Luận văn nghiên cứu vi khuẩn ôxi hóa metan - Nguyễn Thị Hiếu Thứ

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu vi khuẩn ôxi hóa metan Methylomonas, phân lập chủng BG3, ứng dụng xử lý khí metan và sản xuất sinh khối protein.

• Tác giả: Nguyen Thi Hieu Thu
• Người hướng dẫn: Dr. Dinh Thuy Hang
• Trường học: Vietnam National University, Hanoi
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Vi khuẩn ôxi hóa metan và tiềm năng ứng dụng
• Loại tài liệu: master thesis
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hanoi

Tóm tắt

I. Tổng quan về Vi khuẩn ôxi hóa metan Khám phá vai trò của Methanotrophs

Trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu ngày càng nghiêm trọng, khí metan (CH4) được xem là một trong những tác nhân gây hiệu ứng nhà kính mạnh mẽ. Để đối phó với thách thức này, các giải pháp sinh học bền vững đang được ưu tiên nghiên cứu, trong đó vi khuẩn ôxi hóa metan (methanotrophs) nổi lên như một nhân tố đầy hứa hẹn. Những sinh vật nhỏ bé này có khả năng đặc biệt là sử dụng metan làm nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, biến đổi nó thành các hợp chất hữu cơ khác hoặc CO2, góp phần đáng kể vào việc điều hòa khí hậu trái đất. Bài viết này đi sâu phân tích cơ chế hoạt động, các phương pháp nghiên cứu và đặc biệt là tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn ôxi hóa metan trong nhiều lĩnh vực, từ xử lý chất thải đến sản xuất sinh khối, mở ra hướng đi mới cho công nghệ sinh học và phát triển bền vững.

1.1. Định nghĩa và sự đa dạng sinh học của vi khuẩn ôxi hóa metan

Vi khuẩn ôxi hóa metan, hay còn gọi là methanotrophs, là một nhóm vi sinh vật hóa tự dưỡng hoặc hóa dị dưỡng có khả năng sử dụng metan làm nguồn cacbon và năng lượng chính cho quá trình sinh trưởng. Chúng phân bố rộng rãi trong nhiều môi trường khác nhau, từ đất, nước, trầm tích đến các khu vực giàu metan như bãi rác hoặc đầm lầy. Sự đa dạng của các chủng vi khuẩn ôxi hóa metan được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, và di truyền, bao gồm các nhóm như Alpha-proteobacteria và Gamma-proteobacteria. Các chủng này thường biểu hiện những đặc điểm sinh hóa và khả năng thích nghi riêng biệt với điều kiện môi trường, làm nền tảng cho tiềm năng ứng dụng đa dạng của chúng. Nhóm vi khuẩn ôxi hóa metan loại I, điển hình là chi Methylomonas, thường sử dụng chu trình RuMP (ribulose monophosphate) để cố định cacbon, trong khi nhóm loại II (ví dụ Methylocystis) sử dụng chu trình serine. Việc hiểu rõ sự đa dạng này là chìa khóa để khai thác tối đa khả năng của chúng.

1.2. Cơ chế hô hấp metan và vai trò của enzyme methane monooxygenase

Cơ chế chính yếu cho phép vi khuẩn ôxi hóa metan chuyển hóa metan là thông qua hoạt động của enzyme methane monooxygenase (MMO). Enzyme này xúc tác phản ứng ôxi hóa metan thành methanol, bước đầu tiên và quan trọng nhất trong con đường dị hóa metan. Có hai dạng chính của enzyme MMO: dạng hòa tan (sMMO) và dạng hạt (pMMO). Enzyme sMMO có phổ cơ chất rộng hơn, cho phép vi khuẩn sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác ngoài metan. Ngược lại, pMMO, được tìm thấy phổ biến hơn, thường đặc hiệu cao với metan. Sự hiện diện và hoạt động của các gen mã hóa cho enzyme methane monooxygenase, đặc biệt là gen pmoA mã hóa cho tiểu đơn vị của pMMO, là dấu hiệu đặc trưng để nhận diện các vi khuẩn ôxi hóa metan. Khả năng biểu hiện và tối ưu hóa hoạt động của enzyme methane monooxygenase chính là nền tảng cho các ứng dụng công nghệ sinh học nhằm chuyển hóa metan thành các sản phẩm có giá trị.

