ĐẶT VẤN ĐỀ Được nghiên cứu từ những năm 50 và khoảng 20 năm sau nhờ những đặc tính như sử dụng được nhiều lần, sản phẩm tinh sạch, thích hợp với các qui trình tự động hoá, enzyme cố định đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như trong nghiên cứu cơ bản hoá sinh, trong y dược học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghiệp chế biến, hoá chất và trong bảo vệ môi trường. Trong số các nghiên cứu ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp, enzyme amylase được quan tâm nhiều nhất, bởi đây là enzyme có ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm. Enzyme amylase cố định được ứng dụng trong sản xuất đường fructose nồng độ cao, trong thuỷ phân các loại tinh bột… Ưu điểm của việc sử dụng enzyme cố định là giảm được giá thành sản phẩm, tăng sức cạnh tranh của sản phẩm trên thị trường… Enzyme amylase thường được cố định trên các chất mang như polyacrylamide, alginate, CMC,… Đề tài “Cố định amylase trên chitosan” nhằm tìm hiểu khả năng gắn kết enzyme amilase trên hạt rắn chitosan và các tác nhân ảnh hưởng đến hiệu suất gắn protein- enzyme, từ đó chọn ra điều kiện tốt nhất trong phương pháp cố định amilase bằng liên kết cộng hóa trị hay hấp phụ trên hạt rắn chitosan. Quá trình thủy phân tinh bột thành glucose syrup phải trải qua nhiều giai đoạn nhằm phân cắt hoàn toàn các liên kết glucoside để giải phóng glucose.
Trên thực tế người ta thường sử dụng enzyme α – amylase trong quá trình dịch hóa của tinh bột, còn glucose – amylase, pullulanase được sử dụng trong quá trình đường hóa. Do vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện cố định hai loại enzyme α – amylase và glucose – amylase trên chitosan với mục đích sử dụng được nhiều lần và loại bỏ dễ dàng enzyme trong thành phẩm.2 MỤC TIÊU: - Khảo sát các điều kiện cố định enzyme α – amylase và glucose – amylase nhằm đưa ra điều kiện tối ưu nhất cho quá trình cố định enzyme trên hạt chitosan. - Đánh giá chất lượng enzyme cố định.3 NỘI DUNG: - Khảo sát các điều kiện cố định enzyme α – amylase và glucose – amylase riêng lẽ do hai enzyme này có điều kiện nhiệt độ và pH tối thích khác nhau. - Tối ưu hóa quá trình cố định.
- Khảo sát nhiệt độ và pH tối thích của hai enzyme. - Khảo sát khả năng tái sử dụng. 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. CÁC ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT (AMYLOLYTIC ENZYME) [3, 14, 17] Có 5 nhóm enzyme cơ bản tham gia thủy phân tinh bột: [17] − Nhóm endoamylase và exoamylase thủy phân chủ yếu ở liên kết α–1,4 glycoside.
− Nhóm cắt nhánh thủy phân liên kết α–1,6 glycoside. − Nhóm isomerase xúc tác phản ứng chuyển đồng phân hóa từ glucose thành fructose, được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất syrup fructose từ syrup glucose. − Nhóm cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân tinh bột đồng thời xúc tác quá trình tạo vòng cyclodextrin. Các enzyme chuyển hóa tinh bột α–1,4–glucanases α–1,6–glucanases Endo– Exo– Endo– Exo– α–amylase β–amylase Pullulanase Exopullulanase Glucose - Isoamylase amylaseIsopul lulanaseα– glucosidase Hình 2.1: Các enzyme thủy phân tinh bột [17] 4 Bảng 2.1: Phân loại enzyme dùng trong sản xuất syrup tinh bột, maltodextrin và cyclodextrin [17] Loại Nguồn Vị trí xúc tác pHopt Topt (oC) Bacillus subtilis α-1,4-glycoside 6,0 65 – 70 Endoamylase B.
licheniformis α-1,4-glycoside 5,0 – 7,0 90 Aspergillus oryzae α-1,4-glycoside 4,5 50 – 60 α-1,4-glycoside 4,0 – 5,0 60 A.niger Exoamylase α-1,6-glycoside Bacillus sp. α-1,4-glycoside 5,0 55 – 60 Clostridium sp. α-1,4-glycoside 5,5 – 6,0 75 – 85 Klebsiella aerogenes α-1,6-maltotrioside 5,0 60 α-1,6-amylase Pseudomonas sp. α-1,6-heptasacch 4,0 50 – 55 Streptomyces griseus α-1,4-glycoside – – B.circulans α-1,4-glycoside – – Exo-α-amylase Pseudomonas stutzeri α-1,4-glycoside – – Pseudomonas sp.circulans α-1,4-glycoside – – Aldo/keto pentose 8,2 65 Isomerase B.circulans Aldo/keto hexose B.macerans α-1,4-glycoside 5,0 50 Glucanotransferase Thermoanaerobacter sp.
