Khóa luận tốt nghiệp về nhân giống in vitro giống đồng tiền cao

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống đồng tiền cao, tập trung vào phương pháp hiệu quả để bảo tồn và phát triển loài cây này.

• Tác giả: Đỗ Thị Thủy
• Người hướng dẫn: TS. Phùng Thị Thu Hà
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Nông học
• Đề tài: Nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống đồng tiền cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• I. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• I.1. Đặt vấn đề
• I.2. Mục đích, yêu cầu
• II. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• II.1. Giới thiệu chung về chi Gerbera
• II.2. Vị trí phân loại, nguồn gốc và phân bố
• II.2.1. Vị trí phân loại
• II.2.2. Nguồn gốc
• II.2.3. Phân bố
• II.3. Đặc điểm thực vật học
• II.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa đồng tiền
• II.4.1. Nhiệt độ
• II.4.2. Ánh sáng
• II.4.3. Đất và dinh dưỡng
• II.4.4. Độ ẩm
• II.5. Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế
• II.5.1. Giá trị sử dụng
• II.5.2. Giá trị kinh tế
• II.6. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô đồng tiền ở trên Thế giới và Việt Nam
• II.6.1. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô đồng tiền trên Thế giới
• II.7. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
• II.7.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
• II.7.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống invitro
• II.7.3. Các giai đoạn của nuôi cấy mô tế bào
• II.7.4. Ưu nhược điểm của cây trồng nhân giống bằng phương pháp nhân giống invitro
• II.7.5. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
• II.7.6. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
• II.7.7. Những vấn đề trong nhân giống in vitro
• III. PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• III.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• III.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• III.3. Nội dung nghiên cứu
• III.4. Phương pháp nghiên cứu
• III.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• III.6. Điều kiện nuôi cấy
• III.7. Các chỉ tiêu theo dõi
• III.8. Phương pháp xử lý số liệu
• IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• IV.1. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP tới khả năng nhân nhanh chồi của các giống đồng tiền cao
• IV.2. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh của các giống đồng tiền cao
• IV.3. Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của các giống đồng tiền cao
• IV.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các giống đồng tiền cao trong giai đoạn vườn ươm
• V. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nhân giống in vitro và giống đồng tiền cao

Nhân giống in vitro là phương pháp hiện đại được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp, đặc biệt với các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao như giống đồng tiền cao. Phương pháp này cho phép tạo ra số lượng lớn cây giống đồng nhất, sạch bệnh trong thời gian ngắn. Kỹ thuật nhân giống này dựa trên công nghệ in vitro, sử dụng môi trường dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng để kích thích tăng trưởng cây và phát triển giống. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nhân giống in vitro cho các giống đồng tiền cao, nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất và nâng cao chất lượng cây trồng.

1.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Công nghệ in vitro dựa trên nguyên lý tái sinh tế bào và mô thực vật trong điều kiện vô trùng. Khoa học cây trồng đã chứng minh rằng, sự kết hợp giữa kỹ thuật sinh học và các chất điều hòa sinh trưởng như BAP và NAA có thể kích thích sự hình thành chồi và rễ. Nghiên cứu này sử dụng môi trường MS với các nồng độ BAP và NAA khác nhau để tìm ra công thức tối ưu cho nhân giống in vitro giống đồng tiền cao.

1.2. Ứng dụng thực tiễn

Nhân giống in vitro không chỉ giúp tăng hệ số nhân giống mà còn đảm bảo chất lượng cây giống đồng nhất, sạch bệnh. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc mở rộng diện tích trồng đồng tiền và nâng cao hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn để áp dụng rộng rãi phương pháp nhân giống in vitro trong sản xuất cây giống đồng tiền cao.

II. Kỹ thuật nhân giống và tối ưu hóa môi trường

Kỹ thuật nhân giống trong nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để đạt hiệu quả cao nhất trong phát triển giống. Môi trường MS được sử dụng làm nền tảng, kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng như BAP và NAA. Kết quả cho thấy, môi trường 1/2MS + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6,8 g/l agar, pH = 5,86 là tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi. Đối với giai đoạn ra rễ, môi trường 1/2MS + 0,5 mg/l NAA + 30g/l đường + 6,5g/l agar, pH 5,86 cho kết quả tốt nhất.

2.1. Ảnh hưởng của BAP và NAA

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượng BAP ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nhân nhanh chồi của giống đồng tiền cao. Kết hợp BAP với NAA giúp tăng hiệu quả nhân giống, đồng thời kích thích sự hình thành rễ. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về kỹ thuật sinh học trong nhân giống in vitro.

2.2. Đánh giá sinh trưởng trong vườn ươm

Sau khi ra vườn ươm, các giống đồng tiền cao được đánh giá về khả năng sinh trưởng và tỷ lệ sống. Giống VC cho tỷ lệ sống đạt 100%, trong khi giống HP có khả năng sinh trưởng tốt nhất. Điều này khẳng định hiệu quả của kỹ thuật nhân giống và công nghệ in vitro trong việc tạo ra cây giống chất lượng cao.

III. Giá trị kinh tế và ứng dụng thực tiễn

Giống đồng tiền cao có giá trị kinh tế cao trong nông nghiệp, đặc biệt là trong ngành trồng hoa. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp quy trình nhân giống hiệu quả mà còn góp phần giảm chi phí sản xuất, tăng năng suất và chất lượng hoa. Việc áp dụng kỹ thuật nhân giống in vitro sẽ giúp các nhà sản xuất chủ động hơn trong việc tạo ra cây giống, giảm phụ thuộc vào nguồn giống nhập ngoại.

