Luận án về chuyển gen cry8db và khả năng kháng của cây mía

Luận án nghiên cứu chuyển gen cry8db vào cây mía nhằm nâng cao khả năng kháng sâu bệnh, góp phần cải thiện năng suất và chất lượng cây trồng.

• Trường học: Trường Đại Học Nông Nghiệp
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Chuyển Gen Cry8Db Vào Cây Mía Để Tăng Cường Khả Năng Kháng
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại
• 1.2. Đặc điểm hình thái sinh thái và di truyền
• 1.3. Giá trị của cây mía và tình hình sản xuất mía đường
• 1.4. Bọ hung hại mía và biện pháp phòng trừ

Tóm tắt

I. Tính cấp thiết của đề tài

Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp được trồng rộng rãi nhất trên thế giới, với diện tích canh tác lên tới 26,9 triệu ha và sản lượng đạt 1,91 tỷ tấn. Cây mía không chỉ cung cấp thực phẩm như sucrose và fructose mà còn là nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Tuy nhiên, cây mía đang phải đối mặt với nhiều thách thức từ sâu bệnh, đặc biệt là các loài bọ cánh cứng. Việc cải thiện khả năng kháng của cây mía thông qua kỹ thuật chuyển gen là cần thiết để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Kỹ thuật chuyển gen, đặc biệt là việc chuyển gen cry8db, có thể giúp tạo ra giống mía mới có khả năng kháng sâu bệnh hiệu quả hơn, từ đó giảm thiểu sự phụ thuộc vào thuốc trừ sâu hóa học.

II. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8db có khả năng kháng ấu trùng bọ hung. Nghiên cứu sẽ đánh giá thiệt hại do bọ hung gây ra trên cây mía và thử nghiệm hoạt tính kháng của protein độc tố cry8db. Việc thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen cry8db sẽ được thực hiện, cùng với việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây mía. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua Agrobacterium tumefaciens cũng là một phần quan trọng trong nghiên cứu này.

III. Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm việc đánh giá thiệt hại do bọ hung gây ra trên cây mía và thử nghiệm hoạt tính kháng của protein độc tố cry8db. Nghiên cứu sẽ thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen cry8db và xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây mía. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua Agrobacterium tumefaciens sẽ được thực hiện để đánh giá khả năng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện gen cry8db. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen.

IV. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong việc nâng cao khả năng kháng bọ hung hại mía bằng kỹ thuật chuyển gen. Nghiên cứu cung cấp cơ sở lý luận cho việc phát triển giống mía kháng sâu bệnh, từ đó góp phần vào việc cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc tạo ra protein tái tổ hợp Cry8Db có khả năng kháng ấu trùng bọ hung sẽ mở ra triển vọng mới trong ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp. Kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo vệ cây trồng mà còn giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường từ việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học.

V. Đóng góp mới của luận án

Luận án đã chứng minh được protein Cry8Db có khả năng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau. Nghiên cứu đã tạo ra 13 dòng mía chuyển gen cry8db và kiểm tra nồng độ protein tái tổ hợp bằng phản ứng ELISA. Kết quả cho thấy dòng mía chuyển gen S3 có khả năng kháng ấu trùng tốt nhất với tỷ lệ phá hại thấp. Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song hai quy trình chuyển gen vào cây mía, mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc tạo giống mía kháng côn trùng hại mía.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Cây mía (Saccharum officinarum L.) là cây công nghiệp lấy đường chủ lực trên quy mô toàn cầu, được canh tác tại 109 quốc gia với tổng diện tích 26,9 triệu ha và sản lượng đạt 1,91 tỷ tấn (Factfish, 2015; Dotaniya & Datta, 2014). Mía cung cấp tới 80% sản lượng đường sucrose thương mại và đóng vai trò nền tảng cho ngành nhiên liệu sinh học thế hệ mới (ethanol sinh học, cellulose, vật liệu ép sinh học). Tuy nhiên, đặc thù hệ gen cây mía vô cùng phức tạp: kích thước hệ gen lớn lên tới 985 Mbp, trạng thái đa bội thể cực kỳ phức tạp (2n = 70–140) đan xen giữa tự đa bội (autopolyploid) và dị đa bội (allopolyploid) (Zhang et al., 2012; Đỗ Năng Vịnh, 2006). Hệ quả là công tác chọn tạo giống mía bằng phương pháp lai hữu tính truyền thống đòi hỏi chu kỳ kéo dài từ 10 đến 12 năm và gặp phải rào cản phân ly di truyền khó kiểm soát.

Song song với thách thức di truyền, mía là vật chủ của hơn 1500 loài côn trùng và 80 loại bệnh hại trên thế giới. Trong đó, bọ cánh cứng thuộc họ bọ hung (Coleoptera: Scarabaeidae) là tác nhân dịch hại trong đất nguy hiểm bậc nhất, gây suy giảm từ 15–20% năng suất tại Trung Quốc (Luo et al., 2008) và lên tới 39% tại Hoa Kỳ (FAOSTAT). Tại Việt Nam, loài bọ hung Lepidiota signata Fabricius (ấu trùng đục rễ và thân ngầm, trưởng thành ăn lá và thân) tại các vùng mía nguyên liệu trọng điểm như Sơn Nam, Sơn Dương (Tuyên Quang) với mật độ đỉnh điểm đạt 3,33 con/m² vào tháng 12 (Lê Quang Khải et al., 2017) đã gây thiệt hại nghiêm trọng. Nghiên cứu thực nghiệm chứng minh: "kết quả nghiên cứu cho thấy, không có giống mía nào hệ gen tự nhiên mang gen biểu hiện tính kháng côn trùng gây hại" (James, 2014). Biện pháp hóa học (Regent 0,3% hiệu lực diệt trừ đạt 38,4% sau 1 tháng nhưng mất tác dụng sau 6 tháng) hay nấm sinh học Metarhizium anisopliae (chỉ đạt hiệu lực 26,7%) đều bộc lộ hạn chế lớn về tính bền vững và an toàn sinh thái.

Xuất phát từ khoảng trống khoa học đó, luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học / Di truyền học Thực vật thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen cry8Db mang tính kháng côn trùng vào mía”. Nghiên cứu thiết lập hệ thống câu hỏi và giả thuyết khoa học:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Protein độc tố tái tổ hợp Cry8Db có hoạt tính gây độc đặc hiệu và ngưỡng gây chết đối với các tuổi ấu trùng bọ hung Lepidiota signata Fabricius ở mức độ nào?
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 mang cấu trúc gen cry8Db được tối ưu hóa codon có đảm bảo khả năng tích hợp và biểu hiện ổn định trong mô mía?
3. Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Quy trình tái sinh và chuyển gen in vitro qua phôi soma (somatic embryogenesis) kết hợp quy trình chuyển gen ex vitro qua chồi nách qua trung gian Agrobacterium tumefaciens đạt hiệu suất tối ưu dưới các thông số kỹ thuật nào?
4. Giả thuyết khoa học 1 (H1): Độc tố protein Cry8Db (73 kDa) có độc lực cao làm rối loạn tính thấm màng ruột giữa của ấu trùng L. signata, với giá trị LC50 phân hóa rõ rệt theo các giai đoạn tuổi sinh trưởng.
5. Giả thuyết khoa học 2 (H2): Các dòng mía chuyển gen biểu hiện protein độc tố Cry8Db ngoại lai có khả năng kháng cắn phá và làm suy giảm sinh trưởng khối lượng của ấu trùng bọ hung vượt trội so với đối chứng không chuyển gen.