α-1,4-glycoside 4,5 90 Endo/Exocellulase Trichoderma reesei β-1,4-glycoside – – Endoprotease B.2: Vị trí hoạt động của amylolytic enzyme [17] Chú thích: − A: α-amylase. − D: Enzyme cắt mạch nhánh. − Ø, đầu tận cùng khử. Endo-enzyme Cơ chế tác dụng: Endo-enzyme thủy phân liên kết α-1,4 glycoside bên trong phân tử amylose, amylopectin, và các polysaccharide tương tự nhưng không thủy phân liên kết α-1,6 glycoside trong amylopectin.
Sản phẩm thủy phân là các oligosaccharide có độ dài chuỗi khác nhau và có cấu tạo α trên C1 của nhóm khử trong phân tử glucose. [14] Có hai endoamylase khác nhau (EC 3.1): bền nhiệt và không bền nhiệt. Hiện nay, hai loại α-amylase thương mại quan trọng là: − Amylase từ B.subtilis nếu có mặt ion Ca2+ sẽ có nhiệt độ tối thích trong khoảng từ 65 đến 70oC.licheniformis hoạt động và ổn định trong dung dịch tinh bột ở nhiệt độ trên 90oC, sự ổn định tương đối độc lập với ion Ca2+, và nó hoạt động tốt hơn với khoảng pH rộng. Exoamylase Cơ chế tác dụng: Một số có thể cắt liên kết α-1,6 (hình 2.2), nhưng tốc độ phản ứng chậm hơn so với khi thủy phân liên kết α-1,4.
Exoamylase hoạt động trên các liên kết bên ngoài từ đầu tận cùng không khử và tạo ra các sản phẩm khối lượng phân tử thấp.[14] Hai loại exoenzyme quan trọng trong thủy phân tinh bột được ứng dụng trong công nghiệp là: glucogenic exoamylase và maltogenic exoamylase.1 Glucose – amylase [3] Glucose - amylase có khả năng thủy phân liên kết α – 1,4 lẫn α – 1,6 glucoside. Khi thủy phân liên kết α – 1,4 glucan trong chuỗi polysaccharide, glucose - amylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Ngoài các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 glucoside, glucose - amylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α – 1,2 và α – 1,3 glucoside. Glucose - amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại amylase khác.
Glucose - amylase thủy giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ. Các polysaccharide có nhánh như amylosepectine, glucogen, β – dextrin bị glucose - amylase thủy phân khá nhanh. Ở nồng độ glucose cao, glucose - amylase tái tổng hợp các phân tử glucose hình thành maltose và isomaltose. Hiện tượng này xảy ra rõ hơn ở nồng độ cơ chất cao và nồng độ enzyme cao.
Trong dung dịch glucose - amylase thô thường có mặt transglucosidase (EC 2.24), enzyme này cũng có khả năng trùng hợp glucose.2 β-amylase Enzyme β-amylase (EC 3.2), có nguồn gốc thực vật. Lúa mạch, lúa mì, khoai tây, và đậu nành là những nguồn phổ biến để thu nhận β-amylase. Tuy nhiên, β-amylase cũng tồn tại như một enzyme ngoại bào trong Bacillus sp. và Pseudomonas sp.
[14] β-amylase hoạt động theo kiểu exo, thủy phân từ đầu tận cùng không khử của chuỗi bên ngoài phân tử tinh bột hoặc polysaccharide tương tự, và mạch ngắn dần tạo β-maltose. Amylose được chuyển hoàn toàn thành maltose, ngược lại amylopectin và các polymer mạch nhánh khác được thủy phân thành nhiều sản phẩm khác nhau phụ thuộc vào mức độ phân nhánh, kết quả quá trình thủy phân này khoảng 50 – 60% chuyển thành maltose. Kết quả này là do β-amylase không thể thủy phân liên kết α-1,6. Hoạt tính cao nhất đạt được ở pH 5.
