Luận án về chuyển gen cry8db và khả năng kháng của cây mía

Luận án nghiên cứu chuyển gen cry8db vào cây mía nhằm nâng cao khả năng kháng sâu bệnh, góp phần cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng.

• Trường học: Trường Đại Học Nông Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chuyển Gen Cry8Db Vào Cây Mía Để Tăng Cường Khả Năng Kháng
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại
• 1.2. Đặc điểm hình thái sinh thái và di truyền
• 1.3. Giá trị của cây mía và tình hình sản xuất mía đường
• 1.4. Bọ hung hại mía và biện pháp phòng trừ

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp được trồng rộng rãi nhất trên thế giới, với diện tích canh tác lên tới 26,9 triệu ha và sản lượng đạt 1,91 tỷ tấn. Cây mía không chỉ cung cấp thực phẩm như sucrose và fructose mà còn là nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Tuy nhiên, cây mía đang phải đối mặt với nhiều thách thức từ sâu bệnh, đặc biệt là các loài bọ cánh cứng. Việc cải thiện khả năng kháng của cây mía thông qua kỹ thuật chuyển gen là cần thiết để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Kỹ thuật chuyển gen, đặc biệt là việc chuyển gen cry8db, có thể giúp tạo ra giống mía mới có khả năng kháng sâu bệnh hiệu quả hơn, từ đó giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu hóa học.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8db có khả năng kháng ấu trùng bọ hung. Nghiên cứu sẽ đánh giá thiệt hại do bọ hung gây ra trên cây mía và thử nghiệm hoạt tính kháng của protein độc tố cry8db. Việc thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen cry8db sẽ được thực hiện, cùng với việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây mía. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua Agrobacterium tumefaciens cũng là một phần quan trọng trong nghiên cứu này.

III. Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm việc đánh giá thiệt hại do bọ hung gây ra trên cây mía và thử nghiệm hoạt tính kháng của protein độc tố cry8db. Nghiên cứu sẽ thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen cry8db và xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây mía. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua Agrobacterium tumefaciens sẽ được thực hiện để đánh giá khả năng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện gen cry8db. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen.

IV. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong việc nâng cao khả năng kháng bọ hung hại mía bằng kỹ thuật chuyển gen. Nghiên cứu cung cấp cơ sở lý luận cho việc phát triển giống mía kháng sâu bệnh, từ đó góp phần vào việc cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc tạo ra protein tái tổ hợp Cry8Db có khả năng kháng ấu trùng bọ hung sẽ mở ra triển vọng mới trong ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp. Kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo vệ cây trồng mà còn giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường từ việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học.

V. Đóng góp mới của luận án

Luận án đã chứng minh được protein Cry8Db có khả năng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau. Nghiên cứu đã tạo ra 13 dòng mía chuyển gen cry8db và kiểm tra nồng độ protein tái tổ hợp bằng phản ứng ELISA. Kết quả cho thấy dòng mía chuyển gen S3 có khả năng kháng ấu trùng tốt nhất với tỷ lệ phá hại thấp. Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song hai quy trình chuyển gen vào cây mía, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc tạo giống mía kháng côn trùng hại mía.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học thực vật (Di truyền và Công nghệ gen), tiếp cận theo hướng thực nghiệm định lượng kết hợp sinh học phân tử và sinh học thực nghiệm. Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2012 đến năm 2017 tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Cây mía (Saccharum officinarum L.) được canh tác tại 109 quốc gia với diện tích 26,9 triệu ha và sản lượng đạt 1,91 tỷ tấn (Factfish, 2015). Tại Việt Nam, diện tích canh tác mía năm 2013 đạt 310,2 nghìn ha, sản lượng đạt 20,1 triệu tấn (FAO, cập nhật 08/2017). Cây mía là vật chủ của hơn 1.500 loài côn trùng và 80 bệnh hại, trong đó côn trùng bộ Cánh cứng (Coleoptera) — đặc biệt là họ bọ hung (Scarabaeidae) — gây thiệt hại nghiêm trọng. Ở Việt Nam, thành phần sâu hại mía ghi nhận 26 loài thuộc 8 bộ côn trùng, trong đó bộ Cánh cứng chiếm 13 loài (50% tổng số loài gây hại mía) (Phạm Thị Vượng và đtg, 2011). Bọ hung làm giảm 39% năng suất mía ở Mỹ (faostat). Tại Trung Quốc, Holotrichia parallela và Anomala corpulenta làm giảm 15–20% năng suất trung bình mỗi năm (Luo et al., 2008).

Khoảng trống nổi bật là: không có giống mía nào mang gen kháng côn trùng tự nhiên trong hệ gen (James, 2014); các biện pháp hóa học và sinh học hiện có (Regent 0,3%, Diazan 10H, nấm Metarhizium anisopliae) có hiệu quả thấp, không bền vững (Lê Quang Khải và đtg, 2017). Bộ gen mía rất phức tạp (kích thước 985 Mbp, số NST 2n = 70–140), khiến tạo giống theo phương pháp truyền thống kéo dài 10–12 năm (Zhang et al., 2012). Nhóm gen cry8 mã hóa độc tố đặc hiệu với côn trùng bộ Cánh cứng là nguồn gen tiềm năng nhưng chưa được ứng dụng chuyển vào cây mía. Chưa có công trình nào sử dụng song song hai quy trình chuyển gen (in vitro và ex vitro) vào cây mía mang gen cry8Db.

Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được các dòng mía chuyển gen cry8Db có hoạt tính kháng ấu trùng bọ hung hại mía.

Nội dung nghiên cứu

1. Đánh giá thiệt hại do bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài bọ hung điển hình của protein Cry8Db tái tổ hợp.
2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen cry8Db.
3. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây mía.
4. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A. tumefaciens.
5. Đánh giá khả năng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện gen cry8Db.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng thực vật: Ba giống mía ROC22, ROC10, QĐ21, cây 4–6 tháng tuổi, thu từ vùng nguyên liệu Nhà máy đường Sơn Dương, Tuyên Quang.
• Đối tượng côn trùng: Ấu trùng Lepidiota signata Fabricius tuổi 1, 2, 3, thu tại Sơn Nam, Sơn Dương, Tuyên Quang.
• Phạm vi thời gian: 2012–2017.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm tại Viện Công nghệ sinh học; thực địa tại vùng mía nguyên liệu Tuyên Quang.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước

Tái sinh in vitro cây mía: Nhiều công trình quốc tế đã xây dựng hệ thống tái sinh qua phôi soma trên các giống mía khác nhau: Geetha và Padmanabhan (2001) với giống CoSi 95071; Desai et al. (2004) với giống CoC 671; Suprasanna và Bapat (2006); Biradar et al. (2009); Basnayake et al. (2011) với 16 giống mía Australia; Kaur và Kapoor (2016) với CoJ64, CoJ83, CoJ86; Taparia et al. (2012) với CP 88-1762; Mayavan et al. (2013, 2015). Tại Việt Nam, các nghiên cứu chủ yếu tập trung nhân giống in vitro (Nguyễn Thị Nhẫn, 2006) và một số thử nghiệm chuyển gen gus, cry1Ab (Lưu Thị Cư et al., 2009; Phan Tường Lộc et al., 2012, 2014).

Chuyển gen vào cây mía: Phương pháp súng bắn gen được Bower và Birch (1992) sử dụng đầu tiên; phương pháp xung điện do Arencibia et al. (1997); chuyển gen qua A. tumefaciens do Arencibia et al. (1998) — đây là công trình đầu tiên tạo được dòng chuyển gen với một bản sao duy nhất. Các hướng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ (Gallo-Meagher, Irvine, 1996; Enríquez-Obregón et al., 1998; Leibbrandt, Snyman, 2003), kháng bệnh (Ingelbrecht et al., 1999; McQualter et al., 2004; Gilbert et al., 2005; Guo et al., 2015), kháng côn trùng cánh vảy và rệp (Arencibia et al., 1999; Braga et al., 2003; Zhangsun et al., 2007; Christy et al., 2009; Kalunke et al., 2009; Arvinth et al., 2010; Weng et al., 2011), kháng stress phi sinh học (Belintani et al., 2012; Rani et al., 2012; Kumar et al., 2014; Augustine et al., 2015) đều đã có công trình quốc tế.

Nhóm gen cry8 và bọ hung: Gen cry8 được phát hiện năm 1992 bởi Narva từ chủng Bt subsp. kumamotoensis. Đến năm 2011 xác định được 38 gen thuộc nhóm này. Liu et al. (2010) phân lập chủng BT185 mang gen cry8Ca2 kháng Holotrichia parallela và Anomala corpulenta. Shu et al. (2009a, 2009b) thiết kế gen cry8Ga1 từ chủng HBF-18. Yamaguchi et al. (2008, 2010, 2013) chứng minh cấu trúc 3D và hoạt lực của Cry8Db và Cry8Da. Tại Việt Nam, Lê Thị Minh Thành và đtg (2012) phân lập 78 chủng Bt, chuyển gen cry8Da vào thuốc lá, tạo cây kháng Anomala cuprea; Pham et al. (2015) chuyển gen cry8Db vào khoai lang kháng bọ hà.

Khoảng trống luận án giải quyết

Chưa có công trình nào chuyển gen cry8Db vào cây mía; chưa có nghiên cứu nào sử dụng song song quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro trên cùng một cây trồng để đối chiếu hiệu quả; chưa có đánh giá định lượng về độc lực của Cry8Db đối với Lepidiota signata Fabricius — loài bọ hung hại mía phổ biến tại Tuyên Quang.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Lý thuyết và khung phân tích

• Cơ chế gây độc của độc tố Cry: Protein tinh thể Cry hòa tan dưới tác động của men protease kiềm (pH 10) trong ruột sâu, gắn vào thụ thể glycoprotein trên màng tế bào thành ruột, tạo lỗ rò (kênh ion), phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu, dẫn đến tế bào phồng và phân hủy, sâu chết. Ion Mg++ đóng vai trò kích hoạt độc tố Cry (Pardo-López et al., 2013; Zhang et al.).
• Nguyên tắc cải biến codon (codon optimization): Tỷ lệ G-C của vi khuẩn Bt chỉ khoảng 37%, trong khi ở mía lên đến 55%. Tăng tỷ lệ G-C trong gen chuyển giúp tăng mức độ biểu hiện protein (Weng et al., 2006, 2011; Arvinth et al., 2010). Gen cry8Db trong luận án được cải biến mã bộ ba để tối ưu biểu hiện ở thực vật, dựa trên trình tự gen phân lập từ Bt chủng BT51 (mã số AB303980).
• Cơ chế chuyển gen qua Agrobacterium tumefaciens: Gen chuyển được định hướng gắn vào bộ gen thực vật theo cơ chế tự nhiên, tạo ít bản sao hơn so với súng bắn gen.
• Cấu trúc 3D protein Cry8Db: Gồm ba vùng (Domain I, II, III). Vùng II với cấu trúc 3 móc quyết định tính đặc hiệu với côn trùng họ Scarabaeidae, móc 2 quy định hoạt tính gây độc với pha trưởng thành (Yamaguchi et al., 2008).

