Nhận diện Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học identification of neoscytalidium dimidiatum causing brown spot, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề

• Tác giả: Dang Thi Ngoc Thuy
• Người hướng dẫn: Dr. Huynh Van Biet
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Nhận diện Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long qua đặc điểm hình thái và sinh học phân tử
• Loại tài liệu: Undergraduate Thesis
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• CONFIRMATION AND ASSURANCE
• 1. CHAPTER 1: Background
• 1.1. Objective of the study
• 1.2. Contents of the study
• 1.3. Origin and taxonomy
• 1.4. Botanical characteristics
• 1.5. Nutritional value
• 1.6. Production and consumption of dragon fruit in Vietnam
• 1.7. Pests and diseases
• 1.8. Brown spot disease on dragon fruit
• 1.9. Taxonomy
• 1.10. Morphological characteristics
• 2. CHAPTER 2
• 2.1. Origin and taxonomy
• 2.2. Production and consumption of dragon fruit in Vietnam
• 2.3. Brown spot disease on dragon fruit
• 2.4. Hosts of Neoscytalidium dimidiatum
• 2.5. Some studies on identification of Neoscytalidium dimidiatum on dragon fruit by ITS and LSU rDNA regions
• 3. MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Time and place
• 3.2. Samples collection and tissue staining
• 3.3. Preparation of culture medium
• 3.4. Pathogen isolation
• 3.5. Identify fungal isolates using morphology
• 3.6. Identify fungal isolates using molecular methods
• 3.7. DNA quantification by electrophoresis
• 3.8. PCR
• 3.9. DNA sequencing and analysis
• 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Samples collection and tissue staining
• 4.2. Identify morphology of fungal isolates
• 4.3. Identify molecular of fungal isolates
• 5. CONCLUSION AND SUGGESTION
• REFERENCES
• LIST OF ACRONYMS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về Neoscytalidium dimidiatum và bệnh đốm nâu trên thanh long

Neoscytalidium dimidiatum là một loại nấm gây bệnh đốm nâu trên thanh long, một trong những loại cây trồng quan trọng tại Việt Nam. Bệnh này không chỉ ảnh hưởng đến năng suất mà còn làm giảm giá trị thương mại của sản phẩm. Việc nhận diện chính xác loại nấm này là rất cần thiết để có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm hình thái của Neoscytalidium dimidiatum

Nấm Neoscytalidium dimidiatum có hình thái đặc trưng với màu sắc từ trắng xám đến đen. Sự phát triển nhanh chóng của nấm trên môi trường nuôi cấy giúp dễ dàng nhận diện.

1.2. Tác động của bệnh đốm nâu đến thanh long

Bệnh đốm nâu gây ra những vết nâu trên thân và trái thanh long, làm giảm chất lượng và năng suất. Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến thu nhập của nông dân.

II. Vấn đề và thách thức trong việc nhận diện Neoscytalidium dimidiatum

Việc nhận diện Neoscytalidium dimidiatum gặp nhiều khó khăn do sự tương đồng với các loại nấm khác. Thách thức lớn nhất là thiếu thông tin về các gene khác ngoài ITS, điều này làm hạn chế khả năng phân tích gen và xác định chính xác loại nấm.

2.1. Khó khăn trong việc phân tích hình thái

Phân tích hình thái có thể bị nhầm lẫn với các loại nấm khác, do đó cần có các phương pháp bổ sung để xác định chính xác.

2.2. Thiếu dữ liệu gen cho Neoscytalidium dimidiatum

Hiện tại, dữ liệu gen cho Neoscytalidium dimidiatum chủ yếu tập trung vào vùng ITS, trong khi các vùng gen khác như LSU chưa được nghiên cứu đầy đủ.

III. Phương pháp nhận diện Neoscytalidium dimidiatum qua hình thái và sinh học phân tử

Phương pháp nhận diện bao gồm việc quan sát hình thái nấm và phân tích gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Sử dụng các mồi PCR như ITS5/ITS4 và LROR/LRS giúp xác định chính xác loại nấm gây bệnh.

3.1. Quan sát hình thái nấm

Quan sát hình thái nấm trên môi trường nuôi cấy giúp nhận diện nhanh chóng và hiệu quả. Các đặc điểm như màu sắc, hình dạng và tốc độ phát triển là những yếu tố quan trọng.

3.2. Phân tích gen bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại các vùng gen ITS và LSU, từ đó so sánh với dữ liệu trên GenBank để xác định chính xác Neoscytalidium dimidiatum.

IV. Kết quả nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum trên thanh long

Nghiên cứu cho thấy 15 mẫu nấm thu thập từ các tỉnh Long An, Tiền Giang và Bình Thuận đều có sự tương đồng cao với Neoscytalidium dimidiatum. Phân tích gen cho thấy sự tương đồng lên đến 99,77% với vùng ITS và 100% với vùng LSU.

4.1. Tương đồng gen giữa các mẫu nấm

Các mẫu nấm đều cho thấy sự tương đồng cao về gen, cho thấy chúng có nguồn gốc gần gũi và có thể là một chủng nấm duy nhất gây bệnh.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh đốm nâu trên thanh long, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum

Việc nhận diện Neoscytalidium dimidiatum là rất quan trọng trong việc quản lý bệnh đốm nâu trên thanh long. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo về nấm gây bệnh trên cây trồng.

