Luận văn thạc sĩ vnua isolation selection and identification of aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua isolation selection and identification of aspergillus oryzae producing high salt tolerant, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Vũ Thị Lan
• Người hướng dẫn: Dr. Nguyễn Hoàng Anh
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Food Technology
• Đề tài: Isolation, Selection And Identification Of Aspergillus Oryzae Producing High Salt Tolerant Neutral Protease
• Loại tài liệu: Thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• DECLARATION
• ACKNOWLEDGEMENT
• TABLE OF CONTENT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. OBJECTIVES OF STUDY
• 1.1. General objective
• 1.2. Specific objectives
• 2. PART II. Enzyme protease
• 2.1. Classification of proteases
• 2.2. Characteristics of types of proteases
• 2.3. Application of proteases in industries
• 2.3.1. Detergents industry
• 2.3.2. Peptide synthesis
• 2.3.3. Leather Industry
• 2.3.4. Food Industry
• 3. MATERIAL AND METHOD
• 3.1. Fungal media and buffers
• 3.2. Isolation of Aspergillus oryzae from natural substrates
• 3.3. Primary identification of Aspergillus oryzae
• 3.4. Determination of protease activity by well diffusion and enzymatic assay
• 3.5. Effect of pH on activity and stability of protease
• 3.6. Effect of NaCl concentrations on activity and stability of protease
• 3.7. Identification of Aspergillus oryzae by molecular biological method
• 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Isolation and primary identification of Aspergillus oryzae
• 4.2. Isolation of Aspergillus oryzae from the natural sources
• 4.3. Primary identification of the isolated fungal isolates
• 4.4. Determination of protease activity produced from isolated A.
• 4.5. Determination of protease activity produced from the isolates
• 4.6. Growth rate of the fungi on the different media
• 4.7. Effect of Sodium chloride (NaCl) on protease activity and stability
• 4.8. Effect of NaCl on protease activity
• 4.9. Effect of salt on protease stability
• 4.10. Effect of pH on the protease activity and stability
• 4.11. Effect of pH on the protease activity
• 4.12. Effect of pH on the protease stability
• 4.13. Identification of the fungi by molecular biological method
• 4.14. DNA extraction and PCR
• 5. CONCLUSION AND RECOMMENDATION

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu Aspergillus oryzae sản xuất protease trung tính chịu mặn cao

Nghiên cứu về Aspergillus oryzae trong sản xuất protease trung tính chịu mặn cao đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Protease là một loại enzyme quan trọng, có vai trò trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp. Việc tìm kiếm các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sản xuất enzyme này trong điều kiện mặn cao là một thách thức lớn, nhưng cũng mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và chế biến.

1.1. Đặc điểm của Aspergillus oryzae và protease trung tính

Aspergillus oryzae là một loại nấm mốc có khả năng sản xuất protease trung tính với hoạt tính cao. Enzyme này có thể hoạt động hiệu quả trong môi trường có nồng độ muối cao, điều này rất quan trọng trong các quy trình chế biến thực phẩm. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng protease từ A. oryzae có thể duy trì hoạt tính trong điều kiện mặn lên đến 16% NaCl.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu protease chịu mặn

Nghiên cứu về protease chịu mặn không chỉ giúp cải thiện chất lượng thực phẩm mà còn tăng cường hiệu quả sử dụng nguyên liệu. Việc phát triển các enzyme này có thể giúp rút ngắn thời gian chế biến và nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm.

II. Vấn đề và thách thức trong sản xuất protease trung tính chịu mặn

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc sản xuất protease trung tính chịu mặn vẫn gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là khả năng duy trì hoạt tính enzyme trong môi trường có nồng độ muối cao. Nhiều enzyme thường bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với nồng độ muối lớn, điều này làm giảm hiệu quả trong ứng dụng thực tiễn.

2.1. Khó khăn trong việc duy trì hoạt tính enzyme

Hoạt tính của protease thường giảm khi nồng độ NaCl tăng. Nghiên cứu cho thấy rằng enzyme từ A. oryzae có thể duy trì hoạt tính tốt hơn so với các nguồn enzyme khác, nhưng vẫn cần tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để đạt được hiệu quả cao nhất.

2.2. Cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động

Để phát triển các chủng A. oryzae có khả năng sản xuất protease chịu mặn, cần có những nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của enzyme trong điều kiện mặn. Việc hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của enzyme sẽ giúp cải thiện quy trình sản xuất.

III. Phương pháp nghiên cứu sản xuất protease trung tính chịu mặn

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và xác định các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sản xuất protease trung tính chịu mặn. Các phương pháp bao gồm phân lập từ nguồn tự nhiên, xác định hoạt tính enzyme và phân tích bằng phương pháp sinh học phân tử.

