Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ mang tên "Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ" được thực hiện trong lĩnh vực Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Hóa phân tích thực nghiệm. Nghiên cứu tập trung giải quyết các vấn đề liên quan đến việc đánh giá giá trị dinh dưỡng, phân lập các hoạt chất hóa học thứ cấp và thử nghiệm hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên nấm lớn tại khu vực Bắc Trung Bộ Việt Nam.

Về tính cấp thiết, nấm lớn giữ vai trò sinh thái quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất tự nhiên nhờ khả năng phân hủy chất bã hữu cơ. Về mặt giá trị sử dụng, nấm là nguồn thực phẩm giàu protein, chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu, hàm lượng chất béo thấp (chủ yếu là acid béo chưa bão hòa), giàu khoáng chất, vitamin và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học như tăng cường hệ miễn dịch, kháng viêm, hỗ trợ điều trị ung thư, viêm gan và ức chế virus. Việt Nam có mức độ đa dạng sinh học cao với hơn 2.500 loài nấm đã được ghi nhận tính đến năm 2015, trong đó có khoảng 1.400 loài nấm lớn thuộc 120 chi; hơn 50 loài nấm ăn và khoảng 200 loài nấm dược liệu. Riêng tại tỉnh Nghệ An, hệ thống các khu bảo tồn thiên nhiên và rừng đặc dụng như Vườn Quốc gia Pù Mát, Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và Pù Hoạt sở hữu nguồn tài nguyên sinh vật phong phú. Tuy nhiên, các nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học, giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của nấm lớn tại khu vực này trước thời điểm nghiên cứu còn hạn chế, chưa có các dữ liệu phân tích định lượng đầy đủ về các nguyên tố vi lượng đặc thù (như gecmani, selen), thành phần acid amin, vitamin và các hợp chất sterol.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ 08 loài nấm lớn thu hái tại vùng Bắc Trung Bộ của Việt Nam, được ký hiệu mã hóa từ Mush 01 đến Mush 08:

  1. Ganoderma applanatum (Mush 01)
  2. Daldinia concentrica (Mush 02)
  3. Ganoderma lucidum (Mush 03)
  4. Ganoderma lobatum (Mush 04)
  5. Ganoderma philippii (Mush 05)
  6. Ganoderma multiplicatum (Mush 06)
  7. Fomitopsis dochmius (Mush 07)
  8. Trametes gibbosa (Mush 08)

Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của luận án được đánh số theo văn bản gồm:

  1. Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ dịch chiết của 08 loài nấm lớn nghiên cứu (Ganoderma applanatum, Daldinia concentrica, Ganoderma lucidum, Ganoderma lobatum, Ganoderma philippii, Ganoderma multiplicatum, Fomitopsis dochmius và Trametes gibbosa).
  2. Xác định thành phần dinh dưỡng như: thành phần khoáng và nguyên tố vi lượng, acid amin, vitamin A, vitamin E.
  3. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide.
  4. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ quả thể của hai loài nấm: Ganoderma applanatum (Mush 01) và Daldinia concentrica (Mush 02).
  5. Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.

Phạm vi nghiên cứu về không gian tập trung tại khu vực rừng tự nhiên thuộc Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống, tỉnh Nghệ An. Phạm vi về thời gian thu mẫu thực địa được thực hiện vào tháng 08 năm 2015.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong lịch sử nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ nấm lớn, hợp chất chuyển hóa bậc hai đầu tiên được phân lập từ nấm P. glaucoma là acid mycophenolic do Gosio công bố. Đến năm 1929, Alexander Fleming công bố hợp chất penicillin phân lập từ nấm mốc Penicillium notatum. Từ năm 1940, các chất chuyển hóa bậc hai từ nấm lớn nhận được sự quan tâm rộng rãi từ giới khoa học; đến nay đã có hơn 8.600 hợp chất chuyển hóa bậc hai có hoạt tính sinh học được phân lập và xác định cấu trúc.