5.1. Tầm quan trọng của việc nhận diện chính xác

Nhận diện chính xác Neoscytalidium dimidiatum giúp nông dân có biện pháp phòng ngừa kịp thời, từ đó bảo vệ mùa màng và tăng thu nhập.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu các vùng gen khác của Neoscytalidium dimidiatum để có cái nhìn toàn diện hơn về đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của nấm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây thanh long (Hylocereus spp.) thuộc họ Xương rồng (Cactaceae) là loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, khả năng chịu hạn tốt và thích ứng rộng với điều kiện khí hậu nhiệt đới. Tại Việt Nam, thanh long đã phát triển thành một trong những mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực, chiếm tỷ trọng 80 – 85% sản lượng xuất khẩu đến hơn 40 quốc gia và vùng lãnh thổ, đặc biệt là thị trường Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản, châu Âu. Các vùng chuyên canh sản xuất thanh long tập trung lớn nhất tại các tỉnh Bình Thuận (khoảng 29.743 ha), Long An (12.500 ha) và Tiền Giang (hơn 9.000 ha theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2022).

Tuy nhiên, sự gia tăng diện tích canh tác đồng thời đi kèm với rủi ro bùng phát sâu bệnh hại nghiêm trọng. Trong các bệnh do nấm gây hại trên thanh long (như thán thư do Colletotrichum sp., thối thân rễ do Fusarium sp. hay Sclerotium sp.), bệnh đốm nâu (còn gọi là bệnh đốm tắc kè hay loét cành - stem canker) do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra là đối tượng nguy hiểm hàng đầu. Bệnh gây ra các vết đốm sần sùi màu cam đến nâu đỏ trên thân cành và vỏ quả, làm thối mô và hình thành các lỗ thủng trên cành, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất và giá trị thương phẩm. Vào tháng 05/2022 tại Long An, diện tích nhiễm bệnh đốm nâu lên tới 2.760 ha; tại Bình Thuận vào tháng 12/2022 ghi nhận 1.591 ha nhiễm bệnh với tỷ lệ bệnh từ 5 – 10%.

Trước yêu cầu cấp thiết về quản lý dịch hại, việc nhận diện và xác định chính xác loài nấm gây bệnh là bước khởi đầu bắt buộc. Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu chỉ định danh N. dimidiatum dựa trên vùng gen ITS (Internal Transcribed Spacer) với số lượng công bố hạn chế, chưa có nghiên cứu kết hợp phân tích các vùng gen ribosome khác như LSU (Large Subunit).

Từ thực tiễn đó, khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Sinh học của tác giả Đặng Thị Ngọc Thủy (Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM) thực hiện đề tài nhằm giải quyết các mục tiêu và nội dung cụ thể:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Định danh nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu từ các mẫu cành thanh long thu thập tại ba vùng trồng trọng điểm Long An, Tiền Giang và Bình Thuận thông qua quan sát đặc điểm hình thái và phân tích trình tự hai vùng gen ribosome ITS và LSU rDNA.
2. Nội dung nghiên cứu:
   • Thu thập mẫu cành thanh long nhiễm bệnh và phân lập nấm thuần khiết.
   • Quan sát và xác định các đặc điểm hình thái đại thể (khuẩn lạc) và vi thể (bào tử, sợi nấm) của các chủng phân lập.
   • Tách chiết DNA tổng số, khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho vùng ITS và LSU.
   • Giải trình tự DNA, phân tích mức độ tương đồng trình tự (BLAST, ClustalW) và thiết lập cây phát sinh loài (Phylogenetic tree) để kết luận định danh loài và khảo sát biến dị di truyền theo địa lý.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
   • Đối tượng: 15 mẫu bệnh phẩm thu thập từ cành cây thanh long ruột đỏ có triệu chứng đốm nâu điển hình.
   • Địa bàn thu mẫu: Huyện Châu Thanh (Long An - 5 mẫu), Huyện Chợ Gạo (Tiền Giang - 5 mẫu) và Huyện Hàm Thuận Bắc (Bình Thuận - 5 mẫu).
   • Thời gian và địa điểm thực hiện: Từ tháng 08/2022 đến tháng 01/2023 tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử (RIBE 204 và 205), Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và phân loại học

Nấm Neoscytalidium dimidiatum (Penz.) Crous & Slippers (2006) thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Dothideomycetes, bộ Botryosphaeriales, họ Botryosphaeriaceae. Danh pháp đồng nghĩa bao gồm Neoscytalidium hyalinum (biến thể bạch tạng không sinh melanin) và Fusicoccum dimidiatum. Loài nấm này có phổ ký chủ rất rộng trên cây ăn quả và cây lâm nghiệp trên thế giới (xoài, táo, hạnh nhân, sung, bạch đàn...) và có khả năng gây bệnh cơ hội ở người.

Trong phân loại và định danh vi nấm, các vùng DNA ribosome (rDNA) gồm các vùng mã hóa bảo thủ (18S, 5.8S, 28S/LSU) và các vùng đệm phiên mã không mã hóa biến đổi cao (ITS1, ITS2, IGS) đóng vai trò làm chỉ thị phân tử chuẩn. Vùng ITS được Ủy ban Mã vạch Sự sống quốc tế xem là mã vạch DNA phổ quát (universal barcode) cho nấm. Trong khi đó, vùng LSU (28S rDNA) có kích thước lớn, chứa các tiểu vùng bảo thủ kết hợp các vùng phân kỳ (divergent domains), hỗ trợ phân loại ở cấp độ chi và loài với độ ổn định cao.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm đồng bộ từ bệnh học thực vật đến sinh học phân tử:

Hạng mục quy trình	Phương pháp và điều kiện thực nghiệm
Nhuộm mô bệnh	Phương pháp nhuộm Trypan blue 0,01% trong Lactophenol (Chung et al.). Mẫu mô cành (1 x 1 cm²) được tẩy màu lần lượt bằng dung dịch A (Acid acetic : Ethanol = 1:3, v/v trong 24 giờ) và dung dịch B (Acid acetic : Ethanol : Glycerol = 1:5:1, v/v/v trong 3 giờ), nhuộm trong 24 giờ, quan sát trên kính hiển vi Olympus.
Phân lập nấm	Phương pháp cấy chuyển mô (tissue transplantation). Mẫu mô rìa vết bệnh (1,5 x 1,5 cm²) được khử trùng bề mặt bằng Ethanol 70% (30 giây – 1 phút), tráng nước cất vô trùng 2 lần, cắt nhỏ (1 – 2 mm²), đặt lên đĩa môi trường thạch nước (WA: 20 g agar/1000 ml), ủ 1 – 2 ngày. Đỉnh sợi nấm được cấy chuyền sang môi trường thạch khoai tây glucose (PGA: dịch chiết 200 g khoai tây, 20 g glucose, 20 g agar/1000 ml).
Đánh giá hình thái	Đánh giá đại thể: cấu trúc khuẩn lạc, sắc tố, đo tốc độ phát triển sợi nấm hàng ngày trên đĩa PGA (3 lần lặp lại). Đánh giá vi thể: hình dạng, vách ngăn và kích thước của bào tử chuỗi (arthroconidia) trên kính hiển vi quang học theo khóa phân loại của Ellis (1976) và Crous et al. (2006).
Tách chiết DNA tổng số	Quy trình cải tiến từ Lee và Taylor (1988) sử dụng đệm phá vách SDS (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8), ủ nhiệt 65°C trong 1 giờ. Chiết bằng Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1) và Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1). Tủa DNA bằng Sodium acetate 3M (12 µl) và Isopropanol (400 µl) ở -20°C trong 1 giờ. Rửa tủa 2 lần bằng Ethanol 70% lạnh, hòa tan trong 50 µl đệm 1X TE.
Kiểm tra chất lượng DNA	Đo quang phổ hấp thụ UV trên máy BioDrop Duo (xác định nồng độ ng/µl và độ sạch qua tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% trong đệm 0,5X TAE ở hiệu điện thế 100 V.
Khuếch đại gen (PCR)	Sử dụng máy luân nhiệt LifeECO Thermal Cycler (Bioer). Phản ứng 50 µl gồm: 25 µl MyTaq Mix 2X (Bioline), 2 µl mỗi mồi (10 µM), 3 µl DNA khuôn, 18 µl nước không nuclease. - Mồi ITS: ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). - Mồi LSU: LR0R (5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’) và LR5 (5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’).
Giải trình tự và Tin sinh học	Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR tại Công ty TNHH Nam Khoa Biotek. Trình tự được chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit, gióng hàng đa trình tự bằng ClustalW. Tìm kiếm độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng thuật toán BLASTn. Cây phát sinh loài được xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood với 1000 lần lặp bootstrap trên phần mềm MEGA 11.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Background and Objective of the study (Mở đầu)

Chương này tổng quan về vị thế kinh tế của cây thanh long tại Việt Nam, sự suy giảm năng suất và chất lượng do dịch bệnh, nhấn mạnh mức độ thiệt hại nặng nề do bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum). Tác giả chỉ ra khoảng trống nghiên cứu trong nước khi chưa có công bố nào định danh loài nấm này bằng vùng gen LSU kết hợp ITS, từ đó xác lập mục tiêu và hai nội dung cốt lõi của đề tài.

Chương 2. Literature Review (Tổng quan tài liệu)

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết bao quát gồm 4 nhóm nội dung:

• Cây thanh long (Hylocereus spp.): Nguồn gốc, phân loại thực vật, đặc điểm rễ khí sinh và cơ chế quang hợp CAM, thành phần dinh dưỡng (độ ẩm >80%, protein 0,4 – 2,2 g/100g, carbohydrate 8,5 – 13,0 g/100g) và hoạt tính sinh học từ các hợp chất betalain, flavonoid, polyphenol. Tình hình sản xuất, xuất khẩu và các đối tượng sâu bệnh hại chính.
• Bệnh đốm nâu: Mô tả 3 giai đoạn tiến triển triệu chứng từ đốm trắng nhỏ (giai đoạn 1), chuyển sang vết đốm lồi màu vàng cam/nâu đỏ có quầng vàng (giai đoạn 2), đến thối mô khô và rụng tạo thành các lỗ thủng trên cành (giai đoạn 3). Phương thức phát tán bào tử qua gió, nước, côn trùng và ốc sên; điều kiện bùng phát trong mùa mưa (tháng 5 đến tháng 11) kết hợp bón thừa đạm và chất kích thích sinh trưởng.
• Vi nấm Neoscytalidium dimidiatum: Lịch sử phân loại học, danh pháp đồng nghĩa, hình thái khuẩn lạc phát triển nhanh (tốc độ 3 cm/ngày, đường kính đạt 9 cm sau 3 ngày), khuẩn ty dạng bông, chuyển từ trắng sang xám đậm/đen; bào tử chuỗi arthroconidia vách dày. Thống kê phổ ký chủ đa dạng trên thế giới (cây ăn quả, cây công nghiệp, cây rừng) và ghi nhận khả năng gây bệnh nấm móng, nấm da, nhiễm trùng phổi ở người.
• Chỉ thị phân tử rDNA và tổng quan các nghiên cứu liên quan: Cấu trúc các vùng rDNA nhân thực; ưu thế của vùng ITS và LSU trong định danh nấm; tổng hợp các nghiên cứu định danh N. dimidiatum trên thanh long tại Đài Loan (Chuang et al., 2012), Malaysia (Mohd et al., 2013), Thái Lan (Dy et al., 2022), Ecuador (Espinoza-Lozano et al., 2022) và Việt Nam (Võ Thị Thu Oanh et al., 2014).

