Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong kỹ thuật chăn nuôi hiện đại, công nghệ cấy truyền phôi kết hợp kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) đóng vai trò thay thế cho phương pháp gây rụng trứng nhiều truyền thống, giúp rút ngắn khoảng cách thế hệ và gia tăng số lượng cá thể có phẩm chất di truyền tốt trong đàn gia súc. Về mặt sinh lý sinh sản, buồng trứng của bò có tiềm năng chứa khoảng 68.000 noãn bào có khả năng phát triển thành trứng thành thục. Tuy nhiên, trong sinh sản tự nhiên, mỗi chu kỳ động dục kéo dài 21 ngày của bò cái thường chỉ rụng 1 tế bào trứng (cá biệt là 2 trứng). Nếu chu kỳ dẫn đến mang thai thì tiềm năng khai thác nguồn gen cái bị giới hạn rất lớn.
Tại Việt Nam, sản lượng thịt bò trong nước mới đáp ứng khoảng 30% nhu cầu tiêu dùng, 70% còn lại phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu. Bên cạnh đó, áp lực dịch bệnh trên đàn gia súc (như dịch tả lợn châu Phi) đặt ra yêu cầu tái cơ cấu và phát triển nhanh ngành chăn nuôi bò thịt. Để nhân nhanh các giống bò có giá trị di truyền cao, công nghệ sản xuất phôi bò in vitro từ nguồn buồng trứng thu nhận tại các lò mổ là giải pháp cung cấp nguyên liệu phục vụ cho các định hướng nghiên cứu chuyên sâu như: xác định giới tính phôi, nhân bản, cấy chuyển nhân, bảo tồn nguồn gen và tạo động vật chuyển gen (Galli và Lazzari, 2008).
Dù đã có nhiều cải tiến, hiệu quả tạo phôi bò in vitro nhìn chung vẫn còn ở mức hạn chế. Theo Siard và cộng sự (2006), tỷ lệ trứng sau khi thành thục và thụ tinh phát triển đến giai đoạn phôi nang chỉ đạt khoảng 30% - 40%. Hiệu suất này chịu sự chi phối chặt chẽ bởi nhiều yếu tố: chất lượng tế bào trứng thu nhận, môi trường nuôi thành thục (in vitro maturation - IVM), quy trình thụ tinh (in vitro fertilization - IVF) và môi trường nuôi cấy phôi (in vitro culture - IVC).
Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu:
- Mục đích nghiên cứu: Tạo ra nguồn phôi bò in vitro chất lượng bằng việc áp dụng các kỹ thuật trong công nghệ phôi bò.
- Yêu cầu nghiên cứu:
- Tạo được phôi bò in vitro làm nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu về phôi bò.
- Đánh giá được chất lượng phôi nang bò in vitro.
Đối tượng, phạm vi và thời gian nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Tế bào trứng bò thu nhận từ buồng trứng bò thịt tại lò mổ và tinh trùng bò thịt đông lạnh.
- Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi.
- Địa bàn thu mẫu: Các lò mổ bò thịt tại huyện Đông Anh, thành phố Hà Nội.
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2022 đến tháng 06/2022.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Cơ sở lý thuyết
Nghiên cứu dựa trên các cơ chế sinh học phát triển và sinh lý sinh sản tế bào động vật:
- Cấu tạo buồng trứng và quá trình tạo noãn: Buồng trứng gồm miền vỏ (chứa các nang trứng ở các giai đoạn phát triển khác nhau) và miền tủy (mạch máu, dây thần kinh). Quá trình giảm phân của noãn bào sơ cấp bị tạm dừng ở kỳ đầu giảm phân I (giai đoạn túi mầm - GV) và chỉ tiếp tục hoàn thành giảm phân I khi có các kích thích sinh lý hoặc nuôi cấy in vitro phù hợp.
- Sự thành thục tế bào trứng in vitro (IVM): Bao gồm sự thành thục nhân (nhân chuyển từ giai đoạn túi mầm GV qua Metaphase I đến Metaphase II, tống xuất thể cực thứ nhất ra xoang quanh noãn) và sự thành thục tế bào chất (tái cấu trúc nội bào, tích lũy glutathione - GSH để khử cực đầu tinh trùng, chuẩn bị cho quá trình thụ tinh).
