Khóa Luận Tốt Nghiệp: Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Cây Thuốc Củ Dòm Stephania Dielsiana Y.C. Wu

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu nhân giống in vitro cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y C Wu, phương pháp hiệu quả bảo tồn và phát triển dược liệu quý.

• Tác giả: Hoàng Thị Thu Hường
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Thị Thanh Tâm
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục đích của đề tài
• 1.3. Yêu cầu
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về cây củ Dòm
• 2.1.1. Sơ lược và phân bố
• 2.1.2. Đặc điểm hình thái
• 2.1.3. Đặc tính sinh học và sinh thái
• 2.1.4. Giá trị sử dụng
• 2.1.5. Phân bố và tình trạng phân hạng
• 2.2. Tình hình nghiên cứu về củ Dòm trên thế giới và tại Việt Nam
• 2.2.1. Trên thế giới
• 2.2.2. Tại Việt Nam
• 2.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro cây thuốc họ Tiết dê (Menispermanceae) và cây thuốc củ Dòm (Stephania dielsiana Y.)
• 2.3.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro các cây thuốc họ Tiết dê
• 2.3.2. Các nghiên cứu nhân giống in vitro cây Củ dòm
• 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Dụng cụ, hóa chất, môi trường nghiên cứu
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.3.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.3.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.5.2. Phương pháp xử lí số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 0,1 % đến giai đoạn tạo mẫu sạch in vitro
• 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-NAA đến sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi
• 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và 2,4 D đến sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi
• 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 5.1. Tài liệu tham khảo trong nước
• 5.2. Tài liệu tham khảo nước ngoài

Tóm tắt

I. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y

Nghiên cứu nhân giống in vitro cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu là một phương pháp tiên tiến nhằm bảo tồn và phát triển loài cây dược liệu quý hiếm này. Phương pháp này sử dụng công nghệ sinh học để tạo ra số lượng lớn cây con sạch bệnh, đảm bảo tính khả thi và hiệu quả cao. Khóa luận tốt nghiệp của Hoàng Thị Thu Hường tập trung vào việc xác định các thông số kỹ thuật tối ưu cho quy trình nhân giống in vitro, bao gồm khử trùng mẫu, tạo mô sẹo, và tái sinh chồi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng HgCl2 0,1% trong 7 phút kết hợp với môi trường MS bổ sung BAP và sucrose đạt tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh cao.

1.1. Kỹ thuật nhân giống in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro được áp dụng để nhân giống cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu nhằm tạo ra số lượng lớn cây con sạch bệnh. Quy trình bao gồm các bước khử trùng mẫu, tạo mô sẹo, và tái sinh chồi. Nghiên cứu chỉ ra rằng, sử dụng HgCl2 0,1% trong 7 phút kết hợp với môi trường MS bổ sung BAP và sucrose đạt tỷ lệ mẫu sạch 65,5% và tái sinh 58,9%. Đây là phương pháp hiệu quả để bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý này.

1.2. Ứng dụng y học và bảo tồn nguồn gen

Củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu có giá trị dược liệu cao, được sử dụng trong điều trị các bệnh như đau đầu, sốt rét, và ung thư. Nghiên cứu nhân giống in vitro không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen quý hiếm mà còn cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu y học. Phương pháp này đảm bảo tính khả thi và hiệu quả trong việc tạo ra số lượng lớn cây con sạch bệnh, góp phần vào việc bảo tồn và phát triển loài cây thuốc này.

II. Đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng của cây củ dòm

Cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu là một loài thực vật quý hiếm thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), có giá trị dược liệu cao. Cây phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới châu Á, đặc biệt là Việt Nam. Đặc điểm sinh học của cây bao gồm thân leo, rễ củ to, và lá hình tam giác tròn. Cây có khả năng tái sinh và ưa ẩm, thích hợp với khí hậu nhiệt đới. Giá trị sử dụng của cây không chỉ nằm ở khả năng chữa bệnh mà còn trong việc làm cảnh và trang trí, mang lại hiệu quả kinh tế cao.

2.1. Đặc điểm hình thái và sinh thái

Cây củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu có thân leo dài khoảng 3m, rễ củ to và lá hình tam giác tròn. Cây ưa ẩm và có khả năng tái sinh, thích hợp với khí hậu nhiệt đới. Đặc điểm sinh thái của cây bao gồm mùa hoa từ tháng 4-5 và mùa quả từ tháng 6-7. Cây thường mọc ở rừng kín xanh ẩm và có khả năng chịu bóng, phù hợp với điều kiện tự nhiên của Việt Nam.

2.2. Giá trị dược liệu và kinh tế

Củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu có giá trị dược liệu cao, được sử dụng trong điều trị các bệnh như đau đầu, sốt rét, và ung thư. Các hoạt chất trong củ dòm như L-tetrahydropalmatin có tác dụng an thần và giảm đau. Ngoài ra, cây còn được sử dụng làm cảnh và trang trí, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Việc bảo tồn và phát triển loài cây này thông qua nghiên cứu nhân giống in vitro là cần thiết để đảm bảo nguồn nguyên liệu dược liệu và giá trị kinh tế.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Phương pháp nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp của Hoàng Thị Thu Hường bao gồm các bước khử trùng mẫu, tạo mô sẹo, và tái sinh chồi. Nghiên cứu sử dụng HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu và môi trường MS bổ sung BAP và sucrose để tạo mô sẹo và tái sinh chồi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ mẫu sạch đạt 65,5% và tỷ lệ tái sinh chồi là 58,9%. Đây là những kết quả quan trọng trong việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro hiệu quả cho cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu.