II. Thách thức khí metan toàn cầu Giải pháp đột phá từ Vi khuẩn ôxi hóa metan

Metan (CH4) là một trong những khí nhà kính gây quan ngại hàng đầu, với khả năng giữ nhiệt lớn hơn CO2 nhiều lần trong một khung thời gian nhất định. Lượng phát thải metan tăng nhanh chóng từ các hoạt động của con người như nông nghiệp (chăn nuôi, trồng lúa), khai thác nhiên liệu hóa thạch, và xử lý chất thải, đang đẩy nhanh tốc độ biến đổi khí hậu. Việc tìm kiếm các giải pháp hiệu quả để giảm thiểu phát thải metan trở thành ưu tiên cấp bách. Trong bối cảnh này, vi khuẩn ôxi hóa metan nổi lên như một công cụ sinh học tự nhiên, an toàn và hiệu quả, có khả năng biến đổi metan thành các sản phẩm ít gây hại hơn hoặc có giá trị kinh tế. Việc khai thác tiềm năng ứng dụng của chúng không chỉ giải quyết vấn đề môi trường mà còn mở ra những cơ hội mới cho các ngành công nghiệp tái tạo và bền vững.

2.1. Tác động của phát thải metan và biến đổi khí hậu

Phát thải metan là nguyên nhân chính thứ hai gây ra hiệu ứng nhà kính, sau carbon dioxide. Metan có tiềm năng làm ấm toàn cầu (GWP) gấp khoảng 28-34 lần CO2 trong 100 năm. Các nguồn phát thải metan nhân tạo chủ yếu bao gồm rò rỉ từ ngành dầu khí, khai thác than, bãi chôn lấp rác thải, và các hoạt động nông nghiệp như chăn nuôi gia súc nhai lại và canh tác lúa nước. Sự gia tăng nồng độ metan trong khí quyển dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng như tăng nhiệt độ toàn cầu, làm tan chảy băng và thay đổi mô hình thời tiết cực đoan. Để đạt được các mục tiêu về khí hậu, việc kiểm soát và giảm thiểu phát thải metan là cực kỳ cần thiết. Các giải pháp sinh học sử dụng vi khuẩn ôxi hóa metan cung cấp một lộ trình hứa hẹn để quản lý hiệu quả nguồn khí nhà kính này, chuyển đổi nó thành các dạng ít gây hại hơn.

2.2. Vai trò thiết yếu của vi khuẩn ôxi hóa metan trong tự nhiên

Trong tự nhiên, vi khuẩn ôxi hóa metan đóng vai trò không thể thiếu trong chu trình cacbon toàn cầu, đặc biệt là trong việc kiểm soát nồng độ metan trong khí quyển. Chúng hoạt động như một bộ lọc sinh học, tiêu thụ metan được tạo ra bởi các vi sinh vật sinh metan (methanogens) trong điều kiện kỵ khí. Tại các giao diện đất-khí quyển, nước-khí quyển, hoặc trong các hệ sinh thái ngập nước, vi khuẩn ôxi hóa metan hoạt động mạnh mẽ, ngăn chặn một lượng lớn metan đi vào khí quyển. Khả năng này của chúng đã được nghiên cứu kỹ lưỡng và chứng minh thông qua các mô hình chu trình cacbon. Hiểu rõ và khai thác vai trò tự nhiên này là cơ sở để phát triển các ứng dụng công nghệ sinh học nhằm giảm thiểu phát thải metan nhân tạo, từ đó góp phần bảo vệ môi trường và chống lại biến đổi khí hậu.

III. Phương pháp phân lập và tối ưu Vi khuẩn ôxi hóa metan Nghiên cứu chủng Methylomonas sp

Để khai thác tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn ôxi hóa metan, bước đầu tiên và quan trọng là phân lập các chủng có đặc tính sinh học phù hợp từ các môi trường tự nhiên. Quá trình này đòi hỏi các kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt, sử dụng metan làm nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Một khi các chủng được phân lập, việc xác định đặc tính sinh lý, hình thái và di truyền là cần thiết để đánh giá khả năng chuyển hóa metan của chúng. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiếu Thu (2014) đã thành công trong việc phân lập và xác định đặc tính của chủng Methylomonas sp. BG3, cung cấp một mô hình quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng công nghệ sinh học của vi khuẩn ôxi hóa metan. Chủng này đã được chứng minh có khả năng sinh trưởng tốt và chứa gen mã hóa cho enzyme methane monooxygenase dạng hạt (pMMO), mở ra nhiều triển vọng.