- Vai trò của phức hợp tế bào cumulus: Tế bào cumulus bao quanh noãn duy trì liên kết khe (gap junctions), tiếp nhận tín hiệu từ các thụ thể hormone FSH và LH, đồng thời thực hiện 4 con đường chuyển hóa glucose (đường phân glycolysis, pentose phosphate pathway, polyol pathway, hexosamine biosynthesis pathway) nhằm cung cấp năng lượng pyruvate/lactate và chất chống oxy hóa NADPH/GSH cho noãn.
- Cơ chế thụ tinh và phát triển phôi: Quá trình thụ tinh trải qua các bước hoạt hóa tinh trùng (phản ứng thể đỉnh giải phóng hyaluronidase và acrosin), xâm nhập màng trong suốt (zona pellucida), dung hợp màng và hình thành tiền nhân (đực và cái). Hợp tử phân cắt liên tiếp tạo thành các phôi bào (2, 4, 8, 16 tế bào), hình thành phôi dâu (morula) và phôi nang (blastocyst) có sự biệt hóa thành khối tế bào trong (inner cell mass - ICM) và lá nuôi phôi (trophectoderm).
Phương pháp nghiên cứu
Quy trình thực nghiệm được triển khai tuần tự qua các bước kỹ thuật chuẩn:
- Phương pháp thu buồng trứng: Thu trực tiếp từ bò thịt cái tại lò mổ ngay sau khi giết mổ, rửa 3 lần bằng dung dịch DPBS có bổ sung kháng sinh, loại bỏ cuống và dây chằng, bảo quản trong bình ổn nhiệt 35°C chứa dung dịch DPBS + kháng sinh và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong 2-3 giờ.
- Phương pháp thu tế bào trứng: Sử dụng kỹ thuật chọc hút từ các nang trứng có đường kính 3-8 mm trên bề mặt buồng trứng bằng kim 18G gắn bơm tiêm 5 ml chứa dung dịch TALP-Hepes (bổ sung huyết thanh bê và kháng sinh). Dịch hút được để lắng 5-10 phút trên bàn ổn nhiệt 37°C trước khi soi tìm dưới kính hiển vi soi nổi.
- Tiêu chuẩn phân loại tế bào trứng (theo Zeron và cs., 2001):
- Loại A: Có từ 4 lớp tế bào cumulus trở lên, phân bố rõ ràng, liên kết chặt chẽ, tế bào chất đồng nhất.
- Loại B: Có từ 3 lớp tế bào cumulus trở lên, liên kết chặt chẽ, tế bào chất đồng nhất.
- Loại C: Tế bào trứng bị lột trần một phần, tế bào chất co lại không đều.
- Loại D: Tế bào trứng bị lột trần hoàn toàn, tế bào chất co không đều. (Chỉ sử dụng trứng loại A và loại B để tiến hành nuôi thành thục).
- Phương pháp nuôi thành thục in vitro (IVM): Môi trường TCM 199 (Invitrogen) bổ sung 1 µg/ml Cysteamine, 200 µg/ml FSH, 5% huyết thanh thai bò và kháng sinh. Nuôi trong đĩa 4 giếng (mật độ 50 trứng/giếng) trong thời gian 22-24 giờ ở điều kiện 38,5°C, 5% CO2 và độ ẩm bão hòa. Đánh giá thành thục bằng cách bóc tế bào cumulus bằng dung dịch Hyaluronidase trong TALP-Hepes (3 phút) và kiểm tra sự xuất hiện của thể cực thứ nhất.
- Phương pháp thụ tinh in vitro (IVF): Tinh trùng đông lạnh bò thịt được giải đông ở 37°C, rửa 2 lần trong môi trường BO-IVF (Ivf Bioscience, USA), điều chỉnh mật độ đạt 5 x 10^6 tinh trùng/ml. Trứng thành thục được rửa 3 lần trong BO-IVF, đưa vào giọt thụ tinh đồng nuôi cấy với tinh trùng trong 5 giờ ở điều kiện 38,5°C, 5% CO2, 5% O2 và độ ẩm bão hòa. Kiểm tra khả năng xâm nhập của tinh trùng tại thời điểm 10 giờ sau thụ tinh (1 tiền nhân: không xâm nhập; 2 tiền nhân: thụ tinh bình thường; >2 tiền nhân: hiện tượng đa tinh trùng).