Nghiên cứu được triển khai dựa trên khung lý thuyết chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens, thuyết tối ưu hóa mã bộ ba di truyền (Codon Optimization Theory), và cơ chế thẩm thấu keo làm tan vỡ tế bào ruột côn trùng của nội độc tố tinh thể δ-endotoxin (Pore-Forming Toxin Model). Đột phá của luận án là lần đầu tiên thiết lập thành công quy trình chuyển gen song song in vitro và ex vitro mang gen cry8Db vào mía, tạo ra 13 dòng mía chuyển gen T0 với hàm lượng protein Cry8Db đạt từ 1,62 đến 21,73 ng/µg protein tổng số, đặc biệt dòng S3 làm giảm tỷ lệ bị phá hại xuống chỉ còn 12,91% và giảm 2,85 lần khối lượng ấu trùng sau 14 ngày khảo nghiệm.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu ứng dụng độc tố Bacillus thuringiensis (Bt) kiểm soát sâu hại cây trồng bắt đầu bùng nổ từ năm 1996, giúp giảm thiểu thuốc trừ sâu hóa học, tăng cường tính đặc hiệu sinh thái và bảo vệ sức khỏe con người (James, 2014). Các protein diệt côn trùng của Bt bao gồm nhóm Cry (Crystal δ-endotoxins), Cyt (Cytolysins) và Vip (Vegetative Insecticidal Proteins) (Crickmore, 2016; Bravo et al., 2011). Tuy nhiên, phần lớn các công trình chuyển gen Bt trên cây mía trong hơn hai thập kỷ qua tập trung gần như tuyệt đối vào côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera - sâu đục thân) bằng các gen cry1A, cry1Aa3, cry1Ab, cry1Ac (Arencibia et al., 1999; Braga et al., 2003; Kalunke et al., 2009; Weng et al., 2011; Phan Tường Lộc et al., 2012, 2014) hoặc kháng rệp bộ Cánh nửa qua gen gna (Zhangsun et al., 2007). Nhóm gen cry8 chuyên biệt kháng côn trùng bộ Cánh cứng (Coleoptera: Scarabaeidae) là đối tượng nghiên cứu vô cùng phức tạp, khó phân lập và chưa từng được công bố chuyển thành công trên cây mía.

Trong y văn thế giới, tồn tại hai luồng quan điểm và phương pháp luận đối nghịch về công nghệ chuyển gen trên cây mía:

• Quan điểm chuyển gen trực tiếp (Biolistics/Súng bắn gen & Xung điện): Đại diện bởi Bower & Birch (1992), Ingelbrecht et al. (1999), Christy et al. (2009), Basnayake et al. (2011). Luồng tiếp cận này cho rằng bắn gen khắc phục được tính trơ sinh học của thực vật một lá mầm (monocots) đối với vi khuẩn. Tuy nhiên, nhược điểm chí mạng là xử lý vật lý gây tổn thương mô tế bào nghiêm trọng, tỷ lệ tái sinh thấp, gen ngoại lai chèn ngẫu nhiên tạo nhiều bản sao (multiple copies), dễ dẫn đến hiện tượng bất hoạt gen (gene silencing) và bất ổn định di truyền ở các thế hệ sau.
• Quan điểm chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens: Đại diện bởi Arencibia et al. (1998), Elliott et al. (1998), Mayavan et al. (2013, 2015). Luồng tiếp cận này khai thác cơ chế chuyển T-DNA tự nhiên, cho phép gen đích gắn định hướng với số lượng bản sao thấp (thường là đơn bản sao - single copy), chi phí thấp, ít biến dị soma. Khó khăn là cây mía tiết nhiều hợp chất phenolic gây độc cho khuẩn và mô cấy.

Về mặt so sánh quốc tế, các nghiên cứu về nhóm gen cry8 đa phần chỉ dừng lại ở phạm vi biểu hiện trên vi khuẩn hoặc cây mô hình:

• Nghiên cứu của Liu et al. (2010) và Li et al. (2014) tại Trung Quốc: Liu et al. (2010) tích hợp gen cry8Ca2 vào chủng Bt BIOT185 tạo protein 130 kDa diệt Anomala corpulenta và Holotrichia parallela. Li et al. (2014) phân lập chủng Bt Q52-7 mang gen cry8Na1 (GenBank HM640939, protein 132,5 kDa) với hoạt lực gây chết ấu trùng H. parallela. Cả hai nghiên cứu chỉ dừng ở mức chế phẩm sinh học vi khuẩn mà chưa tích hợp vào hệ gen cây trồng kinh tế.
• Nghiên cứu của Asano et al. (2005) tại Nhật Bản và Paula et al. (2010), Bauer et al. (2011) tại Hoa Kỳ: Asano et al. đăng ký bằng sáng chế (US6962977B2) chuyển gen cry8Da vào cỏ voi (Agrostis palustris) bằng súng bắn gen kháng Anomala cuprea. Paula et al. (2010) và Bauer et al. (2011) (Patent US20110136731) nghiên cứu chuyển cry8Da vào cây gỗ tần bì chống bọ cánh cứng Agrilus planipennis.
• Nghiên cứu của Mayavan et al. (2015) tại Ấn Độ: Sử dụng chủng A. tumefaciens EHA105 mang cấu trúc pCAMBIA1301-bar-hpt biến nạp ex vitro vào chồi nách của 5 giống mía (Co 62175, Co 6304, Co 8021, Co 86032, Co 6907), mở ra hướng tiếp cận chuyển gen ngoài ống nghiệm nhằm triệt tiêu biến dị soma.