3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn ôxi hóa metan từ các mẫu môi trường

Việc phân lập vi khuẩn ôxi hóa metan thường bắt đầu bằng việc thu thập mẫu từ các môi trường tự nhiên giàu metan, chẳng hạn như đất ruộng lúa, bùn từ bãi rác, hoặc trầm tích ao hồ. Các mẫu này sau đó được pha loãng và nuôi cấy trong môi trường khoáng lỏng chọn lọc, nơi metan là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Quá trình ủ diễn ra trong bình kín hoặc bioreactor có kiểm soát, với nồng độ metan và oxy phù hợp. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiếu Thu (2014), ba chủng vi khuẩn ôxi hóa metan (BG3, PS1, và W1) đã được phân lập thành công từ các mẫu môi trường khác nhau bằng phương pháp pha loãng trong môi trường khoáng dịch thể sử dụng metan. Việc lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu là yếu tố quyết định để phân lập được các chủng có hoạt tính cao và khả năng ứng dụng thực tiễn.

3.2. Xác định đặc tính sinh học gen của Methylomonas sp. BG3

Sau khi phân lập, việc xác định đặc tính của chủng vi khuẩn ôxi hóa metan là bước thiết yếu. Chủng BG3, được phân lập trong nghiên cứu năm 2014, đã được lựa chọn làm vi sinh vật mô hình nhờ khả năng sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện có metan. Các phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA đã xác định BG3 là một thành viên của chi Methylomonas (thuộc nhóm vi khuẩn ôxi hóa metan loại I), với độ tương đồng 95% so với Methylomonas methanica. Trình tự gen 16S rDNA của chủng này đã được gửi vào ngân hàng gen với mã số K1081955. Ngoài ra, sự hiện diện của gen pmoA, mã hóa cho enzyme methane monooxygenase dạng hạt, cũng được xác nhận với đoạn gen dài 508 bp (GenBank K1081956). Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng BG3 đã được xác định bao gồm pH 6-8, nhiệt độ 25-40°C, và nồng độ muối NaCl 1-15g/L. Những thông tin này cực kỳ quan trọng cho việc phát triển các ứng dụng công nghệ sinh học sau này.

IV. Cách Vi khuẩn ôxi hóa metan chuyển hóa metan Bí quyết tạo giá trị từ khí nhà kính

Khả năng chuyển hóa metan của vi khuẩn ôxi hóa metan không chỉ giúp giảm phát thải metan mà còn mở ra cơ hội tạo ra các sản phẩm sinh học có giá trị. Bí quyết nằm ở enzyme methane monooxygenase (MMO), một enzyme kỳ diệu khởi đầu quá trình chuyển đổi metan thành methanol, một hợp chất hữu cơ dễ dàng được vi khuẩn tiếp tục chuyển hóa thành sinh khối hoặc các sản phẩm khác. Việc tối ưu hóa các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, nồng độ muối, và nguồn dinh dưỡng là chìa khóa để nâng cao hiệu suất của quá trình chuyển hóa metan này. Bằng cách điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy, có thể thúc đẩy sự sinh trưởng của vi khuẩn ôxi hóa metan và tối đa hóa lượng metan được xử lý, từ đó gia tăng tiềm năng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực công nghiệp và môi trường.

4.1. Các dạng enzyme methane monooxygenase SMMO và PMMO

Enzyme methane monooxygenase (MMO) là enzyme chủ chốt trong quá trình ôxi hóa metan. Enzyme này tồn tại dưới hai dạng chính: enzyme hòa tan (sMMO) và enzyme dạng hạt (pMMO). Enzyme sMMO, thường được tìm thấy ở một số chủng vi khuẩn ôxi hóa metan nhất định, có khả năng ôxi hóa không chỉ metan mà còn nhiều hợp chất hữu cơ khác như anken, benzen, và cloform, mang lại tiềm năng lớn trong xử lý chất thải độc hại. Ngược lại, pMMO là dạng phổ biến hơn, gắn với màng tế bào và có tính đặc hiệu cao hơn đối với metan. Các chủng như Methylomonas sp. BG3 trong nghiên cứu (Nguyen Thi Hieu Thu, 2014) được xác định chứa gen mã hóa cho pMMO nhưng không chứa gen sMMO, cho thấy chúng chuyên biệt hơn trong việc sử dụng metan. Việc hiểu rõ cấu trúc và chức năng của từng loại MMO giúp tối ưu hóa quá trình chuyển hóa metan cho các mục đích cụ thể.