3.1. Hiệu quả kinh tế

Với quy trình nhân giống tối ưu, giống đồng tiền cao có thể đạt năng suất cao, mang lại lợi nhuận lớn cho người trồng. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở để mở rộng diện tích trồng đồng tiền, đáp ứng nhu cầu thị trường trong nước và quốc tế.

3.2. Triển vọng phát triển

Việc ứng dụng công nghệ in vitro trong nhân giống đồng tiền cao mở ra triển vọng lớn cho ngành trồng hoa tại Việt Nam. Nghiên cứu này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm cải tiến quy trình và nâng cao hiệu quả sản xuất.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii Bolus, thuộc họ Cúc - Asteraceae) là cây thân thảo lâu năm có nguồn gốc từ Nam Phi, được nhập nội vào Việt Nam từ những năm 1940. Đây là loài hoa thương phẩm có giá trị kinh tế cao, năng suất thu hoạch đạt từ 50 đến 60 bông/cây/năm. Với mật độ trồng bình quân khoảng 2.000 cây/sào (tương đương 60.000 bông/sào/năm) và mức giá bán buôn tại vườn dao động từ 700 đến 1.500 đồng/bông (trung bình 900 đồng/bông), doanh thu bình quân có thể đạt 54 triệu đồng/sào/năm. Sau khi khấu trừ tổng mức đầu tư ban đầu khoảng 29 triệu đồng/sào, người trồng có thể thu về lợi nhuận xấp xỉ 24 triệu đồng/sào ngay từ năm đầu tiên.

Mặc dù có tiềm năng kinh tế lớn, diện tích trồng hoa đồng tiền tại Việt Nam còn hạn chế, chủ yếu tập trung tại một số vùng chuyên canh như Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng và Thành phố Hồ Chí Minh. Thực trạng này bắt nguồn từ hai trở ngại chính được tác giả chỉ rõ:

• Ngành sản xuất hoa trong nước thiếu nguồn giống chất lượng cao, phụ thuộc lớn vào nguồn cây giống nhập khẩu từ Hà Lan và Trung Quốc với giá thành đắt đỏ và nguồn gốc không ổn định, làm gia tăng chi phí sản xuất.
• Cây hoa đồng tiền rất mẫn cảm với nấm bệnh, đặc biệt là nấm Phytophthora trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Kỹ thuật thu hái cắt cành sát mặt đất kết hợp với tập quán vệ sinh đồng ruộng và nguồn nước tưới chưa đảm bảo khiến các giống trồng nhanh chóng bị thoái hóa.

Phương pháp nhân giống vô tính in vitro (nuôi cấy mô tế bào thực vật) là giải pháp kỹ thuật tối ưu nhằm khắc phục các hạn chế trên nhờ ưu thế hệ số nhân cao, thời gian sản xuất ngắn, tạo nguồn cây giống sạch bệnh và có độ đồng đều cao về mặt di truyền. Đề tài "Nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống đồng tiền cao" được thực hiện nhằm giải quyết các yêu cầu kỹ thuật cấp thiết của thực tiễn sản xuất.

Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình tối ưu nhân giống một số giống hoa đồng tiền thân cao từ giai đoạn nhân nhanh, giai đoạn kích thích ra rễ trong phòng nuôi cấy mô tế bào cho đến giai đoạn thích nghi của cây con ngoài vườn ươm.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh chồi các giống đồng tiền cao.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA tới khả năng ra rễ của các giống đồng tiền cao.
3. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các giống đồng tiền cao ở giai đoạn vườn ươm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 3 giống hoa đồng tiền thân cao, được ký hiệu là DX, VC và HP.
• Phạm vi không gian: Phòng Thí nghiệm Công nghệ tế bào Thực vật, Bộ môn Thực vật, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực nghiệm từ tháng 3 năm 2021 đến tháng 10 năm 2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết lập dựa trên các nguyên lý sinh học thực vật và công nghệ tế bào:

• Thuyết tính toàn năng của tế bào (Totipotency) do Haberlandt khởi xướng (1902), khẳng định mỗi tế bào thực vật riêng rẽ đều chứa trọn vẹn thông tin di truyền cần thiết để tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện dinh dưỡng và vi khí hậu nhân tạo phù hợp.
• Nguyên lý phân hóa và phản phân hóa tế bào: Sự biến đổi giữa trạng thái tế bào phôi sinh và tế bào mô chuyên hóa thông qua cơ chế điều hòa hoạt tính gen dưới tác động của chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh.
• Cân bằng hoocmon thực vật Auxin/Cytokinin theo mô hình Skoog và Miller (1957): Tỷ lệ Auxin/Cytokinin thấp kích thích cảm ứng và phân hóa chồi nách; tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao kích thích phân hóa hệ thống rễ; tỷ lệ cân bằng kích thích khối mô sẹo (callus).
• Cơ chế tác động của các chất điều hòa sinh trưởng: 6-Benzylaminopurine (BAP - nhóm Cytokinin tổng hợp) tham gia kích thích phân chia tế bào, kéo dài hoạt tính mô phân sinh và cảm ứng bật chồi; Naphthaleneacetic acid (NAA - nhóm Auxin tổng hợp) kích hoạt bơm proton tại màng sinh chất, làm mềm thành tế bào và cảm ứng phân chia tế bào mô tượng tầng để hình thành rễ phụ.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành đồng bộ qua các khâu kỹ thuật:

• Môi trường nuôi cấy cơ bản: Môi trường khoáng 1/2 MS (Murashige and Skoog, 1962), bổ sung 30 g/l đường saccarose, chất làm đông agar 6,5 g/l, độ chua được hiệu chỉnh ở mức pH = 5,86 trước khi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,1 atm trong 20 phút.
• Điều kiện vi khí hậu phòng nuôi cấy: Hệ thống đèn huỳnh quang neon cung cấp cường độ chiếu sáng xấp xỉ 2.000 lux, chu kỳ chiếu sáng duy trì chế độ 8 giờ sáng/17 giờ tối; nhiệt độ phòng giữ ở mức 25 - 26°C; độ ẩm không khí đạt 70 - 75%.
• Quy chuẩn bố trí thí nghiệm:
  • Thí nghiệm 1 (Nhân nhanh chồi bằng BAP đơn lẻ): Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) gồm 4 công thức (0; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l BAP), 3 lần nhắc lại. Mỗi bình nuôi cấy chứa 15 ml môi trường cấy 6 mẫu chồi (đoạn cắt 1,5 cm từ gốc chồi). Theo dõi 18 cây/giống/công thức sau 4 tuần nuôi cấy.
  • Thí nghiệm 2 (Nhân nhanh chồi bằng tổ hợp BAP và NAA): Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 công thức phối hợp giữa BAP (0 - 0,5 mg/l) và NAA (0 - 0,3 mg/l), 3 lần nhắc lại, theo dõi sau 4 tuần.
  • Thí nghiệm 3 (Cảm ứng tạo rễ bằng NAA): Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 công thức nồng độ NAA (0; 0,1; 0,3; 0,5 mg/l) trên chồi sau giai đoạn nhân nhanh.
  • Thí nghiệm 4 (Thích nghi ngoài vườn ươm): Cây con hoàn chỉnh sau 4 tuần ra rễ được huấn luyện và chuyển ra bầu giá thể, bố trí theo khối tuần tự không lặp lại, quy mô theo dõi 30 cây/giống trong thời gian 2 tuần.
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được thu thập, xử lý thống kê trên phần mềm Microsoft Excel 2013 và kiểm định phân tích phương sai, so sánh sai khác trung bình bằng trắc nghiệm LSD ở mức ý nghĩa 95% (P < 0,05) cùng hệ số biến động CV% thông qua phần mềm chuyên dụng IRISTAT 5.0.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ tiềm năng kinh tế vượt trội của hoa đồng tiền thân cao trong ngành hoa thương phẩm và những rào cản về chất lượng nguồn giống nhập khẩu, sự suy thoái giống do nhiễm nấm bệnh Phytophthora trong điều kiện canh tác tự nhiên. Từ đó xác định mục đích xây dựng quy trình nhân giống in vitro tối ưu cho 3 giống đồng tiền cao và đề ra 3 nhiệm vụ thực nghiệm cụ thể từ khâu nhân chồi, tạo rễ đến thuần hóa ngoài vườn ươm.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận và thực tiễn liên quan đến đề tài:

• Phân loại học thực vật: Xác định vị trí phân loại của chi Gerbera thuộc họ Cúc (Asteraceae), phân họ Mutisioideae. Chi này có khoảng 30 - 40 loài lưu niên phân bố tự nhiên ở Nam Phi, Madagascar, Nam Mỹ và châu Á nhiệt đới. Các giống thương mại hiện nay là dạng lai giữa G. viridifolia và G. jamesonii. Căn cứ vào số lượng cánh, hoa được chia làm ba nhóm: hoa đơn, hoa kép và hoa đơn nhị kép; căn cứ vào chiều cao cuống chia thành hoa đồng tiền lùn (cuống dài 15 - 20 cm) và hoa đồng tiền thân cao (cuống dài 25 - 30 cm, cành hoa cắt dài 40 - 60 cm).
• Đặc điểm sinh học và yêu cầu sinh thái: Thân ngầm phát triển đẻ nhánh, hệ rễ chùm ăn ngang tầng mặt. Cây ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ ngày 21 - 23°C, đêm 15 - 17°C (nhiệt độ phát triển hệ rễ ban đêm khoảng 20°C); đất tơi xốp giàu mùn có độ pH từ 6,0 - 6,5; độ ẩm đất thích hợp 60 - 70%, độ ẩm không khí 55 - 65%.
• Tổng quan nghiên cứu in vitro: Điểm lại các công trình quốc tế về tái sinh chồi từ mô lá, cuống lá, đỉnh sinh trưởng của Pierik, Segers, Huang, Shagufta Naz; các nghiên cứu trong nước về sử dụng hạt nano bạc chống thủy tinh hóa của Hà Thị Mỹ Ngân (2019), kỹ thuật chiếu xạ tia gamma gây đột biến của Phạm Thị Mai và Lê Đức Thảo (2016), chuyển gen kháng PPT qua Agrobacterium tumefaciens của Nguyễn Quang Thạch (2012) và ứng dụng than hoạt tính, nuôi cấy thoáng khí của Nguyễn Thị Kim Yến.
• Cơ sở lý thuyết nuôi cấy mô: Phân tích 5 giai đoạn vi nhân giống (chuẩn bị mẫu vô trùng, tái sinh mẫu, nhân nhanh chồi, tạo cây hoàn chỉnh, chuyển cây ra đất) cùng các giải pháp kiểm soát hiện tượng bất thường gồm nhiễm vi sinh vật, biến dị di truyền, tiết hợp chất phenolic gây hóa nâu và hiện tượng thủy tinh thể (vitrification).