- Phương pháp nuôi phôi in vitro (IVC): Hợp tử sau 5 giờ đồng nuôi cấy được bóc sạch tế bào cumulus, chuyển sang môi trường SOFaa bổ sung 2,5% huyết thanh thai bê (FCS), nuôi ở 38,5°C, 5% CO2, 5% O2 và độ ẩm bão hòa. Đánh giá tỷ lệ phân chia ở ngày thứ 2 và tỷ lệ tạo phôi nang ở ngày thứ 7-8 sau thụ tinh.
- Phương pháp nhuộm đánh giá chất lượng phôi nang: Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 (nồng độ dung dịch nhuộm gồm 50 µl Hoechst 33342 stock 250 µg/ml + 450 µl Ethanol tuyệt đối), cố định và nhuộm qua đêm ở 4°C, rửa qua ethanol tuyệt đối và glycerol, soi đếm tổng số tế bào/phôi nang dưới kính hiển vi huỳnh quang.
- Phương pháp xử lý số liệu: Tính toán các giá trị trung bình (Mean) và sai số chuẩn (± SE) bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.
Nội dung chính theo từng chương
Mở đầu và Tổng quan tài liệu
Phần mở đầu và tổng quan tài liệu làm rõ cơ sở giải phẫu, mô học và nội tiết học của hệ sinh dục bò cái, chi tiết hóa cấu trúc tinh trùng (đầu chứa acrosome, đoạn giữa chứa ty thể cung cấp năng lượng và đuôi vận động) cùng quá trình sinh tinh kéo dài khoảng 45 ngày ở bò đực. Chương này phân tích sâu vai trò của các hệ môi trường nuôi cấy phôi in vitro như TCM 199, CR1aa, SOFaa, cũng như các dạng môi trường nuôi đơn (single-step medium) và môi trường phức hợp (sequential medium). Tổng quan điểm lại các mốc nghiên cứu phôi bò tại Việt Nam từ thập niên 1990 đến nay tại Viện Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Chăn nuôi, bao gồm các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường SOFaa (Nguyễn Thị Hương và cs., 2015), kỹ thuật đồng nuôi cấy với tế bào cumulus (Đỗ Thị Kim Lành và cs., 2021) và ảnh hưởng của lớp cumulus đến tỷ lệ đa tinh trùng (Nguyễn Khánh Vân và cs., 2021).
Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết 3 nội dung nghiên cứu thực nghiệm thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật (Viện Chăn nuôi):
- Đánh giá chất lượng tế bào trứng bò thịt thu từ buồng trứng lò mổ.
- Đánh giá khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng bò thịt thu từ buồng trứng lò mổ.
- Đánh giá khả năng tạo phôi bò in vitro từ tế bào trứng bò thịt thu từ buồng trứng lò mổ.
Mục này mô tả chi tiết quy trình thao tác vô trùng từ khâu vận chuyển buồng trứng lò mổ (Đông Anh, Hà Nội) đến quy trình chọc hút noãn từ nang 3-8 mm bằng kim 18G, công thức môi trường IVM (TCM 199 + FSH + Cysteamine + 5% FCS), môi trường IVF (BO-IVF với mật độ 5 x 10^6 tinh trùng/ml), môi trường IVC (SOFaa + 2,5% FCS) và kỹ thuật nhuộm nhân Hoechst 33342.