Phương pháp thực nghiệm

Biểu hiện protein trong vi khuẩn:

• Vector pET-21a(+)/cry8Db biến nạp vào E. coli Rosetta–Gamy-B.
• Cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ở các nồng độ 0, 1, 10, 100 µM, 1 mM, 5 mM; ở các nhiệt độ 22°C, 28°C, 37°C; thời gian ủ 2, 4, 6 giờ và qua đêm.
• Tinh sạch protein qua cột Hitrap (sắc ký ái lực Ni-NTA), thẩm tích trong PBS qua đêm ở 4°C, lọc qua cột GE Healthcare PD-10 loại imidazole.
• Kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE 12% và Western blot: kháng thể sơ cấp anti-c-myc, kháng thể thứ cấp anti-mouse IgG cộng hợp HRP, cơ chất TMB.

Thử hoạt tính kháng ấu trùng (bioassay):

• Protein Cry8Db được trộn với dung dịch dinh dưỡng (nước deion + 20% sucrose + 10% cholesterol + 10% glucose + 10% casein) rồi trộn với mùn mía (tỷ lệ 1g:1mL) ở 4 nồng độ: 500, 250, 125, 62,5 ng/g.
• Mỗi công thức sử dụng 24 ấu trùng tương ứng 3 nhóm tuổi, mỗi cá thể nuôi trong hộp nhựa đường kính 12 cm, cao 5 cm; nhiệt độ 25°C, độ ẩm 60 ± 5%, chu kỳ sáng/tối 16h/8h.
• Thí nghiệm lặp lại 3 lần; theo dõi 14 ngày.
• Xác định LC50 bằng phần mềm Graphpad Prism (Yu et al., 2006; Palma et al., 2014).

Thiết kế vector chuyển gen:

• Gen cry8Db được cắt từ pBSK-cry8Db bằng cặp enzyme BamHI/SacI, ghép vào pBI121 thay thế gen gus, tạo cấu trúc CaMV35S/cry8Db/NOST.
• Cấu trúc này tiếp tục được cắt bằng EcoRI/SphI, ghép vào vector nhị thể pCAMBIA1300 tạo vector cuối cùng pCAMBIA1300/cry8Db.
• Phản ứng ghép nối dùng T4-ligase ở 22°C trong 1 giờ; kiểm tra bằng colony PCR và cắt enzyme hạn chế.

Hệ thống tái sinh in vitro:

• Khảo sát bốn con đường tái sinh: từ chồi đỉnh, chồi nách, cuộn lá non (tái sinh trực tiếp), và qua phôi soma.
• Môi trường nền: MS (Murashige, Skoog, 1962).
• Tái sinh qua phôi soma: tạo mô sẹo trên MS + 2,4-D (0–5 mg/L) trong tối; tạo phôi soma trên MS + 2,4-D nồng độ thấp (0,3–1,5 mg/L) trong tối; tái sinh chồi trên MS + kinetin 0,5 mg/L + BAP (0–2,5 mg/L); ra rễ trên MS + NAA (0–5 mg/L).
• Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, 30 mẫu/lần; xử lý số liệu bằng Data Analysis Microsoft Excel 2007.

Tối ưu quy trình chuyển gen in vitro:

• Khảo sát ngưỡng hygromycin chọn lọc (0, 25, 50, 75, 100 mg/L); thời gian tiền nuôi cấy (0–3 ngày); thời gian đồng nuôi cấy (1–5 ngày); mật độ vi khuẩn OD600 = 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; nồng độ acetosyringone (0, 25, 50, 100, 150 µM); kiểm tra bằng nhuộm X-gluc.
• Chủng vi khuẩn: A. tumefaciens EHA105 mang pCAMBIA1301 (gen gus, gen hpt) điều khiển bởi promoter CaMV35S.

Tối ưu quy trình chuyển gen ex vitro:

• Lây nhiễm trực tiếp vào chồi nách đoạn thân mía; xử lý siêu âm 6 phút, hút chân không 500 mmHg trong 2 phút, ngâm dịch khuẩn 5 giờ, đồng nuôi cấy trong tối 18 giờ.
• Chọn lọc: tưới hygromycin (0, 50, 100, 150, 200 mg/L) trong 42 ngày; phun hygromycin (0, 1000, 1500, 2000, 2500 mg/L) trong 7 ngày.
• Giá thể: Tribat.