Phần III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất môi trường (đa lượng, vi lượng, FeEDTA, vitamin, inositol, đường, agar, BAP, NAA, HgCl2 0,1%, Presept 0,5%), địa điểm thực hiện tại Bộ môn Thực vật và khung thời gian từ tháng 3 đến tháng 10 năm 2021. Tác giả thiết kế chi tiết 4 thí nghiệm đơn yếu tố và hai yếu tố, quy chuẩn kích thước lát cắt mẫu cấy 1,5 cm từ gốc chồi, tiêu chuẩn chọn mẫu sạch bệnh, thân mập, lá xanh, không bị thủy tinh hóa; xác lập phương pháp đo đếm các chỉ tiêu hình thái, công thức tính hệ số nhân chồi, số rễ, chiều dài rễ, tỷ lệ sống vườn ươm và quy trình phân tích phương sai thống kê bằng phần mềm IRISTAT 5.0.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương thực nghiệm cung cấp các dữ liệu định lượng cụ thể:

• Thí nghiệm khảo sát BAP đơn lẻ cho thấy nồng độ 0,5 mg/l BAP luôn mang lại hệ số nhân chồi cao nhất trên cả 3 giống sau 4 tuần: giống DX đạt 3,83 chồi/mẫu; giống VC đạt 4,39 chồi/mẫu; giống HP đạt 3,95 chồi/mẫu. Chiều cao chồi có xu hướng giảm dần khi tăng nồng độ BAP ngoại sinh.
• Thí nghiệm phối hợp BAP và NAA trên giống DX ghi nhận hệ số nhân chồi đạt cao nhất ở công thức 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA (đạt 2,56 chồi/mẫu), nhưng kết quả này thấp hơn đáng kể so với việc sử dụng BAP đơn lẻ (3,83 chồi/mẫu).
• Thí nghiệm ra rễ xác định môi trường bổ sung 0,5 mg/l NAA tối ưu hóa số rễ và chiều dài rễ.
• Đánh giá vườn ươm sau 2 tuần ghi nhận giống VC đạt tỷ lệ sống tuyệt đối 100%, trong khi giống HP thể hiện khả năng tăng trưởng chiều cao và tích lũy số lá mạnh nhất.

Phần V: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận khẳng định công thức môi trường tối ưu cho từng giai đoạn nhân giống và kiến nghị các bước nghiên cứu tiếp theo để hoàn thiện quy trình nhân giống thương phẩm trên quy mô lớn.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp hệ thống số liệu thực nghiệm đầy đủ về quá trình vi nhân giống của 3 giống hoa đồng tiền thân cao DX, VC và HP:

Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đơn lẻ đến khả năng nhân chồi của 3 giống hoa sau 4 tuần

Giống	Công thức BAP (mg/l)	Chiều cao chồi (cm)	Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu)	Đặc điểm hình thái chồi
DX	CT1: 0 (ĐC)	4,51	1,00	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm, xuất hiện rễ dài
	CT2: 0,3	2,42	3,72	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm
	CT3: 0,5	2,23	3,83	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm
	CT4: 0,7	1,77	3,11	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm
	LSD 5%	0,66	0,40
	CV%	14,0%	8,10%
VC	CT1: 0 (ĐC)	5,06	1,00	Lá to, chồi mập, lá xanh đậm, xuất hiện rễ dài màu trắng
	CT2: 0,3	2,26	3,70	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm
	CT3: 0,5	2,23	4,39	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm
	CT4: 0,7	2,06	2,56	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm
	LSD 5%	0,23	0,50
	CV%	4,0%	8,60%
HP	CT1: 0 (ĐC)	4,90	1,00	Lá to, chồi mập, lá màu xanh đậm
	CT2: 0,3	2,52	3,40	Lá to, chồi mập, lá màu xanh nhạt
	CT3: 0,5	2,74	3,95	Lá to, chồi mập, lá màu xanh nhạt
	CT4: 0,7	2,54	2,42	Lá to, chồi mảnh, lá màu xanh nhạt hoặc dị dạng
	LSD 5%	0,38	0,40
	CV%	6,0%	7,40%

Bảng 2: Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến nhân nhanh giống DX sau 4 tuần

Công thức	Nồng độ BAP (mg/l)	Nồng độ NAA (mg/l)	Chiều cao chồi (cm)	Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu)	Hình thái chồi
CT1 (ĐC)	0,00	0,00	5,78	1,00	Chồi xanh và thân mập
CT2	0,30	0,10	3,70	2,22	Lá to và xanh, chồi mập
CT3	0,50	0,10	3,35	2,56	Chồi mập, xanh tốt
CT4	0,50	0,30	4,01	1,72	Lá to, chồi mập, lá có màu xanh
LSD 5%			0,48	0,37
CV%			5,7%	9,9%

Từ các kết quả thực nghiệm, tác giả rút ra các kết luận chuyên môn:

• Ở giai đoạn nhân nhanh chồi: Môi trường tối ưu cho cả 3 giống đồng tiền cao là 1/2 MS + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar (pH = 5,86). Mức nồng độ BAP 0,5 mg/l kích thích phân hóa chồi tối ưu mà không gây hiện tượng dị dạng, thoái hóa chồi như khi nâng lên mức 0,7 mg/l. Giống VC đạt khả năng nhân chồi vượt trội nhất (4,39 chồi/mẫu), kế tiếp là giống HP (3,95 chồi/mẫu) và giống DX (3,83 chồi/mẫu).
• Đối với việc phối hợp chất điều hòa sinh trưởng: Việc bổ sung auxin NAA (0,1 - 0,3 mg/l) vào môi trường có chứa BAP làm suy giảm hệ số nhân chồi trên giống DX (chỉ đạt tối đa 2,56 chồi/mẫu so với 3,83 chồi/mẫu khi dùng BAP đơn độc). Do đó, giai đoạn nhân nhanh không cần bổ sung thêm NAA.
• Ở giai đoạn ra rễ: Môi trường tối ưu là 1/2 MS + 0,5 mg/l NAA + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar (pH = 5,86), giúp chồi nhanh chóng cảm ứng hình thành rễ hoàn chỉnh, rễ mập, phân bố đồng đều.
• Ở giai đoạn thích nghi vườn ươm: Sau 2 tuần ra ngôi trên giá thể, giống VC thể hiện khả năng thích nghi cao nhất với tỷ lệ sống đạt tuyệt đối 100%, trong khi giống HP có ưu thế về tốc độ sinh trưởng chiều cao và phát triển bộ lá ngoài tự nhiên.

Đóng góp của khóa luận: Đề tài đã xác lập được bộ thông số môi trường in vitro hoàn chỉnh từ khâu nhân nhanh, tạo rễ đến ra ngôi vườn ươm cho 3 giống đồng tiền cao DX, VC và HP. Việc sử dụng môi trường khoáng giảm một nửa (1/2 MS) giúp tiết kiệm đáng kể chi phí hóa chất trong quy trình nhân giống thương phẩm nhưng vẫn đảm bảo cây giống đạt chất lượng sinh học cao và tỷ lệ sống sót vượt trội khi ra ngôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Dựa trên các giới hạn thực tế được ghi nhận trong văn bản khóa luận:

• Thời gian theo dõi sinh trưởng của cây con ở giai đoạn vườn ươm mới chỉ tiến hành trong phạm vi 2 tuần đầu sau khi ra ngôi, chưa đánh giá được toàn diện các chỉ tiêu sinh trưởng sinh dưỡng dài hạn, khả năng phân cành nhánh và chất lượng hoa cắt cành khi bước vào giai đoạn kinh doanh.
• Thí nghiệm giai đoạn vườn ươm mới chỉ khảo sát sinh trưởng của 3 giống trên một loại giá thể duy nhất, chưa tiến hành thử nghiệm so sánh các công thức phối trộn giá thể khác nhau (như xơ dừa, tro trấu, phân trùn quế, đất mùn) để xác định giá thể tối ưu nhất cho từng giống.
• Thí nghiệm phối hợp giữa BAP và NAA mới chỉ được tiến hành chi tiết trên một đối tượng là giống DX, chưa mở rộng phân tích đầy đủ đối chứng trên cả hai giống VC và HP.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất bao gồm:

• Tiếp tục theo dõi chu kỳ sinh trưởng của các giống hoa đồng tiền in vitro ngoài đồng ruộng qua các giai đoạn phân hóa mầm hoa, nở hoa và đánh giá độ bền cành hoa cắt thương phẩm.
• Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần giá thể hữu cơ phối trộn và chế độ dinh dưỡng khoáng vi lượng đến tỷ lệ sống và tốc độ sinh trưởng của cây giống giai đoạn vườn ươm.
• Nghiên cứu thử nghiệm bổ sung than hoạt tính (AC) hoặc hạt nano bạc (AgNPs) vào môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao hơn nữa chất lượng cây giống và triệt tiêu hoàn toàn hiện tượng thủy tinh hóa mô cấy theo các tài liệu đã tổng quan.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn rõ ràng:

• Nhóm đối tượng phù hợp: Sinh viên, học viên cao học, cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Nông học, Công nghệ sinh học thực vật, Hoa viên cây cảnh, Trồng trọt và Bảo vệ thực vật.
• Ứng dụng sản xuất: Các kỹ thuật viên và chủ cơ sở nhân giống mô thực vật thương mại có thể tham khảo trực tiếp quy trình nồng độ BAP (0,5 mg/l) và NAA (0,5 mg/l) trên nền 1/2 MS để chuẩn hóa quy trình sản xuất giống hoa đồng tiền cao sạch bệnh, giảm chi phí hóa chất khoáng và hạ giá thành cây giống xuất vườn.
• Các phần nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Phần tổng quan tài liệu về các hiện tượng bất thường trong nuôi cấy mô (vitrification, hóa nâu mô do hợp chất phenolic, nhiễm khuẩn) và các biện pháp can thiệp kỹ thuật.
  • Phương pháp chuẩn bị mẫu chồi sạch bệnh và kỹ thuật xử lý vi khí hậu trong phòng nuôi cấy.
  • Dữ liệu đối chiếu về phản ứng khác biệt giữa 3 kiểu gen giống (DX, VC, HP) trước cùng một nồng độ chất kích thích sinh trưởng thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ BAP nào mang lại hiệu quả nhân nhanh chồi tối ưu nhất cho cả ba giống đồng tiền cao DX, VC và HP?
Nồng độ BAP tối ưu được xác định là 0,5 mg/l trên nền môi trường 1/2 MS + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar (pH = 5,86). Ở nồng độ này sau 4 tuần theo dõi, hệ số nhân chồi đạt cao nhất ở cả 3 giống: giống VC đạt 4,39 chồi/mẫu; giống HP đạt 3,95 chồi/mẫu; giống DX đạt 3,83 chồi/mẫu. Các chồi tái sinh đều mập, lá to và có màu xanh đặc trưng. Khi tăng nồng độ BAP lên 0,7 mg/l, hệ số nhân chồi của cả 3 giống đều suy giảm và xuất hiện tình trạng chồi mảnh, lá xanh nhạt hoặc biến dạng (đặc biệt ở giống HP).