4.2. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chuyển hóa metan hiệu quả

Để tối đa hóa hiệu suất chuyển hóa metan của vi khuẩn ôxi hóa metan, việc xác định và duy trì các điều kiện nuôi cấy tối ưu là cực kỳ quan trọng. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ oxy, nồng độ metan, và hàm lượng muối đều ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzyme của vi khuẩn. Đối với chủng Methylomonas sp. BG3, nghiên cứu đã xác định các điều kiện tối ưu như pH từ 6-8, nhiệt độ từ 25-40°C, và nồng độ NaCl từ 1-15 g/L. Trong những điều kiện này, BG3 cho thấy khả năng sinh trưởng tốt nhất. Việc kiểm soát chặt chẽ các thông số này trong bioreactor giúp tăng cường hiệu quả chuyển hóa metan, tạo ra lượng sinh khối vi khuẩn lớn hơn hoặc giảm phát thải metan một cách tối ưu. Điều này đặc biệt có ý nghĩa trong các ứng dụng công nghệ sinh học quy mô lớn.

V. Top ứng dụng tiềm năng của Vi khuẩn ôxi hóa metan Giải pháp bền vững cho môi trường

Khả năng độc đáo của vi khuẩn ôxi hóa metan trong việc sử dụng metan đã mở ra một loạt các tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp. Từ việc biến khí nhà kính thành nguồn protein giá trị cao đến việc làm sạch môi trường khỏi phát thải metan độc hại, những sinh vật này đang định hình tương lai của công nghệ sinh học bền vững. Các nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của chúng trong việc sản xuất sinh khối vi khuẩn giàu protein, có thể dùng làm thức ăn chăn nuôi, cũng như khả năng giảm thiểu khí metan từ các nguồn phát thải lớn như bãi rác và hệ thống xử lý nước thải. Việc khai thác triệt để những ứng dụng này không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần giải quyết các vấn đề môi trường cấp bách, hướng tới một nền kinh tế tuần hoàn và xanh.

5.1. Sản xuất sinh khối vi khuẩn giàu protein cho nông nghiệp

Một trong những ứng dụng tiềm năng nổi bật của vi khuẩn ôxi hóa metan là khả năng sản xuất sinh khối vi khuẩn giàu protein. Metan, một loại khí thải dồi dào và rẻ tiền, có thể được chuyển đổi thành protein đơn bào (Single-Cell Protein - SCP) chất lượng cao, dùng làm thức ăn bổ sung cho động vật. Chủng Methylomonas sp. BG3 đã được chứng minh có khả năng tạo ra sinh khối khô tế bào đạt 1,26 g/L, với hàm lượng protein thô ấn tượng lên tới 69,69 g/100 g trọng lượng khô tế bào (Nguyen Thi Hieu Thu, 2014). Hiệu suất sử dụng metan đạt 2, cho thấy khả năng chuyển đổi khí metan thành protein hiệu quả. Ứng dụng này không chỉ giải quyết vấn đề phát thải metan mà còn cung cấp một nguồn protein bền vững, giảm phụ thuộc vào các nguồn thức ăn truyền thống và góp phần vào an ninh lương thực.