Kiểm tra dòng mía chuyển gen cry8Db:

• PCR với cặp mồi đặc hiệu cry8Db-Frag-F/R (kích thước 760 bp) và cặp mồi 35S-F/35S-R (kích thước 314 bp).
• Định lượng protein Cry8Db tái tổ hợp bằng ELISA gián tiếp (Chen et al., 2006), kháng thể sơ cấp anti-c-myc, cơ chất TMB, đọc ở 450 nm, đường chuẩn dựng bằng protein scFv gắn đuôi c-myc.
• Western blot xác nhận sự có mặt và kích thước protein đích, phát hiện bằng Amersham ECL Prime.
• Thực nghiệm sinh học: mỗi chậu 10 cây mía chuyển gen (4–5 lá, cao 50–60 cm), thả 1 ấu trùng tuổi 1/cây, theo dõi 14 ngày; 30 cá thể/lần lặp, lặp lại 3 lần.

Nguồn vật liệu và dữ liệu

• Giống mía từ vùng nguyên liệu Nhà máy đường Sơn Dương, Tuyên Quang; ấu trùng Lepidiota signata Fabricius thu trực tiếp tại hiện trường, phân loại bởi TS. Lê Quang Khải, Viện Bảo vệ Thực vật.
• Gen cry8Db cải biến được tổng hợp tại Công ty MWG (Đức) và Epoch Life Science (Mỹ), dựa trên trình tự AB303980.
• Vector pBSK-cry8Db từ đề tài "Nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bọ hà bằng công nghệ gen" (chủ nhiệm: GS.TS. Lê Trần Bình); vector pCAMBIA1300, pCAMBIA1301, pBI121 từ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày nguồn gốc và đặc điểm phân loại cây mía — thuộc chi Saccharum, họ Gramineae, với sáu loài tổ tiên, trong đó S. officinarum L. (2n = 70–140, bộ gen 985 Mbp) và S. spontaneum L. (2n = 40–128, bộ gen 843 Mbp) là hai loài lai tạo nên giống thương mại ngày nay. Bảng tổng hợp đặc điểm di truyền và số liệu sản xuất mía thế giới được dẫn từ FAO (2013–2014):

Châu lục	Diện tích 2013 (ha)	Năng suất 2013 (tấn/ha)	Sản lượng 2013 (tấn)
Toàn thế giới	26 942 686	70,94	1 911 179 776
Châu Mỹ	13 968 445	74,28	1 037 591 125
Châu Á	11 033 670	67,71	747 075 443
Châu Phi	1 559 132	62,49	97 423 114
Châu Đại Dương	381 375	76,26	29 084 644
Châu Âu	64	85,16	5 450

Đối với Việt Nam, năng suất tăng từ 58,77 tấn/ha (2009) lên 64,99 tấn/ha (2014), sản lượng tăng từ 15,6 triệu tấn lên 19,8 triệu tấn. Chương cũng điểm lại toàn bộ kết quả tạo cây mía chuyển gen từ 1992–2015 (Bảng 1.5), hệ thống tái sinh in vitro (Bảng 1.4), đặc điểm cấu trúc nhóm gen cry8, và đặc điểm hình thái—phân bố—mức độ phá hại của Lepidiota signata Fabricius tại Sơn Nam, Sơn Dương, Tuyên Quang.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương mô tả toàn bộ vật liệu (giống mía, ấu trùng bọ hung, vector, chủng khuẩn, cặp mồi, hóa chất, thiết bị) và quy trình thực nghiệm theo sơ đồ tổng quát (Hình 2.1). Các cặp mồi chính được dùng là cry8Db-Frag-F/R (kích thước nhân bản 760 bp) và 35S-F/R (314 bp). Thiết bị chính: máy PCR Thermo Scientific, máy Nanodrop Lite, máy đo quang phổ Shimadzu, bộ điện di Biorad, thiết bị hấp khử trùng Hirayama. Điều kiện nuôi cấy mô chuẩn: 25 ± 2°C, 3000 lux, 16h sáng/8h tối, pH môi trường 5,6–5,8, khử trùng ở 117°C, 1,5 atm trong 15 phút.

Chương 3 (suy luận từ nội dung kết quả): Kết quả nghiên cứu

Biểu hiện và tinh sạch protein Cry8Db: Protein Cry8Db tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong E. coli Rosetta–Gamy-B. Kết quả Western blot xác nhận protein có kích thước phân tử khoảng 73 kDa. Protein tinh sạch được xác định có hoạt tính kháng ấu trùng Lepidiota signata Fabricius với các giá trị LC50 theo từng tuổi:

Giai đoạn ấu trùng	LC50 (ng/g)
Tuổi 1	183,5
Tuổi 2	270,8
Tuổi 3	345,4

Ấu trùng tuổi 1 mẫn cảm nhất với protein Cry8Db; LC50 tăng theo tuổi ấu trùng.

Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro: Trong ba giống mía khảo sát (ROC22, ROC10, QĐ21), giống có khả năng tái sinh qua phôi soma tốt nhất được chọn làm vật liệu chuyển gen. Hệ thống tái sinh qua phôi soma được thiết lập gồm bốn giai đoạn kế tiếp: tạo mô sẹo (MS + 2,4-D 1–5 mg/L, tối), tạo phôi soma (MS + 2,4-D nồng độ thấp, tối), tái sinh chồi (MS + kinetin 0,5 mg/L + BAP, sáng), ra rễ (MS + NAA, sáng). Môi trường tái sinh tối ưu bổ sung kinetin 0,5 mg/L và BAP ở nồng độ thích hợp (dựa vào công thức của Debax et al., 2013 cải biến).