3.1. Phân lập và xác định chủng Aspergillus oryzae

Quá trình phân lập các chủng A. oryzae được thực hiện từ các nguồn tự nhiên như đất và thực phẩm. Sau đó, các chủng này được xác định bằng phương pháp hình thái và sinh học phân tử để đảm bảo tính chính xác.

3.2. Đánh giá hoạt tính protease trong điều kiện khác nhau

Hoạt tính của protease được đánh giá thông qua các thử nghiệm khác nhau, bao gồm thử nghiệm khuếch tán và phân tích enzym. Các yếu tố như pH, nồng độ muối và nhiệt độ được điều chỉnh để tìm ra điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của protease trung tính chịu mặn

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chủng A. oryzae có khả năng sản xuất protease trung tính chịu mặn cao, với hoạt tính enzyme duy trì tốt trong điều kiện mặn. Điều này mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất thực phẩm lên men và chế biến thực phẩm.

4.1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm

Các enzyme từ A. oryzae có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm lên men, giúp cải thiện hương vị và giá trị dinh dưỡng. Việc sử dụng protease chịu mặn cũng giúp tăng cường khả năng bảo quản thực phẩm trong môi trường có nồng độ muối cao.

4.2. Kết quả thực nghiệm và tiềm năng phát triển

Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng các chủng A. oryzae có thể duy trì hoạt tính enzyme cao trong điều kiện mặn. Điều này không chỉ giúp cải thiện quy trình sản xuất mà còn mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu và phát triển enzyme trong tương lai.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về Aspergillus oryzae sản xuất protease trung tính chịu mặn cao đã chỉ ra tiềm năng lớn trong ứng dụng thực tiễn. Việc phát triển các chủng enzyme này có thể giúp cải thiện chất lượng thực phẩm và nâng cao hiệu quả sản xuất. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành công nghiệp thực phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu enzyme trong công nghiệp

Nghiên cứu về enzyme chịu mặn sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các chủng A. oryzae có khả năng sản xuất enzyme hiệu quả hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm và giảm thiểu chi phí sản xuất.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu về cơ chế hoạt động của protease trong điều kiện mặn, cũng như các ứng dụng tiềm năng khác của enzyme này trong các lĩnh vực khác nhau. Việc hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và ngành công nghiệp sẽ là chìa khóa để phát triển bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường enzyme công nghiệp toàn cầu hiện ghi nhận sự thống trị mạnh mẽ của nhóm enzyme protease khi chiếm gần 60% tổng giá trị thương mại, trong đó các protease có nguồn gốc từ vi sinh vật đóng góp khoảng 40% tổng doanh số bán hàng. Trong ngành công nghệ thực phẩm, đặc biệt là các quy trình lên men truyền thống như sản xuất nước tương, nước mắm và tương đậu, nồng độ muối ăn (Natri clorua - NaCl) thường được duy trì ở mức rất cao, dao động từ 16% đến 25% nhằm ức chế vi sinh vật gây thối và kéo dài thời gian bảo quản. Tuy nhiên, rào cản kỹ thuật lớn nhất hiện nay là phần lớn các protease thông thường bị suy giảm hoạt tính nghiêm trọng trong môi trường nồng độ muối cao, làm kéo dài thời gian ủ chượp lên đến 6 - 12 tháng và làm giảm hiệu suất thủy phân protein từ nguyên liệu thô.

Nhằm giải quyết nút thắt công nghệ này, nghiên cứu tập trung vào mục tiêu phân lập, tuyển chọn và định danh chính xác các chủng vi nấm Aspergillus oryzae bản địa có khả năng sinh tổng hợp protease trung tính chịu mặn vượt trội. Đề tài được triển khai thực nghiệm toàn diện tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Thực phẩm thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong năm 2017, khảo sát trên các nguồn mẫu tự nhiên thu thập từ các làng nghề truyền thống tại Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Vĩnh Phúc và Thừa Thiên Huế. Ý nghĩa then chốt của nghiên cứu thể hiện qua việc tìm ra nguồn giống vi sinh an toàn sinh học, có khả năng duy trì trên 50% hoạt tính protease ở nồng độ muối 20%, mở ra tiềm năng rút ngắn 20% - 30% chu kỳ lên men, nâng cao tỷ lệ thu hồi đạm amin và cải thiện chất lượng cảm quan của thực phẩm lên men.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng động học enzyme học vi sinh vật và cơ chế thủy phân liên kết peptide của các nhóm protease. Protease được phân loại thành 4 nhóm xúc tác chính gồm serine protease, metalloprotease, aspartic protease và cysteine protease. Trong chế biến thực phẩm, protease trung tính (hoạt động tối ưu ở pH 6,0 - 7,5) giữ vai trò đặc biệt quan trọng nhờ khả năng cắt đứt liên kết peptide sâu rộng mà không tạo ra các peptide kỵ nước gây vị đắng như protease acid hay protease kiềm.