3.1. Phương pháp khử trùng và tạo mô sẹo

Phương pháp khử trùng sử dụng HgCl2 0,1% trong 7 phút đạt tỷ lệ mẫu sạch cao. Tạo mô sẹo được thực hiện trên môi trường MS bổ sung BAP và sucrose, đạt tỷ lệ tạo mô sẹo 10% và tái sinh chồi 13,33%. Đây là những bước quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro, đảm bảo tính khả thi và hiệu quả của phương pháp.

3.2. Kết quả nhân nhanh chồi in vitro

Kết quả nhân nhanh chồi in vitro cho thấy, môi trường MS bổ sung BAP và sucrose đạt hệ số nhân chồi 3,1 chồi/mẫu. Chồi tái sinh có chiều cao trung bình 2cm, xanh, mập, và khỏe. Đây là những kết quả quan trọng trong việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro hiệu quả cho cây thuốc củ dòm Stephania dielsiana Y.C. Wu, góp phần vào việc bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây củ Dòm (Stephania dielsiana Y. Wu) là loài dược liệu quý thuộc chi Stephania, họ Tiết dê (Menispermaceae). Đây là loài thân thảo leo, rễ phình to thành củ thuôn dài, vỏ ngoài nhăn nheo, thịt màu vàng nâu và phân bố tự nhiên chủ yếu tại các vùng rừng kín xanh ẩm hoặc núi đá vôi ở độ cao 300 – 600 m tại một số tỉnh phía Bắc và miền Trung Việt Nam như Lào Cai, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Bắc Giang, Hà Nội (Ba Vì), Hòa Bình, Quảng Ninh, Quảng Nam.

Về giá trị y dược, rễ củ của loài này chứa nhiều hợp chất alkaloid quý như L-tetrahydropalmatin (hàm lượng khoảng 0,40 ± 0,01%), cepharanthin, tetrandrin, oxostephanin, dehydrocreabanin. Các hoạt chất này có tác dụng an thần, giảm đau, hạ huyết áp, tiêu viêm, ức chế vi khuẩn lao, đồng thời thể hiện hoạt tính gây độc mạnh đối với các dòng tế bào ung thư (ung thư gan, phổi, cơ vân, đại trực tràng, vú). Ngoài ra, củ Dòm còn được thu hái để làm cảnh với giá trị thương mại trên thị trường đạt khoảng 250.000 đồng/kg củ tươi. Do tình trạng khai thác tự nhiên quá mức cùng vùng phân bố hẹp, trữ lượng củ Dòm bị suy giảm nghiêm trọng và đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam với mức độ bị đe dọa cao.

Các phương pháp nhân giống truyền thống ngoài tự nhiên (gieo hạt, giâm hom cành, trồng bằng mầm rễ củ) gặp nhiều hạn chế: hệ số nhân giống thấp, thời gian sinh trưởng kéo dài, cây con dễ nhiễm sâu bệnh và chất lượng không đồng đều. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (in vitro) là giải pháp công nghệ sinh học tối ưu nhằm bảo tồn nguồn gen nguy cấp và sản xuất sinh khối sạch bệnh với số lượng lớn.

Mục tiêu nghiên cứu: Bước đầu xác định được một số thông số kỹ thuật cho quy trình nhân giống vô tính cây thuốc củ Dòm (Stephania dielsiana Y. Wu) trong điều kiện in vitro.

Yêu cầu và nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Xác định công thức vào mẫu in vitro phù hợp cho đoạn thân củ Dòm nhằm nâng cao tỷ lệ tạo mẫu sạch và tỷ lệ tái sinh chồi.
2. Xác định nguồn vật liệu nuôi cấy phù hợp và đánh giá các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân nhanh in vitro.
3. Xác định nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho sự phát sinh hình thái (tạo mô sẹo, tái sinh chồi) và nhân nhanh chồi cây củ Dòm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các đoạn thân non mang mắt ngủ và lát mỏng thân cây củ Dòm (Stephania dielsiana Y. Wu) được thu thập tại Vườn Quốc gia Ba Vì (Hà Nội), lưu giữ tại Bộ môn Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Không gian thực hiện: Phòng thí nghiệm Bộ môn Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2021 đến tháng 9/2021.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình sinh học

Nghiên cứu ứng dụng nguyên lý tính toàn năng của tế bào thực vật và cơ chế phát sinh hình thái in vitro thông qua hai con đường: cảm ứng tạo mô sẹo (callus) - tái sinh cơ quan và kích thích sự phát triển của chồi nách từ mắt ngủ. Quá trình này được điều tiết bởi sự tương tác giữa nhóm chất kích thích phân chia tế bào (Cytokinin: 6-Benzylaminopurine - BAP) và nhóm chất kích thích giãn dài/phân hóa tế bào (Auxin: α-Naphthalene acetic acid - α-NAA; 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid - 2,4-D).