Tối ưu quy trình chuyển gen: Các thông số tối ưu được xác định cho cả hai quy trình in vitro và ex vitro qua chỉ thị gen gus: ngưỡng hygromycin chọn lọc, mật độ vi khuẩn OD600, nồng độ acetosyringone, thời gian tiền nuôi cấy và đồng nuôi cấy. Quy trình ex vitro dựa theo Mayavan et al. (2015) có cải biến, sử dụng siêu âm và hút chân không để tăng hiệu suất lây nhiễm.

Tạo và đánh giá dòng mía chuyển gen cry8Db: Tổng cộng 13 dòng mía chuyển gen cry8Db được tạo ra. PCR với cặp mồi đặc hiệu xác nhận sự tích hợp gen chuyển. ELISA định lượng nồng độ protein Cry8Db tái tổ hợp trong lá mía:

Chỉ số	Giá trị
Số dòng chuyển gen tạo được	13
Nồng độ Cry8Db tái tổ hợp (dao động)	1,62 – 21,73 ng/µg protein tổng số

Western blot xác nhận sự hiện diện của protein đích ở các dòng có nồng độ ELISA cao. Thực nghiệm sinh học trên dòng mía chuyển gen S3 — dòng có khả năng kháng ấu trùng tốt nhất — cho thấy:

• Tỷ lệ bị phá hại: 12,91% (so với đối chứng cây không chuyển gen).
• Khối lượng ấu trùng bị giảm 2,85 lần sau 14 ngày.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự nêu bốn đóng góp mới như sau:

1. Chứng minh hoạt lực diệt ấu trùng của protein Cry8Db kích thước ~73 kDa đối với Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn phát triển khác nhau, với LC50 = 183,5 ng/g (tuổi 1), 270,8 ng/g (tuổi 2), 345,4 ng/g (tuổi 3).

2. Công trình đầu tiên sử dụng song song hai quy trình chuyển gen (in vitro và ex vitro) vào cây mía để tạo ra các dòng mía mang gen cry8Db.

3. Tạo được 13 dòng mía chuyển gen cry8Db; nồng độ protein tái tổ hợp dao động 1,62 – 21,73 ng/µg protein tổng số (kiểm tra bằng ELISA).

4. Thực nghiệm sinh học xác nhận dòng S3 có khả năng kháng ấu trùng Lepidiota signata Fabricius tốt nhất: tỷ lệ bị phá hại chỉ 12,91%, khối lượng ấu trùng giảm 2,85 lần sau 14 ngày.

Ý nghĩa thực tiễn được nêu: kết quả tạo protein tái tổ hợp Cry8Db quy mô phòng thí nghiệm và tạo dòng mía chuyển gen là cơ sở khoa học cho hướng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao khả năng kháng côn trùng gây hại ở cây mía, mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn tạo giống mía kháng côn trùng hại mía.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản không có mục riêng nêu hạn chế. Từ phạm vi nghiên cứu, có thể xác định một số giới hạn:

• Nghiên cứu mới đánh giá được 13 dòng mía chuyển gen thế hệ T0 trên ấu trùng tuổi 1 của một loài duy nhất (Lepidiota signata Fabricius tại Sơn Dương, Tuyên Quang); chưa có dữ liệu về tính ổn định di truyền qua các thế hệ tiếp theo.
• Thực nghiệm sinh học được thực hiện trong điều kiện nhà lưới, chưa có đánh giá ngoài đồng ruộng.
• Phạm vi loài bọ hung thử nghiệm giới hạn ở một loài; chưa đánh giá tác động lên các sinh vật không phải đích.
• Số dòng mía được kiểm tra đầy đủ bằng Southern blot (tính ổn định tích hợp gen) và mức độ biểu hiện protein qua nhiều vụ canh tác chưa được đề cập.

---

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo cho các nhóm đối tượng sau:

• Nghiên cứu sinh và nhà khoa học trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt các hướng: thiết kế vector nhị thể pCAMBIA, tối ưu hóa hệ thống tái sinh mía in vitro qua phôi soma, quy trình chuyển gen qua A. tumefaciens theo cả hai điều kiện in vitro và ex vitro. Bảng tổng hợp kết quả tái sinh mía 2001–2015 (Bảng 1.4) và kết quả tạo cây mía chuyển gen 1992–2015 (Bảng 1.5) có giá trị tra cứu tốt.
• Nhà khoa học nghiên cứu về Bt và nhóm gen cry8: Phần trình bày về cấu trúc 3D protein Cry8Db, phân loại nhóm gen cry8, và các dữ liệu LC50 trên L. signata Fabricius là thông tin có thể tham khảo trực tiếp.
• Cán bộ kỹ thuật và người làm chính sách trong ngành mía đường Việt Nam (đặc biệt khu vực Tuyên Quang và các tỉnh có bọ hung gây hại nặng) quan tâm đến biện pháp phòng trừ sinh học bền vững.
• Giảng viên các học phần Công nghệ gen thực vật, Nuôi cấy mô thực vật, Bảo vệ thực vật sinh học có thể dùng luận án làm tài liệu ví dụ về quy trình thực nghiệm toàn vẹn từ thiết kế vector đến thử hoạt tính sinh học.

