Đặt vấn đề Củ Dòm (Stephania dielsiana Y. Wu ) là một loại cây dược liệu quý thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), thân thảo leo, có củ thuôn dài,. Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á. Ở Việt Nam, có 10 – 12 loài, trong đó chỉ có 2 – 3 loài không có rễ phình thành củ.
Loài củ Dòm được xếp vào diện tương đối hiếm, có điểm phân bố ở Ba Vì (Hà Tây), Kỳ Sơn (Hoà Bình), Bạch Thông (Bắc Kạn) và Trà My (Quảng Nam) (Nguyễn Kim Liễn, 2011). Rễ củ chứa nhiều hoạt chất dược liệu quý. Có vị đắng, lợi tiểu an thần, tiêu viêm. Dùng trong chữa trị các bệnh đau lưng, mỏi nhức chân, đau bụng.
Có nhiều nghiên cứu chỉ ra củ Dòm còn có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư. Các chất tinh khiết được phân lập từ các loài thuộc chi này có thể kháng một số dòng tế bào ung thư như cepharanthin (có tác dụng kích thích miễn dịch), tetrandrin thuộc nhóm bis benzylisoquinolin (Nguyễn Quốc Huy, 2010). Ngoài ra củ Dòm còn được sử dụng để làm cảnh và trang trí, hiện đang được nhiều người ưa chuộng, mang tiềm năng giá trị kinh tế cao. Có giá trị lớn như vậy song loài đang có nguy cơ tuyệt chủng cao, vì vậy việc nhân giống là vô cùng quan trọng.
Hiện có nhiều phương pháp nhân giống cây củ Dòm đang được sử dụng như trồng bằng mầm củ, gieo hạt, giâm hom, giâm cành,. song cây trồng vẫn bị bệnh và kém phát triển, chất lượng cây trồng thấp (Trần Công Vinh, 2019). Vì vậy việc tìm kiếm một phương pháp nhân giống mang lại hiệu cao hơn là cần thiết. Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy in vitro được biết đến là một phương pháp nhân giống tối ưu, tạo số lượng cây lớn sạch bệnh và đã được áp dụng thành công phổ biến trên nhiều loài thực vật khác nhau.
Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm nghiên cứu nhân giống cây củ Dòm bằng phương pháp in vitro. Mục đích của đề tài Bước đầu xác định được một số thông số kỹ thuật cho quy trình nhân giống vô tính cây thuốc củ Dòm trong điều kiện in vitro 1 1.Yêu cầu - Xác định, tìm ra công thức vào mẫu in vitro cây củ Dòm phù hợp, nâng cao hiệu quả vào mẫu thành công. - Xác định nguồn vật liệu phù hợp và các yếu tố ảnh hưởng cho quá trình nhân nhanh in vitro - Nghiên cứu xác định được nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng phù hợp cho sự nhân nhanh của mẫu cấy in vitro cây củ Dòm. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.
Giới thiệu về cây củ Dòm 2. Sơ lược và phân bố Củ Dòm (Stephania dielsiana Y. thuộc họ Tiết dê ( Menispermaceae ) còn có tên gọi khác là Củ gà ấp, Cà tòm,. là cây thuốc quý, hiếm, mới được phát hiện ở Việt Nam.
Cây có thân dạng dây leo nhỏ, rễ củ to. Rễ củ có chứa chất alkaloid có tác dụng giảm đau an thần giãn mạch, hạ huyết áp, điều hòa hô hấp được sử dụng làm thuốc chữa các bệnh đau lưng, đau bụng, mỏi nhức chân, giúp ngủ ngon. Bên cạnh đó còn có chứa chất cepharanthin kích thích miễn dịch và giảm nhẹ tác dụng phụ của thuốc chống ung thư, ngoài ra còn có tác dụng ức chế tế bào ung thư đại trực tràng và ung thư gan, ức chế vi khuẩn lao phát triển (Nguyễn Quốc Huy, 2010). Ngoài tác dụng chữa bệnh củ Dòm còn được sử dụng với mục đích làm cảnh và trang trí, được rất nhiều người ưa chuộng.