Chương 3. Materials and Methods (Vật liệu và phương pháp nghiên cứu)

Mô tả chi tiết danh mục 15 mẫu bệnh phẩm (mã số LA1 – LA5 từ Long An, TG1 – TG5 từ Tiền Giang, BT1 – BT5 từ Bình Thuận). Trình bày từng bước thực nghiệm: quy trình nhuộm Trypan blue kiểm tra sự xâm nhiễm của sợi nấm trong tế bào mô đồng hóa; kỹ thuật phân lập đỉnh sợi nấm trên môi trường WA và PGA; quy trình tách chiết DNA bằng đệm SDS kết hợp hỗn hợp dung môi hữu cơ; công thức phản ứng và chu trình nhiệt PCR cho hai cặp mồi ITS5/ITS4 và LR0R/LR5; phương pháp xử lý dữ liệu trình tự và phân tích phả hệ bằng BioEdit, BLAST và MEGA 11.

Chu trình nhiệt PCR vùng ITS (ITS5/ITS4):
95°C (3 phút) -> 35 chu kỳ [95°C (1 phút) - 60°C (30 giây) - 72°C (1 phút)] -> 72°C (10 phút).

Chu trình nhiệt PCR vùng LSU (LR0R/LR5):
94°C (3 phút) -> 35 chu kỳ [94°C (30 giây) - 60°C (1 phút) - 72°C (1 phút)] -> 72°C (5 phút).

Chương 4. Results and Discussion (Kết quả và thảo luận)

Trình bày và biện luận toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm thu được:

• Nhuộm mô và hình thái học: Quan sát lát cắt mô bệnh nhuộm Trypan blue dưới vật kính 10X cho thấy các cấu trúc bào tử và sợi nấm xâm nhập làm mềm, hòa tan vách tế bào thịt lá cành thanh long, hình thành các xoang rỗng. Cả 15 chủng phân lập đều có khuẩn lạc dạng sợi xốp, tốc độ phát triển đạt đường kính 9 cm sau 3 ngày trên PGA, chuyển từ trắng sang xám đen; sợi nấm phân nhánh có vách ngăn; bào tử chuỗi arthroconidia dạng que, elip, tròn có 0 – 2 vách ngăn, kích thước và hình thái hoàn toàn trùng khớp mô tả của nấm N. dimidiatum.
• Chất lượng DNA và sản phẩm PCR: Tách chiết thành công DNA tổng số từ 15 chủng với nồng độ cao (239,8 – 1303,3 ng/µl), độ tinh sạch đạt chuẩn ($OD_{260}/OD_{280} = 1,976 - 2,083$). Điện di sản phẩm PCR cho vạch sáng rõ, kích thước đặc trưng xấp xỉ 1000 bp đối với vùng ITS và 1300 bp đối với vùng LSU, không có vạch phụ.
• Phân tích trình tự và cây phát sinh loài: Trình tự sau chỉnh sửa đạt 885 bp (ITS) và 1082 bp (LSU). Gióng hàng ClustalW nội bộ 15 mẫu cho thấy trình tự hoàn toàn đồng nhất 100%. Kết quả BLAST trên GenBank khẳng định độ tương đồng 99,66 – 99,77% đối với ITS và 99,91 – 100% đối với LSU so với N. dimidiatum. Cây phát sinh loài Maximum Likelihood chứng minh 15 chủng Việt Nam nằm cùng một nhánh đơn ngành (clade) với các chủng N. dimidiatum chuẩn từ Hà Nội (vùng ITS, bootstrap 81%) và Đài Loan (vùng LSU, bootstrap 76%).

Chương 5. Conclusion and Suggestion (Kết luận và kiến nghị)

Tổng kết các kết quả đạt được về định danh loài, tính bảo thủ của hai chỉ thị rDNA, đồng thời đề xuất mở rộng cỡ mẫu, bổ sung các gen mã hóa protein khác và tự thiết kế mồi PCR phục vụ chẩn đoán nhanh.

---

Kết quả và đóng góp

Số liệu định lượng và phát hiện chính

1. Chỉ số nồng độ và độ tinh sạch DNA tổng số của 15 chủng nấm:

Mẫu	Địa điểm thu mẫu	Nồng độ DNA (ng/µl)	Độ sạch ($OD_{260}/OD_{280}$)
LA1	Vĩnh Công, Châu Thành, Long An	363,9	2,057
LA2	Vĩnh Công, Châu Thành, Long An	425,1	1,976
LA3	Vĩnh Công, Châu Thành, Long An	486,5	2,023
LA4	An Lục Long, Châu Thành, Long An	239,8	2,053
LA5	An Lục Long, Châu Thành, Long An	486,0	2,059
TG1	Tân Bình Thạnh, Chợ Gạo, Tiền Giang	1008,5	2,082
TG2	Tân Bình Thạnh, Chợ Gạo, Tiền Giang	925,2	2,060
TG3	Tân Bình Thạnh, Chợ Gạo, Tiền Giang	946,2	2,083
TG4	Quơn Long, Chợ Gạo, Tiền Giang	698,7	2,075
TG5	Quơn Long, Chợ Gạo, Tiền Giang	865,6	2,078
BT1	Hàm Liêm, Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận	564,9	2,070
BT2	Hàm Liêm, Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận	383,5	2,068
BT3	Hàm Liêm, Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận	1303,3	2,052
BT4	Hàm Hiệp, Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận	838,4	2,048
BT5	Hàm Hiệp, Hàm Thuận Bắc, Bình Thuận	367,6	2,047

2. Kết quả phân tích độ tương đồng trình tự (BLAST) và biến dị di truyền:
   • Vùng ITS (885 bp): Độ tương đồng đạt 99,77% so với các chủng N. dimidiatum và N. hyalinum từ Pháp (MH863770, OW986654), Anh (OW987089), Hoa Kỳ (MT921262, MT921261) và Israel (FJ648577); đạt 99,66% so với chủng từ Hà Nội - Việt Nam (KU290343, KU290342), Hy Lạp (ON181997) và Thổ Nhĩ Kỳ (MW696188). Phân tích đa gióng hàng ClustalW phát hiện 2 vị trí nucleotid đặc trưng cho các mẫu Việt Nam: vị trí 87 là Cytosine (C) (các nước khác là Thymine - T) và vị trí 142 là Guanine (G) (các nước khác là Adenine - A).
   • Vùng LSU (1082 bp): Độ tương đồng đạt 100% so với chủng phân lập từ cành và quả thanh long tại Đài Loan (MT341865, MT341864) và 99,91% so với các chủng từ Pháp, Hoa Kỳ, Anh. Có 1 vị trí biến dị tại nucleotid 115 (15 mẫu phân lập mang Guanine - G, trong khi các mẫu từ Pháp, Mỹ, Anh mang Adenine - A). Trình tự LSU của 15 chủng nghiên cứu hoàn chỉnh hơn so với mã số LC660641 của Thái Lan (chỉ có độ bao phủ 86%).