Phần đáng tham khảo nhất: Chương Vật liệu và phương pháp (chi tiết quy trình thực nghiệm, các thông số tối ưu được xác định từ khảo sát hệ thống) và phần đóng góp mới về dữ liệu LC50 của Cry8Db trên L. signata.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án chọn gen cry8Db thay vì các gen cry8 khác đã có kết quả ứng dụng rộng hơn như cry8Ca2 hay cry8Ea1?

Gen cry8Db được Yamaguchi et al. (2008, 2010, 2013) chứng minh có hoạt lực tương đương cry8Da, đều diệt được côn trùng bộ Cánh cứng ở cả giai đoạn ấu trùng và trưởng thành. Trình tự nucleotide của gen đã được đăng ký trên ngân hàng Gen Quốc tế (mã số AB303980), thuận tiện cho việc tổng hợp và cải biến mã bộ ba. Ngoài ra, tại Việt Nam đã có bước đệm từ nghiên cứu của Lê Thị Minh Thành et al. (chuyển cry8Da vào thuốc lá) và Pham et al. (2015) (chuyển cry8Db vào khoai lang), tạo cơ sở kỹ thuật cho việc ứng dụng gen này vào cây mía.

2. Dòng mía S3 kháng bọ hung tốt nhất có nồng độ protein Cry8Db tái tổ hợp bao nhiêu và được xác định bằng phương pháp nào?

Nồng độ protein Cry8Db tái tổ hợp trong các dòng mía chuyển gen dao động từ 1,62 đến 21,73 ng/µg protein tổng số, được xác định bằng phương pháp ELISA gián tiếp (dựa theo Chen et al., 2006), sử dụng kháng thể sơ cấp kháng c-myc, kháng thể thứ cấp anti-mouse IgG cộng hợp HRP, đọc kết quả ở bước sóng 450 nm, đường chuẩn dựng bằng protein scFv gắn đuôi c-myc. Dòng S3 được xác nhận thêm bằng Western blot và cho kết quả tỷ lệ bị phá hại chỉ 12,91%, khối lượng ấu trùng giảm 2,85 lần sau 14 ngày thử nghiệm.

3. Ấu trùng tuổi 1 của Lepidiota signata Fabricius mẫn cảm với Cry8Db hơn tuổi 2 và tuổi 3 bao nhiêu lần dựa theo giá trị LC50?

Theo dữ liệu trong luận án: LC50 ấu trùng tuổi 1 = 183,5 ng/g; tuổi 2 = 270,8 ng/g; tuổi 3 = 345,4 ng/g. Ấu trùng tuổi 1 mẫn cảm hơn tuổi 2 khoảng 1,47 lần và hơn tuổi 3 khoảng 1,88 lần. Chỉ số LC50 được xác định bằng phần mềm Graphpad Prism.

4. Tại sao luận án sử dụng đồng thời hai quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro, và điểm khác biệt kỹ thuật cơ bản giữa hai quy trình là gì?

Hai quy trình được sử dụng song song để mở rộng khả năng tạo dòng chuyển gen và bổ sung nhược điểm của mỗi phương pháp. Quy trình in vitro dùng phôi soma làm thể nhận gen, thực hiện trong ống nghiệm với chọn lọc bằng hygromycin (25–100 mg/L); ưu điểm là kiểm soát chặt điều kiện lây nhiễm nhưng có thể phát sinh biến dị soma. Quy trình ex vitro lây nhiễm trực tiếp vào chồi nách của đoạn thân mía ngoài ống nghiệm (theo Mayavan et al., 2015 cải biến), xử lý thêm siêu âm 6 phút và hút chân không 500 mmHg trong 2 phút, chọn lọc bằng tưới và phun hygromycin nồng độ cao hơn (tưới: 50–200 mg/L, phun: 1000–2500 mg/L), không qua giai đoạn nuôi cấy mô dài, giảm nguy cơ biến dị soma.

5. Biện pháp phòng trừ bọ hung hại mía hiện tại có hiệu quả như thế nào trước khi có giải pháp chuyển gen, và tại sao cần phương pháp thay thế?

Theo Lê Quang Khải và đtg (2017), ba biện pháp đã được thử nghiệm: (i) thuốc Regent 0,3% đạt hiệu quả diệt Lepidiota signata Fabricius cao nhất 38,4% sau một tháng xử lý, nhưng sau 6 tháng không còn hiệu lực; (ii) thuốc Diazan 10H; (iii) chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae kéo dài hiệu lực nhưng chỉ đạt 26,7%. Như vậy không có biện pháp nào đạt hiệu quả dài hạn vượt 40%, trong khi bọ hung có thói quen sống và gây hại dưới đất, khó tiếp xúc với thuốc. Điều này tạo cơ sở để nghiên cứu tạo giống mía chuyển gen tự sản sinh độc tố Bt như một biện pháp phòng trừ bền vững hơn.