Luận án định vị chính xác khoảng trống khoa học: Chưa có công trình nào trên thế giới thực hiện chuyển gen cry8Db (nguồn gốc từ Bt chủng BBT2-5, GenBank AB303980) vào hệ gen cây mía nhằm kháng loài bọ hung Lepidiota signata Fabricius; đồng thời chưa có hệ thống đánh giá so sánh trực tiếp song song hiệu quả giữa quy trình chuyển gen in vitro (qua phôi soma) và quy trình chuyển gen ex vitro (qua chồi nách đoạn thân) trên các giống mía thương mại chủ lực tại Việt Nam.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và đóng góp sâu sắc vào ba nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và di truyền thực vật:

1. Thuyết biểu hiện gen dị tuyển và tối ưu hóa mã bộ ba (Codon Optimization Theory): Đóng góp lý thuyết của Weng et al. (2006, 2011) và Estruch et al. (1997) chỉ ra rằng vi khuẩn Bt có tỷ lệ GC chỉ ~37%, trong khi hệ gen cây mía có tỷ lệ GC lên tới 55%. Sự sai lệch hàm lượng GC và thiên vị sử dụng codon (codon bias) dẫn đến việc cấu trúc chromatin bị ngưng tụ bởi vùng giàu AT, cản trở phiên mã và phân giải sớm mRNA trong tế bào chất thực vật. Luận án đã củng cố lý thuyết này bằng việc biến nạp thành công cấu trúc gen cry8Db đã được tái thiết kế nâng cao tỷ lệ GC và tối ưu hóa codon thực vật, giúp protein Cry8Db tích lũy ổn định trong lá mía với nồng độ cao đạt 21,73 ng/µg protein tổng số.
2. Thuyết cơ chế tác động độc tố hình thành lỗ rò (Pore-Forming Toxin & Colloid-Osmotic Lysis Model): Dựa trên mô hình cấu trúc 3D của Bravo et al. (2011), Palma et al. (2014) và Yamaguchi et al. (2008, 2010), protein độc tố Cry8Db gồm 3 domain chức năng riêng biệt: Domain I (bó 7 chuỗi xoắn alpha) chịu trách nhiệm đâm xuyên màng; Domain II (3 cấu trúc vòng loop lặp lại) quyết định tính đặc hiệu gắn kết với thụ thể glycoprotein bề mặt màng vi nhung mao ruột giữa (midgut brush border membrane vesicles - BBMV); Domain III (chuỗi gấp nếp beta sandwich) bảo vệ phân tử protein. Nghiên cứu thực nghiệm của luận án bổ sung bằng chứng sinh học phân tử xác nhận vòng loop 2 và loop 3 của Domain II protein Cry8Db (kích thước ~73 kDa) tương tác đặc hiệu tuyệt đối với hệ tiêu hóa có môi trường kiềm (pH ~10) của ấu trùng Lepidiota signata Fabricius dưới sự hoạt hóa của enzyme protease kiềm và ion Mg²⁺, phá vỡ gradient điện hóa và áp suất thẩm thấu màng tế bào.
3. Thuyết phát sinh phôi soma và tính toàn năng tế bào thực vật (Somatic Embryogenesis & Plant Cell Totipotency): Kế thừa công trình kinh điển của Murashige & Skoog (1962), Ho & Vasil (1983) và Kaur & Kapoor (2016), luận án đã mô hình hóa động học biệt hóa tế bào mô sẹo mía từ cuộn lá non thành 3 phân nhóm hình thái riêng biệt, chứng minh chỉ có dạng mô sẹo loại III (màu vàng sáng, kết cấu xốp hạt, chứa cấu trúc phôi hình cầu màu trắng đục) mới sở hữu năng lực toàn năng để tái sinh đa chồi chuyển gen thành công.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp một cách đa tầng giữa Công nghệ Sinh học Vi sinh, Kỹ thuật Tái tổ hợp DNA, Nuôi cấy Mô Tế bào Thực vật và Khảo nghiệm Độc học Sinh thái (Ecotoxicology Bioassay):

• Tầng 1 - Biểu hiện và thẩm định độc học protein đích in vitro: Gen cry8Db được nhân dòng và biểu hiện trong hệ thống vector pET-21a(+) mang đuôi His-tag trên chủng Escherichia coli Rosetta-gamy B. Tinh sạch qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA, thẩm tách loại bỏ độc tính của Imidazole qua cột PD-10 (Palma et al., 2014), thẩm định kích thước phân tử 73 kDa bằng SDS-PAGE và lai miễn dịch Western blot (Burnette, 1981; Laemmli, 1970). Khảo nghiệm sinh học xác định đường cong liều lượng - đáp ứng và chỉ số LC50 theo mô hình Probit Analysis trên phần mềm GraphPad Prism.
• Tầng 2 - Thiết kế cấu trúc vector nhị thể thực vật pCAMBIA1300/cry8Db: Tích hợp đoạn biểu hiện hoàn chỉnh gồm promoter CaMV35S mạnh, khung đọc mở gen cry8Db, terminator NOST và gen chỉ thị chọn lọc hpt (kháng Hygromycin B).
• Tầng 3 - Tối ưu hóa đa biến chuyển gen in vitro và ex vitro: Phân tích tương tác giữa các yếu tố: mật độ quang vi khuẩn (OD600), nồng độ chất cảm ứng phenolic Acetosyringone, thời gian tiền nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy (co-cultivation), áp suất hút chân không kết hợp sóng siêu âm (Sonication & Vacuum Infiltration), và áp lực chọn lọc kháng sinh hai pha.
• Tầng 4 - Thẩm định phân tử và thử nghiệm kháng sâu in vivo: Kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng phản ứng PCR cặp mồi đặc hiệu (cry8Db-Frag_F/R tạo sản phẩm 760 bp; 35S-F/R tạo sản phẩm 314 bp), định lượng protein ngoại lai bằng ELISA gián tiếp kháng c-myc (Chen et al., 2006; Bradford, 1976), khẳng định biểu hiện bằng Western blot với cơ chất phát quang hóa học Amersham ECL Prime, và thử nghiệm sinh học lây nhiễm nhân tạo ấu trùng L. signata tuổi 1 ngoài nhà lưới (Gao et al., 2016).

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích: Hoạt tính độc lực của gen cry8Db có tính đặc hiệu cao với ấu trùng bộ Cánh cứng trong đất, không gây ức chế đối với các loài côn trùng không phải đối tượng mục tiêu (non-target insects); hiệu quả chuyển gen phụ thuộc chặt chẽ vào kiểu gen của 3 giống mía khảo nghiệm (ROC22, ROC10, QĐ21).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu theo đuổi trường phái nhận thức luận thực chứng thực nghiệm (Positivism & Empirical Scientific Stance), sử dụng thiết kế đa phương pháp định lượng và thực nghiệm sinh học đối chứng ngẫu nhiên hoàn toàn (Completely Randomized Design - CRD). Thiết kế nghiên cứu bao gồm hai trục song song:

1. Trục công nghệ chuyển gen in vitro (qua phôi soma): Khảo sát 3 nguồn mẫu cấy khởi đầu gồm đỉnh sinh trưởng, chồi nách và bản mỏng cuộn lá non (1–9 cm tính từ đỉnh) của 3 giống mía (ROC22, ROC10, QĐ21) 4–6 tháng tuổi thu thập từ vùng nguyên liệu Nhà máy Đường Sơn Dương, Tuyên Quang.
2. Trục công nghệ chuyển gen ex vitro (qua chồi nách đoạn thân): Ứng dụng kỹ thuật vi xâm lấn cơ học (mechanical microwounding) kết hợp siêu âm và thẩm thấu chân không để đưa vi khuẩn A. tumefaciens trực tiếp vào mô phân sinh chồi nách, loại bỏ hoàn toàn giai đoạn mô sẹo in vitro.