Hiện tượng hóa nâu do sự oxy hóa các hợp chất polyphenol nội sinh giải phóng từ vết cắt mô củ Dòm là rào cản sinh lý lớn, đòi hỏi phải bổ sung chất chống oxy hóa (vitamin C / acid ascorbic) vào môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản Murashige & Skoog (MS, 1962).

Vật liệu, hóa chất và thiết bị

• Môi trường cơ sở: Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) bổ sung 30 g/l sucrose và 6,3 g/l agar; pH môi trường được chỉnh về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút.
• Chất điều hòa sinh trưởng và hóa chất: BAP, α-NAA, 2,4-D, cồn ethanol 70%, muối thủy ngân Biclorua (HgCl₂ 0,1%), vitamin C (100 mg/l).
• Thiết bị: Box cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng autoclave, máy đo pH, cân phân tích, máy khuấy từ, phòng nuôi cấy kiểm soát nhiệt độ 23 – 25°C, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux với quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối.

Phương pháp bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu

Nghiên cứu gồm 4 nội dung thí nghiệm thực nghiệm, mỗi công thức được lặp lại 3 lần:

1. Thí nghiệm 1 (Khử trùng tạo mẫu sạch ban đầu): Đoạn thân 4 – 6 cm mang mắt ngủ được rửa xà phòng 10 phút, sát trùng bề mặt bằng ethanol 70% trong 1 phút, sau đó xử lý với dung dịch HgCl₂ 0,1% theo 3 mức thời gian: 5 phút (CT1), 7 phút (CT2), 10 phút (CT3) và đối chứng không khử trùng (ĐC). Mỗi lần lặp sử dụng 15 mẫu. Nuôi trên môi trường MS + 2 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 6,3 g/l agar.
2. Thí nghiệm 2 (Tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ lát mỏng với BAP và α-NAA): Mẫu lát mỏng thân dày 1,0 – 1,3 mm cấy trên nền MS + 2 mg/l BAP + 100 mg/l vitamin C + 30 g/l sucrose + 6,3 g/l agar kết hợp α-NAA ở các nồng độ 0 mg/l (ĐC); 0,1 mg/l (CT1); 0,3 mg/l (CT2); 0,5 mg/l (CT3).
3. Thí nghiệm 3 (Tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ lát mỏng với BAP và 2,4-D): Mẫu lát mỏng thân dày 1,0 – 1,3 mm cấy trên nền MS + 2 mg/l BAP + 100 mg/l vitamin C + 30 g/l sucrose + 6,3 g/l agar kết hợp 2,4-D ở các nồng độ 0 mg/l (ĐC); 0,1 mg/l (CT1); 0,2 mg/l (CT2); 0,3 mg/l (CT3).
4. Thí nghiệm 4 (Nhân nhanh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ): Đoạn thân dài 2 cm mang mắt ngủ cấy trên môi trường MS + 100 mg/l vitamin C + 30 g/l sucrose + 6,3 g/l agar bổ sung nồng độ BAP đơn lẻ gồm 0 mg/l (ĐC); 1 mg/l (CT1); 2 mg/l (CT2); 3 mg/l (CT3); 4 mg/l (CT4).

Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy về tỷ lệ mẫu nhiễm (%), tỷ lệ mẫu sạch (%), tỷ lệ tái sinh (%), tỷ lệ tạo mô sẹo (%), hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) và chiều cao chồi (cm) được tổng hợp bằng Microsoft Excel và phân tích phương sai (ANOVA) qua phần mềm thống kê chuyên ngành IRRISTAT để kiểm định sai số thí nghiệm ($CV%$) và độ lệch tiêu chuẩn ở mức ý nghĩa $P < 0,05$ ($LSD_{0.05}$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả nêu bật tầm quan trọng của nguồn dược liệu cây củ Dòm (Stephania dielsiana Y. Wu) đối với y học dân tộc và y học hiện đại, nhấn mạnh tình trạng cạn kiệt nguồn gen tự nhiên do bị khai thác thương mại và sinh cảnh bị thu hẹp. Khóa luận xác định sự cần thiết phải thiết lập quy trình nhân giống in vitro nhằm khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, từ đó đưa ra mục đích và 3 yêu cầu nghiên cứu cụ thể về công nghệ nuôi cấy mô.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến đối tượng nghiên cứu:

• Đặc điểm thực vật và sinh thái củ Dòm: Mô tả cơ quan dinh dưỡng (rễ củ thuôn dài nhiều rãnh, thân leo nhẵn màu tím nhạt, lá hình tam giác tròn đỉnh nhọn) và cơ quan sinh sản (hoa đơn tính khác gốc, mùa hoa tháng 4 – 5, mùa quả tháng 6 – 7).
• Thành phần hóa học và tác dụng sinh học: Tổng kết các công trình phân lập 21 hợp chất (15 alkaloid, 3 flavonoid, 3 terpenoid) từ củ Dòm của Nguyễn Quốc Huy (2010), hoạt tính ức chế acetylcholinesterase điều trị Alzheimer của Đỗ Quyên (2015), tác dụng ức chế tế bào ung thư của oxostephanine, thailandine (James Knockleby et al., 2020), khả năng kháng khuẩn, kháng nấm thực vật của stephanine và crebanine (Yecheng Deng et al., 2011), cũng như hệ nấm nội sinh rễ củ (Zhenling Yan et al., 2020).
• Tổng quan nuôi cấy in vitro chi Stephania: Phân tích quy trình vi nhân giống trên các loài cùng chi như Stephania tetrandra (Chao-Lin Kuo et al., 2011), Stephania rotunda (Trịnh Ngọc Nam, 2012), Stephania glabra (Nguyễn Thị Sen, 2020; Sysomephone Tangmany, 2020) và công trình nuôi cấy lát mỏng tế bào củ Dòm của Nguyễn Văn Việt et al. (2018).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết xuất xứ nguồn mẫu đoạn thân củ Dòm tại Ba Vì, các thông số kỹ thuật của trang thiết bị, hóa chất và môi trường dinh dưỡng MS. Mô tả phương pháp vô trùng dụng cụ, khử trùng mẫu thực vật, thiết kế công thức thí nghiệm và công thức toán học xác định các chỉ tiêu phát sinh hình thái thực vật, phương pháp phân tích thống kê sinh học trên phần mềm IRRISTAT.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Tác giả trình bày chi tiết các phát hiện thực nghiệm qua 4 nội dung:

                                  KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM IN VITRO CÂY CỦ DÒM
  1. Khử trùng tạo mẫu         2. Tạo mô sẹo                  3. Tạo mô sẹo                4. Nhân nhanh
    (HgCl2 0,1%)            (BAP + α-NAA lát mỏng)         (BAP + 2,4-D lát mỏng)      (BAP trên mắt ngủ)
  - 7 phút tối ưu             - Mẫu hóa nâu đen               - CT1 (0,1 mg/l 2,4-D)       - CT2 (2 mg/l BAP)
  - Mẫu sạch: 66,67%          - Không tạo sẹo                 - Tạo sẹo: 10,00%            - Hệ số nhân: 3,15 chồi
  - Tái sinh: 55,56%          - Không tái sinh                - Tái sinh chồi: 13,33%      - Cao: 2,00 cm, chồi khỏe

• Nghiên cứu khử trùng đoạn thân: Dung dịch HgCl₂ 0,1% trong 7 phút cho kết quả tối ưu nhất với tỷ lệ mẫu sạch 66,67% và tỷ lệ tái sinh chồi 55,56%. Thời gian 5 phút khử trùng chưa triệt để (nhiễm 51,11%), trong khi 10 phút gây độc mô làm mô thâm đen và giảm tái sinh (26,67%).
• Cảm ứng mô sẹo với tổ hợp BAP và α-NAA: Sau 4 tuần nuôi cấy lát mỏng, toàn bộ các công thức (0 – 0,5 mg/l NAA kết hợp 2 mg/l BAP) đều bị hóa nâu đen và chết do tích tụ polyphenol và điều kiện ánh sáng chưa phù hợp.
• Cảm ứng mô sẹo với tổ hợp BAP và 2,4-D: Bổ sung 0,1 mg/l 2,4-D kết hợp 2 mg/l BAP (CT1) cho tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 10,00% và tỷ lệ tái sinh chồi đạt 13,33%. Các nồng độ 2,4-D cao hơn (0,2 – 0,3 mg/l) làm giảm khả năng tái sinh chồi.
• Nhân nhanh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ: Môi trường MS bổ sung 2 mg/l BAP (CT2) là công thức tối ưu nhất, đạt hệ số nhân 3,15 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình 2,00 cm, chồi sinh trưởng khỏe, mập và xanh cứng (+++).

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các thông số kỹ thuật cốt lõi đã đạt được về nồng độ chất khử trùng, môi trường tạo mô sẹo và môi trường nhân nhanh chồi; đồng thời đề xuất 4 định hướng nghiên cứu bổ sung để hoàn thiện quy trình vi nhân giống hoàn chỉnh.

---

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chi tiết

Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl₂ 0,1% đến đoạn thân củ Dòm sau 4 tuần

Công thức	Thời gian khử trùng (phút)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu sạch (%)	Tỷ lệ mẫu tái sinh (%)
ĐC	0	100,00	0,00	0,00
CT1	5	51,11	48,89	21,11
CT2	7	33,33	66,67	55,56
CT3	10	40,00	60,00	26,67

Bảng 2: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP (2 mg/l) và 2,4-D đến tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ lát mỏng

Công thức	Nồng độ 2,4-D (mg/l)	Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)	Tỷ lệ tái sinh chồi (%)
ĐC	0,0	3,33	0,00
CT1	0,1	10,00	13,33
CT2	0,2	3,33	6,67
CT3	0,3	3,33	0,00
LSD₀.₀₅	—	0,13	0,88
CV (%)	—	0,10	0,10

Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ

Công thức	Nồng độ BAP (mg/l)	Số chồi (chồi/mẫu)	Chiều cao chồi (cm)	Hình thái chồi
ĐC	0	2,15	1,75	Chồi vàng, mềm (+)
CT1	1	2,30	1,79	Chồi trung bình, xanh, cứng (++)
CT2	2	3,15	2,00	Chồi tốt, xanh vươn, mập, cứng (+++)
CT3	3	3,30	1,62	Chồi trung bình, xanh, cứng (++)
CT4	4	3,50	1,63	Chồi trung bình, xanh, cứng (++)
LSD₀.₀₅	—	0,451	0,367	—
CV (%)	—	5,70	7,50	—

So sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm và đóng góp khoa học

• Về khử trùng tạo mẫu sạch: So với nghiên cứu của Nguyễn Văn Việt et al. (2018) trên cùng loài củ Dòm (đạt 85,96% mẫu sạch và 70,84% tái sinh), kết quả của tác giả đạt 66,67% mẫu sạch và 55,56% tái sinh. Sự chênh lệch này được tác giả giải thích là do đặc tính mẫu thực vật tự nhiên thu thập từ Ba Vì mang lượng nấm nội sinh cao (như các nghiên cứu của Zhenling Yan et al., 2020 đã chỉ ra có tới 26 chủng nấm nội sinh trong rễ củ loài này).
• Về khả năng nhân nhanh: Nghiên cứu của Nguyễn Văn Việt (2018) cần phối hợp phức tạp 3 chất điều hòa sinh trưởng (0,7 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA) để đạt hệ số nhân 3,3 chồi/mẫu và chiều cao 3,83 cm. Khóa luận này chứng minh chỉ cần sử dụng BAP đơn lẻ ở nồng độ 2 mg/l trên đoạn thân mang mắt ngủ đã đạt hệ số nhân tương đương là 3,15 chồi/mẫu với chồi mập, khỏe, xanh cứng, giúp đơn giản hóa môi trường và tiết kiệm chi phí hóa chất.
• Về phản ứng mô học: Tác giả phát hiện phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào thân củ Dòm làm tăng mức độ hóa nâu nghiêm trọng hơn nhiều so với nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ, cung cấp cơ sở quan trọng cho việc lựa chọn nguồn mẫu cấy khởi đầu.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

1. Hiện tượng hóa nâu mô cấy: Mẫu cấy lát mỏng chứa hàm lượng cao hợp chất thứ cấp polyphenol, dẫn đến tỷ lệ mẫu bị chết do hóa nâu cao ở thí nghiệm tạo mô sẹo (đặc biệt tổ hợp BAP + NAA thất bại hoàn toàn), dù đã bổ sung 100 mg/l vitamin C.
2. Quy mô và điều kiện thực hiện: Do ảnh hưởng của dịch bệnh Covid-19 và nguồn vật liệu thu thập ngoài tự nhiên có hạn, tác giả chưa thể triển khai các thí nghiệm bổ sung nhằm khắc phục triệt để hiện tượng hóa nâu.
3. Tính toàn diện của quy trình: Nghiên cứu dừng lại ở giai đoạn nhân nhanh chồi in vitro, chưa thực hiện được các giai đoạn tiếp theo gồm kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện cây con thích nghi ngoài vườn ươm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Khảo sát bổ sung các chất chống oxy hóa và chất hấp phụ khác với nồng độ thích hợp (acid citric, polyvinylpyrrolidone - PVP, than hoạt tính) hoặc điều chỉnh chế độ chiếu sáng (nuôi trong tối hoàn toàn giai đoạn đầu) để khắc phục hiện tượng hóa nâu ở mẫu lát mỏng.
• Nghiên cứu ảnh hưởng của các Auxin (NAA, IBA, IAA) đến khả năng kích thích ra rễ của chồi in vitro cây củ Dòm.
• Nghiên cứu cơ chất giá thể và điều kiện vi khí hậu tại vườn ươm nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cây củ Dòm in vitro khi đưa ra ngoài đất.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ sinh học, Nông học, Dược học và Lâm nghiệp quan tâm đến vi nhân giống các loài cây dược liệu quý hiếm thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae).
• Phần nội dung có giá trị ứng dụng cao:
  • Quy trình khử trùng đoạn thân cây rừng tự nhiên bằng HgCl₂ 0,1% trong 7 phút.
  • Công thức môi trường nhân nhanh chồi đơn giản, hiệu quả sử dụng MS + 2 mg/l BAP + 100 mg/l vitamin C + 30 g/l sucrose + 6,3 g/l agar.
  • Các phân tích nguyên nhân sinh lý và biện pháp xử lý hiện tượng hóa nâu mô cấy do hợp chất polyphenol.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Công thức khử trùng nào cho hiệu quả tốt nhất để tạo mẫu sạch cây củ Dòm in vitro trong nghiên cứu này? Công thức tối ưu là sát khuẩn bề mặt mẫu đoạn thân bằng ethanol 70% trong 1 phút, sau đó khử trùng bằng dung dịch HgCl₂ 0,1% trong thời gian 7 phút, cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 66,67% và tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 55,56%.