---

Kết luận

Luận án trình bày một quy trình thực nghiệm hoàn chỉnh từ đánh giá hoạt lực protein độc tố, thiết kế vector chuyển gen, xây dựng hệ thống tái sinh in vitro, tối ưu hóa điều kiện chuyển gen, đến kiểm tra phân tử và thực nghiệm sinh học trên cây mía. Kết quả xác định được giá trị LC50 của Cry8Db đối với Lepidiota signata Fabricius ở ba tuổi ấu trùng, tạo được 13 dòng mía chuyển gen cry8Db qua hai quy trình in vitro và ex vitro, và xác nhận dòng S3 có khả năng kháng ấu trùng với tỷ lệ phá hại 12,91% sau 14 ngày thử nghiệm trong điều kiện nhà lưới. Nghiên cứu cung cấp cơ sở kỹ thuật cho hướng tạo giống mía kháng bọ hung bằng công nghệ gen tại Việt Nam, tuy kết quả mới dừng ở quy mô phòng thí nghiệm và nhà lưới, cần được tiếp tục đánh giá về tính ổn định di truyền và hiệu quả ngoài đồng ruộng ở các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Tính cấp thiết của đề tài Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp đƣợc trồng rộng rãi nhất trên thế giới (Dotaniya, Datta, 2014; Choudhary et al., 2017) đƣợc canh tác ở 109 quốc gia với diện tích 26,9 triệu ha, sản lƣợng đạt 1,91 tỷ tấn (Factfish, 2015) ây m a đƣợc sử dụng vào nhiều mục đ ch: cung cấp thực phẩm: sucrose, fructose, mật m a; làm sợi: cung cấp vật liệu cenlullose, thức n gia súc: lá, thân đã đƣợc ép đƣờng; tạo n ng lƣợng: n ng lƣợng sinh học tái tạo từ rỉ đƣờng…; công nghiệp hóa chất: ethanol sinh học, chất mùn (Dotaniya et al. Việc cải thiện các đặc t nh nông sinh học ở cây m a đã đƣợc nghiên cứu trong những n m qua nhằm t ng trữ lƣợng đƣờng, t ng khả n ng chống ch u các điều kiện stress nhƣ: hạn hán, ngập, mặn, kháng sâu hại, thuốc diệt cỏ, nấm gây bệnh… Tuy nhiên do một số đặc thù của cây m a nhƣ: k ch thƣớc hệ gen lớn (985 Mbp), bộ nhi m sắc thể phức tạp (2n 70-140 , và sự tƣơng tác phức tạp của cây mía với các điều kiện môi trƣờng (Zhang et al., 2012)… khiến cho thời gian để tạo ra một giống mía mới theo phƣơng pháp truyền thống lên tới 10-12 n m Kỹ thuật chuyển gen có thể xem là phƣơng pháp tối ƣu nhất để tạo ra giống mía mới trong thời gian ngắn nhất. ây m a đƣợc biết là vật chủ của hơn 1500 loài côn trùng và 80 bệnh hại, trong đó đặc biệt gây hại trên diện rộng và khó kiểm soát là các loài bọ cánh cứng (bọ hung, xén tóc , sâu đục thân, rệp nhƣng phần lớn chúng thƣờng b giới hạn bởi sự phân bố đ a lý. Tuy nhiên, hiện nay sự phát triển của du l ch, thƣơng mại giữa các nƣớc cùng với thay đổi điều kiện khí hậu làm t ng nguy cơ sâu bệnh hại xâm nhập và bùng phát trong nhiều hệ thống nông nghiệp, trong đó sâu bệnh gây hại trên mía ngày càng khó kiểm soát.

Khả n ng th ch ứng của một số loài gây hại và xâm nhập vào các khu vực trồng mía rất nhanh, gây thiệt hại đặc biệt nghiêm trọng. ôn trùng bọ cánh cứng ảnh hƣởng xấu đến n ng suất cây mía vì chúng phá hoại m a ở giai đoạn ấu trùng và trƣởng thành Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen biểu hiện protein độc tố diệt côn trùng gây hại của Bt đã phát triển trên khắp thế giới từ n m 1996. Việc tạo ra cây trồng biến đổi 2 gen là bƣớc đột phá nhằm: (i): giảm thiểu tác hại của thuốc trừ sâu hóa học, (ii): t ng cƣờng hiệu quả, t nh đặc hiệu trong diệt trừ sâu đ ch; (iii): giảm chi phí, ít ảnh hƣởng tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và các loài sinh vật khác (James, 2014). Ở Việt Nam, cây m a cũng là một trong số các cây trồng ch u sự phá hoại lớn từ côn trùng thuộc Bộ cánh cứng trong đó có họ bọ hung Scarabaeidae.

Ấu trùng bọ hung thƣờng đục thân, phá hoại r , còn giai đoạn trƣởng thành chúng n các bộ phận nhƣ thân, lá cây m a Sự phá hại do bọ hung gây ra có thể làm chết cây hoặc giảm đáng kể n ng suất cây m a (Shu et al. Kết quả nghiên cứu cho thấy, không có giống mía nào hệ gen tự nhiên mang gen biểu hiện t nh kháng côn trùng gây hại (James, 2014). Vì vậy, việc tạo giống m a chuyển gen có khả n ng kháng côn trùng nói chung và bọ hung nói riêng đang là vấn đề cấp thiết hiện nay Nhóm protein ry8 là một trong những nhóm protein độc tố Bt đƣợc mã hóa bởi các gen thuộc họ cry8 đã đƣợc chứng minh có độc t nh với ấu trùng của bọ cánh cứng trong đó có bọ hung (Zhang et al. ho đến nay, cây mía chuyển gen chủ yếu đƣợc tạo ra nhờ sử dụng hai phƣơng pháp ch nh là súng bắn gen và chuyển gen đ ch thông qua A.