Về thành phần dinh dưỡng, các công bố quốc tế chỉ ra rằng quả thể nấm tươi chứa khoảng 90% nước, hàm lượng chất khô chiếm khoảng 10% bao gồm carbohydrate, protein, chất xơ và chất khoáng. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO, 1991), protein nấm có chất lượng dinh dưỡng cao hơn protein thực vật; do tỷ lệ hợp chất nitơ phi protein (chitin) cao nên hệ số chuyển đổi nitơ thành protein được sử dụng là 4,39. Nấm thường chứa hàm lượng protein dao động từ 12,0% đến 29,3% tính theo khối lượng chất khô (dm); một số loài như Cantharellus cibarius và Lepista nuda đạt hàm lượng lần lượt là 54% và 59% dm. Dữ liệu của Sun và cộng sự (2012) khi nghiên cứu 41 loài nấm từ Vân Nam cho thấy tỷ lệ các acid amin thiết yếu trên tổng số acid amin (EAA/TAA) dao động từ 0,27 đến 0,51; tỷ lệ acid amin mang vị umami (acid aspartic và glutamic) chiếm trung bình 0,22. Liu và cộng sự (2012) ghi nhận tỷ lệ acid béo bão hòa trên acid béo chưa bão hòa (SFA/UFA) của nấm tự nhiên nằm trong khoảng 4,3 đến 12,7. Về các nguyên tố vi lượng, hàm lượng selen (Se) trong các loài Boletus có thể vượt quá 10 mg/kg dm, đạt 48,5 mg/kg dm ở Boletus aestivalis và 19,9 mg/kg dm ở Boletus pinophilus; trong khi đó hàm lượng gecmani (Ge) được ghi nhận ở nấm Phellinus vùng Đông Bắc Thái Lan dao động từ 0,32 đến 1,70 mg/kg khối lượng tươi.

Đối với chi nấm than Daldinia, dữ liệu của Index Fungorum (CABI 2012) ghi nhận hơn 80 loài, trong đó có 25 loài mang giá trị dược liệu. Các nghiên cứu hóa học đã phân lập nhiều nhóm chất chuyển hóa thứ cấp: daldiaol A-C có hoạt tính kháng viêm từ Daldinia chidiae; Nagasawa và cộng sự (2000) phân lập cytochalasin (1) và 14 dẫn xuất từ quả thể Daldinia vernicosa có hoạt tính kháng dòng ung thư ruột kết HCT116; neocytochalasin (2) và polyketide từ Daldinia eschscholzii; các dẫn xuất 5-hydroxy-2-methyl-chroman-4-one (3), peperovulcanone A (4), 8-methoxynaphtalen-1-ol (5) từ Daldinia loculata. Riêng đối với loài Daldinia concentrica, các công trình trước đây đã phân lập hợp chất benzofuran concenticolide có khả năng ức chế virus HIV xâm nhập tế bào người, hợp chất caruilignan C chống thoái hóa thần kinh, diaporthin (8), orthosporin (9) và 6 dẫn xuất sesquiterpene.

Đối với chi nấm linh chi Ganoderma, trong hơn 50 năm qua, hơn 450 hợp chất triterpenoid khung lanostan đã được phân lập. Các nghiên cứu tiêu biểu bao gồm: Shiao M. và cộng sự phân lập acid ganoderic A và B; Hirotani và cộng sự (1983) phân lập 6 lanostanoid gồm acid ganoderic T, V, W, X, Y, Z; Akihisa T. và cộng sự (2005) phân lập 7 triterpenoid thuộc nhóm acid lucidenic; Sato và cộng sự (2009) phân lập các acid ganoderic GS-1, GS-2, GS-3 ức chế protease của HIV-1. Riêng đối với nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum, các nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận nhóm acid applanoxidic A-H, các hợp chất applanlactone A-C, methyl applaniate A, acid applanoic B-D có khả năng ức chế tăng sinh tế bào sao gan (HSC), và các acid ganoderic AP2, AP3.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Mặc dù khu hệ nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ Việt Nam rất đa dạng nhưng chưa có công trình nào đánh giá một cách có hệ thống về các chỉ tiêu dinh dưỡng vi lượng (khoáng Ge, Se, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, 17 acid amin, vitamin A, vitamin E, sterol) trên 08 loài nấm lớn tiêu biểu của khu vực; đồng thời việc phân lập các hợp chất chuyển hóa thứ cấp và thăm dò hoạt tính sinh học từ nấm than Daldinia concentrica và nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum thu hái tại Nghệ An chưa được thực hiện chi tiết.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp giữa phương pháp phân tích hóa lý định lượng và quy trình phân lập hóa thực vật, khảo sát cấu trúc hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro.

