ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH TRÀ VINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH TRẦN THỊ NGÂN TÚ – LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH THÚ Y ISO 9001:2015 TRẦN THỊ NGÂN TÚ PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CÓ LỢI CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. TỪ ĐẤT VÀ PHÂN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI GÀ TRONG TỈNH TRÀ VINH LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH THÚ Y NĂM BẢO VỆ: 2020 TRÀ VINH, NĂM 2020 ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH TRÀ VINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH TRẦN THỊ NGÂN TÚ PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CÓ LỢI CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. TỪ ĐẤT VÀ PHÂN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI GÀ TRONG TỈNH TRÀ VINH LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH THÚ Y MÃ NGÀNH: 8640101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TIẾN SĨ NGUYỄN THỊ ĐẤU TRÀ VINH, NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết công trình nghiên cứu “Phân lập, định danh và xác định các đặc tính có lợi của chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ đất và phân tại trại chăn nuôi gà trong tỉnh Trà Vinh” hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Trà Vinh, Ngày 20 tháng 09 năm 2020 NGƯỜI THỰC HIỆN TRẦN THỊ NGÂN TÚ i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành các nội dung trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ quý thầy cô, bạn bè. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: TS. Nguyễn Thị Đấu đã động viên, hỗ trợ chuyên môn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Quí thầy cô Bộ môn Thú y, khoa Nông nghiêp và Thủy sản, trường Đại học Trà Vinh đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quí báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Tập thể kỹ thuật viên phòng xét nghiệm công ty trách nhiệm hữu hạn dịch vụ và thương mại Nam Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được thực hiện các xét nghiệm vi sinh. Các công tác viên thú y ở 3 xã Nguyệt Hóa, Song Lộc thuộc huyện châu Thành và xã Đại Phước thuộc huyện Càng Long đã hỗ trợ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu vi sinh tại các trại gà trong địa bàn xã phụ trách. Xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp, các anh, chị, em phòng thí nghiệm vi sinh của Khoa Nông nghiệp và Thủy sản đã hỗ trợ, chia sẻ và cung cấp thông tin giúp tôi hoàn thành luận án. Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên, chia sẻ và luôn sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. ii TÓM TẮT Đề tài “Phân lập, định danh và xác định các đặc tính có lợi của chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ đất và phân tại trại chăn nuôi gà trong tỉnh Trà Vinh” được thực hiện với mục đích phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp. có tiềm năng probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất và phân của trại gà. Nghiên cứu này nhằm tìm biện pháp mới thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy cơ lan rộng các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh trong tự nhiên. Đề tài đã phân lập được 62 chủng vi khuẩn từ 35 mẫu đất và 35 mẫu phân gà thu thập tại các trại gà tại 2 huyện của tỉnh Trà Vinh. Các chủng vi khuẩn này được chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với các chỉ tiêu như: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP (Voges - Proskauer), và chịu nhiệt cao (phát triển được ở 500C); Kết quả phân tích cho thấy đã chọn ra được 7 chủng vi khuẩn đạt chỉ tiêu về mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu. Nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic, 7 chủng Bacillus spp. tuyển chọn đã được khảo sát các đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính chịu nhiệt (phát triển ở nhiệt độ từ 500C), tính nhạy cảm kháng sinh (colistin, trimethoprim, streptomycin, ampicillin, tetracyclin, norfloxacin), khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease), khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh (Salmonella enterica), khả năng chịu pH thấp (pH 2,0), khả năng chịu muối mật 0,3%, khả năng bám dính (tự bám dính). Kết quả cho thấy trong 7 chủng vi khuẩn khảo sát, có 2 chủng P6.N thể hiện tốt nhất các đặc tính probiotic. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen trên cơ sở dữ liệu NCBI) cho thấy chủng P6.N thuộc loài Bacillus coagulans và chủng P21.N thuộc loài Bacillus subtilis với độ tương đồng 100%. subtilis, gà, phân lập, định danh, probiotic, Trà Vinh iii ABSTRACT The dissertation “Isolation and identification of some Bacillus spp. accessions with high biological from soil and fecal samples at intensive chicken farms in Trà Vinh province” was carried out to isolate the Bacillus spp. strains with probiotic potential from soil and fecal samples at intensive chicken farms. This study aimed to find out alternatives for antibiotics in the prevention and treatment of intestinal diseases as well as to increase productivity and effectiveness in poultry industry and also to reduce the risks of spreading antibiotic resistant bacteria in nature. From 35 soil samples and 35 fecal samples of chicken farms from 2 districts in Tra Vinh province, 62 similarly Bacillus spp. bacteria were isolated. These isolates were analyzed further for Bacillus spp. characteristics by