Đóng góp khoa học của đề tài

• Bổ sung dữ liệu khoa học đầu tiên tại Việt Nam về trình tự vùng gen ribosome LSU (1082 bp) của loài nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long.
• Chứng minh tính đồng nhất di truyền cao của quần thể nấm N. dimidiatum tại ba vùng chuyên canh lớn (Long An, Tiền Giang, Bình Thuận), cho thấy mầm bệnh không có sự phân hóa theo vị trí địa lý.
• Khẳng định vùng chỉ thị phân tử LSU có mức độ bảo thủ và độ tương đồng trình tự cao hơn vùng ITS (100% so với 99,77%), hỗ trợ hoàn thiện quy trình giám định phân tử chuẩn xác cho đối tượng nấm bệnh này.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi khảo sát giới hạn ở 15 mẫu bệnh phẩm thu thập từ cành thanh long ruột đỏ tại 3 tỉnh phía Nam, chưa mở rộng sang thanh long ruột trắng, thanh long vỏ vàng hoặc các bộ phận khác (như nụ hoa, vỏ quả) và các tỉnh thành khác.
• Nghiên cứu chỉ sử dụng hai chỉ thị rDNA (ITS và LSU), chưa kết hợp phân tích đa locus với các gen mã hóa protein khác để đánh giá chi tiết cấu trúc phả hệ.

Hướng nghiên cứu tiếp theo (do tác giả đề xuất)

• Tăng cường số lượng mẫu phân lập và mở rộng địa bàn thu thập mẫu trên toàn quốc.
• Ứng dụng thêm các chỉ thị phân tử gen giữ nhà (housekeeping genes) như yếu tố kéo dài dịch mã 1-alpha ($TEF1\alpha$), Calmodulin ($CAL$) hoặc Beta-tubulin ($tub$) để tăng độ phân giải phân loại học.
• Nghiên cứu thiết kế cặp mồi PCR chuyên biệt (specific primers) phục vụ kỹ thuật chẩn đoán và phát hiện sớm mầm bệnh Neoscytalidium dimidiatum trực tiếp từ mô thực vật ngoài đồng ruộng.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, Bảo vệ Thực vật, Bệnh học Cây trồng và Vi sinh học ứng dụng.

Các phần có giá trị thực tiễn cao bao gồm:

• Quy trình tách chiết DNA nấm sợi cải tiến: Hướng dẫn chi tiết kỹ thuật phá màng nấm bằng đệm SDS nồng độ cao và tinh sạch qua hệ dung môi Phenol:Chloroform, cho hiệu suất thu hồi nồng độ DNA cao và độ tinh sạch đạt chuẩn quang phổ.
• Hệ thống điều kiện phản ứng PCR và mồi chỉ thị: Cung cấp thông số chu trình nhiệt chuẩn xác cho hai cặp mồi ITS5/ITS4 và LR0R/LR5 trong khuếch đại nấm gây bệnh thực vật.
• Phương pháp xử lý dữ liệu tin sinh học: Trình tự thao tác chuẩn từ xử lý chuỗi bằng BioEdit, gióng hàng ClustalW đến dựng cây phả hệ Maximum Likelihood với kiểm định bootstrap trên phần mềm MEGA 11.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm Neoscytalidium dimidiatum phân lập trên môi trường PGA có đặc điểm hình thái đại thể và vi thể như thế nào?

Khuẩn lạc nấm phát triển rất nhanh, đạt đường kính 9 cm trên đĩa PGA chỉ sau 3 ngày ủ (tốc độ phát triển khoảng 3 cm/ngày). Khuẩn ty mọc xốp nhô cao như bông, ban đầu có màu trắng, sau chuyển dần sang màu xám trắng, xám đậm đến đen. Về vi thể, sợi nấm có màu nâu, phân nhánh, có vách ngăn; hình thành các chuỗi bào tử khớp (arthroconidia) vách dày, màu nâu sẫm, đa dạng hình thái (bầu dục, hình que, hình cầu hoặc trứng) với 0 đến 2 vách ngăn.

2. Cặp mồi nào đã được sử dụng để khuếch đại vùng gen ITS và LSU, kích thước sản phẩm PCR là bao nhiêu?

Nghiên cứu sử dụng cặp mồi ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) để khuếch đại vùng ITS rDNA, tạo sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1000 bp (chuỗi sau chỉnh sửa là 885 bp). Vùng LSU rDNA được khuếch đại bằng cặp mồi LR0R (5’-ACCCGCTGAACTTAAGC-3’) và LR5 (5’-TCCTGAGGGAAACTTCG-3’), tạo sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1300 bp (chuỗi sau chỉnh sửa là 1082 bp).

3. Quy trình tách chiết DNA tổng số nấm đạt được nồng độ và độ tinh sạch như thế nào?

Quy trình cải tiến từ phương pháp của Lee và Taylor (1988) sử dụng đệm SDS lysis buffer cho hiệu quả cao trên cả 15 mẫu. Nồng độ DNA thu nhận dao động từ 239,8 ng/µl (mẫu LA4) đến 1303,3 ng/µl (mẫu BT3). Tỷ số độ hấp thụ quang phổ $OD_{260}/OD_{280}$ dao động trong khoảng tối ưu từ 1,976 đến 2,083, chứng minh DNA có độ tinh sạch cao, không bị đứt gãy và đáp ứng điều kiện thực hiện phản ứng PCR.