Phân bố chủ yếu ở các vùng như: Lào Cai, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Tây,…(Nguyễn Kim Liễn, 2011) Hình 2. Cây củ Dòm (Stephania dielsiana Y.Wu ) (https://www.com/watch?v=2R1PzMZY-XM) 3 2. Đặc điểm hình thái Rễ: Rễ củ to thường hình thuôn dài, vỏ ngoài nhăn nheo, thịt màu vàng nâu, rắn. Thân: Thân có dạng leo cuốn, dài khoảng 3m; thân non có màu tím nhạt; không có lông, trơn nhẵn.
Lá: Lá đơn nguyên, mọc so le, có cuống dài 4,5 - 8,5 cm. Phiến lá có hình tam giác tròn, rộng khoảng 9 - 13 cm; mép lá có hình răng tù rất thưa hơi lượn sóng ở phía ngọn; chóp lá nhọn, gốc bằng hoặc hơi lõm; gân dạng chân vịt, xuất phát từ chỗ đính của cuống lá. Những ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím hồng (Nguyễn Tiến Bân, 2010) Hoa: Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực do 3 - 5 xim nhỏ, hợp thành xim tán kép.
Hoa nhỏ, có cuống ngắn, 6 lá đài màu tím xếp 2 vòng, 3 cánh hoa hình quạt tròn, màu vàng cam; cột nhị ngắn, bao phấn dính thành đĩa 6 ô. Cụm hoa cái gồm 7 - 8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng bầu. Hoa 1 lá đài màu tím hồng, 2 cánh hoa hình quạt tròn màu vàng cam và có các vân tím. Bầu hình trứng, đầu nhuỵ có 4 - 5 thuỳ dạng dùi (Nguyễn Tiến Bân, 2010) Quả: Quả có hình trứng đảo, hơi dẹt.
Hạt hình trứng ngược cụt đầu có lỗ thủng ở giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn cong. Đặc tính sinh học và sinh thái Mùa hoa thường là từ tháng 4 - 5, mùa quả từ tháng 6 - 7. Cây mọc chồi từ thân hoặc từ cổ rễ vào đầu mùa xuân. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể chịu bóng.
Thường mọc ở rừng kín xanh ẩm; có mọc ở rừng núi đá vôi ở độ cao 300 - 600 m nhưng ít gặp, có khả năng tái sinh (Nguyễn Tiến Bân, 2010). Giá trị sử dụng - Giá trị kinh tế Rễ củ là phần có giá trị cao nhất, được dùng làm thuốc. Hiện nay trên thị trường củ Dòm đang được bán với giá khoảng 250. Giá trị kinh tế là vô cùng lớn do cây phát triển tốt, phù hợp với khí hậu tự nhiên 4 của Việt Nam, không cần tốn nhiều công sức chăm sóc mà vẫn mang lại hiệu quả và năng suất cao.
- Giá trị dược liệu Củ Dòm được dùng để điều trị một số bệnh như phong tê thấp, đau thần kinh, nhức mỏi. Theo kinh nghiệm dân gian, củ Dòm được dùng chữa kiết ly, đại tiện ra máu, đau bụng kinh niên, đau dạ dày: với liều dung là 4 – 8g củ sắc với 200 ml nước, đun cho sôi rút xuống còn 50 ml, uống một lần/ngày (Đỗ Tất Lợi, 2004). Củ Dòm còn có tác dụng giúp an thần, ngủ ngon, giúp lợi tiểu. Trị mụn nhọt, tiêu viêm, chữa rắn cắn: củ Dòm để tươi, giã nhỏ với ít muối và gừng, đắp tại chỗ chữa nhọt độc.
Trong y học hiện đại, hoạt chất L-tetrahydropalmatin (hyndarin, gindarin) chiết từ củ cây củ Dòm có tác dụng đặc hiệu với một số trường hợp loạn tâm thần, trạng thái căng thẳng tinh thần, suy nhược thần kinh. Với liều dùng là 0,05-0,1g dưới dạng viên đơn 0,05g L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặc viên phối hợp gồm: 0,03 g L-tetrahydropalmatin + 0,06 g cao khô lá vông + 0,05 g cao khô lá sen, tá dược vừa đủ cho 1 viên. Dạng viên phối hợp này được ứng dụng cho 100 bệnh nhân ở khoa thần kinh – Bệnh viện Hữu Nghị, thấy tác dụng an thần, gây ngủ nhanh hơn, giấc ngủ kéo dài êm dịu, không có triệu chứng mệt mỏi như dùng thuốc meprobamat (Nguyễn Chiều, 1982). Củ Dòm còn được sử dụng để tươi, giã với muối và gừng, đắp có tác dụng tiêu viêm, chữa nhọt độc, bắp chuối do tiêm.