2. Tại sao thí nghiệm tạo mô sẹo từ lát mỏng với tổ hợp BAP và α-NAA không thu được kết quả? Các mẫu lát mỏng ở tất cả công thức BAP + α-NAA bị hóa nâu đen và chết dần sau 4 tuần nuôi cấy. Nguyên nhân do lát cắt giải phóng nhiều hợp chất polyphenol nội sinh gây độc cho tế bào, kết hợp với việc nuôi cấy dưới ánh sáng mạnh (16 giờ sáng/ngày) và số lần cấy chuyển ban đầu chưa đủ nhiều để loại bỏ độc chất.

3. Công thức nào cho tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ lát mỏng tốt nhất khi kết hợp với 2,4-D? Công thức CT1 gồm môi trường MS cơ bản bổ sung 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l 2,4-D + 100 mg/l vitamin C + 30 g/l sucrose + 6,3 g/l agar cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 10,00% và tỷ lệ tái sinh chồi đạt 13,33%.

4. Nồng độ BAP nào là tối ưu nhất cho giai đoạn nhân nhanh chồi cây củ Dòm từ đoạn thân mang mắt ngủ? Nồng độ BAP tối ưu là 2 mg/l (CT2) trên nền môi trường MS bổ sung 100 mg/l vitamin C, 30 g/l sucrose và 6,3 g/l agar. Công thức này cho hệ số nhân 3,15 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình đạt 2,00 cm với hình thái chồi sinh trưởng tốt, xanh đậm, thân mập và cứng cáp.

5. Vì sao nồng độ 4 mg/l BAP cho số chồi cao nhất (3,50 chồi/mẫu) nhưng không được chọn là công thức tối ưu? Mặc dù nồng độ 4 mg/l BAP tạo ra số chồi cao nhất nhưng chiều cao chồi lại thấp (1,63 cm), xuất hiện nhiều chồi nhỏ và chất lượng chồi kém hơn (chỉ đạt mức ++), không đảm bảo tiêu chuẩn hình thái tốt như ở công thức 2 mg/l BAP (đạt mức +++).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Hoàng Thị Thu Hường đã bước đầu xác định được các thông số kỹ thuật then chốt cho quy trình nhân giống in vitro cây dược liệu củ Dòm (Stephania dielsiana Y. Wu). Nghiên cứu khẳng định phương pháp khử trùng đoạn thân bằng HgCl₂ 0,1% trong 7 phút mang lại hiệu quả tạo mẫu sạch cao nhất (66,67%), đồng thời xác định môi trường MS bổ sung 2 mg/l BAP là tối ưu cho quá trình nhân nhanh chồi từ mắt ngủ với hệ số nhân 3,15 chồi/mẫu. Kết quả thực nghiệm đã làm rõ sự ảnh hưởng tiêu cực của hiện tượng hóa nâu polyphenol trên mô cấy lát mỏng, đặt nền tảng dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho việc hoàn thiện quy trình vi nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây củ Dòm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Củ Dòm (Stephania dielsiana Y. Wu ) là một loại cây dược liệu quý thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), thân thảo leo, có củ thuôn dài,. Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á. Ở Việt Nam, có 10 – 12 loài, trong đó chỉ có 2 – 3 loài không có rễ phình thành củ.

Loài củ Dòm được xếp vào diện tương đối hiếm, có điểm phân bố ở Ba Vì (Hà Tây), Kỳ Sơn (Hoà Bình), Bạch Thông (Bắc Kạn) và Trà My (Quảng Nam) (Nguyễn Kim Liễn, 2011). Rễ củ chứa nhiều hoạt chất dược liệu quý. Có vị đắng, lợi tiểu an thần, tiêu viêm. Dùng trong chữa trị các bệnh đau lưng, mỏi nhức chân, đau bụng.

Có nhiều nghiên cứu chỉ ra củ Dòm còn có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư. Các chất tinh khiết được phân lập từ các loài thuộc chi này có thể kháng một số dòng tế bào ung thư như cepharanthin (có tác dụng kích thích miễn dịch), tetrandrin thuộc nhóm bis benzylisoquinolin (Nguyễn Quốc Huy, 2010). Ngoài ra củ Dòm còn được sử dụng để làm cảnh và trang trí, hiện đang được nhiều người ưa chuộng, mang tiềm năng giá trị kinh tế cao. Có giá trị lớn như vậy song loài đang có nguy cơ tuyệt chủng cao, vì vậy việc nhân giống là vô cùng quan trọng.

Hiện có nhiều phương pháp nhân giống cây củ Dòm đang được sử dụng như trồng bằng mầm củ, gieo hạt, giâm hom, giâm cành,. song cây trồng vẫn bị bệnh và kém phát triển, chất lượng cây trồng thấp (Trần Công Vinh, 2019). Vì vậy việc tìm kiếm một phương pháp nhân giống mang lại hiệu cao hơn là cần thiết. Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy in vitro được biết đến là một phương pháp nhân giống tối ưu, tạo số lượng cây lớn sạch bệnh và đã được áp dụng thành công phổ biến trên nhiều loài thực vật khác nhau.

Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm nghiên cứu nhân giống cây củ Dòm bằng phương pháp in vitro. Mục đích của đề tài Bước đầu xác định được một số thông số kỹ thuật cho quy trình nhân giống vô tính cây thuốc củ Dòm trong điều kiện in vitro 1 1.Yêu cầu - Xác định, tìm ra công thức vào mẫu in vitro cây củ Dòm phù hợp, nâng cao hiệu quả vào mẫu thành công. - Xác định nguồn vật liệu phù hợp và các yếu tố ảnh hưởng cho quá trình nhân nhanh in vitro - Nghiên cứu xác định được nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng phù hợp cho sự nhân nhanh của mẫu cấy in vitro cây củ Dòm. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.

Giới thiệu về cây củ Dòm 2. Sơ lược và phân bố Củ Dòm (Stephania dielsiana Y. thuộc họ Tiết dê ( Menispermaceae ) còn có tên gọi khác là Củ gà ấp, Cà tòm,. là cây thuốc quý, hiếm, mới được phát hiện ở Việt Nam.

Cây có thân dạng dây leo nhỏ, rễ củ to. Rễ củ có chứa chất alkaloid có tác dụng giảm đau an thần giãn mạch, hạ huyết áp, điều hòa hô hấp được sử dụng làm thuốc chữa các bệnh đau lưng, đau bụng, mỏi nhức chân, giúp ngủ ngon. Bên cạnh đó còn có chứa chất cepharanthin kích thích miễn dịch và giảm nhẹ tác dụng phụ của thuốc chống ung thư, ngoài ra còn có tác dụng ức chế tế bào ung thư đại trực tràng và ung thư gan, ức chế vi khuẩn lao phát triển (Nguyễn Quốc Huy, 2010). Ngoài tác dụng chữa bệnh củ Dòm còn được sử dụng với mục đích làm cảnh và trang trí, được rất nhiều người ưa chuộng.

Phân bố chủ yếu ở các vùng như: Lào Cai, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Tây,…(Nguyễn Kim Liễn, 2011) Hình 2. Cây củ Dòm (Stephania dielsiana Y.Wu ) (https://www.com/watch?v=2R1PzMZY-XM) 3 2. Đặc điểm hình thái  Rễ: Rễ củ to thường hình thuôn dài, vỏ ngoài nhăn nheo, thịt màu vàng nâu, rắn.  Thân: Thân có dạng leo cuốn, dài khoảng 3m; thân non có màu tím nhạt; không có lông, trơn nhẵn.

 Lá: Lá đơn nguyên, mọc so le, có cuống dài 4,5 - 8,5 cm. Phiến lá có hình tam giác tròn, rộng khoảng 9 - 13 cm; mép lá có hình răng tù rất thưa hơi lượn sóng ở phía ngọn; chóp lá nhọn, gốc bằng hoặc hơi lõm; gân dạng chân vịt, xuất phát từ chỗ đính của cuống lá. Những ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím hồng (Nguyễn Tiến Bân, 2010)  Hoa: Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực do 3 - 5 xim nhỏ, hợp thành xim tán kép.

Hoa nhỏ, có cuống ngắn, 6 lá đài màu tím xếp 2 vòng, 3 cánh hoa hình quạt tròn, màu vàng cam; cột nhị ngắn, bao phấn dính thành đĩa 6 ô. Cụm hoa cái gồm 7 - 8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng bầu. Hoa 1 lá đài màu tím hồng, 2 cánh hoa hình quạt tròn màu vàng cam và có các vân tím. Bầu hình trứng, đầu nhuỵ có 4 - 5 thuỳ dạng dùi (Nguyễn Tiến Bân, 2010)  Quả: Quả có hình trứng đảo, hơi dẹt.

Hạt hình trứng ngược cụt đầu có lỗ thủng ở giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn cong. Đặc tính sinh học và sinh thái Mùa hoa thường là từ tháng 4 - 5, mùa quả từ tháng 6 - 7. Cây mọc chồi từ thân hoặc từ cổ rễ vào đầu mùa xuân. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể chịu bóng.

Thường mọc ở rừng kín xanh ẩm; có mọc ở rừng núi đá vôi ở độ cao 300 - 600 m nhưng ít gặp, có khả năng tái sinh (Nguyễn Tiến Bân, 2010). Giá trị sử dụng - Giá trị kinh tế Rễ củ là phần có giá trị cao nhất, được dùng làm thuốc. Hiện nay trên thị trường củ Dòm đang được bán với giá khoảng 250. Giá trị kinh tế là vô cùng lớn do cây phát triển tốt, phù hợp với khí hậu tự nhiên 4 của Việt Nam, không cần tốn nhiều công sức chăm sóc mà vẫn mang lại hiệu quả và năng suất cao.

- Giá trị dược liệu Củ Dòm được dùng để điều trị một số bệnh như phong tê thấp, đau thần kinh, nhức mỏi. Theo kinh nghiệm dân gian, củ Dòm được dùng chữa kiết ly, đại tiện ra máu, đau bụng kinh niên, đau dạ dày: với liều dung là 4 – 8g củ sắc với 200 ml nước, đun cho sôi rút xuống còn 50 ml, uống một lần/ngày (Đỗ Tất Lợi, 2004). Củ Dòm còn có tác dụng giúp an thần, ngủ ngon, giúp lợi tiểu. Trị mụn nhọt, tiêu viêm, chữa rắn cắn: củ Dòm để tươi, giã nhỏ với ít muối và gừng, đắp tại chỗ chữa nhọt độc.