Quy mô mẫu nghiên cứu: Mọi công thức thí nghiệm nuôi cấy mô, biến nạp và chọn lọc kháng sinh đều được bố trí với dung lượng mẫu N = 30 mẫu/lần thí nghiệm, lặp lại độc lập 3 lần (tổng số 90 mẫu/công thức). Thí nghiệm thử hoạt tính protein Cry8Db tinh sạch sử dụng 24 ấu trùng/tuổi/nồng độ, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm lây nhiễm sâu hại trên cây mía chuyển gen ngoài nhà lưới sử dụng 10 cây/chậu, 1 ấu trùng/cây, lặp lại 3 lần (30 cây/dòng chuyển gen).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn sinh học phân tử quốc tế:

• Quy trình tạo protein tái tổ hợp và tinh sạch: Vector pET-21a(+)/cry8Db được biến nạp vào E. coli Rosetta-gamy B. Cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ở thang nồng độ (0 µM, 1 µM, 10 µM, 100 µM, 1 mM, 5 mM) tại các ngưỡng nhiệt độ 22°C, 28°C, 37°C trong các khoảng thời gian 2, 4, 6 giờ và qua đêm. Tế bào được siêu âm phá vỡ, ly tâm 13.000 rpm ở 4°C, dịch chiết tinh sạch qua cột Ni-NTA, dung giải bằng đệm chứa 250 mM Imidazole (pH 8,0), sau đó khử Imidazole bằng cột GE Healthcare PD-10 và thẩm tách trong đệm PBS qua đêm.
• Thiết kế vector nhị thể chuyển gen: Phân đoạn gen cry8Db từ vector pBSK-cry8Db được cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và SacI, gắn vào vector pBI121 thay thế gen gus dưới sự xúc tác của T4 DNA ligase. Sau đó đoạn cấu trúc CaMV35S/cry8Db/NOST được cắt bằng EcoRI và SphI, tinh sạch gel qua kit AccuPrep® Gel Purification và ghép nối vào vector pCAMBIA1300 mở vòng, biến nạp vào E. coli DH5α và A. tumefaciens EHA105.
• Quy trình tái sinh và chuyển gen in vitro: Mẫu cuộn lá non được cảm ứng tạo mô sẹo trên môi trường MS bổ sung 2,4-D (0, 1, 2, 3, 4, 5 mg/L) trong tối hoàn toàn ở 25 ± 2°C trong 3 tuần. Cụm mô sẹo phôi hóa chuyển sang môi trường MS bổ sung 2,4-D nồng độ thấp (0,3 đến 1,5 mg/L) tạo phôi soma. Biến nạp gen qua A. tumefaciens EHA105 mang vector pCAMBIA1301 (gus/hpt) hoặc pCAMBIA1300 (cry8Db/hpt) với mật độ quang vi khuẩn OD600 = 0,25–1,25; Acetosyringone (0, 25, 50, 100, 150 µM); tiền nuôi cấy 0–3 ngày; đồng nuôi cấy 1–5 ngày. Phôi soma chuyển sang môi trường chọn lọc chứa Hygromycin B (50 mg/L) và Cefotaxime (500 mg/L). Tái sinh chồi trên môi trường MS + BAP (1,0 mg/L) + Kinetin (0,5 mg/L), ra rễ trên MS + NAA (3,0 mg/L) + sucrose 30 g/L.
• Quy trình chuyển gen ex vitro: Đoạn thân chứa chồi nách khử trùng bằng Carbendazim 1% (1 giờ), chọc tổn thương mắt ngủ 5 vị trí (sâu 1 mm) bằng kim vô trùng. Ngâm dịch khuẩn A. tumefaciens (OD600 = 0,75, 100 µM Acetosyringone, 0,1% Silwet L-77), siêu âm 6 phút, hút chân không 500 mmHg trong 2 phút, ngâm 5 giờ và đồng nuôi cấy 18 giờ trong tối. Rửa khuẩn bằng Cefotaxime 500 mg/L, trồng trên giá thể Tribat, chọn lọc 2 giai đoạn: tưới Hygromycin B (100–150 mg/L) trong 42 ngày, tiếp nối bằng phun Hygromycin B (1500–2000 mg/L) trong 7 ngày.

Data và phân tích

• Kiểm định độ tin cậy và giá trị nội tại: Phân tích biểu hiện GUS được thực hiện bằng thuốc thử sinh hóa nhuộm màu X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid) theo Jefferson et al. (1987). Kiểm tra di truyền phân tử bằng PCR với chu trình nhiệt chuẩn hóa trên máy Thermo Scientific Mastercycler: 94°C (5 phút); 30 chu kỳ [94°C (20–30 giây), 58°C (20–30 giây), 72°C (50–60 giây)]; 72°C (4–7 phút).
• Định lượng protein ngoại lai bằng ELISA gián tiếp: Xây dựng đường chuẩn tuyến tính chuẩn hóa từ protein scFv-c-myc ở các thang nồng độ 500 ng/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL, 4 µg/mL, 8 µg/mL. Protein tổng số chiết từ 200 mg lá mía tươi trong đệm Carbonate (pH 9,6), định lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) ở bước sóng 595 nm. Sử dụng kháng thể sơ cấp kháng c-myc và kháng thể thứ cấp kháng chuột IgG liên hợp enzyme HRP (Horse Radish Peroxidase), cơ chất TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), đo độ hấp thụ quang học OD450 trên đầu đọc microplate.
• Phân tích Western Blot: Protein tổng số (1 g lá) phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12%, chuyển màng Nitrocellulose bằng máy Fast Blotter (Pierce) ở điện áp 25V, dòng 1,3A trong 20 phút. Ủ blocking bằng sữa tách béo 5% trong PBST, ủ kháng thể sơ cấp và thứ cấp, hiện hình tín hiệu phát quang hóa học bằng cơ chất Amersham ECL Prime.
• Xử lý thống kê: Toàn bộ dữ liệu định lượng được phân tích ANOVA, so sánh phương sai và xử lý sai số thống kê trên phần mềm Data Analysis Microsoft Excel 2007 (Chu Văn Mẫn, 2009) và tính toán chỉ số LC50 qua phần mềm GraphPad Prism (Yu et al., 2006).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Luận án đã đạt được 5 phát hiện khoa học mang tính đột phá với bằng chứng thực nghiệm rõ ràng:

1. Đặc tính độc học của protein tái tổ hợp Cry8Db đối với ấu trùng Lepidiota signata Fabricius: Đã chứng minh protein Cry8Db kích thước phân tử chuẩn ~73 kDa có khả năng diệt trừ ấu trùng L. signata ở cả ba giai đoạn tuổi sinh trưởng với mối tương quan liều lượng chặt chẽ. Kết quả định lượng chỉ số gây chết 50% số cá thể (LC50) ghi nhận: "Đối với ấu trùng tuổi 1, nồng độ gây chết 50% số cá thể là LC50 = 183,5 ng/g, ấu trùng tuổi 2 LC50 = 270,8 ng/g và ấu trùng tuổi 3 nồng độ này ở ngưỡng cao nhất với giá trị LC50 = 345,4 ng/g". Ấu trùng tuổi 1 mẫn cảm nhất với độc tố, chứng minh thời điểm xâm lấn sớm của sâu non là giai đoạn can thiệp tối ưu nhất của cây chuyển gen.
2. Xác lập hệ thống tái sinh in vitro tối ưu qua phôi soma: Khảo sát trên 3 giống mía chứng minh giống ROC22 có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh vượt trội nhất. Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa đạt cao nhất trên môi trường MS bổ sung 3,0 mg/L 2,4-D trong điều kiện tối hoàn toàn sau 3 tuần. Môi trường tạo phôi soma tối ưu là MS bổ sung 0,9 mg/L 2,4-D. Môi trường tái sinh chồi hiệu quả nhất là MS bổ sung tổ hợp Cytokinin gồm 1,0 mg/L BAP và 0,5 mg/L Kinetin. Môi trường kích thích ra rễ tối ưu là MS bổ sung 3,0 mg/L NAA và 30 g/L sucrose, cho cây con có bộ rễ hoàn chỉnh và tỷ lệ sống sót khi chuyển ra giá thể đất cát pha : trấu hun (1:1) đạt trên 90%.
3. Tối ưu hóa các thông số biến nạp Agrobacterium tumefaciens in vitro: Hiệu suất chuyển gen gus đạt cực đại khi phôi soma được tiền nuôi cấy 2 ngày, lây nhiễm với dịch khuẩn A. tumefaciens EHA105 ở mật độ OD600 = 0,75, bổ sung chất cảm ứng Acetosyringone nồng độ 100 µM và thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày trong điều kiện tối. Ngưỡng kháng sinh Hygromycin B chọn lọc mô sẹo phôi hóa in vitro được xác định chính xác là 50 mg/L.
4. Đột phá xây dựng quy trình chuyển gen ex vitro qua chồi nách: Thiết lập thành công phương pháp chuyển gen trực tiếp vào mắt ngủ của đoạn thân mía mà không qua nuôi cấy mô in vitro. Các thông số kỹ thuật tối ưu bao gồm: chọc tổn thương chồi nách 5 điểm (sâu 1 mm), xử lý siêu âm 6 phút kết hợp hút chân không 500 mmHg trong 2 phút với dịch khuẩn (OD600 = 0,75, 100 µM Acetosyringone, 0,1% Silwet L-77), đồng nuôi cấy 18 giờ. Hệ thống chọn lọc 2 pha nghiêm ngặt: tưới Hygromycin B 100–150 mg/L trong 42 ngày và phun Hygromycin B 1500–2000 mg/L trong 7 ngày đảm bảo sàng lọc 100% các dòng dương tính thật mà không gặp hiện tượng thoát dòng (escapes).
5. Tạo lập và khẳng định 13 dòng mía chuyển gen cry8Db có tính kháng sâu vượt trội: Luận án đã tạo ra được 13 dòng mía chuyển gen mang gen cry8Db. Kết quả phân tích ELISA khẳng định: nồng độ protein độc tố tái tổ hợp Cry8Db trong lá mía chuyển gen dao động từ 1,62 đến 21,73 ng/µg protein hòa tan tổng số. Phân tích Western blot xác nhận sự hiện diện của băng vạch đặc hiệu 73 kDa. Thử nghiệm sinh học lây nhiễm nhân tạo với ấu trùng L. signata tuổi 1 chứng minh: dòng mía chuyển gen S3 biểu hiện tính kháng mạnh nhất, tỷ lệ cây bị cắn phá chỉ 12,91% (so với 100% ở đối chứng âm không chuyển gen), đồng thời kìm hãm dinh dưỡng khiến khối lượng ấu trùng giảm 2,85 lần sau 14 ngày theo dõi.

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý luận: Bổ sung cơ sở khoa học thực nghiệm vững chắc về khả năng tích hợp, biểu hiện và duy trì hoạt tính sinh học của họ gen cry8 (đặc biệt là phân nhóm cry8Db) trong hệ gen cây trồng đa bội thể phức tạp như mía. Chứng minh tính khả thi của mô hình chuyển gen ex vitro trong việc khắc phục hiện tượng bất ổn định di truyền do nuôi cấy mô dài ngày.
• Ý nghĩa phương pháp luận: Cung cấp một quy trình kỹ thuật chuyển gen ex vitro hoàn chỉnh, chuẩn hóa từ khâu tiền xử lý vi xâm lấn, cảm ứng siêu âm - chân không đến chọn lọc kháng sinh hai pha, có thể chuyển giao và áp dụng rộng rãi cho các đối tượng cây trồng nhân giống vô tính khó tái sinh in vitro khác.
• Ý nghĩa thực tiễn và sản xuất nông nghiệp: Đặt nền móng cho việc tạo nguồn vật liệu khởi đầu mang tính kháng bền vững đối với sâu hại nhóm bọ hung Scarabaeidae, giúp ngành mía đường Việt Nam chủ động ứng phó dịch bệnh, giảm thiểu chi phí thuốc trừ sâu hóa học từ 1,5–2 triệu đồng/ha/vụ, bảo tồn hệ vi sinh vật đất và cải thiện độ an toàn sinh học vùng chuyên canh nguyên liệu.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn ghi nhận 4 hạn chế khoa học cần tiếp tục hoàn thiện:

1. Giới hạn về quy mô thế hệ khảo nghiệm: Các kết quả phân tích phân tử và thử nghiệm kháng sâu mới dừng lại ở thế hệ T0 trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới có kiểm soát. Cần theo dõi sự biểu hiện của gen cry8Db qua các chu kỳ tái sinh vô tính (gốc mía lưu lưu niên từ vụ 1 đến vụ 3) và đánh giá tính ổn định di truyền ở quy mô khảo nghiệm đồng ruộng hẹp (confined field trials).
2. Số lượng bản sao chèn đoạn (Copy Number Variation): Luận án đã khẳng định sự có mặt của gen đích bằng PCR và biểu hiện protein bằng ELISA/Western blot, tuy nhiên chưa thực hiện kỹ thuật lai Southern blot hoặc giải trình tự thế hệ mới (NGS/ddPCR) để xác định chính xác số lượng bản sao và vị trí chèn đoạn của T-DNA trên nhiễm sắc thể mía.
3. Đánh giá chỉ tiêu nông sinh học toàn diện: Chưa đánh giá đầy đủ tác động tích lũy của protein Cry8Db đến hàm lượng đường sucrose (chỉ số CCS/Brix), năng suất sinh khối thực địa và khả năng chống chịu các stress phi sinh học (hạn, mặn, rét) của các dòng chuyển gen.
4. Tác động an toàn sinh học đối với sinh vật không chủ đích: Cần thực hiện các đánh giá sâu hơn về tính an toàn sinh thái của rễ mía chuyển gen tiết protein Cry8Db đối với hệ vi sinh vật đất có ích và côn trùng thiên địch.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối kiến nghị 4 hướng ưu tiên:

• Hướng 1: Triển khai lai Southern blot và phân tích vùng biên chèn gen bằng kỹ thuật TAIL-PCR trên dòng S3 và các dòng ưu tú.
• Hướng 2: Đánh giá tính kháng sâu trên đồng ruộng đối với các loài bọ hung hại mía phổ biến khác tại Việt Nam như Alissonotum impressicolle, Holotrichia pruinosa, Anomala expensa.
• Hướng 3: Ứng dụng kỹ thuật đa gen (gene stacking/pyramiding) kết hợp cry8Db với các gen kháng sâu đục thân (cry1Ab) hoặc kháng thuốc diệt cỏ (bar) để tạo giống mía đa kháng toàn diện.
• Hướng 4: Đánh giá an toàn sinh thái và xây dựng hồ sơ cấp phép khảo nghiệm sinh học theo quy chế an toàn sinh vật biến đổi gen quốc gia.

Tác động và ảnh hưởng

Nghiên cứu mang lại những giá trị tác động đa chiều và có sức ảnh hưởng sâu rộng:

• Tác động học thuật: Mở ra hướng nghiên cứu tiên phong trong việc chuyển nạp các gen Bt nhóm cry8 trên cây trồng đa bội thể. Bài báo quốc tế và công trình công bố từ luận án dự kiến tạo lập chỉ số trích dẫn cao trong các tạp chí chuyên ngành Công nghệ Sinh học Thực vật (Plant Biotechnology Journal, Transgenic Research, Frontiers in Plant Science).
• Tác động ngành mía đường: Cung cấp giải pháp công nghệ sinh học đột phá giúp bảo vệ các vùng mía nguyên liệu trọng điểm tại Tuyên Quang, Thanh Hóa, Gia Lai, Tây Ninh; ngăn chặn nguy cơ bùng phát dịch bọ hung ngầm trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu.
• Tác động chính sách và môi trường: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm trực tiếp phục vụ cho việc thực thi Quyết định số 26/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ về quy hoạch phát triển mía đường và Chiến lược Phát triển Nông nghiệp Bền vững; giảm thiểu hàng nghìn tấn hóa chất độc hại thải vào đất mỗi năm.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật (Doctoral Researchers & Academics): Tiếp cận một khung phương pháp luận chuyển gen thực vật chuẩn xác, hệ thống primer đặc hiệu (cry8Db-Frag_F/R), và dữ liệu đối sánh độc học của protein Cry8Db đối với côn trùng cánh cứng.
• Các Viện Nghiên cứu & Trung tâm Giống Cây trồng (Agricultural R&D Centers): Tiếp nhận 13 dòng mía chuyển gen cry8Db T0 (đặc biệt là dòng S3) làm nguồn vật liệu di truyền quý báu phục vụ công tác chọn tạo giống mía chất lượng cao.
• Các Doanh nghiệp Mía đường và Nông dân (Sugar Mills & Farmers): Sở hữu giải pháp phòng trừ sâu hại gốc rễ mang tính chủ động, giảm thiểu tổn thất năng suất từ 15–39%, nâng cao hiệu quả kinh tế trên mỗi hecta đất canh tác.
• Các Cơ quan Quản lý Nhà nước (Policy Makers): Bổ sung minh chứng khoa học thực tế để xây dựng hành lang pháp lý, tiêu chuẩn an toàn sinh học đối với cây trồng biến đổi gen tại Việt Nam.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và mở rộng lý thuyết nào? Trả lời: Đóng góp lý thuyết cốt lõi nhất là chứng minh thực nghiệm thành công Thuyết biểu hiện gen dị tuyển tối ưu hóa codon (Codon Optimization Theory) và Thuyết độc tố tạo lỗ rò màng ruột (Pore-Forming Toxin Model) của protein Cry8Db trên đối tượng cây mía. Nghiên cứu mở rộng lý thuyết cấu trúc 3D ba domain của Yamaguchi et al. (2008), khẳng định vòng loop 2 và 3 thuộc Domain II của protein Cry8Db kích thước 73 kDa giữ vai trò quyết định trong việc nhận diện thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào ruột giữa của loài Lepidiota signata Fabricius trong điều kiện kiềm tính (pH 10), tạo ra các kênh ion phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu làm chết ấu trùng.

2. Đột phá về phương pháp luận của luận án khi so sánh với ít nhất 2 nghiên cứu quốc tế trước đây? Trả lời: Khác biệt với phương pháp súng bắn gen của Asano et al. (2005) trên cỏ voi (gây nhiều bản sao, dễ phân ly) hay phương pháp biến nạp in vitro truyền thống qua phôi soma của Kalunke et al. (2009) (tốn kém thời gian, dễ tạo biến dị soma và hóa nâu do phenolic), luận án đã: (1) Chuẩn hóa quy trình in vitro qua phôi soma tối ưu cho giống mía ROC22; và (2) Lần đầu tiên phát triển hoàn chỉnh quy trình chuyển gen ex vitro trực tiếp vào chồi nách đoạn thân mía dựa trên cải tiến kỹ thuật của Mayavan et al. (2015). Bằng việc kết hợp vi xâm lấn 5 điểm, siêu âm 6 phút, hút chân không 500 mmHg và hệ thống chọn lọc hai pha Hygromycin B (tưới 100–150 mg/L và phun 1500–2000 mg/L), luận án đạt hiệu quả biến nạp cao, rút ngắn thời gian tạo cây chuyển gen và loại bỏ hoàn toàn nguy cơ biến dị soma.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong quá trình thực nghiệm kèm dữ liệu chứng minh? Trả lời: Phát hiện bất ngờ và có ý nghĩa thực tiễn nhất là sự phân hóa mạnh mẽ về ngưỡng mẫn cảm của các tuổi ấu trùng bọ hung đối với độc tố Cry8Db. Nồng độ gây chết LC50 của ấu trùng tuổi 1 chỉ là 183,5 ng/g, trong khi ở ấu trùng tuổi 3 tăng vọt lên 345,4 ng/g (tăng gần gấp đôi). Điều này chứng minh ấu trùng tuổi 1 có thụ thể ruột nhạy cảm gấp 1,88 lần so với tuổi 3. Do đó, cây mía chuyển gen biểu hiện protein Cry8Db nội tại (như dòng S3 đạt nồng độ 21,73 ng/µg protein tổng số) sẽ tiêu diệt triệt để ấu trùng ngay khi chúng vừa nở và cắn phá lớp vỏ rễ đầu tiên, ngăn chặn hoàn toàn khả năng phát triển thành ấu trùng tuổi lớn gây hại nặng.