4. Kết quả so sánh trình tự vùng ITS và LSU giữa các mẫu Việt Nam và thế giới có phát hiện sai khác nucleotid nào?

Ở vùng ITS, 15 mẫu phân lập tại Việt Nam hoàn toàn đồng nhất với nhau và có 2 vị trí nucleotid sai khác so với các trình tự trên GenBank từ các quốc gia khác: tại vị trí 87 là Cytosine (C) thay vì Thymine (T) và vị trí 142 là Guanine (G) thay vì Adenine (A). Ở vùng LSU, các mẫu Việt Nam tương đồng 100% với mẫu Đài Loan (MT341865, MT341864) và có 1 vị trí sai khác tại nucleotid 115 (mang Guanine - G thay vì Adenine - A) so với các chủng từ Pháp, Anh, Mỹ.

5. Phân tích cây phát sinh loài (Phylogenetic tree) chỉ ra mối quan hệ di truyền của 15 chủng nấm ra sao?

Cây phát sinh loài xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (1000 bootstrap) cho thấy cả 15 chủng phân lập từ Long An, Tiền Giang và Bình Thuận đều quy tụ vào cùng một nhánh đơn hệ không có biến dị nội bộ. Cụ thể, các mẫu nghiên cứu nhóm chung với chủng N. dimidiatum tại Hà Nội (KU290343) ở cây phả hệ ITS với giá trị bootstrap 81%, và nhóm chung với 2 chủng N. dimidiatum trên thanh long tại Đài Loan (MT341865, MT341864) ở cây phả hệ LSU với giá trị bootstrap 76%.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đặng Thị Ngọc Thủy đã phân lập và nhận diện thành công tác nhân gây bệnh đốm nâu trên cành thanh long ruột đỏ tại ba tỉnh Long An, Tiền Giang và Bình Thuận là vi nấm Neoscytalidium dimidiatum. Kết quả kết hợp đồng thời đặc điểm hình thái và giải trình tự hai vùng gen ribosome ITS (885 bp, tương đồng 99,77%) và LSU (1082 bp, tương đồng 100%) chứng minh tính bảo thủ di truyền tuyệt đối giữa các chủng nấm ở các vùng địa lý khác nhau. Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam công bố dữ liệu trình tự vùng gen LSU của loài nấm bệnh này, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công tác giám định phân tử và nghiên cứu phòng trừ bệnh đốm nâu hại thanh long.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES IDENTIFICATION OF Neoscytalidium dimidiatum CAUSING BROWN SPOT DISEASE ON DRAGON FRUIT BY MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR BIOLOGICAL CHARACTERIZATION Major : BIOTECHNOLOGY Student : DANG THI NGOC THUY Student ID : 18126171 Academic year : 2018 — 2022 Thu Duc City, 03/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS IDENTIFICATION OF Neoscytalidium dimidiatum CAUSING BROWN SPOT DISEASE ON DRAGON FRUIT BY MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR BIOLOGICAL CHARACTERIZATION Supervisor Student Dr. HUYNH VAN BIET DANG THI NGOC THUY Thu Duc City, 03/2023 ACKNOWLEDGEMENT Firstly, I would like to thank the teachers of the Faculty of Biological Sciences and Research Institute for Biotechnology and Environment, administrators of Nong Lam University Ho Chi Minh City for creating the best opportunities and conditions for me during the process of study and completion of the thesis. I would like to extend my deepest gratitude to my supervisor, Dr. Huynh Van Biet; who always cared, encouraged, created the best conditions for me, approached and corrected my deficiencies missed during the process of completion of the thesis.

I would like to thank M. Pham Thi Hong Phi, Mr. Truong Quang Toan, MS. Dao Uyen Tran Da and Ms.

Vu Ngoc Khanh Nhu. They have instructed enthusiastically, imparted valuable knowledges and experiences for me; which enabled me to successfully complete my this study. I would also like to thank my friends at the Molecular Biology Lab — Research Institute for Biotechnology and Environment and DH18SM class for their enthusiastic assistance and support for me. Finally, I am extremely grateful to my family; who have always accompanied, supported and believed in me during my study journey.

Student Dang Thi Ngoc Thuy CONFIRMATION AND ASSURANCE My name is Dang Thi Ngoc Thuy, Student ID: 18126171, Class: DH18SM (Phone number: 0365474986, Email: [e-mail]) from Biotechnology, Nong Lam University Ho Chi Minh City. I hereby declare: This is my graduation thesis, the data and information in this study are completely honest and objective. I take full responsibility to the board for these commitments. Thu Duc City, 17 March 2023 The writer pledges (Sign and write full name) Dang Thi Ngoc Thuy ul ABSTRACT Dragon fruit (Hylocerews spp.) is commonly cultivated and key export produce in Vietnam.

Disease problems are always concerned, because it greatly affects the development and productivity of dragon fruit. This study was conducted to identify the fungus causing brown spot disease on dragon fruit from Long An, Tien Giang and Binh Thuan. A total of 15 infected samples were collected, isolated and identified based on observation of morphological characteristics and analysis of ITS and LSU regions. Sequences of two gene regions were amplified by using ITSS/TTS4 and LROR/LRS primer pairs, compared to sequences on GenBank which showed 99,77% and 100% similarity to Neoscytalidium dimidiatum, respectively.