Kết quả và thảo luận
Đánh giá chất lượng tế bào trứng bò thu từ buồng trứng bò ở lò mổ
Qua 8 đợt thí nghiệm chọc hút từ 46 buồng trứng bò thịt lò mổ đủ tiêu chuẩn, nghiên cứu đã thu được tổng cộng 423 tế bào trứng. Tỷ lệ trứng đạt chất lượng loại A và B chiếm đa số.
| Đợt TN | Số buồng trứng | Số trứng thu được | Số trứng/buồng trứng (Mean ± SE) | Số trứng loại A, B | Số trứng loại A, B/buồng trứng | Tỷ lệ trứng loại A, B (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 4 | 34 | 8,5 | 31 | 7,8 | 88,24 |
| 2 | 6 | 62 | 10,3 | 53 | 8,8 | 85,48 |
| 3 | 8 | 75 | 9,4 | 68 | 8,5 | 85,33 |
| 4 | 7 | 58 | 8,3 | 46 | 6,6 | 77,59 |
| 5 | 3 | 30 | 10,0 | 25 | 8,3 | 86,67 |
| 6 | 5 | 43 | 8,6 | 36 | 7,2 | 86,05 |
| 7 | 6 | 53 | 8,8 | 41 | 6,8 | 84,91 |
| 8 | 7 | 68 | 9,7 | 58 | 8,3 | 88,24 |
| Tổng | 46 | 423 | 9,19 ± 0,27 | 358 | 7,78 ± 0,29 | 84,76 ± 1,24 |
Kết quả thu được 7,78 trứng loại A, B/buồng trứng cao hơn công bố của Nguyễn Thị Hương và cs. (2015) trên bò sữa cao sản (7,2 trứng/buồng trứng), nhưng thấp hơn kết quả của Phan Lê Sơn (2013) thực hiện bằng kỹ thuật siêu âm hút trứng từ bò sống (8,56 trứng loại A, B/buồng trứng).
Đánh giá khả năng thành thục in vitro của tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ
Nuôi cấy 358 tế bào trứng loại A, B trong môi trường TCM 199 bổ sung FSH và Cysteamine trong 22-24 giờ ghi nhận tỷ lệ sống và thành thục cao. Dấu hiệu thành thục biểu hiện qua sự giãn nở hoàn toàn của khối tế bào cumulus và sự xuất hiện của thể cực thứ nhất.
| Đợt TN | Số trứng nuôi IVM | Số trứng sống sau IVM | Tỷ lệ trứng sống (%) | Số trứng thành thục (có thể cực I) | Tỷ lệ trứng thành thục (% Mean ± SE) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 31 | 24 | 77,42 | 23 | 74,19 |
| 2 | 53 | 47 | 88,68 | 45 | 84,91 |
| 3 | 68 | 62 | 91,18 | 56 | 82,35 |
| 4 | 46 | 40 | 86,96 | 39 | 84,78 |
| 5 | 25 | 23 | 92,00 | 20 | 80,00 |
| 6 | 36 | 33 | 91,67 | 30 | 83,33 |
| 7 | 41 | 40 | 97,56 | 38 | 92,68 |
| 8 | 58 | 49 | 84,48 | 41 | 70,69 |
| Tổng | 358 | 318 | 88,96 ± 2,09 | 292 | 81,74 ± 2,44 |
Tỷ lệ thành thục 81,74% cao hơn kết quả của Nguyễn Hữu Đức và cs. (2003) trên bò lai Sind (65,61%) và Nguyễn Văn Lý (2006) (76,83%), nhưng thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Thị Hương và cs. (2015) (89,31%). Nguyên nhân một lượng trứng bị chết (11,04%) được xác định là do khoảng thời gian vận chuyển buồng trứng từ lò mổ về đến phòng thí nghiệm kéo dài từ 3 đến 5 giờ.