Hiện tượng suy giảm hoạt tính enzyme dưới tác động của áp suất thẩm thấu và nồng độ ion muối cao được giải thích qua cơ chế biến tính cấu trúc protein và hiện tượng muối kết (salting-out), làm co cụm các tâm hoạt động của enzyme. Do đó, việc tìm kiếm chủng vi sinh vật sở hữu enzyme có cấu trúc không gian bền vững trong dung dịch ion cao là một yêu cầu cấp thiết. Vi nấm Aspergillus oryzae được lựa chọn làm đối tượng trung tâm vì đây là loài vi nấm sợi đạt chuẩn an toàn thực phẩm GRAS (Generally Recognized As Safe), sở hữu hệ thống tiết enzyme ngoại bào dồi dào và hoàn toàn không chứa các cụm gen biểu hiện độc tố aflatoxin gây ung thư như loài liên quan Aspergillus flavus.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 21 mẫu cơ chất chứa protein tự nhiên, thu thập theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đại diện tại 7 nhóm cơ chất khác nhau: nước tương Bần (Hưng Yên), đậu tương mốc (Hà Nội), bã đậu phụ (Hà Nội), gạo mốc (Nam Định), cơm mốc (Nam Định), chất thải chăn nuôi bò sữa (Vĩnh Phúc) và mắm tôm chua (Thừa Thiên Huế), với 3 mẫu lặp lại cho mỗi nguồn thu thập. Phương pháp chọn mẫu này đảm bảo tính đa dạng sinh học và tăng cơ hội phân lập được các chủng vi nấm đã thích nghi tự nhiên với môi trường dinh dưỡng giàu đạm và độ mặn cao.

Quy trình phân tích thực nghiệm được thiết kế nhiều tầng nghiêm ngặt:

• Khâu phân lập sử dụng môi trường thạch nước (Water Agar) có bổ sung kháng sinh Streptomycin 3% nhằm triệt tiêu hoàn toàn vi khuẩn ngoại nhiễm, chỉ thu nhận các dòng nấm sợi nội sinh thuần khiết.
• Phương pháp khuếch tán giếng thạch trên môi trường Casein Agar có chất chỉ thị màu Bromocresol Green (BCG) ở pH 8,0 được lựa chọn để sơ tuyển nhanh hoạt tính phân giải protein thông qua đường kính vòng phân giải (halo zone).
• Hoạt độ protease định lượng chính xác bằng phương pháp so màu quang phổ tiêu chuẩn của Sigma, sử dụng cơ chất casein 0,65% kết hợp thuốc thử Folin-Ciocalteu, đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm và quy đổi theo đường chuẩn L-tyrosine (tính theo đơn vị U/L). Lý do lựa chọn phương pháp này là độ nhạy cao, độ lặp lại ổn định và phản ánh chính xác lượng tyrosine tự do được giải phóng.
• Khảo sát độ bền nhiệt, ảnh hưởng của pH (từ pH 3,0 đến 10,0 bằng hệ đệm Briton-Robinson) và nồng độ muối NaCl (từ 0% đến 20% trong hệ đệm kali phosphat 50 mM) trong các khoảng thời gian từ 0,5 đến 12 giờ.
• Định danh phân tử bằng kỹ thuật trích xuất DNA tổng số qua phương pháp CTAB, khuếch đại đoạn gen ITS (Internal Transcribed Spacer) kích thước khoảng 700 bp bằng cặp mồi chuyên biệt ITS1/ITS4, giải trình tự Sanger và đối soát dữ liệu trên ngân hàng gen quốc tế NCBI thông qua công cụ BLAST và phần mềm MEGA phiên bản 6.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 21 mẫu thực địa ban đầu, quá trình phân lập đã thu nhận được 12 chủng vi nấm có đặc điểm hình thái tương đồng với chi Aspergillus. Sau các bước cấy chuyển slide culture và quan sát hiển vi cấu trúc cuống sinh bào tử, bọc bào tử và thể bình, 4 chủng tiềm năng nhất được định danh sơ bộ gồm TB1, TB2, G2 và M1.

Đánh giá định lượng hoạt tính protease ngoại bào cho thấy sự phân hóa rõ rệt giữa các chủng:

• Chủng TB1 (phân lập từ nước tương Hưng Yên) đạt hoạt tính protease cao nhất với 49,26 U/L, tạo đường kính vòng phân giải casein lên tới 17,10 mm.
• Chủng G2 (phân lập từ gạo mốc Nam Định) đạt hoạt tính cao thứ hai với 29,56 U/L tương ứng vòng phân giải 11,00 mm.
• Chủng TB2 và M1 đạt hoạt tính thấp hơn đáng kể, lần lượt là 13,72 U/L (vòng phân giải 9,50 mm) và 15,54 U/L (vòng phân giải 7,50 mm). Hoạt tính của chủng TB1 cao hơn 66,6% so với chủng G2 và vượt trội hơn 250% so với chủng TB2.