From the phylogenetic analysis, isolates of N. dimidiatum were grouped together and did not show any sequence variation. Thus proves that 15 isolates tended to be genetically similar regardless of geographical locations and LSU region had a higher sequence similarity than ITS region. Keywords: dragon fruit, brown spot disease, Neoscytalidium dimidiatum, ITS, LSU.

il TABLE OF CONTENTS Page ACKNOW LEDGEMEN ] sscscsennusssosmenmees en ET 1 CONFIRMATION AND ASSURANCCE. -- G1 2112112 HH HH rei lÀ II, NHA GD: ss.xgilnlinuBqboiEnsSssiodfseibidouigeGirlisis3GG-362eedasudn.ke ill TABLE OF GON TENTS csssessesasssencrnerxeusecosueeneepsuaaepas re 3684300 36G15.GU48039800SE0 1V IDL509)6. vì LIST OF TABLES giceniesssetniiiaE1151331808514055L7153355591154885515395915840518550133391054184346001355955028538230 Vil LIST OF EIGUR ES ecmemeaee eee er ee vill CHAPTER 1./Obyectine ot the study soessssoisszsttosit2303644G1G83895E4950g895018891300324538:858E83ISBEEAGA4088138iE 2 1. Contents of the Study ssecmasecceamemexexesmemereuncea anne 2 CHAPTER 2.12110102 4 HH TH KH Ki ngờ 3 2.

DDPABOM LTTE 0110007 số. Origin and †aXOIOINV. character sttesescscrsccrwcuse mea ae RES 3 2-13: Ute ti Ofal WAU ssssssssernsesonettbeooDSNGGgE0-019005030050833200393043308g125G:Đ2g0038830900D1330gui03390210mggaanl 4 2. Production and consumption of dragon fruit in Vietnam.-- --- 55+ +5<5<52 4 DMD PCStS Gi ISCAS ES sce cscs S612 12600/860 l6 coh 43864628 ssiaaitiewnilact% tis Sst Salis tase Ualiactisa lb 5 2.

Brown spot disease on dragon ÍTUIẨ. - ---- : + 22232312232 EErrrsrrrrrrrrrerrerree 5 DD IN COSCYI OLE IIE: GIMIA IVI thosxscgndigs eae tes eR SCE EISLER ETS TID SEER 7 2 Dele VAROWODIY ccssacemnm canesrsesncenmaancune eerarncen eemeneme een 7 2. HOSts Of NEOSCVIGHOIUM GINIGIGIUIN ccc. ccssseceseses vcsseasncancestzensvnstnve suetanzavstanesemansenns 8 230 LV Sati TS Oi T ID VÀ ese eiste2:0ii8itg©8BgELS9Ei605015:g00091634005809g5395088i8E830tBS38803Esi-S03Esbsbbt 8 28 Slax OMEL VAC W i x exsasasosscenvecarawarnncmeriea area SE REE EE gan 8 2.

Some studies on identification of Neoscytalidium dimidiatum on dragon fruit by ITS and LSU rDNA regions 1117. Studs 18 The World siscssisesssssapsseisisiaeiGS50163953850365303G4883813510039564363405i€1SU485883683E 10 IV 2. Studies in 4i iv\điiai)Ũ. MATERIALS AND METHODS.

Time and place bàin.2: Malet IS veccecseesrsmuapeierremesteerrniearniorermmne aie rea e he pr EEE EET 12 Bi Se METRO S| snisseiesncateonnnsiaenaiiosnstbosnanttioantirtonst deinen ett iSttlonubitnbeisetintisbnantaabtnveeatneiteiion aati 13 3. Samples Collection aiid 180] G1 Oi accssscsascceesevesnenstnnenneonenane eweneausaaacvacwewuroeavoauasenaee 13 3. Samples collection and tissue sfa1n1ng. Preparation of culture me€d]1u1m.3: Pathogen 1SOÏaHOH siicieseiesiess0S0L010101116151151201033149033533061060034014460113005821003 13 3.

Identify fungal isolates using morphoÏOgV. Identify fungal isolates using moleculÌar-. DNA quantification by electrophOT€S1S.373: PCR Qi pl HCaHOn ssensaerbepsdeSistiasivSseosgSbSgeke34EEggrvsv99x03800805eip3Ep2psassE3Bisgontg4ortgrsle 15 3. DNA sequencing and analysis.

RESULTS AND DISCUSSION oassssscncseesssnssanseneonoonsaneasanwenesusnrsnancnennays 17 An. Samples collection and tissue sfa1n1ng. Identify morphology of fungal 1sOÏaf€. Identify molecular of fungal 1SOÏAf.- -- - 5c 5+ St St + sesrrerrrrrrrrrrrrrrerex 19 U90.

CONCLUSION AND SUGGESTION. 33 Sel, CöfiG USD socancsscseerseseesseseoseessensornsesercaseuneutae en enaaneenne neem eameeeenee 33 93024509 ÚC 18 (0) 61 Dee cee neee 33 RE BER ENCES) svoscscs csusssasamvonsaanans ns 3638N6848648H1830380Ex3350Đ40538. 37 LIST OF ACRONYMS bp : Base pair DNA : Deoxyribonucleic Acid et al. : And others etc.

: Et cetera ETS : External Transcribed Spacer ha : Hectare IGS : Intergenic Spacer ITS : Internal Transcribed Spacer kb : Kilobases LSU : Large Subunit NTS : Non Transcribed Spacer OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction PGA : Potato Glucose Agar rDNA : Ribosomal Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid SDS : Sodium Dodecyl Sulfate SSU : Small Subunit TAE : Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-EDTA TEFla : Translational Elongation Factor la tub : B-tubulin UV : Ultra Violet V : Volt WA : Water Agar VI LIST OF TABLES Page Table 3. Samples using in this Study vsicssissssecsessacesscaceconssaenvacpenzasasataasinsa seenevsasoseneneniee 12 Table 3. Primer sequences used 1n PCR. Thermal cycling for PCR with ITS5/ITS4 primer pair.