2. Việc bổ sung kết hợp NAA vào môi trường nhân chồi chứa BAP có làm tăng hệ số nhân chồi của giống đồng tiền cao DX không?
Không. Kết quả thực nghiệm tại Bảng 4.4 cho thấy khi kết hợp BAP với NAA, hệ số nhân chồi của giống DX đạt cao nhất ở công thức 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA cũng chỉ đạt 2,56 chồi/mẫu, thấp hơn rõ rệt so với công thức chỉ sử dụng 0,5 mg/l BAP đơn lẻ (đạt 3,83 chồi/mẫu). Khi nâng hàm lượng NAA lên 0,3 mg/l (ở nồng độ 0,5 mg/l BAP), hệ số nhân chồi tiếp tục giảm xuống còn 1,72 chồi/mẫu. Do đó, việc phối hợp thêm auxin NAA trong giai đoạn nhân chồi không mang lại hiệu quả gia tăng chồi như mong muốn.

3. Môi trường tối ưu cho giai đoạn cảm ứng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh gồm những thành phần cụ thể nào?
Môi trường ra rễ tối ưu cho các giống đồng tiền cao được tác giả xác định là: Môi trường khoáng 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường saccarose và 6,5 g/l agar, độ pH được hiệu chỉnh đạt 5,86 trước khi khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút.

4. Khả năng sống sót và sinh trưởng của ba giống đồng tiền cao sau 2 tuần đưa ra vườn ươm đạt kết quả như thế nào?
Sau 2 tuần ra ngôi trên giá thể ngoài vườn ươm, giống VC đạt tỷ lệ sống sót cao nhất với mức tuyệt đối 100%. Về khả năng tăng trưởng hình thái, giống HP thể hiện khả năng thích nghi và sinh trưởng mạnh nhất về chiều cao cây và diện tích lá so với hai giống còn lại.

5. Điều kiện vi khí hậu phòng nuôi cấy và quy cách mẫu cấy ban đầu được quy định như thế nào trong khóa luận?
Mẫu cấy ban đầu là các đoạn chồi dài 1,5 cm được cắt từ gốc chồi khỏe mạnh, lá xanh tốt, không bị thủy tinh hóa. Điều kiện phòng nuôi cấy được kiểm soát ổn định gồm: nhiệt độ duy trì 25 - 26°C; độ ẩm không khí 70 - 75%; chiếu sáng bằng bóng đèn neon với cường độ khoảng 2.000 lux và chế độ chiếu sáng 8 giờ sáng/17 giờ tối; môi trường được khử trùng ở 121°C, áp suất 1,1 atm trong 20 phút.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Đỗ Thị Thủy đã xây dựng thành công quy trình vi nhân giống in vitro hiệu quả cho ba giống hoa đồng tiền thân cao (DX, VC, HP) trên nền môi trường khoáng tiết kiệm 1/2 MS. Kết quả thực nghiệm xác định nồng độ 0,5 mg/l BAP là tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi và 0,5 mg/l NAA là tối ưu cho giai đoạn cảm ứng tạo rễ hoàn chỉnh. Đề tài cung cấp các luận cứ khoa học và thông số kỹ thuật tin cậy, góp phần chủ động công nghệ sản xuất giống hoa đồng tiền sạch bệnh, chất lượng cao phục vụ nhu cầu phát triển nông nghiệp đô thị và thương phẩm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hoa đồng tiền có tên khoa học là Gerbera jameanii Bolexaclam (còn gọi là hoa mặt trời hay hoa Phu Lăng), có nguồn gốc từ Nam Phi. Đến nay hoa đồng tiền được trồng ở nhiều nước trên thế giới điển hình là: Hà Lan, Mỹ, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc,. (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2003) Hoa đồng tiền rất phong phú đa dạng với nhiều màu sắc khác nhau như: đỏ, cam, vàng, trắng, phấn hồng, tím,… Trên một bông hoa có thể có một màu đơn hoặc nhiều màu xen kẽ. Hoa đồng tiền có cuống hoa to, là hoa lý tưởng để làm bó hoa, lẵng hoa và cắm nghệ thuật rất được ưa chuộng.