Khảo sát khả năng chịu mặn ghi nhận protease của cả hai chủng TB1 và G2 đều có tính kháng muối ấn tượng. Tại nồng độ NaCl 4%, protease của TB1 giữ được 93,4% hoạt tính ban đầu, trong khi G2 đạt 87,4%. Khi nồng độ NaCl tăng cực hạn lên mức 20%, hoạt tính protease của TB1 vẫn duy trì ở mức 50,8%, cao hơn mức 41,2% của chủng G2. Thử nghiệm độ bền enzyme trong môi trường NaCl 16% ở 30°C cho thấy trong 30 phút đầu, TB1 duy trì đến 92,5% hoạt tính; sau 3 giờ đạt 65,8% và sau 9 giờ ủ liên tục, hoạt tính tồn dư vẫn đạt 49,8%.

Về đặc tính pH, protease của cả TB1 và G2 đều đạt đỉnh hoạt tính cực đại tại pH 7,0 (protease trung tính). Tại pH 5,0, TB1 giữ được 78,0% hoạt tính và tại pH 8,0 giữ được 81,3% hoạt tính. Khi thử nghiệm độ bền tại pH 7,0 ở nhiệt độ 37°C suốt 12 giờ, enzyme duy trì trên 80% hoạt tính trong 2 giờ đầu và còn giữ lại 37% (đối với TB1) và 41% (đối với G2) sau 12 giờ.

Kết quả phân tích sinh học phân tử vùng gen ITS kích thước 700 bp đã xác định chủng TB1 có độ tương đồng nucleotide lên tới 99% (độ bao phủ 97% - 98%) với các chủng chuẩn Aspergillus oryzae trên GenBank (như chủng AS-A9 mã số HQ285528.1). Ngược lại, chủng G2 dù có hoạt tính tốt nhưng lại bị định danh là loài Aspergillus flavus – loài sinh độc tố nấm mốc không được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm.

Thảo luận kết quả

Sự suy giảm hoạt tính của protease khi nồng độ NaCl tăng từ 0% lên 20% là một quy luật phù hợp với các nghiên cứu động học enzyme quốc tế. Nồng độ ion Na+ và Cl- đậm đặc làm thay đổi hằng số điện môi của dung môi, tước đoạt lớp vỏ hydrat hóa bao quanh phân tử protein enzyme, dẫn đến hiện tượng co cụm bề mặt kỵ nước để tự bảo vệ. Tuy nhiên, việc enzyme của chủng TB1 duy trì được xấp xỉ 50% hoạt tính ở độ mặn 20% là một chỉ số vượt trội so với đa số các chế phẩm nấm mốc thương mại vốn mất hơn 70% hoạt tính ở cùng điều kiện.

Dữ liệu nghiên cứu về tốc độ sinh trưởng khuẩn ty có thể được biểu diễn trực quan thông qua biểu đồ cột so sánh đường kính khuẩn lạc trên hai môi trường PDA và CYA qua các mốc 1, 2, 4 và 5 ngày nuôi cấy. Trên môi trường PDA giàu dinh dưỡng, đường kính khuẩn lạc của TB1 tăng trưởng mạnh từ 5,0 mm (ngày 1) lên 24,0 mm (ngày 5), chứng minh khả năng thích ứng cơ chất tuyệt vời. Đường cong suy giảm hoạt tính theo nồng độ muối từ 0% đến 20% và đồ thị biểu diễn độ bền enzyme theo thời gian 12 giờ ở pH 7,0 thể hiện trực quan tính ổn định của protease trung tính TB1.

Điểm thảo luận có giá trị khoa học sâu sắc nhất nằm ở khâu định danh phân tử. Mặc dù chủng G2 có tốc độ phát triển khuẩn lạc nhanh (đạt 35,0 mm sau 5 ngày) và hoạt tính protease khá cao (29,56 U/L), nhưng phân tích trình tự gen ITS đã vạch trần chủng này thuộc loài Aspergillus flavus. Về mặt hình thái ngoài, hai loài này gần như tương đồng tuyệt đối do cùng thuộc nhóm nấm mốc vàng xanh. Do đó, việc ứng dụng giải trình tự sinh học phân tử là giải pháp then chốt để loại trừ hoàn toàn nguy cơ nhiễm chéo độc tố aflatoxin, khẳng định chủng TB1 là Aspergillus oryzae an toàn tuyệt đối cho công nghiệp lên men.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển hóa các kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm thành giá trị ứng dụng thực tiễn trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, 4 giải pháp trọng tâm được đề xuất như sau:

• Tối ưu hóa quy trình lên men thu hồi enzyme quy mô bán công nghiệp: Tiến hành nghiên cứu công nghệ lên men bề mặt và bán rắn sử dụng cơ chất cám gạo, bã đậu nành phối trộn nhằm gia tăng hoạt độ protease ngoại bào của chủng Aspergillus oryzae TB1 lên mức mục tiêu trên 65 U/g cơ chất. Thời gian thực hiện dự kiến trong vòng 6 tháng, do các trung tâm R&D công nghệ sinh học và chế biến thực phẩm chủ trì.
• Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm enzyme trong sản xuất nước tương và nước mắm ngắn ngày: Bổ sung trực tiếp dịch chiết enzyme protease chịu mặn TB1 vào giai đoạn ủ chượp với nồng độ muối 16% - 18%, đặt mục tiêu rút ngắn thời gian ủ chượp từ 180 ngày xuống còn 120 ngày (giảm 33% thời gian) mà vẫn đảm bảo hàm lượng đạm formol và đạm amin tăng từ 15% đến 20%. Kế hoạch triển khai thử nghiệm trong 12 tháng tại các cơ sở chế biến nước mắm, nước tương truyền thống.
• Nghiên cứu bổ sung các chất trợ bền và ion kim loại bảo vệ: Khảo sát bổ sung các vi lượng ion hóa trị hai như Canxi (Ca2+) hoặc Magie (Mg2+) với nồng độ 2 - 5 mM nhằm tạo cầu nối ion ổn định cấu trúc bậc bốn của protease TB1, hướng tới duy trì trên 60% hoạt tính tồn dư sau 12 giờ ở độ mặn 16% NaCl và nhiệt độ 40°C. Hoàn thành nghiên cứu trong khung thời gian 9 tháng.
• Đăng ký bảo hộ nguồn gen và kiểm định an toàn sinh học toàn diện: Thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) của chủng TB1 để chứng minh không mang gen mã hóa sinh tổng hợp độc tố mycotoxin, hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu giữ nguồn gen vi sinh vật quốc gia và chứng nhận an toàn thực phẩm trong vòng 18 tháng, do nhóm tác giả phối hợp cùng Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang giá trị học thuật và thực tiễn phong phú, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng sau:

• Cán bộ nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm & Công nghệ Sinh học: Sử dụng tài liệu làm dẫn chứng thực tế cho bài giảng về động học enzyme, phương pháp phân lập vi nấm sợi và kỹ thuật định danh phân tử vùng gen ITS trong phân loại vi sinh vật học ứng dụng.
• Kỹ sư nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) tại các doanh nghiệp thực phẩm lên men: Ứng dụng nguồn giống thuần khiết Aspergillus oryzae TB1 và các thông số tối ưu về pH, độ mặn để nâng cấp quy trình sản xuất nước tương, tương miso, nước mắm, giúp rút ngắn thời gian lên men và gia tăng tỷ lệ thủy phân đạm.
• Chuyên viên quản lý chất lượng và kiểm nghiệm an toàn thực phẩm: Tham khảo quy trình phân tích sai khác giữa A. oryzae và A. flavus bằng công cụ sinh học phân tử phục vụ công tác giám sát, phát hiện nấm mốc sinh độc tố trong chuỗi cung ứng nông sản và thực phẩm chế biến.
• Học viên cao học và sinh viên đại học khối ngành Khoa học Sự sống: Nắm vững phương pháp luận nghiên cứu hoàn chỉnh từ khâu thu thập mẫu thực địa, bố trí thí nghiệm enzymology đến xử lý dữ liệu tin sinh học bằng các phần mềm chuyên dụng như ClustalX và MEGA.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao protease trung tính từ Aspergillus oryzae lại được ưu tiên sử dụng trong công nghệ thực phẩm hơn protease có nguồn gốc từ vi khuẩn?
Protease trung tính từ Aspergillus oryzae có khả năng thủy phân triệt để protein nguyên liệu ở dải pH trung tính 6,0 - 7,5 mà không giải phóng các peptide kỵ nước gây vị đắng khó chịu cho sản phẩm lên men. Đồng thời, loài vi nấm này đạt chuẩn an toàn thực phẩm GRAS, dễ nuôi cấy và chiết xuất enzyme ngoại bào với chi phí sản xuất thấp.

Nồng độ muối ảnh hưởng cụ thể như thế nào đến hoạt tính và độ bền của enzyme protease từ chủng TB1?
Khi nồng độ muối NaCl tăng từ 0% lên 20%, hoạt tính protease có xu hướng giảm do hiện tượng muối kết làm biến đổi cấu hình không gian của enzyme. Tuy nhiên, protease TB1 thể hiện tính chịu mặn tuyệt vời khi giữ được 93,4% hoạt tính ở 4% NaCl, duy trì 50,8% ở 20% NaCl và giữ vững 49,8% độ bền sau 9 giờ ngâm ở độ mặn 16% NaCl.