Đánh giá khả năng tạo phôi bò in vitro từ tế bào trứng bò thu từ buồng trứng lò mổ
Nội dung này gồm hai thí nghiệm đánh giá:
1. Khả năng xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng sau thụ tinh 10 giờ:
| Đợt TN | Số trứng thụ tinh | Trứng có tinh trùng xâm nhập [n (%)] | Trứng có 2 tiền nhân [n (%)] | Trứng có >2 tiền nhân (Đa tinh trùng) [n (%)] |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 14 | 12 (85,71) | 11 (78,57) | 1 (7,14) |
| 2 | 13 | 10 (76,92) | 10 (76,92) | 0 (0,00) |
| 3 | 11 | 8 (72,73) | 8 (72,73) | 0 (0,00) |
| 4 | 10 | 9 (90,00) | 8 (80,00) | 1 (10,00) |
| 5 | 12 | 8 (66,67) | 8 (66,67) | 0 (0,00) |
| 6 | 17 | 13 (76,47) | 13 (76,47) | 0 (0,00) |
| 7 | 15 | 11 (73,33) | 11 (73,33) | 0 (0,00) |
| 8 | 16 | 13 (81,25) | 13 (81,25) | 0 (0,00) |
| Tổng | 108 | 84 (77,96 ± 2,45) | 82 (76,02 ± 1,66) | 2 (2,14 ± 1,42) |
Tỷ lệ xâm nhập đạt 77,96% và tỷ lệ tạo 2 tiền nhân đạt 76,02%. Tỷ lệ đa tinh trùng thấp (2,14%), hiện tượng này được giải thích do màng zona pellucida chưa đạt mức độ hóa rắn sinh học cần thiết để ngăn cản hoàn toàn nhiều tinh trùng xâm nhập.
2. Khả năng phân chia, tạo phôi nang và tổng số tế bào/phôi nang:
| Đợt TN | Số trứng thụ tinh | Phôi phân chia ngày 2 [n (%)] | Phôi nang ngày 7 [n (%)] | Tổng số tế bào/phôi nang (Mean ± SE) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 9 | 8 (88,89) | 2 (22,22) | 114,06 |
| 2 | 32 | 24 (75,00) | 12 (37,50) | 111,04 |
| 3 | 45 | 34 (75,56) | 13 (28,89) | 96,04 |
| 4 | 29 | 22 (75,86) | 9 (31,04) | 102,04 |
| 5 | 8 | 7 (87,50) | 3 (37,50) | 91,02 |
| 6 | 13 | 9 (69,23) | 4 (30,77) | 90,04 |
| 7 | 23 | 19 (82,61) | 6 (26,09) | 108,04 |
| 8 | 25 | 19 (76,00) | 9 (36,00) | 109,08 |
| Tổng | 184 | 142 (77,34 ± 2,41) | 57 (31,06 ± 1,98) | 102,67 ± 3,42 |
Tỷ lệ phân chia ở ngày thứ 2 đạt 77,34% và tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày thứ 7 đạt 31,06%. Số lượng tế bào trung bình trên mỗi phôi nang đạt 102,67 tế bào. Tác giả thảo luận việc bổ sung FCS với nồng độ 2,5% (v/v) vào môi trường SOFaa ngay từ thời điểm 0 giờ giúp hỗ trợ tăng sinh tế bào, giảm hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis), đồng thời kiểm soát hàm lượng tích lũy lipid trong phôi để không làm ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh khi bảo quản đông lạnh sau này.
Kết luận và đề nghị
Khóa luận đúc kết các chỉ số sinh học đạt được qua toàn bộ các khâu thực nghiệm và đưa ra đề nghị sử dụng nguồn phôi bò thịt in vitro tạo ra từ phụ phẩm buồng trứng lò mổ làm nguồn vật liệu chuẩn phục vụ các nghiên cứu tiếp theo về bảo quản đông lạnh phôi, cấy truyền phôi và tạo động vật chuyển gen.