Thermal cycling for PCR with LROR/LRS primer pAaIT. Result of total DNA concentration and purification by UV SpectrophO tome y wrccssnnsssenseenserem aes see eee EERE EET 20 Table 4. Result of BLAST on GenBank of the ITS reglon. Result of BLAST on GenBank of the LSU reglon.

--- --------= 55+ 27 vil LIST OF FIGURES Page Figure 2. Symptoms of brown spot disease on dragon fruit stem. Symptoms of brown spot disease on dragon fruit ÍTuIt. Samples of brown spot disease on dragon fruit stem from 15 locations.

Infected brown spot tissue of dragon fruit stem under the microscope. Morphological characteristics of Neoscytalidium dimidiatum from brown spot disease:on drag ont 111 tiscccessecssssresesssaunnussreeereseneupneeene emanate meu neanamneseaananeaes 19 Figure 4. (a, b) Electrophoresis results of total DNA on 1,5% agarose gel. (a, b) Electrophoresis results of the PCR products with ITS5/ITS4 primer [ee 21 Figure 4.

(a, b) Electrophoresis results of the PCR products with LROR/LRS primer DAL cessssemcemaremnen canes nee erEREE wer a eae ERE 21 Figure 4. Result of ClustalW alignment of the ITS region between sequence of 15 isolated samples and 11 sequences on GenbanE.-----+-++++++sx++++s+eezeeeeezrzxe 24 Figure 4. Result of ClustalW alignment of the LSU region between sequence of 15 isolated samples and 9 sequences on GenbanÌ. Phylogenetic tree of ITS region of combined sequence of 15 isolated samples and 21 sequences on GenBank.

Phylogenetic tree of LSU region of combined sequence of 15 isolated samples and 20 sequences on GenBank.ccecceeceeseeseeeceeseeeceeseeeceeseeeeeeseeeeeeseensees 31 vill CHAPTER 1. Background Dragon fruit is a popular and widely used fruit all over the world. Because it has high drought tolerance, easy adaptation to light intensity and high temperature, a wide range of tolerance to different soil salinities and benefits to human health (Luu et al. Dragon fruit has a distinctive sweet taste; 1s a source of essential nutrients for humans (vitamins, minerals, antioxidants, fibre, etc.) and the most profitable crop for Vietnamese farmers.

Dragon fruit has commercially been cultivated in over 20 tropical and subtropical countries. In Vietnam, dragon fruit was introduced by the French over a hundred years ago (Mizrahi et al, 1997) and until the 1980s was planted commercially. Currently, dragon fruit is a Vietnamese key export produce with a high competitiveness in international markets and has been exported to many countries from Asia, Europe to America in which the key market is China. When exporting dragon fruit, it must meet strict conditions of technical standards, quality standards and origin.

Tropical monsoon climate, soil and farmers' experience are favorable conditions for the development of dragon fruit in our country. Along with that are the difficulties caused by pests and diseases, they seriously affect the development and productivity of dragon fruit that will affect the export of dragon fruit. Diseases on dragon fruit are mainly caused by fungi, such as anthracnose caused by Colefofrichum sp. , stem and root rot (Fusarium sp.

or Schlerotium sp. In which, brown spot disease is caused by Neoscytalidium dimidiatum is the most serious plant disease. Stems and fruits of dragon fruit will appear rough brown spots, which gradually cause dry rot in patches, reducing the aesthetic and commercial value. To prevent and reduce the disease occurrence, the fungus should be detected early and promptly.

dimidiatum was identified based on morphological observations and molecular biology techniques. In Vietnam, sequence of N. dimidiatum causing brown spot disease on dragon fruit has only been recorded with ITS gene region and there are very few studies, there have been no reports to identify fungi with other gene regions. Therefore it is necessary to identify fungi with sequences of other gene regions.

Objective of the study Identify Neoscytalidium dimidiatum from brown spot disease of dragon fruit stem samples from Long An, Tien Giang and Binh Thuan by using morphological characteristics and sequences of ITS and LSU regions. Contents of the study Samples collection and isolation of N. dimidiatum by morphological characteristics. dimidiatum by sequence of ITS and LSU rDNA regions.

Origin and taxonomy The exact origin of dragon fruit is unknown, but it 1s probadly native to Southern Mexico, the Pacific coast of Guatemala, Costa Rica and El Salvador (IUCN, 2016). Dragon fruit has been widely commercialized and cultivated across tropical and some temperate regions of the world, including South-East Asia, China, Israel, Africa, Australia, North America, tropical South America and the West Indies (CABI, 2022). In Vietnam, dragon fruit was introduced by the French over a hundred years ago (Mizrahi et al., 1997) and until the 1980s was planted commercially. Dragon fruit (Hylocereus spp.) is also known as strawberry pear, pitaya or pitahaya.

It is a climbing plant, belongs to the cactus (Cactaceae) family. According to Spichiger et al. (2000), Cactaceae are 120 — 200 genera which group 1500 — 2000 species. In there, the genus Hy/ocereus are 18 species (Gunasena et al., 2007) such as Hylocereus undatus (white flesh with red skin), Hylocereus ostaricensis (red flesh with red skin), Hylocereus polyrhizus (red flesh with red skin), Hylocereus megalanthus (white flesh with yellow skin), etc.

(Luu et al. Botanical characteristics Hylocereus spp. are facultative epiphytes that 1mtially roots in the soil and then later become fully epiphytic (Wallace and Gibson, 2002) — due to the Crassulacean Acid Metabolism (CAM) and this makes dragon fruit possible to conserve water and survive in arid, semiarid and in other regions with limited water or irrigation. Dragon fruit develops both ground roots and air roots.

They absorb water and nutrients from soil or their surroundings to feed the plant. Ground roots are a shallow roots system, distributed at topsoil level at a depth of 0 — 30 cm.