thế chúng đóng vai trò tăng cường sức đề kháng, chống lại các vi sinh vật gây bệnh (Tahiri et al., 2004; Pinto et al.

Do đó, bacteriocin được các nhà khoa học xem xét là hợp chất tiềm năng nhằm thay thế cho các chất bản quản trong Công nghệ chế biến thực phẩm. Xuất phát từ hiện trạng cũng như nhận thấy nhu cầu cấp thiết, đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men” được tiến hành nghiên cứu. Mục đích và yêu cầu 1.1 Mục đích Phân lập được một số chủng vi khuẩn từ thực phẩm lên men có khả năng sinh bacteriocin định hướng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Yêu cầu - Phân lập được 10-15 chủng vi khuẩn từ thực phẩm lên men.

- Tuyển chọn được 2-3 chủng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin. 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) Vi khuẩn lactic được phát hiện và nghiên cứu từ rất sớm. Năm 1780, nhà hoá học Scheele (Thuỵ Điển) lần đầu tách chiết được acid lactic từ sữa bò lên men chua.Sau đó, năm 1784, Blondeau đã công nhận acid lactic là sản phẩm cuối của của chuỗi phản ứng lên men.

Đến năm 1857, Louis Pasteur chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Năm 1873, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (nay được gọi là Streptococcus lactis). Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập, định danh và ngành công nghiệp lên men để sản xuất acid lactic (hình thành từ năm 1881) được phát triển, mở rộng (Hashium, 2010). Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều điều kiện môi trường khác nhau, ví dụ như: trong phân, rác, niêm mạc ruột và đặc biệt là trong các sản phẩm lên men chua.

Ngày nay, vi khuẩn lactic được ứng dụng phổ biến trên quy mô lớn, đặc biệt là những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus,. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là tên gọi chung của những vi khuẩn sinh lactic acid như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa carbohydrate. Do đặc tính chung này, các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceaemặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái (bao gồm vi khuẩn dạng que ngắn, que dài và vi khuẩn hình cầu). Tuy nhiên về mặt sinh lý chúng lại tương đối thống nhất với nhau ở các đặc điểm:  Đều là vi khuẩn Gram dương  Không hình thành bào tử  Là vi sinh vật kỵ khí tùy ý 4 Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số chủng trong họ vi khuẩn có khả năng sinh nội bào tử.

Chúng thiếu khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (các thành phần của chuỗi hô hấp) và vì thế không thể tạo ra ATP do gradient proton. LAB chỉ có thể thu được ATP bằng cách lên men, thường là lên men đường. Vi khuẩn lactic không khử nitrate (NO3-), có phản ứng catalase âm tính, kỵ khí không bắt buộc trừ một số loài kỵ khí bắt buộc sống trong hệ tiêu hoá của con người. Bên cạnh acid lactic, các sản phẩm phụ khác bao gồm acetate, ethanol, CO2, formate và succinate cũng được tìm thấy (Hayek, 2013) Vi khuẩn lactic bao gồm các chi: Aerococcus, Alloiococcus, Cronobacter, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus và Bifidobacterium.

Trong đó, các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus chiếm số lượng lớn nhất, gồm khoảng 175 loài phân lập từ nhiều nguồn khác nhau đã được công bố, gần 1/3 trong số những chủng được mô tả được phân lập từ đường ruột người và động vật. Và Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus được ứng dụng nhiều nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm (Noordiana, 2013)  Streptococcus Tế bào có hình cầu hoặc hình oval, đường kính nhỏ hơn 2µm, xếp thành dạng đôi, dạng chuỗi ngắn hoặc dài, ưa ấm, nhiệt độ sinh trưởng thích hợp khoảng 37oC.Vi khuẩn thuộc chi này có khả năng phân giải nhiều loại đường khác nhau: glucose, maltose, lactose và đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị cho sản phẩm, đặc biệt là các sản phẩm từ sữa (Zhangand and Cai, 2014)  Leuconostoc Tế bào hình oval xếp thành từng đôi, chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài.Chúng có nhu cầu cao về mặt dinh dưỡng.Quá trình lên men dị hình của chúng tạo thành acid lactic và các sản phẩm phụ như acid acetic, ethanol, CO2. Bên cạnh đó, vi khuẩn thuộc chi Leuconostoc có khả năng tạo hương thơm cho bơ, sữa chua do tạo thành các chất như acetyl metyl carbinol hay acetonin (Zhang and Cai, 2014) 5  Bifidobacterium Là những trực khuẩn kỵ khí, lên men lactic dị hình; sản phẩm chính là acid lactic và acid acetic cùng với một lượng nhỏ acid formic, etanol, acid succinic. Không giống với các vi khuẩn lên men dị hình khác, chi Bifidobacterium không sinh CO2.

Các vi khuẩn thuộc chi này ưa ấm và có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 31oC – 41oC.  Lactobacillus Tế bào không di động, có hình que dài, hoặc que ngắn, thường xếp thành hình chuỗi với kích thước dao động trong khoảng 0,5 – 1,2 x 1 – 10 µm. Hầu hết vi khuẩn thuộc chi này là dạng kỵ khí không bắt buộc, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 50oC – 53oC nhưng nhiệt độ sinh trường tối ưu từ 30oC – 40oC. Ngoài ra chúng có thể sống ở điều kiện pH < 5 (Zhang and Cai, 2014).

Lactobacillus gồm 25 loài, được chia thành 3 nhóm: lên men lactic đồng hình bắt buộc, lên men lactic dị hình bắt buộc và lên men lactic dị hình tuỳ ý. Các nhóm vi khuẩn lactic này đều tạo ra acid lactic nhưng acid do nhóm tạo ra lại khác nhau về cấu hình đồng phân. Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phô mai, thịt và các chế phẩm probiotic (Zhang and Cai, 2014) 2.Đặc điểm di truyền của vi khuẩn lactic Bộ gene của Lactococcus lactis subsp. Lactis IL403 được công bố vào năm 2001.

Đây là đại diện đầu tiên được giải trình tự của bộ gen LAB. Kể từ đó hơn 75 bộ gen quan trọng của LAB trong lĩnh vực công nghiệp đã được giải trình tự, trong khi hơn 80 dự án giải trình tự bộ gene đang được tiến hành (Klaenhammer, 2006). Bộ gen của LAB có hàm lượng GC thấp và phạm vi kích thước từ 1,3 đến 3,3 Mb. Từ các bộ gen hoàn chỉnh được công bố khả năng sinh tổng hợp và trao đổi chất cũng như sự khác biệt tiến hoá của LAB đạt được mô tả chi tiết hơn.

Số lượng gen mã hoá protein được dự đoán trong LAB khác nhau từ khoảng 1700 đến 2800 gene.Nhiều LAB chứa một số plasmid, một số trong đó rất cần thiết 6 cho sự tăng trưởng trong các môi trường cụ thể và có các gen sử dụng trong quá trình trao đổi chất, vận chuyển màng và sản xuất bacteriocin. Các gen được mã hoá từ plasmid trong LAB dao động từ 0% đến 4,8% tổng lượng gene (Klaenhammer, 2009) Vi khuẩn lactic lên men carbohydrate để lấy năng lượng, sử dụng các nguồn carbon nội sinh làm chất nhận điện tử cuối cùng thay oxy thông qua quá trình đường phân.