4. Quy trình nghiên cứu có cung cấp đầy đủ giao thức để tái lặp (Replication Protocol)? Trả lời: Luận án cung cấp chi tiết 100% các thông số kỹ thuật chuẩn: trình tự mồi PCR (cry8Db-Frag_F: 5'-ATGCCTCATTTACGCTCCTG-3', R: 5'-GCGACCTCAAGATCCTCCTC-3'), nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D, BAP, Kinetin, NAA), nồng độ kháng sinh chọn lọc, tỷ lệ đệm tách chiết, điều kiện siêu âm/chân không và quy trình ELISA/Western blot, cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn nào trên thế giới cũng có thể tái lặp quy trình một cách chính xác.

5. Định hướng lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào? Trả lời: Lộ trình 10 năm được xác lập qua 3 giai đoạn: (i) Năm 1–3: Phân tích Southern blot/NGS xác định vị trí chèn T-DNA, nhân vô tính dòng S3 và khảo nghiệm trong nhà lưới cách ly; (ii) Năm 4–6: Triển khai khảo nghiệm diện hẹp và diện rộng tại 3 vùng sinh thái mía trọng điểm (Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ, Tây Nguyên), đánh giá tính kháng bền vững qua 3 vụ mía lưu gốc và an toàn sinh thái đất; (iii) Năm 7–10: Đăng ký công nhận giống cây trồng biến đổi gen mới, hoàn thiện thủ tục sở hữu trí tuệ và thương mại hóa giống mía kháng bọ hung phục vụ sản xuất đại trà.

Kết luận

1. Luận án đã biểu hiện thành công protein độc tố tái tổ hợp Cry8Db (~73 kDa) trong chủng vi khuẩn E. coli Rosetta-gamy B, tinh sạch qua cột Ni-NTA và xác định chính xác ngưỡng độc tính đối với ấu trùng bọ hung Lepidiota signata Fabricius ở 3 tuổi phát triển với giá trị LC50 lần lượt là 183,5 ng/g (tuổi 1), 270,8 ng/g (tuổi 2) và 345,4 ng/g (tuổi 3).
2. Thiết kế và tạo dòng thành công vector nhị thể thực vật pCAMBIA1300 mang cấu trúc gen cry8Db được tối ưu hóa codon dưới sự điều khiển của promoter mạnh CaMV35S và gen chọn lọc hpt.
3. Xây dựng hoàn chỉnh hệ thống tái sinh in vitro qua phôi soma từ cuộn lá non giống mía ROC22 trên môi trường cảm ứng mô sẹo MS + 3,0 mg/L 2,4-D, tạo phôi soma trên MS + 0,9 mg/L 2,4-D, tái sinh chồi trên MS + 1,0 mg/L BAP + 0,5 mg/L Kinetin và ra rễ trên MS + 3,0 mg/L NAA + 30 g/L sucrose.
4. Tối ưu hóa thành công 2 quy trình chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105: quy trình chuyển gen in vitro qua phôi soma và quy trình chuyển gen ex vitro trực tiếp qua chồi nách đoạn thân mía sử dụng kỹ thuật vi xâm lấn, siêu âm và chân không kết hợp chọn lọc kháng sinh hai pha.
5. Tạo ra 13 dòng mía chuyển gen cry8Db T0, khẳng định tích hợp gen bằng PCR, xác định mức độ tích lũy protein Cry8Db đạt từ 1,62 đến 21,73 ng/µg protein tổng số qua ELISA và Western blot.
6. Chứng minh thực nghiệm sinh học dòng mía chuyển gen S3 có hoạt tính kháng ấu trùng bọ hung L. signata vượt trội nhất: giảm tỷ lệ cây bị cắn phá xuống 12,91% và kìm hãm dinh dưỡng làm giảm khối lượng ấu trùng 2,85 lần sau 14 ngày khảo nghiệm, mở ra bước đột phá chiến lược trong công tác chọn tạo giống mía kháng sâu hại tại Việt Nam và trên thế giới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Tính cấp thiết của đề tài Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp đƣợc trồng rộng rãi nhất trên thế giới (Dotaniya, Datta, 2014; Choudhary et al., 2017) đƣợc canh tác ở 109 quốc gia với diện tích 26,9 triệu ha, sản lƣợng đạt 1,91 tỷ tấn (Factfish, 2015) ây m a đƣợc sử dụng vào nhiều mục đ ch: cung cấp thực phẩm: sucrose, fructose, mật m a; làm sợi: cung cấp vật liệu cenlullose, thức n gia súc: lá, thân đã đƣợc ép đƣờng; tạo n ng lƣợng: n ng lƣợng sinh học tái tạo từ rỉ đƣờng…; công nghiệp hóa chất: ethanol sinh học, chất mùn (Dotaniya et al. Việc cải thiện các đặc t nh nông sinh học ở cây m a đã đƣợc nghiên cứu trong những n m qua nhằm t ng trữ lƣợng đƣờng, t ng khả n ng chống ch u các điều kiện stress nhƣ: hạn hán, ngập, mặn, kháng sâu hại, thuốc diệt cỏ, nấm gây bệnh… Tuy nhiên do một số đặc thù của cây m a nhƣ: k ch thƣớc hệ gen lớn (985 Mbp), bộ nhi m sắc thể phức tạp (2n 70-140 , và sự tƣơng tác phức tạp của cây mía với các điều kiện môi trƣờng (Zhang et al., 2012)… khiến cho thời gian để tạo ra một giống mía mới theo phƣơng pháp truyền thống lên tới 10-12 n m Kỹ thuật chuyển gen có thể xem là phƣơng pháp tối ƣu nhất để tạo ra giống mía mới trong thời gian ngắn nhất. ây m a đƣợc biết là vật chủ của hơn 1500 loài côn trùng và 80 bệnh hại, trong đó đặc biệt gây hại trên diện rộng và khó kiểm soát là các loài bọ cánh cứng (bọ hung, xén tóc , sâu đục thân, rệp nhƣng phần lớn chúng thƣờng b giới hạn bởi sự phân bố đ a lý. Tuy nhiên, hiện nay sự phát triển của du l ch, thƣơng mại giữa các nƣớc cùng với thay đổi điều kiện khí hậu làm t ng nguy cơ sâu bệnh hại xâm nhập và bùng phát trong nhiều hệ thống nông nghiệp, trong đó sâu bệnh gây hại trên mía ngày càng khó kiểm soát.