Với điều kiện thực tế ở Việt Nam, sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen thực vật là phƣơng pháp đơn giản và mang lại hiệu quả cao Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực ti n, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hu n g n r D t nh kháng n tr ng v o m ”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc các dòng m a chuyển gen cry8Db có hoạt t nh kháng ấu trùng bọ hung hại m a 3. Nội dung nghiên cứu 1.

Đánh giá thiệt hại bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài bọ hung điển hình của Cry8Db tái tổ hợp. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen chuyển cry8Db. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây m a 4. Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A.

Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện gen cry8Db. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Kết quả đạt đƣợc của luận án có giá tr khoa học và thực ti n trong tiếp cận nghiên cứu t ng cƣờng khả n ng kháng bọ hung hại m a bằng kỹ thuật chuyển gen thông qua A.Ý nghĩ lý luận Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và thực nghiệm tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen Bt. Ý nghĩ thực tiễn 1. Tạo đƣợc protein tái tổ hợp Cry8Db quy mô phòng thí nghiệm thông qua vi khuẩn E.coli Rosetta - amy B, chứng minh đƣợc protein tinh sạch có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius – một loài thuộc họ bọ hung hại m a thu đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang.

Tạo đƣợc các dòng mía chuyển gen cry8Db có khả n ng biểu hiện độc tố có tính kháng ấu trùng bọ hung thu thập đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hƣớng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao khả n ng kháng côn trùng gây hại ở cây m a, mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực ti n tạo giống m a kháng côn trùng hại m a 5. Đóng góp mới của luận án 1. Đã chứng minh đƣợc protein ry8 b k ch thƣớc phân tử khoảng 73 K a có khả n ng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau. Đối với ấu trùng tuổi 1, nồng độ gây chết 50% số cá thể là LC50 = 183,5 ng/g, ấu trùng tuổi 2 LC50 = 270,8 ng/g và ấu trùng tuổi 3 nồng độ này ở ngƣỡng cao nhất với giá tr LC50 = 345,4 ng/g.

Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song 2 quy trình chuyển gen vào cây m a (trong điều kiện in vitro và ex vitro để tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8Db. ông trình đã tạo đƣợc 13 dòng m a chuyển gen cry8Db. Protein Cry8Db ở các dòng mía chuyển gen đã đƣợc kiểm tra bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ protein tái tổ hợp ở các dòng mía chuyển gen dao động từ 1.62 - 21,73 ng/µg protein tổng số. Thử nghiệm sinh học cho thấy dòng m a chuyển gen S3 có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius tốt nhất với tỷ lệ b phá hại thấp (12,91% , khối lƣợng ấu trùng b giảm 2,85 lần sau 14 ngày.

4 ƯƠ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. guồn gốc và vị trí phân loại Cây mía (Saccharum officinarum Linn.) trồng hiện nay thuộc chi Saccharum, họ Gramineae, lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật hạt kín (Magnoliophyta) (Đ N ng V nh, 2006). Việc phân loại cây mía gặp rất nhiều vấn đề phức tạp, vì ngoài chi Saccharum còn có các chi khác thuộc cùng một nhóm giao phấn gọi là „„phức hợp Saccharum” bao gồm: Erianthus, Ripidium, Miscanthus, Diandra, Narenga và Sclerostachya (Office of Gene Technology Regulator, 2011). Chi Saccharum gồm có sáu loài khác nhau: S.

Trong số này, S. (loài hoang dại với bộ NST thể d bội đƣợc cho là tổ tiên của mía trồng ngày nay (Sandhu et al. Các giống m a thƣơng mại ngày nay là con lai giữa S. (chiếm 10–20% hệ gen) (Hoarau et al.1: C c loài mía tổ ti n của c c giống mía th ng mại ngày nay A: Loài S.

đƣợc phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới ở châu và châu Phi, có môi trƣờng sống đa dạng Đây là một loài trong tự nhiên có hình thái biến đổi, có thể rậm ngắn hoặc cao lớn (có thể cao tới 5 m Hầu hết loài S. spontaneum L có lá và cuống lá mỏng, hàm lƣợng đƣờng thấp, và tỷ lệ xơ cao (Aditya, Jitendra, 2014) ác ngành công nghiệp m a đƣờng trên thế giới đã thuần hóa và phát triển các giống m a thuộc loài S. officinarum L , đặc trƣng của loài này là hàm lƣợng đƣờng cao, lƣợng xơ thấp, dày cuống và lá rộng và có nguồn gốc từ New uinea hoặc Melanesian (Grivet et al. Đặc điểm h nh th i sinh th i và di truyền Đặc điểm hình thái M a là cây một lá mầm, thân thảo Thân m a là nguyên liệu chế biến đƣờng và làm giống cho vụ sau Trên biểu bì thân m a có chứa nhiều chlorophin và xantophin hợp thành màu sắc đặc trƣng của từng giống m a iữa các dóng thân là các đốt m a chứa bốn bộ phận gồm đai sinh trƣởng, r , chồi bên và sẹo lá Trên thân có các bẹ lá bao bọc, lá mọc thành hai hàng so le, đối nhau hoặc theo đƣờng vòng trên thân m a Là thực vật thuộc nhóm 4, lá m a dài 1-2 m, rộng 5 -7 cm (Taparia et al.