Nguồn mẫu và xử lý mẫu thực nghiệm

Các mẫu nấm lớn được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống (Nghệ An) vào tháng 08 năm 2015. Tiêu bản mẫu mang ký hiệu Vinh-TSWu-20150815 được định danh bởi PGS. Ngô Anh (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế) và lưu giữ tại Viện Công nghệ Hóa, Sinh và Môi trường thuộc Trường Đại học Vinh. Mẫu nấm sau khi thu hái được làm sạch, sấy khô bằng thiết bị sấy bơm nhiệt ở nhiệt độ 40°C, sau đó nghiền mịn và tiến hành chiết siêu âm với các dung môi thích hợp.

Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng

Quy trình vô cơ hóa và phân tích hàm lượng khoáng, vitamin, acid amin tuân thủ theo tiêu chuẩn của Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức (AOAC) và tài liệu kỹ thuật của Agilent:

Chỉ tiêu phân tích Quy trình chuẩn bị mẫu Kỹ thuật và thiết bị phân tích Điều kiện đo tối ưu
Gecmani (Ge) Phá mẫu trong lò vi sóng Unilex Uni 8300 với 5 ml HNO3 65% và 2 ml H2O2 30% Phổ khối lượng plasma cao tần cảm ứng (ICP-MS Agilent 7500) Công suất cao tần RF 1390 W, tốc độ bơm 0,1 rps, lưu lượng khí mang 1,19 l/phút
Selen (Se) Vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc và H2O2 30%, hoàn nguyên Se(VI) về Se(IV) bằng HCl đặc và KI ở 50°C Quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật hydrua hóa (HG-AAS, Shimadzu AAS-6800) Vạch phổ 196 nm, khử bằng NaBH4 1%, khí mang Ar 70 ml/phút, HCl 6N
Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn Phá mẫu vi sóng (chương trình áp suất nâng từ 20 đến 100 psi, công suất 500-800 W) Quang phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (F-AAS, Shimadzu AAS-6800/7000) Ngọn lửa C2H2 - không khí nén, bước sóng và cường độ dòng đèn đặc trưng cho từng kim loại
17 Acid amin Thủy phân 2,00 g mẫu nấm bằng HCl 6M ở 125°C trong 23 giờ trong môi trường khí N2; đệm borate pH 9-10; tạo dẫn xuất OPA và FMOC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Cột C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm), detector huỳnh quang FLD (λEx = 340 nm, λEm = 455 nm), tốc độ dòng 0,45 ml/phút, rửa giải gradient
Vitamin A và E Xà phòng hóa mẫu bằng KOH/ethanol và acid ascorbic ở 70°C trong 30 phút; chiết phân bố bằng diethyl ether; làm khô bằng Na2SO4 khan Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC pha đảo RP-18) Vitamin A: 100% ACN, detector UV (λ = 325 nm). Vitamin E: pha động 1,4-dioxan : n-hexan (1,2 : 98,8), detector FLD (λEx = 292 nm, λEm = 330 nm)
Ergosterol & Ergosterol peroxide Chiết siêu âm 2 g bột nấm với MeOH : MeCN (85:15 v/v) ở 4°C trong 30 phút, ly tâm 3500 vòng/phút Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC pha đảo RP-18) Ergosterol: MeOH:ACN (85:15), detector UV (λ = 290 nm), 30°C. Ergosterol peroxide: MeOH 100%, UV (λ = 290 nm), 35°C