Vì sao phương pháp quan sát hình thái kính hiển vi không đủ an toàn để định danh vi nấm Aspergillus oryzae?
Các loài thuộc nhóm Aspergillus flavus (bao gồm A. oryzae, A. flavus, A. parasiticus) có hình thái khuẩn ty, cuống sinh bào tử và đầu mang bào tử màu vàng xanh vô cùng giống nhau. Chủng G2 trong nghiên cứu có hình thái tương đồng nhưng phân tích gen ITS cho thấy đây là A. flavus – loài sinh độc tố aflatoxin, do đó bắt buộc phải sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh chuẩn xác.

Hoạt độ enzyme protease được định lượng và tính toán bằng phương pháp nào trong nghiên cứu này?
Nghiên cứu sử dụng quy trình đo quang học chuẩn của Sigma với cơ chất casein 0,65% và thuốc thử Folin-Ciocalteu. Lượng acid amin L-tyrosine tự do được giải phóng sau phản ứng thủy phân ở 37°C được đo độ hấp thụ quang phổ tại bước sóng 660 nm và đối chiếu qua đường chuẩn tyrosine để tính toán hoạt độ chính xác (chủng TB1 đạt 49,26 U/L).

Chủng nấm mốc TB1 có thể ứng dụng trong những quy trình sản xuất công nghiệp cụ thể nào?
Chủng TB1 rất thích hợp để cấy giống làm bánh mốc koji trong sản xuất nước tương truyền thống, nước tương công nghiệp, tương đậu nành và bổ sung enzyme hỗ trợ quá trình chượp cá độ mặn cao (16% - 20% muối). Ứng dụng này giúp đẩy nhanh tốc độ hòa tan protein, gia tăng vị ngọt umami tự nhiên và rút ngắn 20% - 30% tổng thời gian ủ chín.

Kết luận

• Phân lập thành công 4 chủng vi nấm triển vọng từ 21 mẫu thực địa tự nhiên, trong đó chủng TB1 thể hiện hoạt tính protease trung tính ngoại bào vượt trội đạt 49,26 U/L.
• Xác lập tính năng chịu mặn đặc biệt của protease TB1 với khả năng duy trì 50,8% hoạt tính ở nồng độ muối 20% NaCl và bảo lưu 49,8% hoạt tính sau 9 giờ ở nồng độ 16% NaCl.
• Khẳng định vùng pH hoạt động tối ưu của enzyme tại pH 7,0, duy trì độ bền vững trên 80% hoạt tính trong 2 giờ đầu ở điều kiện 37°C.
• Ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ITS 700 bp để định danh chính xác chủng TB1 là Aspergillus oryzae (độ tương đồng 99%), loại bỏ hoàn toàn nhầm lẫn với nấm độc Aspergillus flavus.
• Cung cấp nguồn giống vi sinh vật an toàn và chế phẩm enzyme giá trị cao, mở ra hướng đi đột phá giúp rút ngắn 20% - 30% thời gian lên men thực phẩm truyền thống tại Việt Nam.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đã kết hợp nhuần nhuyễn giữa phương pháp enzymology truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để giải quyết bài toán thủy phân protein trong môi trường siêu mặn. Kế hoạch nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung thử nghiệm lên men pilot quy mô 500 lít trong 12 tháng tới để tối ưu hóa bài toán kinh tế - kỹ thuật. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm có thể liên hệ trực tiếp với nhóm tác giả hoặc tải toàn văn luận văn để tiếp cận toàn bộ dữ liệu thực nghiệm chi tiết.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE VU THI LAN ISOLATION, SELECTION AND IDENTIFICATION OF ASPERGILLUS ORYZAE PRODUCING HIGH SALT TOLERANT NEUTRAL PROTEASE Major: Food technology Code: 24. Nguyen Hoang Anh AGRICULTURAL UNIVERSITY PRESS - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DECLARATION I hereby declare that the thesis entitled “Isolation, selection and identification of Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease” is the result of the research work carried out by me under the guidance of Dr. Nguyen Hoang Anh in the Central Laboratory of Food Science and Technology, the faculty of Food Science and Technology, Vietnam National University of Agriculture. I certify that the work presented in this thesis has not been submitted to any other universities.

Any help received in preparing this thesis and all sources used have been specifically acknowledged. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Vu Thi Lan i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ACKNOWLEDGEMENT I would like to express my deep gratitude and appreciation to my supervisor, Dr. Nguyen Hoang Anh, Vice Dean as well as Head of Central Laboratory of the faculty of Food Science and Technology whose encouragement and guidance supported me to do this thesis. His patience, motivation, enthusiasm, and immense knowledge helped me during the time of my research and thesis writing.