Nông dân ở nhiều địa phương còn dùng nước sắc từ củ cây củ Dòm để điều trị chứng chán ăn ở trâu bò (Phạm Thanh Kỳ, 2009) 2. Phân bố và tình trạng phân hạng Ở nước ta, củ Dòm được tìm thấy ở những vùng như Lào Cai, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Bắc Giang, Hà Nội, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Quảng Nam (Nguyễn Kim Liễn, 2011). Củ Dòm hiện đang trong tình trạng nguy cấp do trữ lượng ít mà lại bị khai thác nhiều, có mặt trong sách đỏ Việt Nam.Tình hình nghiên cứu về củ Dòm trên thế giới và tại Việt Nam 2. Trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cây thuốc củ Dòm (Stephania dielsiana Y.
Các nghiên cứu chủ yếu tìm hiểu về các hợp chất có chứa trong loài này và tác dụng của chúng. Cây thuốc củ Dòm được đánh giá là cây dược liệu có nhiều hợp chất có giá trị ứng dụng chữa trị ung thư, sốt rét, chống viêm, kháng nấm, khuẩn. Điển hình là các chất có khả năng chống ung thư, như nghiên cứu về các hoạt động gây độc tế bào và chống bệnh của chiết xuất methanol từ lá của loài củ Dòm. Nghiên cứu chỉ ra rằng, trong số các hợp chất alkaloid phân lập được thì oxostephanine và thailandine có tác dụng chống lại một số dòng ung thư tốt nhất.
Trong đó oxostephanine được chiết xuất từ lá củ Dòm chống lại hiệu quả hầu hết các tế bào ung thư, mặc dù tính chọn lọc tế bào ung thư thấp. Thailandine thì chỉ có hiệu quả trên các tế bào ung thư phụ như MDA-MB-468 và MCF7 ( dòng tế bào ung thư vú), tuy nhiên độ chọn lọc lại tốt (SI> 12). Nghiên cứu này đã giúp bước đầu định hướng tạo và phát triển ra các loại thuốc chống ung thư, chống sốt rét an toàn và hiệu quả (James Knockleby et al. Bên cạnh việc chống tế bào ung thư, hợp chất alkaloid còn có hiệu quả kháng khuẩn tốt.
Hai alkaloid là stephanine và crebanine được phân lập từ củ của cây thuốc củ Dòm, có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh trên động vật và nấm gây bệnh trên thực vật. Cụ thể, chiết xuất stephanine và crebanine từ củ Dòm có hoạt tính ức chế cao chống lại 5 vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm gây bệnh trên động vật, với giá trị MIC là 0,625 – 7,5 g/l, hoạt tính ức chế vi khuẩn gram dương cao hơn so với gram âm. Chiết xuất methanol, stephanine và crebanine cũng ức chế sự phát triển của các sợi nấm trong các mầm bệnh thực vật như Cercospora kaki, Gymnosporangium haraeanum, Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani và Colletotrichum graminicola,.(Yecheng Deng et al. 6 Không chỉ có chứa các hoạt chất chữa bệnh tốt mà bên cạnh đó, trong củ rễ của củ Dòm còn có những cộng đồng nấm sống cộng sinh, có khả năng kháng khuẩn, giúp kiểm soát bệnh tốt.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng tổng cộng có 26 chủng nấm nội sinh đã được phân lập trong rễ củ của S. dielsiana, và 21 chủng phân lập được xác định và phân loại thành 8 chi khác nhau, bao gồm Briansuttonomyces, Glomerella, Pleosporales, Diaporthe, Phoma, Penicillium, Periconia và Colletotrichum, và loài nội sinh phổ biến nhất thu được là Diaporthe phaseolorum, Penicillium sp., Periconia fireari và Colletotrichum sp. Trong đó hoạt động kháng khuẩn của nấm endophytes là đáng chú ý nhất.