Nhiệt độ tối thích khoảng giữa 55 và 60oC. α-1,6 enzymes Các enzyme α-1,6 (hay còn gọi là các enzyme cắt nhánh - debranching enzyme), vài thập niên qua đã được biết đến nhưng chưa phổ biến, như pullulanase (EC 3.41) và isoamylase (EC 3. Gần đây các enzyme này thu hút nhiều sư chú ý do có thể cải thiện hiệu suất thủy phân khi có mặt một enzyme cắt nhánh trong hệ thống. [14] Các enzyme cắt nhánh có 2 nhóm, có hoạt tính endo có thể thủy phân liên kết α-1,6 glycoside ở điểm nhánh của amylose, glycogen, pullulan và các oligosaccharide tương tự: − Nhóm đầu tiên là pullulanase, thủy phân đặc hiệu liên kết α-1,6, giải phóng các oligosaccharide mạch thẳng gồm các nhóm glucose liên kết bằng liên kết α-1,4.
8 − Nhóm thứ hai của deranching enzyme là neopullulanase và amylopullulanase, có hoạt tính nhắm vào cả liên kết α-1,6 và α-1,4 glycoside. Pullulanase [17] Được phát hiện đầu tiên vào năm 1961 và thu hút sự chú ý vì nó hoạt động đặc hiệu trên liên kết α-1,6 của pullulan (một polymer D-glucose mạch thẳng bản chất gồm các đơn phân maltotriosyl liên kết với nhau bằng liền kết α-1,6), tinh bột, amylopectin, và các oligosaccharide tương tự. Pullulanase thủy phân tinh bột tạo các sản phẩm DP trung bình thay đổi từ 115 đến 2300. Enzyme này thường dùng kết hợp với glucose - amylase, α- hoặc β- amylase.3: Cấu trúc của pullulan [17] Chú thích: − O: gốc glucose.
Isoamylase [17] Isoamylase được phát hiện vào năm 1949, được thu nhận ở phòng thí nghiệm từ một số vi sinh vật như K. aerogenes và Pseudomonas sp. Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6 glycoside trong amylopectin và có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính trên pullulan. 9 Trong phản ứng thủy phân tinh bột, khi sử dụng isoamylase trước amyloglucosidase, phần amylopectin được tách khỏi polymer nhanh chóng và vì thế rất dễ bị hồ hóa.
Thời điểm cho isoamylase vào hệ thống thủy phân rất quan trọng. Isomerases Glucose isomerase (EC 5.5) được ứng dụng quan trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm là dùng để chuyển glucose thành fructose. Cobalt được biết là chất hoạt hóa glucose isomerase, nhưng glucose isomerase từ một số nguồn lại không cần ion cobalt. Magnesium là một chất hoạt hóa khác của những enzyme này.
Ngược lại, calcium và oxygen có tác động ức chế, tác động ức chế của calcium có thể khắc phục bằng cách cho magnesium vào, ngược lại tác động của oxygen được khắc phục nhờ quá trình nhiệt. Vì thế, việc tinh sạch cơ chất (glucose syrup) rất quan trọng để enzyme ổn định. [17] Glucose isomerase Glucose Fructose Hình 2.4: Quá trình chuyển đồng phân glucose thành fructose[17] 2. Cyclodextrin Glycosyltransferase Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase; EC 2.19) thủy phân một loạt đầu không khử cyclomaltooligosaccharides chuyển thành cyclodextrin, gồm 6, 7 hoặc 8 nhóm -glucopyranol.
Các enzyme Cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân cắt mạch nhánh của tinh bột và xúc tác tạo vòng. [14] 10 α-cyclodextrin β-cyclodextrin Phân tử tinh bột γ-cyclodextrin Hình 2.5: Cơ chế phản ứng thủy phân – liên kết của cyclodextrin glycosyltransferases. [14] Chú thích: − →, vị trí thủy phân − O-O, liên kết α-1,4. CGTase được sản xuất chủ yếu bởi Bacillus.
macerans khi thủy phân tinh bột chủ yếu tạo ra α-cyclodextrin, ngược lại CGTase bền nhiệt từ B. stearothermophilus khi thủy phân tinh bột sản xuất cả α- và β-cyclodextrin và B. subtilis CGTase thì tạo ra chủ yếu là γ-cyclodextrin. ENZYME CỐ ĐỊNH [3, 10, 18, 35, 36] 2.
Lịch sử nghiên cứu và phát triển [3] Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzyme invertase của nấm men khi hấp phụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose. Đến năm 1949, Micheal và Iuers sử dụng phương pháp azide hóa carboxymethyl cellulose để cố định những chuỗi protein có hoạt tính.