I am grateful to Research and Teaching Higher Education Academy-Committee on Development Cooperation (ARES-CDD) for generous financial support for the course work and research work. I sincerely thank all the teachers in the Department of Food Safety and Quality management, Faculty of Food Science and Technology, who gave me many valuable suggestions and ideas for my thesis. Finally, I would like to acknowledge my family and friends for their love and encouragement during the completion of the thesis. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Vu Thi Lan ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TABLE OF CONTENT Declaration.

ii Table Of Content. iii List Of Abbreviations. v List Of Tables. vi List Of Figures.

Objectives of study. Classification of proteases. Application of proteases in industries. Sources of proteases.

General characteristics of Aspergillus oryzae. Use of Aspergillus oryzae. Enzyme production of A. MATERIAL AND METHOD.

Fungal media and buffers. Isolation of Aspergillus oryzae from natural substrates. Primary identification of Aspergillus oryzae. Determination of protease activity by well diffusion and enzymatic assay.

Effect of pH on activity and stability of protease. 23 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Effect of NaCl concentrations on activity and stability of protease. Identification of Aspergillus oryzae by molecular biological method.

RESULTS AND DISCUSSION. Isolation and primary identification of Aspergillus oryzae. Isolation of Aspergillus oryzae from the natural sources. Primary identification of the isolated fungal isolates.

Determination of protease activity produced from isolated A. Determination of protease activity produced from the isolates………. Growth rate of the fungi on the different media. Effect of Sodium chloride (NaCl) on protease activity and stability.

Effect of NaCl on protease activity. Effect of salt on protease stability. Effect of pH on the protease activity and stability. Effect of pH on the protease activity.

Effect of pH on the protease stability. Identification of the fungi by molecular biological method. DNA extraction and PCR. CONCLUSION AND RECOMMENDATION.

42 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF ABBREVIATIONS Acronym Abbreviations A.flavus Aspergillus flavus A. oryzae Aspergillus oryzae A. sojae Aspergillus sojae A. nomius Aspergillus nomius A.

parasiticus Aspergillus parasiticus ITS Internal Transcribed Spacer PCR Polymerase Chain Reaction BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF TABLES Table 2. Characteristics of types of proteases. Characteristics of the collected samples. The enzymatic assay procedure of protease.

Natural sources of Aspergillus oryzae and isolation results. Morphological characteristics of four isolates on PDA. Diameter of clear zones of protease produced from isolates. Diameter (mm) of colony on PDA and CYA.

32 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LIST OF FIGURES Figure 2. Crystal structure of protease from Aspergillus oryzae. Aspergillus oryzae morphology. Conidial head of A.

Conidial head of A. The hyphae on the surface of soybeans (Hung Yen) and rices (Nam Dinh). Aspergillus oryzae from Institute of Microbiology and Biotechnology. Morphological characterization of strain TB1.

Aspergillus oryzae in 4-day PD broth culture. The clear distinct zones of proteases on the casein agar plates flooded with BCG reagent after 3 day incubation. The growth rate of fungus TB1 on CYA and PDA after 2 days and 5 days. Effect of NaCl concentrations on protease activity of two isolates TB1 and G2.

The NaCl tolerance of the protease from TB1and G2 at 16% NaCl. Effect of pH on protease activity from TB1 and G2. The pH stability of protease produced from A.oryzae TB1 and G2. 38 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Master candidate: Vu Thi Lan Thesis title: Isolation, selection and identification of Aspergilus oryzae producing high salt tolerance neutral protease Major: Food technology Code: 24180554 Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) This study was to isolate, select and identify Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease.

Four isolates (TB1, TB2, G2 and M1) in 12 isolates were primarily assumed to be A. oryzae by morphological characterization. TB1 and G2 revealed the highest protease activity with 49. The protease was labile in the sodium chloride solution alternated from 0% to 20%.

The protease activity of TB1 and G2 behaved high salt tolerance in 16% NaCl and retained 49.8%, respectively, of initial activity after 9 hours. The optimum pH for activity of the extracellular protease of both isolates TB1 and G2 were shown to be 7. The protease was more stable in the neutral condition than in acid or alkaline environments. After incubation at 37oC for 12 hours at pH 7.0, the enzyme activity left were detected only 37% for TB1 and 41% for G2.

TB1 was determined to be Aspergillus oryzae by the molecular method. Key words: Aspergillus oryzae (A.oryzae), protease, salt tolerance. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. INTRODUCTION Proteases are multifunctional enzymes and represent a fundamental group of enzymes due to diversity of their physiological roles and biotechnological applications (Silva et al.