Phương pháp phân tách và xác định cấu trúc hóa học

  • Phân tách hỗn hợp: Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) tráng sẵn silicagel 60 F254, sắc ký cột thường (CC) và sắc ký cột nhanh (FC) sử dụng pha tĩnh silica gel (cỡ hạt 70-230 mesh và 230-400 mesh, Merck), gel thẩm thấu Sephadex LH-20 và pha đảo RP-18. Phát hiện vết trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 368 nm, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% gia nhiệt 110°C hoặc hơi iod.
  • Khảo sát cấu trúc hóa học: Đo điểm nóng chảy trên máy Yanaco MP-S3; độ quay cực đo trên máy phân cực kế Jasco DIP-370; phổ tử ngoại (UV) trên máy Hitachi UV-3210; phổ hồng ngoại (IR) trên máy Shimadzu FTIR-8501 và Bruker dưới dạng viên nén KBr; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS trên thiết bị Bruker Daltonics APEX II 30eV và micrOTOF-QII; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) ghi trên máy Bruker 500 MHz và Bruker AVANCE III-700 MHz với dung môi deuterated (CDCl3, CD3OD) và chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).

Phương pháp thử hoạt tính sinh học

  • Hoạt tính gây độc tế bào in vitro: Thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư người gồm HepG2 (ung thư biểu mô tế bào gan), Hep3B (ung thư gan), SK-LU-1 (ung thư phổi) và SW480 (ung thư đại trực tràng), xác định giá trị nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào (IC50).
  • Hoạt tính kháng viêm: Đánh giá khả năng ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu trình bày lý do chọn đề tài dựa trên tính cấp thiết về việc nghiên cứu giá trị dinh dưỡng và hóa học dược liệu của nguồn nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ; xác định 08 loài nấm thuộc đối tượng nghiên cứu; nêu rõ 05 nhiệm vụ khoa học cần giải quyết; tóm tắt các phương pháp phân tích thực nghiệm; liệt kê các đóng góp mới của luận án. Luận án có độ dài 124 trang, gồm 23 bảng số liệu, 62 hình vẽ, 04 sơ đồ và 130 tài liệu tham khảo; cấu trúc thành các phần: Mở đầu (4 trang), Chương 1 (25 trang), Chương 2 (24 trang), Chương 3 (55 trang), Kết luận (2 trang), Danh mục công trình liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (13 trang) và phần Phụ lục chứa 70 phổ nghiệm chọn lọc.

Chương 1: TỔNG QUAN

Chương 1 tổng hợp các tài liệu học thuật trong nước và quốc tế liên quan đến đề tài:

  • Thành phần dinh dưỡng của nấm lớn: Phân tích các dữ liệu về hàm lượng chất khô, hàm lượng protein và thành phần acid amin, hàm lượng carbohydrate (chất xơ thô, β-glucan), lipid và thành phần acid béo không bão hòa, các vitamin (B1, B2, C, D, E, A) và thành phần khoáng chất (khoáng đa lượng và các nguyên tố vi lượng Se, Ge).
  • Chi nấm than (Daldinia): Khái quát đặc điểm hình thái và phân bố; tổng quan các kết quả nghiên cứu thành phần hóa học (nhóm cytochalasin, polyketide, lactone) và hoạt tính sinh học từ các loài Daldinia chidiae, Daldinia vernicosa, Daldinia eschscholzii, Daldinia loculata. Đi sâu vào loài nấm than Daldinia concentrica với đặc điểm thể quả bán cầu giòn màu nâu đen, các vòng đồng tâm và các hợp chất chuyển hóa đặc trưng.
  • Chi nấm linh chi (Ganoderma): Trình bày đặc điểm hình thái, phân loại theo y học phương Đông (lục bảo linh chi) và phân loại học hiện đại dựa trên bào tử đảm hai lớp; tổng quan về hơn 450 hợp chất triterpenoid khung lanostan phân lập từ chi này (như acid ganoderic, ganoderiol, acid lucidenic, lucidone); tổng quan về các hoạt tính gây độc tế bào, bảo vệ gan, kháng virus HIV và điều hòa miễn dịch.
  • Nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum): Phân tích đặc điểm hình thái thể quả hóa gỗ, không cuống, sống nhiều năm bám trên cây gỗ, các lớp thụ tầng phát triển theo từng năm; tổng kết các công bố về thành phần hóa học gồm các acid applanoxidic A-H, applanlactone A-C, applanoic acid B-D và acid ganoderic AP2, AP3.