physiobiological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer) and temperature tolerance (being able to grow at 500C). The results showed that there were 7 isolates which satisfied the required physio- biochemical criteria. In order to select the B. subtilis strain with probiotic capabilities, 7 selected Bacillus spp. isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (colistin, trimethoprim, streptomycin, ampicillin, tetracyclin, norfloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 500C), extracellular enzyme production (amylase, protease), bacterial pathogen inhibition properties (Salmonella enterica), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts & adherence ability (autoaggregation). The results showed that among 7 isolates observed, the strain 2 isolates P6.N exposed the best probiotic capabilities. Identified by the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank), the P6.N strain is 100% similarity with Bacillus coagulans and the P21.N strain is 100% similarity with Bacillus subtilis. subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic, Tra Vinh iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN . iv CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN .1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.1 Mục tiêu chung .2 Mục tiêu cụ thể .3 PHẠM VI GIỚI HẠN ĐỀ TÀI .1 Phạm vi nội dung .2 Phạm vi không gian .3 Phạm vi thời gian .4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỐI TƯỢNG KHẢO SÁT .1 Đối tượng nghiên cứu.2 Đối tượng khảo sát . 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .1 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC.1 Lịch sử về probiotic .2 Các định nghĩa về probiotic .3 Vai trò và cơ chế tác động của probiotic .4 Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm .5 Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic trong chăn nuôi .6 Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic .1 Về mặt sản xuất .2 Về mặt sử dụng cho vật nuôi.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SPP.1 Đặc điểm chung của giống Bacillus .2 Các vi khuẩn Bacillus spp. có tiềm năng probiotic .3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ PROBIOTIC TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC . Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới . Một số nghiên cứu về probiotic trong nước .4 MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG TIÊU HÓA THƯỜNG GẶP TRÊN GÀ . 28 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu .2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng .3 Môi trường sử dụng .2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1 .2 Phương pháp thực hiện .1 Phương pháp lấy mẫu .2 Số lượng mẫu .3 Phân lập Bacillus spp. bằng phương pháp truyền thống .3 NỘI DUNG 2: TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACLLUS SPP. CÓ ĐẶC TÍNH PROBIOTIC .1 Khả năng kháng kháng sinh .2 Khả năng sinh các enzyme tiêu hóa (amylase, protease) .3 Khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh .4 Khả năng chịu đựng tác động của dịch tiêu hóa (pH thấp và muối mật) .1 Khả năng chịu pH thấp .2 Đánh giá khả năng chịu muối mật .4 NỘI DUNG 3: ĐỊNH DANH DÒNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. CÓ TIỀM NĂNG PROBIOTIC .1 Quy trình tách chiết .2 Quy trình PCR.3 Phương pháp điện di . 38 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1 PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SPP.2 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH BẰNG CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA .3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC .1 Kết quả khảo sát khả năng nhạy/kháng kháng sinh . Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào amylase và protease .3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh .4 Kết quả khảo sát khả năng chịu tác động của dịch tiêu hóa (pH thấp và muối mật) .5 Kết quả khảo sát khả năng bám dính giữa các chủng Bacillus spp.5 ĐỊNH DANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN . 53 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT . 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH, BẢNG BIỂU Bảng 1. 1 Phân loại khoa học trực khuẩn Bacillus spp. 2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis .1 Phân bố địa điểm lấy mẫu.2 Thành phần cho 1 phản ứng PCR .3 Chu kỳ nhiệt của máy PCR.1 Số dòng vi khuẩn được phân lập tại Càng Long và Châu Thành .2 Đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào của 62 dòng vi khuẩn . Kết quả sàn lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa .4 Kết quả kháng sinh đồ của 7 chủng Bacillus spp. Khả năng sinh emzym ngoại bào của 7 chủng chọn lọc .6 Khoảng cách kháng khuẩn trung bình của các chủng Bacillus spp. chọn lọc47 Bảng 4.7 Mật độ vi khuẩn Bacillus spp. tại các mức pH .8 Mật độ vi khuẩn Bacillus spp. tại các thời điểm khảo sát .9 Tỷ lệ bám dính của vi khuẩn Bacillus spp. sau 1; 2; 3 và 4 giờ khảo sát .10 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA . 1 Sơ đồ tổng hợp cơ chế bảo vệ sức khỏe của probiotic . 2 Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vi khuẩn probiotic và niêm mạc ruột 8 Hình 1. 3 Mô Hình cấu tạo tế bào Bacillus spp.4 Sơ đồ quá trình hình thành nha bào của Bacillus subtilis . 5 Hình thái của vi khuẩn Bacillus subtilis. 6 Hình thái của vi khuẩn Bacillus clausii . 7 Hình thái của vi khuẩn Bacillus Coagulans . 8 Hình thái của vi khuẩn Bacillus licheniformis .1 Khuẩn lạc và hình thái vi khuẩn Bacillus spp.2 Kết quả test các phản ứng sinh hóa .