Kết quả và đóng góp
Tổng hợp các kết quả thực nghiệm chính
| Chỉ tiêu theo dõi | Số lượng mẫu thực hiện | Kết quả đạt được (Mean ± SE) |
|---|---|---|
| Số tế bào trứng thu được / buồng trứng lò mổ | 46 buồng trứng | 9,19 ± 0,27 trứng |
| Số tế bào trứng loại A, B / buồng trứng | 46 buồng trứng | 7,78 ± 0,29 trứng |
| Tỷ lệ tế bào trứng loại A, B trên tổng số trứng thu | 423 trứng | 84,76 ± 1,24% |
| Tỷ lệ tế bào trứng sống sau nuôi thành thục (IVM) | 358 trứng loại A, B | 88,96 ± 2,09% |
| Tỷ lệ tế bào trứng thành thục (xuất hiện thể cực I) | 358 trứng loại A, B | 81,74 ± 2,44% |
| Tỷ lệ trứng có tinh trùng xâm nhập (10 giờ sau IVF) | 108 trứng | 77,96 ± 2,45% |
| Tỷ lệ tạo 2 tiền nhân (thụ tinh bình thường) | 108 trứng | 76,02 ± 1,66% |
| Tỷ lệ đa tinh trùng (> 2 tiền nhân) | 108 trứng | 2,14 ± 1,42% |
| Tỷ lệ phôi phân chia (ngày thứ 2 sau thụ tinh) | 184 trứng | 77,34 ± 2,41% |
| Tỷ lệ phát triển thành phôi nang (ngày thứ 7 sau IVF) | 184 trứng | 31,06 ± 1,98% |
| Tổng số tế bào / phôi nang (nhuộm Hoechst 33342) | 57 phôi nang | 102,67 ± 3,42 tế bào |
Đóng góp của đề tài
- Về mặt khoa học: Cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm có độ tin cậy cao về các chỉ số phát triển của phôi bò thịt in vitro (từ tỷ lệ thu nhận trứng, tỷ lệ thành thục nhân, tỷ lệ hình thành tiền nhân đến số lượng tế bào của phôi nang) trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Kết quả này tạo tiền đề khoa học cho việc tối ưu hóa quy trình công nghệ tế bào động vật.
- Về mặt thực tiễn: Khẳng định tính khả thi của việc tận dụng buồng trứng bò thịt từ các cơ sở giết mổ thương phẩm để sản xuất phôi in vitro chất lượng cao với chi phí hợp lý. Quy trình này cung cấp nguồn phôi dồi dào phục vụ công tác nghiên cứu chuyên sâu và hỗ trợ định hướng cải tạo đàn bò thịt trong nước.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế được ghi nhận từ thực nghiệm:
- Khoảng thời gian vận chuyển buồng trứng từ các lò mổ ngoại thành (Đông Anh) về đến phòng thí nghiệm mất từ 2 đến 3 giờ và tổng thời gian từ lúc giết mổ đến khi kết thúc chọc hút kéo dài 3 đến 5 giờ, gây suy giảm tỷ lệ sống của tế bào trứng (khoảng 11,04% trứng bị thoái hóa/chết sau nuôi IVM).
- Tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng vẫn còn tồn tại (2,14%) do màng trong suốt chưa hóa rắn hoàn toàn.
- Tỷ lệ phôi phát triển lên giai đoạn phôi nang (31,06%) và tổng số tế bào/phôi nang (102,67 tế bào) còn thấp hơn khi so sánh với một số nghiên cứu sử dụng tế bào trứng thu bằng phương pháp siêu âm hút trực tiếp từ bò sống.
- Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo kiến nghị của tác giả):
- Sử dụng nguồn phôi bò thịt in vitro thu được để thực hiện các nghiên cứu về bảo quản lạnh (đông lạnh phôi).
- Ứng dụng phôi nang vào kỹ thuật cấy chuyển phôi cho bò nhận nhằm đánh giá tỷ lệ đậu thai in vivo.
- Sử dụng làm nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu công nghệ tạo phôi chuyển gen và các kỹ thuật can thiệp phôi sinh học khác.
Giá trị tham khảo
Công trình là tài liệu chuyên khảo thực nghiệm hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành: Công nghệ sinh học động vật, Chăn nuôi, Thú y và Sinh thái - Sinh lý học sinh sản gia súc.
Các phần nội dung có giá trị tham khảo thực tiễn cao bao gồm:
- Tiêu chuẩn phân loại noãn (Zeron et al., 2001): Mô tả chi tiết hình thái phức hợp cumulus-oocyte (loại A, B, C, D) giúp người làm thực nghiệm nhận diện chính xác noãn có đủ thẩm quyền phát triển (developmental competence).
- Công thức và quy trình nuôi cấy: Quy trình phối hợp môi trường TCM 199 bổ sung FSH (200 µg/ml) và Cysteamine (1 µg/ml) cho nuôi IVM, môi trường BO-IVF cho thụ tinh, và môi trường SOFaa bổ sung 2,5% FCS cho nuôi cấy phôi IVC.
- Kỹ thuật kiểm tra tế bào học: Quy trình bóc tách cumulus bằng Hyaluronidase, phương pháp đánh giá tiền nhân sau 10 giờ IVF và kỹ thuật nhuộm huỳnh quang đếm tế bào phôi nang bằng Hoechst 33342.