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các điều kiện kỹ thuật của thiết bị:

  • Quy trình lấy mẫu thực địa tại Nghệ An (Pù Huống, Pù Mát), phương pháp xử lý, sấy khô ở 40°C và chiết siêu âm.
  • Chi tiết quy trình xử lý mẫu vô cơ hóa vi sóng và điều kiện đo ICP-MS để định lượng Ge; quy trình xử lý mẫu tạo hydrua để định lượng Se bằng HG-AAS; thông số đo ngọn lửa và vạch phổ F-AAS cho các nguyên tố Na (589,0 nm), K (766,5 nm), Ca (442,7 nm), Mg (285,2 nm), Fe (533 nm), Cu (324,76 nm), Zn (213,9 nm).
  • Quy trình thủy phân mẫu nấm xác định 17 acid amin bằng dung dịch HCl 6M ở 125°C trong 23 giờ, tạo dẫn xuất huỳnh quang tự động với OPA và FMOC, các thông số chạy gradient của hệ thống HPLC cột pha đảo C18.
  • Quy trình xà phòng hóa mẫu bằng KOH ở 70°C và chiết phân bố lỏng - lỏng xác định vitamin A, E bằng HPLC.
  • Quy trình chiết mẫu bằng MeOH/MeCN (85:15 v/v) và phân tích HPLC định lượng ergosterol và ergosterol peroxide.
  • Quy trình chiết xuất và phân lập hóa thực vật từ nấm than Daldinia concentrica: Quả thể nấm khô được chiết với methanol, cô cất thu cao tổng; hòa tan cao tổng trong nước và chiết phân bố với ethyl acetate thu được 105 g cao ethyl acetate. Tiến hành sắc ký cột silica gel cao ethyl acetate với các hệ dung môi rửa giải n-hexane - acetone và CHCl3 - MeOH với độ phân cực tăng dần, thu được 7 phân đoạn chính từ F1 đến F7. Phân đoạn F4 (4,7 g) tiếp tục được tách trên cột silica gel thu phân đoạn phụ F4.1, từ đó kết tinh và tinh chế thu được hợp chất DCM4 (10 mg) và DCM8 (21 mg). Các phân đoạn khác được phân tách liên tục để thu nhận 9 hợp chất ký hiệu từ DCM1 đến DCM9.
  • Quy trình chiết xuất và phân lập từ quả thể nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum: Tách các phân đoạn dịch chiết để thu nhận 5 hợp chất tinh khiết ký hiệu từ GAM1 đến GAM5.
  • Ghi nhận đầy đủ các thông số vật lý và phổ nghiệm (nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực, IR, HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) của các hợp chất phân lập.
  • Phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro đối với khả năng gây độc tế bào ung thư và ức chế sản sinh NO.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm định lượng và xác định cấu trúc hóa học:

  • Hàm lượng khoáng và nguyên tố vi lượng: Kết quả phân tích hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg, Se, Fe, Cu, Zn trong 08 mẫu nấm lớn Bắc Trung Bộ. Luận án xây dựng các phương trình đường chuẩn cho từng nguyên tố và so sánh sự tích lũy khoáng chất giữa các loài nấm nghiên cứu.
  • Hàm lượng acid amin: Báo cáo đường chuẩn và diện tích peak sắc ký tương ứng với nồng độ của 17 acid amin; định lượng hàm lượng acid amin thủy phân (µg/g) trong 08 mẫu nấm; đánh giá hiệu suất thu hồi acid amin trên mẫu nấm cổ linh chi G. applanatum.
  • Hàm lượng vitamin: Xây dựng đường chuẩn định lượng vitamin A (UV 325 nm) và vitamin E (FLD Ex 292 nm, Em 330 nm); kết quả phân tích cho thấy hàm lượng các vitamin này có sự biến thiên rõ rệt giữa các loài nấm.
  • Hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide: Thiết lập đường chuẩn sắc ký HPLC cho hai chất chuẩn sterol; xác định hàm lượng ergosterol (µg/kg) và ergosterol peroxide trong 08 mẫu nấm khảo sát.
  • Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nấm than Daldinia concentrica: Phân lập thành công 09 hợp chất (DCM1 - DCM9). Trong đó, luận án biện giải chi tiết dữ liệu phổ của hợp chất mới DCM1: Tinh thể không màu; phổ IR xuất hiện các dải hấp thụ cực đại tại 3386 cm-1 (nhóm hydroxyl), 2950, 2847 cm-1 (liên kết C-H), 1723 và 1664 cm-1 (nhóm carbonyl); khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS xác định pic ion phân tử [M+H]+ ở m/z 546; kết hợp phổ 1D và 2D-NMR (1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC) xác định cấu trúc hóa học của DCM1 là: [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E,16S*,18S*,19R*). Hợp chất DCM8 được xác định là ergosterol.
  • Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum: Tách được 05 hợp chất gồm GAM1 (ergosterol), GAM2 (5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol), GAM3 (ergosta-7,22-dien-3β-ol), GAM4 (lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) và GAM5 (3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid) dựa trên dữ liệu phổ NMR và DEPT.
  • Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học: Báo cáo kết quả thử nghiệm độc tính tế bào của 5 hợp chất (DCM1 - DCM5) trên các dòng tế bào ung thư:
    • Hợp chất DCM2 và DCM3 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu đối với cả 4 dòng tế bào khối u thử nghiệm với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 23,0 ± 1,1 đến 58,2 ± 2,3 µM.
    • Hợp chất DCM4 và DCM5 thể hiện độc tính tế bào yếu đối với hai dòng tế bào gan HepG2 và Hep3B với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 21,5 ± 5,1 đến 46,9 ± 3,7 µM; hai hợp chất này không thể hiện hoạt tính đáng kể ở nồng độ thử nghiệm cao nhất đối với dòng SK-LU-1 và SW480.
    • Báo cáo kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng viêm qua khả năng ức chế nitric oxide (NOs INHIBITION).

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã công bố các kết quả đóng góp mới về mặt khoa học thực nghiệm và dữ liệu tài nguyên sinh học:

  1. Dữ liệu dinh dưỡng của 08 loài nấm lớn: Lần đầu tiên tại Việt Nam, luận án tiến hành nghiên cứu và công bố có hệ thống thành phần dinh dưỡng (khoáng Ge, Se, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn; 17 acid amin; vitamin A; vitamin E) của 08 loài nấm lớn tại vùng Bắc Trung Bộ: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08).
  2. Dữ liệu định lượng sterol: Lần đầu tiên xác định được hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide trong 08 loài nấm lớn nêu trên tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC.
  3. Hợp chất mới từ nấm than Daldinia concentrica: Phân lập được 09 hợp chất từ dịch chiết ethyl acetate của quả thể nấm than Daldinia concentrica. Trong đó, hợp chất ký hiệu DCM1 có tên hóa học [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E,16S*,18S*,19R*) được xác định là một hợp chất mới.
  4. Các hợp chất lần đầu tìm thấy trong Ganoderma applanatum: Từ dịch chiết quả thể nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum, luận án phân lập được 05 hợp chất (GAM1 đến GAM5). Trong đó, có 03 hợp chất gồm ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3), lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) và 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) lần đầu tiên được tìm thấy từ loài nấm này.
  5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Lần đầu tiên công bố dữ liệu thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của 5 hợp chất (DCM1, DCM2, DCM3, DCM4, DCM5) trên các dòng tế bào HepG2, Hep3B, SK-LU-1 và SW480. Xác định DCM2 và DCM3 có giá trị IC50 từ 23,0 ± 1,1 đến 58,2 ± 2,3 µM; DCM4 và DCM5 có giá trị IC50 từ 21,5 ± 5,1 đến 46,9 ± 3,7 µM đối với HepG2 và Hep3B.

Về mặt kiến nghị và giải pháp đề xuất, tác giả định hướng việc tiếp tục khai thác các phân đoạn còn lại từ các dịch chiết nấm; bảo tồn và phát triển các loài nấm có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học cao tại khu vực rừng Bắc Trung Bộ nhằm cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi nghiên cứu và các dữ kiện được tác giả trình bày trong văn bản, luận án có một số giới hạn thực nghiệm:

  • Giới hạn về đối tượng và địa bàn: Nghiên cứu tập trung vào 08 loài nấm lớn được thu thập tại một số điểm thuộc Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống (Nghệ An) trong một đợt thu mẫu (tháng 08 năm 2015), chưa khảo sát biến động hàm lượng dinh dưỡng và hoạt chất theo các mùa sinh trưởng khác nhau hoặc ở các vùng sinh thái lân cận.
  • Giới hạn phân lập hóa thực vật: Việc phân lập và xác định cấu trúc chi tiết mới chỉ thực hiện tập trung trên 02 loài là nấm than Daldinia concentrica và nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum; các loài còn lại trong nhóm 08 loài chủ yếu mới dừng lại ở bước khảo sát thành phần dinh dưỡng tổng thể và định lượng sterol.
  • Giới hạn thử nghiệm hoạt tính: Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được mới được sàng lọc ở quy mô in vitro (độc tính tế bào ung thư và ức chế giải phóng NO), chưa đi sâu vào cơ chế phân tử chi tiết cũng như các thử nghiệm in vivo.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được văn bản gợi mở bao gồm: Tiếp tục phân tách các phân đoạn dịch chiết còn lại của Daldinia concentrica và Ganoderma applanatum; mở rộng nghiên cứu hóa thực vật trên 06 loài nấm còn lại; khảo sát sâu hơn cơ chế tác động sinh học của hợp chất mới DCM1 và các dẫn xuất lanostanoid.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo trong các lĩnh vực:

  • Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học thuộc các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa phân tích, Dược liệu học, Công nghệ sinh học thực vật và Nấm học: Có thể tham khảo chi tiết quy trình xử lý mẫu vô cơ hóa vi sóng cho phân tích nguyên tố vi lượng (Ge, Se); quy trình tạo dẫn xuất tự động OPA/FMOC phân tích acid amin bằng HPLC huỳnh quang; quy trình phân tách sắc ký cột silica gel và hệ thống dữ liệu phổ nghiệm cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC) để giải đoán cấu trúc khung cytochalasan và lanostanoid.
  • Các nhà nghiên cứu và cơ quan quản lý dược liệu, tài nguyên sinh vật: Cung cấp cơ sở dữ liệu định lượng về giá trị dinh dưỡng, hàm lượng acid amin thiết yếu và nồng độ các hợp chất sterol sinh học của nguồn nấm lớn tự nhiên tại khu vực Bắc Trung Bộ phục vụ định hướng bảo tồn và khai thác.