These enzymes are extremely important in the pharmaceutical, medical, food, and biotechnology industries, accounting for nearly 60% of the whole enzyme market (Ramakrishna, Rajasekhar et al. It has been estimated that microbial proteases represent approximately 40% of the total worldwide enzyme sales (Rao et al. Proteases are ubiquitous but to get high salt tolerant neutral proteases is still receiving considerable attention. Proteases can be classified into three types based on their optimum functional pH.

Neutral protease is more important for food industry because it can hydrolyze the proteins of the raw materials thoroughly and reduce the bitterness. It is mainly used in the industry of food fermentation, brewing and feed additives etc. In addition, some kinds of food are unique due to its high concentration of sodium chloride. The higher sodium chloride content provided a lower degree of protein degradation.

The salt stable proteases are used in fermented food production, antifouling coating preparation and waste treatment, especially at marine habitat (Gao et al. The protease activity and stability decreased sharply when the materials is mixed with sodium chloride at high concentration, which is used for inhibiting spoilage bacteria, selectively retaining the slow growth of osmotolerant yeast and lactic acid bacteria as well as prolonging the preservation time. Consequently, a protease which could tolerate high concentration of sodium chloride is important in order to improve food quality, to shorten the time for the maturation process and to improve the efficiency of raw material utilization (Wang et al. Since proteases are physiologically necessary for living organisms, being found in a wide diversity of sources such as plants, animals, but commercial proteases are produced exclusively from microorganisms.

Fungi of the genera Aspergillus, Penicillium and Rhizopus are especially useful for producing proteases, as several species of these genera are generally regarded as safe, of which, Aspergillus oryzae (A.oryzae) is mentioned (Chutmanop, Chuichulcherm et al. This fungus is also a potential source of proteases due to their high 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] proteolytic activity, broad biochemical diversity, their susceptibility to genetic manipulation, high productivity, and being extracellular and are easily recoverable from the fermentation medium (de Castro and Sato 2014). Many studies have characterized the proteases from A.oryzae and disclosed their role in food processing technology. However, there have been only a few reports on the mechanism of the protease stability under high concentration of sodium chloride.

In order to enhance the performance of the enzyme in shortening the production cycle and conversion rate of raw materials, studies on the protease properties under high concentration of sodium chloride are necessary. Besides morphological and physical chemical characteristics, identification of the accurate A. oryzae by methods of biochemistry and molecular biology is extremely necessary. In this context, the study "Isolation, selection and identification of Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease" is conducted.

OBJECTIVES OF STUDY  General objective The aim of this study is to isolate, select and identify the Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease from some Vietnam natural sources.  Specific objectives - Isolate A. oryzae from some Vietnam natural sources and primarily identify by morphological method; - Select strains producing protease by well diffusion and enzymatic assay; - Determine the high salt tolerance of protease activity and stability; - Determine the effect of pH on protease activity and stability; - Identify isolated strains using molecular biology method. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] PART II.

Enzyme protease Protease or peptidase is one of member in hydrolysis enzyme group that is capable of cutting the peptide link of polypeptide molecules, proteins and some other similar substrates into free amino acids and low molecular peptides. Crystal structure of protease from Aspergillus oryzae (Kamitori, et al., 2003) The characters of this enzyme are common with respect to optimum pH, temperature and stability. The biochemical characterization showed that the enzyme was most active over the pH range 5.5 and was stable from pH 4. The optimum temperature range for activity was 55–60°C, and the enzyme was stable at temperatures below 45°C (Vishwanatha, 2009).

Majority of these enzymes show low thermostability and lose their activities and structure at high temperature (Rao et at. In the body, proteins in food are digested in the digestive tract by protein- degrading enzymes, first pepsin in gastric juice and then secretions in the pancreas and from mucosal cells, intestine. Amino acids are absorbed into the liver and then involved in the metabolism. Protein hydrolysis plays an important role in the production of many foods.

This process can be accomplished by the protease of the food itself or the microbial protease introduced into the food processing process. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Protease is one of the most important commercial enzymes, and is used in food processing, detergents, diary industry and leather making. Proteases occur widely in plants and animals, but commercial proteases are produced exclusively from microorganism. Molds of the genera Aspergillus, Penicillium and Rhizopusare especially useful for producing proteases, as several species of these genera are generally regarded as safe (Chutmanop, Chuichulcherm et al.

Classification of proteases As reported by Pushpam, proteases are classified into six types based on the functional groups in their active sites. They are aspartic, cysteine, glutamic, metallo, serine, and threonine proteases. They are also classified as exo- peptidases and endo-peptidases, based on the position of the peptide bond cleavage. Proteases are also classified as acidic, neutral or alkaline proteases based on their pH optima.

Exopeptidases: The exopeptidases act only near the end of polypeptide chains.