5.2. Giảm phát thải metan từ chất thải hữu cơ hiệu quả

Khả năng của vi khuẩn ôxi hóa metan trong việc hấp thụ và chuyển hóa metan biến chúng thành công cụ lý tưởng để giảm phát thải metan từ các nguồn như bãi chôn lấp rác, hệ thống xử lý nước thải, và các khu vực sản xuất năng lượng sinh học. Trong điều kiện thí nghiệm, chủng Methylomonas sp. BG3 đã chứng minh khả năng loại bỏ 7,46% thể tích metan sinh ra trong quá trình phân hủy kỵ khí rác hữu cơ (Nguyen Thi Hieu Thu, 2014). Con số này tuy nhỏ trong mô hình phòng thí nghiệm nhưng cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn khi được triển khai ở quy mô công nghiệp. Việc ứng dụng vi khuẩn ôxi hóa metan trong các hệ thống lọc sinh học hoặc lớp phủ sinh học trên bãi rác có thể góp phần đáng kể vào việc kiểm soát khí nhà kính, cải thiện chất lượng không khí và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

VI. Tương lai của Vi khuẩn ôxi hóa metan Hướng tới công nghệ sinh học xanh bền vững

Vi khuẩn ôxi hóa metan đại diện cho một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn, không chỉ trong việc giải quyết thách thức môi trường mà còn trong việc tạo ra các sản phẩm sinh học có giá trị. Tương lai của công nghệ sinh học ứng dụng các sinh vật này sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa hiệu suất, mở rộng quy mô sản xuất, và khám phá thêm các ứng dụng tiềm năng mới. Việc nghiên cứu sâu hơn về đặc tính di truyền, cơ chế sinh hóa và khả năng thích nghi của các chủng vi khuẩn ôxi hóa metan khác nhau sẽ là chìa khóa để khai thác tối đa lợi ích của chúng. Mục tiêu cuối cùng là xây dựng một hệ thống bền vững, nơi khí metan không còn là gánh nặng môi trường mà trở thành tài nguyên quý giá, đóng góp vào một nền kinh tế tuần hoàn và một hành tinh xanh hơn. Các nhà khoa học đang nỗ lực phát triển các giải pháp đổi mới, đưa vi khuẩn ôxi hóa metan từ phòng thí nghiệm ra ứng dụng thực tiễn.

6.1. Phát triển công nghệ sinh học ứng dụng vi khuẩn ôxi hóa metan

Tương lai của vi khuẩn ôxi hóa metan nằm ở việc phát triển các công nghệ sinh học tiên tiến hơn. Điều này bao gồm việc thiết kế các bioreactor hiệu quả hơn để nuôi cấy vi khuẩn trên quy mô công nghiệp, tối ưu hóa quá trình chuyển đổi metan thành sinh khối hoặc các hóa chất giá trị. Các kỹ thuật chỉnh sửa gen có thể được áp dụng để tăng cường khả năng ôxi hóa metan hoặc khả năng sản xuất các hợp chất cụ thể của vi khuẩn. Bên cạnh đó, việc tích hợp vi khuẩn ôxi hóa metan vào các hệ thống quản lý chất thải tổng hợp, như hệ thống ủ sinh học hoặc nhà máy xử lý nước thải, sẽ tạo ra một vòng tuần hoàn khép kín, nơi metan được thu hồi và chuyển hóa thành sản phẩm hữu ích. Những tiến bộ này hứa hẹn biến vi khuẩn ôxi hóa metan thành một trụ cột quan trọng trong nền kinh tế sinh học.

6.2. Triển vọng nghiên cứu sâu hơn về Methylomonas và chủng mới

Mặc dù đã có những thành công nhất định với chủng Methylomonas sp. BG3, nghiên cứu về vi khuẩn ôxi hóa metan vẫn còn nhiều tiềm năng chưa được khai thác. Việc tìm kiếm và phân lập các chủng mới từ các môi trường khắc nghiệt hoặc độc đáo có thể mang lại những chủng vi khuẩn với đặc tính sinh học ưu việt hơn, ví dụ như khả năng chịu nhiệt cao, chịu mặn tốt, hoặc hiệu suất chuyển hóa metan vượt trội. Nghiên cứu sâu hơn về gen pmoA và mmo ở các chủng Methylomonas và các chi khác sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế ôxi hóa metan, từ đó phát triển các chiến lược kỹ thuật để tối ưu hóa quá trình này. Ngoài ra, việc khám phá các sản phẩm chuyển hóa phụ từ metan, ngoài sinh khối và methanol, cũng là một hướng đi đầy hứa hẹn, mở rộng tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn ôxi hóa metan trong sản xuất hóa chất sinh học và vật liệu mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LIEGE UNIVERSITY VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI Nguyen Thi Hieu Thu STUDY ON METHANOTROPHS AND THEIR SOME POTENTIAL APPLICATION ASPECTS Specialty: Biotechnology Code: 60 42 02 01 MASTER THESIS SUPERVISOR: Dr. DINH THUY HANG Hanoi, 2014 ACKNOWLEDGEMENTS Foremast, I would like to express my deep gratitude to my advisor Dr. Dinh Thuy Hang for her palicnce, molivalion, enlhusiasin, and immense knowledge. Her guidance helped me in all the time of research and writing of this thesis.