Câu hỏi thường gặp

1. Tám loài nấm lớn được nghiên cứu trong luận án gồm những loài nào và được thu thập ở đâu?

Tám loài nấm lớn nghiên cứu trong luận án gồm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08). Toàn bộ mẫu nấm được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống, tỉnh Nghệ An vào tháng 08 năm 2015, định danh bởi PGS. Ngô Anh và lưu tiêu bản với mã Vinh-TSWu-20150815 tại Trường Đại học Vinh.

2. Cấu trúc hóa học và tên gọi của hợp chất mới DCM1 được phân lập từ nấm than Daldinia concentrica là gì?

Hợp chất mới DCM1 được phân lập từ dịch chiết ethyl acetate của quả thể nấm than Daldinia concentrica, có dạng tinh thể không màu, pic ion phân tử trên phổ HR-ESI-MS ở m/z 546. Tên gọi hóa học đầy đủ của DCM1 là: [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E,16S*,18S*,19R*).

3. Ba hợp chất nào lần đầu tiên được phân lập từ nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum trong luận án này?

Trong số 05 hợp chất phân lập được từ quả thể nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum (từ GAM1 đến GAM5), có 03 hợp chất lần đầu tiên được ghi nhận tìm thấy trong loài này bao gồm:

  • ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3)
  • lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4)
  • 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5)

4. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất DCM2, DCM3, DCM4 và DCM5 trên các dòng tế bào ung thư như thế nào?

  • Hợp chất DCM2 và DCM3 thể hiện độc tính tế bào yếu đối với cả 4 dòng tế bào khối u thử nghiệm (HepG2, Hep3B, SK-LU-1, SW480) với các giá trị IC50 dao động trong khoảng từ 23,0 ± 1,1 đến 58,2 ± 2,3 µM.
  • Hợp chất DCM4 và DCM5 thể hiện độc tính tế bào yếu đối với hai dòng tế bào gan HepG2 và Hep3B với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 21,5 ± 5,1 đến 46,9 ± 3,7 µM; đối với hai dòng SK-LU-1 và SW480, DCM4 và DCM5 không thể hiện hoạt tính đáng kể ở nồng độ thử nghiệm cao nhất.

5. Phương pháp phân tích nào được sử dụng để xác định hàm lượng acid amin và các nguyên tố vi lượng trong các mẫu nấm?

  • Xác định acid amin: Thủy phân bằng dung dịch HCl 6M ở 125°C trong 23 giờ dưới khí bảo vệ N2; tạo dẫn xuất OPA/FMOC với đệm borate; phân tích trên hệ thống HPLC sử dụng cột C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) và đầu dò huỳnh quang FLD ở bước sóng kích thích λEx = 340 nm và bước sóng phát xạ λEm = 455 nm.
  • Xác định nguyên tố vi lượng: Gecmani (Ge) được xác định bằng phương pháp phổ khối lượng plasma cảm ứng cao tần (ICP-MS Agilent 7500); Selen (Se) được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử hydrua hóa (HG-AAS); các kim loại Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn được phân tích bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (F-AAS) sau khi vô cơ hóa bằng vi sóng.

Kết luận

Luận án tiến sĩ "Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ" đã hoàn thành việc đánh giá thực nghiệm các chỉ tiêu dinh dưỡng vi lượng, khoáng chất, acid amin, vitamin và sterol trên 08 loài nấm lớn thu hái tại Nghệ An. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 09 hợp chất từ nấm than Daldinia concentrica (bao gồm 01 hợp chất cytochalasan mới là DCM1) và 05 hợp chất từ nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum (trong đó có 03 hợp chất lần đầu ghi nhận ở loài). Kết quả thử nghiệm sinh học in vitro đã cung cấp các số liệu định lượng về độc tính tế bào ung thư và khả năng ức chế NO của các hợp chất phân lập, tạo cơ sở dữ liệu học thuật phục vụ việc nghiên cứu hóa thực vật và định hướng sử dụng nguồn nấm lớn tự nhiên tại Việt Nam.