Câu hỏi thường gặp
1. Tác giả sử dụng tiêu chuẩn nào để phân loại và lựa chọn tế bào trứng bò trước khi nuôi thành thục?
Tác giả áp dụng tiêu chuẩn của Zeron và cs. (2001) để phân chia noãn thành 4 loại (A, B, C, D) dựa vào số lớp tế bào cumulus và tính đồng nhất của tế bào chất. Nghiên cứu chỉ chọn lựa trứng loại A (có từ 4 lớp cumulus trở lên, liên kết chặt) và loại B (có từ 3 lớp cumulus trở lên, liên kết chặt) với tế bào chất đồng nhất để đưa vào nuôi thành thục in vitro.
2. Điều kiện và thành phần môi trường nuôi thành thục in vitro (IVM) trong khóa luận được thiết lập như thế nào?
Môi trường nuôi thành thục là TCM 199 có bổ sung 1 µg/ml Cysteamine, 200 µg/ml FSH, 5% huyết thanh thai bò và kháng sinh. Tế bào trứng được nuôi trong đĩa 4 giếng (mật độ 50 trứng/giếng) trong thời gian 22-24 giờ ở điều kiện nhiệt độ 38,5°C, nồng độ 5% CO2 và độ ẩm không khí bão hòa.
3. Tỷ lệ tế bào trứng thụ tinh bình thường và tỷ lệ xảy ra hiện tượng đa tinh trùng đạt bao nhiêu sau 10 giờ thụ tinh in vitro?
Qua kiểm tra 108 tế bào trứng tại thời điểm 10 giờ sau thụ tinh in vitro, tỷ lệ trứng có tinh trùng xâm nhập đạt 77,96 ± 2,45%. Trong đó, tỷ lệ trứng thụ tinh bình thường (xuất hiện 2 tiền nhân) đạt 76,02 ± 1,66% và tỷ lệ trứng bị thụ tinh đa tinh trùng (có > 2 tiền nhân) là 2,14 ± 1,42%.
4. Khả năng phát triển thành phôi nang và chỉ số tế bào của phôi nang bò in vitro đạt kết quả như thế nào?
Từ 184 tế bào trứng đưa vào thụ tinh và nuôi cấy, tỷ lệ trứng phân chia ở ngày thứ 2 đạt 77,34 ± 2,41% (142 phôi), tỷ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang ở ngày thứ 7 đạt 31,06 ± 1,98% (57 phôi nang). Khi kiểm tra chất lượng bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342, số lượng tế bào trung bình đạt 102,67 ± 3,42 tế bào/phôi nang.
5. Vì sao nghiên cứu chỉ bổ sung huyết thanh thai bê (FCS) ở nồng độ 2,5% (v/v) trong môi trường nuôi phôi SOFaa?
Mặc dù FCS cung cấp protein, yếu tố tăng trưởng và giảm hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis), nhưng sự hiện diện nồng độ cao của FCS sẽ làm gia tăng tích lũy hàm lượng lipid trong tế bào chất của phôi bò. Sự tích tụ lipid này gây bất lợi lớn cho quá trình hạ nhiệt và bảo quản đông lạnh phôi sau này. Do đó, tác giả chủ động giới hạn nồng độ FCS ở mức 2,5% để vừa kích thích phôi phát triển thành phôi nang vừa duy trì chất lượng phục vụ bảo quản lạnh.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra về việc thiết lập quy trình tạo phôi bò thịt in vitro từ nguồn buồng trứng thu nhận tại lò mổ. Công trình đã xác định chính xác các thông số sinh học quan trọng gồm tỷ lệ thu noãn loại A và B (84,76%), tỷ lệ thành thục (81,74%), tỷ lệ thụ tinh bình thường (76,02%), tỷ lệ tạo phôi nang (31,06%) cùng tổng số tế bào phôi nang đạt 102,67 tế bào. Đây là nguồn tài liệu thực nghiệm có giá trị khoa học và tính ứng dụng thực tiễn cao, đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công nghệ phôi động vật tại Việt Nam.