T am indebled to all the lecturers of Vietnam National University, Hanoi (Vietnam) and University of Liege (Belgium) for sharing their valuable scientific knowledge 1 thank my lab mates in Microbial Licology Department (Institute of Microbiology and Biotechnology) for the stimulating discussions, for providing guidance, and for all the fun we have had. Finally, and most intportanily, T would like to thank my family, especial my husband, for unconditional supports that made this thesis possible. Hanoi, December 2013 Nguyen Thi Hicu Thứ Aeknowledgements. SH TH H0 HH HH HH re 'Table oŸ conterts.

_ List of figures List of tables. Abbreviations Abstract - § Tóm tắt. Methane and global climate change - 11 1. Phylogeny of methanalrophs - - 12 1.

Physical diversily of methanotrophs - 15 1. Acrobic methane oxidalion - - 17 1. The role of MMOs in MOB 1. Soluble methane monoaxyge ase 1.3, Particulate methane monooxygenase.

Application potential of Methanotrophs.1, Food for animal. Bioconversion of methane to methanol. Objectives of this study —-- Chapter 2. Materiat and Method 2.

Isolation of methanotrophs - - coe 36 2.3 DNA extraclion and PCR amplification ce 38 2. Sequencing and phylogenetic analysis - ce Al 2. Morphotogical and physiological characterization ce Al TOM TAT Từ các mẫu mỗi trường thu thập từ các địa điểm khác nhau, ba chủng vì khuẩn oxy hỏa metan gồm BG3, PSI vá W1 đã duợc phân lập nhờ phương pháp pha loãng, trong môi trường khoáng địch thể sử dụng metan làm nguồn cacbon vả năng lượng đuy nhật. Ba chủng tới trên chứa gen tnã hóa cho envyme methane monooxygenase 6 dang hạt nhưng không chứa gen mã hóa cho enzyme này ở dạng hòa tan, chứng tô ba chúng, này không có khả năng sinh trưởng trên đa đạng cáo loại cơ chật hữu cơ kháo nhan.

‘Trong ba ching phân lập được, chủng 13G3 có khá năng sinh trưởng tốt nhất trong điển kiện có metan do đẻ chủng nảy được lựa chọn và sử đựng như vi sinh vật mô hình trong các thí nghiện tiếp theo về tiểm năng ứng dụng. Các điều kiện nuôi cây tối ưu của chủng này đã được xác định bao gdm: pll 6-8, nhiệt độ 25-40°C, nông độ muối 1-15g'LNaCl. Dựa trên các phân tích trình tự đoạn gen 168 rDNA, chúng BG3 được xác định lá một thành viên của chỉ Methylomonas (vi khudn sir dang metan tuyp 1) với chủng gần gũi nhật là Methylomonas methanica (6 tuong déng 95%). Ching nay dược dặt tên là A⁄e£ylomonas sp.

BG3 và trình tự doạn gen 168 rDNA của nó đã được gửi vào ngân hàng gen đưới mã số K1081955. Ngoài ra, gen pmad cũng đã được xác định có mặt ở chủng này với đoạn gen dải 508 bp được gửi tai GenBank véi ma sé KI081956. Một số hướng ứng đựng của vì khuẩn oxy hóa metan đã được tiến hành nghiền cứu với vi sinh vật mô hình là chúng BG3. Nuôi cấy chúng BG3 với metan tạo sinh: khỏi có trọng lượng khô tế bảo là 1,26 g1, ham none protein thd là 69,69g/100 g CDW va higu sud sir dung motan fa 2.