Ngoài ra đồng tiền có thể được trồng vào chậu để chơi cả chậu hoa trong suốt một thời gian dài, đặt trong phòng làm việc, phòng khách rất phù hợp. Trong sản xuất, cây hoa đồng tiền là loài hoa có giá trị kinh tế cao: Hoa đồng tiền có thể trồng một lần và cho thu hoạch quanh năm, mỗi cây cho khoảng từ 50 - 60 bông/năm, một ha hoa đồng tiền có thể trồng khoảng 60. Giá trị hoa đồng tiền không cao như hoa phăng, hoa lily, hoa layơn, Tuy nhiên hiệu quả kinh tế thu được trên một đơn vị diện tích lại khá cao. Hoa đồng tiền ở nước ta được nhập nội từ những năm 1940 và đến nay được phát triển ra nhiều tỉnh thành trong cả nước.

Tuy nhiên diện tích trồng hoa đồng tiền trong cả nước còn thấp, chất lượng hoa của một số vùng còn yếu, chủ yếu được trồng ở một số địa phương có điều kiện như: Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng, Thành Phố Hồ Chí Minh. Nguyên nhân của hạn chế về diện tích và chất lượng hoa đồng tiền là (Ngô Đăng Vịnh & cs., 2003): - Thiếu giống tốt và thường xuyên phải nhập nội chủ yếu từ Hà Lan và Trung Quốc với giá thành cao và không rõ nguồn gốc, thiếu chủ động. Do vậy chi phí sản xuất của người trong hoa bị nâng cao, từ đó giá thành sản xuất cũng lên cao. 1 - Hoa đồng tiền thường nhiễm bệnh nhất là nấm phytophthora trong điều kiện trồng trọt ở vùng nhiệt đới nước ta.

Với nguồn nước ô nhiễm, vệ sinh đồng ruộng kém, cành hoa bị cắt sát đất dễ mẫn cảm với bệnh nên các giống đồng tiền bị thoái hoá rất nhanh. Vì vậy trong những năm gần đây công tác chọn giống hoa đồng tiền ở Việt Nam đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu. Phương pháp nhân giống in vitro được áp dụng khá phổ biến trên các đối tượng cây trồng đặc biệt là trên một số giống đồng tiền cao. Một trong những ưu điểm nổi bật của phương pháp này là: hệ số nhân giống cao, trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây giống tương đối đồng nhất, cây giống sạch bệnh.

Đứng trước yêu cầu của thực tế sản xuất, việc “Nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống đồng tiền cao” là rất cần thiết 1. Mục đích, yêu cầu. Mục đích Xây dựng quy trình tối ưu nhân giống một số giống đồng tiền cao từ giai đoạn nhân nhanh tới giai đoạn ra rễ trong phòng nuôi cấy mô và ra cây ngoài vườn ươm. Yêu cầu - Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh chồi các giống đồng tiền cao.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA tới khả năng ra rễ của các giống đồng tiền cao - Đánh giá sinh trưởng của các giống đồng tiền giai đoạn vườn ươm 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về chi Gerbera: 2. Vị trí phân loại, nguồn gốc và phân bố: a. Vị trí phân loại: Cây hoa đồng tiền có tên khoa học là Gerbera jameanii Bolexaclam.

Là một chi thực vật thuộc họ Asteraceae (họ cúc). Nó được đặt tên để vinh danh nhà thực vật học và bác sĩ y khoa người Đức Traugott Gerber (1710-1743), người đã đi du lịch nhiều nơi ở Nga và là bạn của Carl Linnaeus.1: Hoa đồng tiền cao (Gerbera jameanii Bolexaclam) Theo hệ thống học thực vật, cây hoa đồng tiền được phân loại như sau: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida (lớp 2 lá mầm) Bộ: Asteraceae (họ cúc) 3 Phân họ: Mutisioideae Chi: Gerbera Chi đồng tiền Gerbera có khoảng 40 loài thuộc loại hoa lưu niên ra hoa quanh năm, độ bền hoa cắt cao, được coi là 1 loài hoa đẹp trong thế giới hoa. Các giống trồng hiện nay là con lai giữa G. viridifilia Schult Bip và G.

jamesonii với các giống lai tự nhiên ở Nam Phi. - Phân loại hoa đồng tiền dựa vào số lượng cánh hoa và kiểu dáng cây Dựa vào số lượng cánh hoa, người ta chia thành 3 nhóm: Hoa kép, hoa đơn và hoa đơn nhị kép (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2003). • Nhóm 1 - Đồng tiền đơn: Hoa chỉ có một hoặc 2 tầng cánh, xếp xen kẽ nhau tạo vòng tròn. Hoa mỏng và yếu hơn hoa kép, màu sắc hoa ít hơn, điển hình là trắng, đỏ, tím, hồng.

• Nhóm 2 - Hoa đồng tiền kép: Cánh hoa to gồm hơn 2 tầng, bông to, đường kính có thể đạt tới 12 - 15 cm, cánh hoa tụ lại thành bông nằm ở đầu trục chính, cuống dài 40 - 60 cm. Màu sắc đa dạng như trắng, đỏ, vàng, hồng, gạch cua. • Nhóm 3 - Hoa đơn nhị kép: Bên ngoài cùng cánh đơn, bên trong cánh kép dày đặc, thường màu trắng trong lớp cánh kép màu cánh sen nhưng nhóm này không đẹp bằng hoa kép. Như vậy, trong ba nhóm hoa trên, đồng tiền kép là nhóm hoa có giá trị cao, được ưa chuộng hơn cả và cũng là đối tượng lý tưởng của nuôi cấy mô tế bào thực vật.