Trong y học hiện đại, hoạt chất L-tetrahydropalmatin (hyndarin, gindarin) chiết từ củ cây củ Dòm có tác dụng đặc hiệu với một số trường hợp loạn tâm thần, trạng thái căng thẳng tinh thần, suy nhược thần kinh. Với liều dùng là 0,05-0,1g dưới dạng viên đơn 0,05g L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặc viên phối hợp gồm: 0,03 g L-tetrahydropalmatin + 0,06 g cao khô lá vông + 0,05 g cao khô lá sen, tá dược vừa đủ cho 1 viên. Dạng viên phối hợp này được ứng dụng cho 100 bệnh nhân ở khoa thần kinh – Bệnh viện Hữu Nghị, thấy tác dụng an thần, gây ngủ nhanh hơn, giấc ngủ kéo dài êm dịu, không có triệu chứng mệt mỏi như dùng thuốc meprobamat (Nguyễn Chiều, 1982). Củ Dòm còn được sử dụng để tươi, giã với muối và gừng, đắp có tác dụng tiêu viêm, chữa nhọt độc, bắp chuối do tiêm.

Nông dân ở nhiều địa phương còn dùng nước sắc từ củ cây củ Dòm để điều trị chứng chán ăn ở trâu bò (Phạm Thanh Kỳ, 2009) 2. Phân bố và tình trạng phân hạng Ở nước ta, củ Dòm được tìm thấy ở những vùng như Lào Cai, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Bắc Giang, Hà Nội, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Quảng Nam (Nguyễn Kim Liễn, 2011). Củ Dòm hiện đang trong tình trạng nguy cấp do trữ lượng ít mà lại bị khai thác nhiều, có mặt trong sách đỏ Việt Nam.Tình hình nghiên cứu về củ Dòm trên thế giới và tại Việt Nam 2. Trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cây thuốc củ Dòm (Stephania dielsiana Y.

Các nghiên cứu chủ yếu tìm hiểu về các hợp chất có chứa trong loài này và tác dụng của chúng. Cây thuốc củ Dòm được đánh giá là cây dược liệu có nhiều hợp chất có giá trị ứng dụng chữa trị ung thư, sốt rét, chống viêm, kháng nấm, khuẩn. Điển hình là các chất có khả năng chống ung thư, như nghiên cứu về các hoạt động gây độc tế bào và chống bệnh của chiết xuất methanol từ lá của loài củ Dòm. Nghiên cứu chỉ ra rằng, trong số các hợp chất alkaloid phân lập được thì oxostephanine và thailandine có tác dụng chống lại một số dòng ung thư tốt nhất.

Trong đó oxostephanine được chiết xuất từ lá củ Dòm chống lại hiệu quả hầu hết các tế bào ung thư, mặc dù tính chọn lọc tế bào ung thư thấp. Thailandine thì chỉ có hiệu quả trên các tế bào ung thư phụ như MDA-MB-468 và MCF7 ( dòng tế bào ung thư vú), tuy nhiên độ chọn lọc lại tốt (SI> 12). Nghiên cứu này đã giúp bước đầu định hướng tạo và phát triển ra các loại thuốc chống ung thư, chống sốt rét an toàn và hiệu quả (James Knockleby et al. Bên cạnh việc chống tế bào ung thư, hợp chất alkaloid còn có hiệu quả kháng khuẩn tốt.

Hai alkaloid là stephanine và crebanine được phân lập từ củ của cây thuốc củ Dòm, có tác dụng chống lại vi khuẩn gây bệnh trên động vật và nấm gây bệnh trên thực vật. Cụ thể, chiết xuất stephanine và crebanine từ củ Dòm có hoạt tính ức chế cao chống lại 5 vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm gây bệnh trên động vật, với giá trị MIC là 0,625 – 7,5 g/l, hoạt tính ức chế vi khuẩn gram dương cao hơn so với gram âm. Chiết xuất methanol, stephanine và crebanine cũng ức chế sự phát triển của các sợi nấm trong các mầm bệnh thực vật như Cercospora kaki, Gymnosporangium haraeanum, Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani và Colletotrichum graminicola,.(Yecheng Deng et al. 6 Không chỉ có chứa các hoạt chất chữa bệnh tốt mà bên cạnh đó, trong củ rễ của củ Dòm còn có những cộng đồng nấm sống cộng sinh, có khả năng kháng khuẩn, giúp kiểm soát bệnh tốt.

Các nghiên cứu chỉ ra rằng tổng cộng có 26 chủng nấm nội sinh đã được phân lập trong rễ củ của S. dielsiana, và 21 chủng phân lập được xác định và phân loại thành 8 chi khác nhau, bao gồm Briansuttonomyces, Glomerella, Pleosporales, Diaporthe, Phoma, Penicillium, Periconia và Colletotrichum, và loài nội sinh phổ biến nhất thu được là Diaporthe phaseolorum, Penicillium sp., Periconia fireari và Colletotrichum sp. Trong đó hoạt động kháng khuẩn của nấm endophytes là đáng chú ý nhất.