Trong điểu kiện dư nghiệm chủng BG3 có khả năng loại bó 7,46 %4 thể tích metan sinh ra trong quá trình. phân hủy ky khi rác hữu cơ Tw khéa: vi khan oxy héa metan, Methylomonas, pmod, tao sinh khôi, phát thải Tnelam. 10 TOM TAT Từ các mẫu mỗi trường thu thập từ các địa điểm khác nhau, ba chủng vì khuẩn oxy hỏa metan gồm BG3, PSI vá W1 đã duợc phân lập nhờ phương pháp pha loãng, trong môi trường khoáng địch thể sử dụng metan làm nguồn cacbon vả năng lượng đuy nhật. Ba chủng tới trên chứa gen tnã hóa cho envyme methane monooxygenase 6 dang hạt nhưng không chứa gen mã hóa cho enzyme này ở dạng hòa tan, chứng tô ba chúng, này không có khả năng sinh trưởng trên đa đạng cáo loại cơ chật hữu cơ kháo nhan.

‘Trong ba ching phân lập được, chủng 13G3 có khá năng sinh trưởng tốt nhất trong điển kiện có metan do đẻ chủng nảy được lựa chọn và sử đựng như vi sinh vật mô hình trong các thí nghiện tiếp theo về tiểm năng ứng dụng. Các điều kiện nuôi cây tối ưu của chủng này đã được xác định bao gdm: pll 6-8, nhiệt độ 25-40°C, nông độ muối 1-15g'LNaCl. Dựa trên các phân tích trình tự đoạn gen 168 rDNA, chúng BG3 được xác định lá một thành viên của chỉ Methylomonas (vi khudn sir dang metan tuyp 1) với chủng gần gũi nhật là Methylomonas methanica (6 tuong déng 95%). Ching nay dược dặt tên là A⁄e£ylomonas sp.

BG3 và trình tự doạn gen 168 rDNA của nó đã được gửi vào ngân hàng gen đưới mã số K1081955. Ngoài ra, gen pmad cũng đã được xác định có mặt ở chủng này với đoạn gen dải 508 bp được gửi tai GenBank véi ma sé KI081956. Một số hướng ứng đựng của vì khuẩn oxy hóa metan đã được tiến hành nghiền cứu với vi sinh vật mô hình là chúng BG3. Nuôi cấy chúng BG3 với metan tạo sinh: khỏi có trọng lượng khô tế bảo là 1,26 g1, ham none protein thd là 69,69g/100 g CDW va higu sud sir dung motan fa 2.

Trong điểu kiện dư nghiệm chủng BG3 có khả năng loại bó 7,46 %4 thể tích metan sinh ra trong quá trình. phân hủy ky khi rác hữu cơ Tw khéa: vi khan oxy héa metan, Methylomonas, pmod, tao sinh khôi, phát thải Tnelam. Agarose gel electrophoresis of the mmnaX gene PCR products yielded from genome of the isolates (800 bp). Growth of the MOB isolates with methane as shown by optical density of the liquid cultures after 4 days cultivation.

Phase — contrast micrographs of the MOD isolates grown in liquid cultures with methane (viewed at 1000” magnifications). Phylogenstic tree based on the 168 rRNA gene sequences showing the relationship of strains BG3 and other known mothaniotrophs. Phylogenetic analysis of partial amino acid sequences encaded by the pmad gene from the three MOL isolates. Cultivation condition-dependent.

growth of strain BGS. Cullivation of RG3 wilh methane. Experimental gencration of methane from organic wastes. Control of methane emission from organic wastes in laboratory model using strain BG3.

Results and discussion.1, Enrichment and isolation of MOLs from environmental samples. Enrichment of MOHA. Isolation of MOBs and preliminary identification, ".2, Study the presence of MMO encoding genes in the isolates 3. Growth of the MOB isolates with methane 3.4, Morphology, physiology and phylogeny of strain BG3 AD 3.

Application experiments using Meiftylomonas sp. BG3 as model organism - e 53 3. Study on bacterial meal production e 53 3. Study on reduction of methane emission from organic wastes.55 Conclusion and Prospective works.