Khả n ng th ch ứng của một số loài gây hại và xâm nhập vào các khu vực trồng mía rất nhanh, gây thiệt hại đặc biệt nghiêm trọng. ôn trùng bọ cánh cứng ảnh hƣởng xấu đến n ng suất cây mía vì chúng phá hoại m a ở giai đoạn ấu trùng và trƣởng thành Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen biểu hiện protein độc tố diệt côn trùng gây hại của Bt đã phát triển trên khắp thế giới từ n m 1996. Việc tạo ra cây trồng biến đổi 2 gen là bƣớc đột phá nhằm: (i): giảm thiểu tác hại của thuốc trừ sâu hóa học, (ii): t ng cƣờng hiệu quả, t nh đặc hiệu trong diệt trừ sâu đ ch; (iii): giảm chi phí, ít ảnh hƣởng tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và các loài sinh vật khác (James, 2014). Ở Việt Nam, cây m a cũng là một trong số các cây trồng ch u sự phá hoại lớn từ côn trùng thuộc Bộ cánh cứng trong đó có họ bọ hung Scarabaeidae.

Ấu trùng bọ hung thƣờng đục thân, phá hoại r , còn giai đoạn trƣởng thành chúng n các bộ phận nhƣ thân, lá cây m a Sự phá hại do bọ hung gây ra có thể làm chết cây hoặc giảm đáng kể n ng suất cây m a (Shu et al. Kết quả nghiên cứu cho thấy, không có giống mía nào hệ gen tự nhiên mang gen biểu hiện t nh kháng côn trùng gây hại (James, 2014). Vì vậy, việc tạo giống m a chuyển gen có khả n ng kháng côn trùng nói chung và bọ hung nói riêng đang là vấn đề cấp thiết hiện nay Nhóm protein ry8 là một trong những nhóm protein độc tố Bt đƣợc mã hóa bởi các gen thuộc họ cry8 đã đƣợc chứng minh có độc t nh với ấu trùng của bọ cánh cứng trong đó có bọ hung (Zhang et al. ho đến nay, cây mía chuyển gen chủ yếu đƣợc tạo ra nhờ sử dụng hai phƣơng pháp ch nh là súng bắn gen và chuyển gen đ ch thông qua A.

Với điều kiện thực tế ở Việt Nam, sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen thực vật là phƣơng pháp đơn giản và mang lại hiệu quả cao Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực ti n, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hu n g n r D t nh kháng n tr ng v o m ”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc các dòng m a chuyển gen cry8Db có hoạt t nh kháng ấu trùng bọ hung hại m a 3. Nội dung nghiên cứu 1.

Đánh giá thiệt hại bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài bọ hung điển hình của Cry8Db tái tổ hợp. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen chuyển cry8Db. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây m a 4. Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A.

Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện gen cry8Db. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Kết quả đạt đƣợc của luận án có giá tr khoa học và thực ti n trong tiếp cận nghiên cứu t ng cƣờng khả n ng kháng bọ hung hại m a bằng kỹ thuật chuyển gen thông qua A.Ý nghĩ lý luận Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và thực nghiệm tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen Bt. Ý nghĩ thực tiễn 1. Tạo đƣợc protein tái tổ hợp Cry8Db quy mô phòng thí nghiệm thông qua vi khuẩn E.coli Rosetta - amy B, chứng minh đƣợc protein tinh sạch có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius – một loài thuộc họ bọ hung hại m a thu đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang.

Tạo đƣợc các dòng mía chuyển gen cry8Db có khả n ng biểu hiện độc tố có tính kháng ấu trùng bọ hung thu thập đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hƣớng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao khả n ng kháng côn trùng gây hại ở cây m a, mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực ti n tạo giống m a kháng côn trùng hại m a 5. Đóng góp mới của luận án 1. Đã chứng minh đƣợc protein ry8 b k ch thƣớc phân tử khoảng 73 K a có khả n ng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau. Đối với ấu trùng tuổi 1, nồng độ gây chết 50% số cá thể là LC50 = 183,5 ng/g, ấu trùng tuổi 2 LC50 = 270,8 ng/g và ấu trùng tuổi 3 nồng độ này ở ngƣỡng cao nhất với giá tr LC50 = 345,4 ng/g.

Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song 2 quy trình chuyển gen vào cây m a (trong điều kiện in vitro và ex vitro để tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8Db. ông trình đã tạo đƣợc 13 dòng m a chuyển gen cry8Db. Protein Cry8Db ở các dòng mía chuyển gen đã đƣợc kiểm tra bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ protein tái tổ hợp ở các dòng mía chuyển gen dao động từ 1.62 - 21,73 ng/µg protein tổng số. Thử nghiệm sinh học cho thấy dòng m a chuyển gen S3 có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius tốt nhất với tỷ lệ b phá hại thấp (12,91% , khối lƣợng ấu trùng b giảm 2,85 lần sau 14 ngày.

4 ƯƠ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. guồn gốc và vị trí phân loại Cây mía (Saccharum officinarum Linn.) trồng hiện nay thuộc chi Saccharum, họ Gramineae, lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật hạt kín (Magnoliophyta) (Đ N ng V nh, 2006). Việc phân loại cây mía gặp rất nhiều vấn đề phức tạp, vì ngoài chi Saccharum còn có các chi khác thuộc cùng một nhóm giao phấn gọi là „„phức hợp Saccharum” bao gồm: Erianthus, Ripidium, Miscanthus, Diandra, Narenga và Sclerostachya (Office of Gene Technology Regulator, 2011). Chi Saccharum gồm có sáu loài khác nhau: S.

Trong số này, S. (loài hoang dại với bộ NST thể d bội đƣợc cho là tổ tiên của mía trồng ngày nay (Sandhu et al. Các giống m a thƣơng mại ngày nay là con lai giữa S. (chiếm 10–20% hệ gen) (Hoarau et al.1: C c loài mía tổ ti n của c c giống mía th ng mại ngày nay A: Loài S.

đƣợc phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới ở châu và châu Phi, có môi trƣờng sống đa dạng Đây là một loài trong tự nhiên có hình thái biến đổi, có thể rậm ngắn hoặc cao lớn (có thể cao tới 5 m Hầu hết loài S. spontaneum L có lá và cuống lá mỏng, hàm lƣợng đƣờng thấp, và tỷ lệ xơ cao (Aditya, Jitendra, 2014) ác ngành công nghiệp m a đƣờng trên thế giới đã thuần hóa và phát triển các giống m a thuộc loài S. officinarum L , đặc trƣng của loài này là hàm lƣợng đƣờng cao, lƣợng xơ thấp, dày cuống và lá rộng và có nguồn gốc từ New uinea hoặc Melanesian (Grivet et al. Đặc điểm h nh th i sinh th i và di truyền Đặc điểm hình thái M a là cây một lá mầm, thân thảo Thân m a là nguyên liệu chế biến đƣờng và làm giống cho vụ sau Trên biểu bì thân m a có chứa nhiều chlorophin và xantophin hợp thành màu sắc đặc trƣng của từng giống m a iữa các dóng thân là các đốt m a chứa bốn bộ phận gồm đai sinh trƣởng, r , chồi bên và sẹo lá Trên thân có các bẹ lá bao bọc, lá mọc thành hai hàng so le, đối nhau hoặc theo đƣờng vòng trên thân m a Là thực vật thuộc nhóm 4, lá m a dài 1-2 m, rộng 5 -7 cm (Taparia et al.