- Dựa vào kiểu dáng cây, hoa đồng tiền được chia làm 2 loại là đồng tiền lùn và đồng tiền cao. • Hoa đồng tiền lùn: cây hoa đồng tiền lùn là loại hoa đồng tiền có cuống hoa ngắn chỉ khoảng 15 – 20 cm mà thôi. Do có cuống hoa thấp nên được khá nhiều người thích trồng vì nó phù hợp với không gian chật chội và hoa cũng ít khi bị gãy khi có gió to. 4 • Hoa đồng tiền thân cao: là loại hoa đồng tiền có cuống hoa vươn dài.

Độ dài trung bình của cuống hoa thường đạt 25 – 30 cm. Nguồn gốc: Hoa đồng tiền có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới Nam Mỹ, Châu Phi và Châu Á. Mô tả khoa học đầu tiên về hoa đồng tiền được J. Hooker đưa ra trên Tạp chí Bách thảo của Curtis vào năm 1889 khi ông mô tả Gerbera jamesonii, một loài Nam Phi còn được gọi là cúc Transvaal hoặc cúc Barberton.

Hoa đồng tiền hay còn được gọi với cái tên khác là cúc Châu Phi. Phân bố: Chi đồng tiền có khoảng 30 loài sống hoang dại trên thế giới, phân bố ở Nam Mỹ, Châu Phi, Madagascar và nhiệt đới Châu Á. Ở Việt Nam có khoảng hơn 30 giống đang được trồng ở nhiều tỉnh như: Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng, thành phố Hồ Chí Minh, Vĩnh Phúc, Bắc Giang,… các giống này chủ yếu có nguồn gốc từ Hà Lan, Trung Quốc có màu sắc phong phú và đa dạng. Ngày nay, cây đồng tiền được trồng rất nhiều ở quốc gia trên thế giới như: Hà Lan, Nhật Bản, Mỹ, Đức, Trung Quốc, Việt Nam.

Đặc điểm thực vật học Cây hoa đồng tiền thuộc loại cây thân thảo. - Thân: Thân ngầm, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, thân cao 50-60cm, thân có lông. - Lá phát triển từ thân. Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15 - 45o, hình dáng lá thay đổi theo giống và sự sinh trưởng của cây, từ hình trứng thuôn đến hình thuôn dài.

Lá dài từ 15 - 25 cm, rộng 5 - 8 cm, có hình lông chim, xẻ thuỳ nông hoặc sâu, mặt lưng lá có lớp lông nhung. 5 - Rễ: Rễ đồng tiền thuộc dạng rễ chùm, phát triển khoẻ, rễ hình ống, ăn ngang và nổi phía trên mặt luống, rễ thường vươn dài tương ứng với diện tích lá toả ra. - Hoa: Hoa đồng tiền có dạng cụm hoa đầu trạng, bề ngoài tưởng là một bông hoa trên thực tế là một tập hợp nhiều bông hoa nhỏ riêng biệt. Phía ngoài hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc xếp thành một hoặc vài vòng.

Do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên tâm hoa rất được chú ý trong chọn tạo giống mới. Hoa đồng tiền nở theo thứ tự từ ngoài vào trong, hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở sau theo từng vòng một. - Quả: quả đồng tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, một gam hạt có khoảng 280-300 hạt. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa đồng tiền a) Nhiệt độ Nhiệt độ là 1 trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng của hoa đồng tiền.

Đa số các giống đồng tiền hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển hệ thống rễ hoa đồng tiền là khoảng 20°C vào ban đêm. Nhiệt độ ra hoa thích hợp nhất là 15-17°C (ngoại trừ các giống chịu nhiệt). Nếu nhiệt độ <12°C hoặc >35°C cây sẽ phát triển kém, màu sắc hoa nhợt nhạt dẫn đến chất lượng hoa kém.

Nói chung trong thời kỳ ra hoa cần đảm bảo nhiệt độ thì hoa sẽ to đẹp. Cây đồng tiền thích hợp với nhiệt độ 15-17°C vào ban đêm và từ 21-23°C vào ban ngày (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2003) b) Ánh sáng Ánh sáng là 1 yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Ánh sáng cung cấp năng lượng quang hợp tạo ra chất hữu cơ. Nhờ phản ứng quang hợp cây tạo ra chất hydratcacbon cho quá trình sinh trưởng.

Thiếu ánh 6 sáng hiệu suất quang hợp của hoa đồng tiền thấp. Cường độ quang hợp của cây hoa tăng khi cường độ ánh sáng tăng. Khi cường độ ánh sáng vượt quá chỉ số tới hạn thì cường độ quang hợp bắt đầu giảm. Vì vậy trong trồng trọt người ta có thể trồng đồng tiền vào mùa nắng nóng (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2003) c) Đất và dinh dưỡng Hoa đồng tiền không đòi hỏi khắt khe về đất, chúng thích hợp với đất tơi xốp, nhiều mùn, độ pH từ 6-6,5.

Đất thịt pha cát, ở vùng đất kiềm cần bón phân mang tính chất chua để cải tạo, cũng có thể bón phân chứa lưu huỳnh để giảm thấp độ pH. Ở vùng đất chua có thể bón thêm vôi để điều tiết độ chua, ở nơi đất thịt nặng nên bón thêm lá cây mục, vỏ trấu, bã rượu để tăng độ tơi xốp. Đất trồng hoa đồng tiền cần tơi xốp, mực nước ngầm thấp và ổn định.