59 Appendix - - ceed ABBREVIATIONS 168 rDNA Gene coding for small subunit of ribosomal deoxyribonucleic acid Bp Base pair BSA Bovin serum albumin Chloroform-isoamyl alcohol DGGE Denaturing grachent gel cloetrophoresis DNA Deoxyribonucleic acid đNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FPS Fxtracellularexo- polymeric substance ICM Intracytoplasmic membrane MOB Methane oxidizing bacteria MQ Mili-Q oD Optical density PCR Polymerase chain reaction pMMO Particulate methane mono-oxygenase pod Gene for alpha subunit of the pMMO SDS Sodium dodecyl sulfate sMMO Soluble methane mono-oxygenase TAE Tris-Acetic-EDTA Tag Thermus aquaticus DNA polymerase BPM Bacterial protein meal ABSTRACT From environmental samples of different locations, three freshwater strains of methane oxidizing bacteria (MOBs), i. BG3, PSI and WL, were isolated by using, serial dilution method in liquid mincral medham with methane as the only carbon and energy sources. These three isolates contained genes encoding for the particulate methane-mono-oxygenase (pMMQ) but not the soluble one (sMMO), indicating that they would not. be expected lo growth on a broad range of organic substrates.

Of the three isolales, strain BG3 showed the Inghesl growth with melhane and thus was selected and used as model organisms in further experiments on application aspects. Optimal cultivation conditions for this strain were also determined, ie. Based on phylogenetic analyses of the 168 rDNA partial gene sequences, strain 13G3 was identified as a member of the Aethylomonas genus (type 1 methanotroph), the most closely related species was Methylomonas methanica (95% homology). This straint was designated with the name Methylomonas sp.

BG3 and its 16S rDNA partial sequence was deposited at the GenBank under ac ession tumnber of KIN81 955. In addition, pmed gene has also been detected in this strain and a gene sequence fragment (S08 bp) was deposited the GenBank under accession number of K7081956, Studies on the application aspects of MOLs were conducted with the use of strain BG3 as the model organism. Tt has been shown Ul methane-fed cullure of strain BG3 could yield 1.26 g- cell dry weight (CDW), accordingly produce 68.69 ¢ crude protein per 100 g CDW and the efficiency of methane consumption in this respect was 2.85 m? per kg CDW. Tn the study on control of metlune emission by MOR, strain BG3 showed the capability of reducing 77.46 % of total volume of methane emitted from anacrobically decomposing organic wastes.

methanotroph, Methylomonas, pmoA, biomass production, methane cimission ABSTRACT From environmental samples of different locations, three freshwater strains of methane oxidizing bacteria (MOBs), i. BG3, PSI and WL, were isolated by using, serial dilution method in liquid mincral medham with methane as the only carbon and energy sources. These three isolates contained genes encoding for the particulate methane-mono-oxygenase (pMMQ) but not the soluble one (sMMO), indicating that they would not. be expected lo growth on a broad range of organic substrates.

Of the three isolales, strain BG3 showed the Inghesl growth with melhane and thus was selected and used as model organisms in further experiments on application aspects. Optimal cultivation conditions for this strain were also determined, ie. Based on phylogenetic analyses of the 168 rDNA partial gene sequences, strain 13G3 was identified as a member of the Aethylomonas genus (type 1 methanotroph), the most closely related species was Methylomonas methanica (95% homology). This straint was designated with the name Methylomonas sp.

BG3 and its 16S rDNA partial sequence was deposited at the GenBank under ac ession tumnber of KIN81 955. In addition, pmed gene has also been detected in this strain and a gene sequence fragment (S08 bp) was deposited the GenBank under accession number of K7081956, Studies on the application aspects of MOLs were conducted with the use of strain BG3 as the model organism. Tt has been shown Ul methane-fed cullure of strain BG3 could yield 1.26 g- cell dry weight (CDW), accordingly produce 68.69 ¢ crude protein per 100 g CDW and the efficiency of methane consumption in this respect was 2.85 m? per kg CDW. Tn the study on control of metlune emission by MOR, strain BG3 showed the capability of reducing 77.46 % of total volume of methane emitted from anacrobically decomposing organic wastes.

methanotroph, Methylomonas, pmoA, biomass production, methane cimission 2. Results and discussion.1, Enrichment and isolation of MOLs from environmental samples. Enrichment of MOHA. Isolation of MOBs and preliminary identification, ".2, Study the presence of MMO encoding genes in the isolates 3.

Growth of the MOB isolates with methane 3.4, Morphology, physiology and phylogeny of strain BG3 AD 3. Application experiments using Meiftylomonas sp. BG3 as model organism - e 53 3.