Đánh giá khả năng phát hiện virus ASFV trên lợn của bộ kit TraceDetectTM qPCR

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluating ability of detection of african swine fever virus asfv in, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Ngo Thi Cam Phin
• Người hướng dẫn: Dr. Dinh Xuan Phat
• Trường học: Nong Lam University Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Evaluating Ability Of Detection Of African Swine Fever Virus (ASFV) In Swine Of The Trial Kit Tracedetecttm Qpcr Asfv
• Loại tài liệu: Graduation Thesis
• Năm xuất bản: 2019-2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. CHAPTER 1
• 1.1. Introduction
• 1.2. Objective
• 1.3. Research contents
• 2. CHAPTER 2. Introduction of African Swine Fever virus (ASTFV)
• 2.1. Structural property
• 2.2. Invasion mechanism, replication, and gene expression in host cells of ASFV
• 2.2.1. ASFV Invasion Mechanism
• 2.2.2. ASFV replication and gene expression mechanism in Host cells
• 2.3. Diseases and associated syndromes
• 2.4. Epidemiology
• 2.5. Real-time PCR
• 2.5.1. Principles
• 2.5.2. Real amplification chart - PCR heart
• 2.5.3. Quantification in Real-time PCR
• 2.6. Situation of ASFV diagnostic research
• 2.6.1. National Studies
• 3. Chapter 3. MATERIALS AND METHOD
• 3.1. Location and duration
• 3.2. Object and materials
• 3.3. Experimental design
• 3.4. Treatment of samples
• 3.5. DNA extraction
• 3.6. Realtime PCR
• 3.7. Determination of detection limit
• 3.8. Testing analytical specificity
• 3.9. Determination of detection limits on field samples. Check accuracy in ASFV detection
• 3.10. Evaluation of the stability of the trial kit for the detection of ASFV
• 3.11. Data processing
• 4. Chapter 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. RESULTS
• 4.2. Determination of detection limit
• 4.3. Testing analytical specificity
• 4.4. Determination of detection limits on field samples
• 4.5. Comparative values between the trial kit and Reference Kit
• 5. Chapter 5. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS
• REFERENCE

Tóm tắt

I. Thách thức chẩn đoán ASFV Tổng quan Dịch tả lợn Châu Phi

Virus Dịch tả lợn Châu Phi (African Swine Fever Virus - ASFV) là một trong những mầm bệnh nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi lợn toàn cầu. Đây là một loại virus DNA sợi đôi, có cấu trúc phức tạp, thuộc họ Asfarviridae. Mức độ lây lan của virus rất cao và tỷ lệ tử vong ở lợn có thể lên đến 100%, gây ra những thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Kể từ khi được phát hiện lần đầu tại Kenya vào những năm 1920, ASFV đã lan rộng khắp các châu lục, đặc biệt bùng phát mạnh mẽ tại châu Á từ năm 2018. Tại Việt Nam, sự xuất hiện của ASFV vào tháng 2 năm 2019 đã nhanh chóng lan rộng, gây tổn thất nặng nề cho ngành sản xuất thịt lợn, vốn chiếm tới 60% tổng sản lượng chăn nuôi. Tác động của dịch bệnh không chỉ dừng lại ở việc sụt giảm GDP mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến đời sống của người nông dân. Thách thức lớn nhất trong công cuộc kiểm soát dịch tả heo chính là việc phát hiện sớm và chính xác mầm bệnh. Các triệu chứng lâm sàng của bệnh ở giai đoạn đầu thường không rõ ràng và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác như dịch tả lợn cổ điển (CSFV). Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như quan sát bệnh tích hay xét nghiệm miễn dịch (ELISA) tuy hữu ích nhưng lại có những hạn chế về độ nhạy và thời gian cho kết quả, làm chậm quá trình khoanh vùng dập dịch. Do đó, việc phát triển và ứng dụng các kỹ thuật xét nghiệm ASFV hiện đại, có độ chính xác cao và tốc độ nhanh chóng là yêu cầu cấp thiết. Đây là bối cảnh quan trọng để các bộ sinh phẩm qPCR như TraceDetectTM ra đời, mang lại giải pháp đột phá cho công tác giám sát dịch bệnh và bảo vệ ngành chăn nuôi.

1.1. Tác động kinh tế của virus African Swine Fever

Sự bùng phát của Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) đã gây ra một cuộc khủng hoảng kinh tế sâu sắc trong ngành chăn nuôi toàn cầu. Virus African Swine Fever Virus không chỉ gây chết lợn hàng loạt mà còn làm gián đoạn chuỗi cung ứng, đẩy giá thịt lợn lên cao và gây bất ổn thị trường. Tại Việt Nam, nơi chăn nuôi lợn là ngành kinh tế chủ lực, thiệt hại là vô cùng lớn. Theo báo cáo, chỉ trong vài tháng đầu bùng phát, dịch bệnh đã lan rộng trên quy mô lớn, buộc phải tiêu hủy hàng triệu con lợn, gây thiệt hại trực tiếp hàng nghìn tỷ đồng. Những tổn thất này không chỉ ảnh hưởng đến các trang trại lớn mà còn đẩy nhiều hộ chăn nuôi nhỏ lẻ vào tình trạng phá sản. Việc thiếu vắc-xin hiệu quả và khả năng tồn tại lâu của virus trong môi trường càng làm cho công tác kiểm soát dịch tả heo trở nên khó khăn và tốn kém, đòi hỏi một chiến lược quốc gia dài hạn về an toàn sinh học và giám sát dịch tễ.

1.2. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán ASFV truyền thống

Trước khi các kỹ thuật sinh học phân tử phát triển, việc chẩn đoán ASFV chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các phương pháp xét nghiệm trong phòng thí nghiệm như virus học hoặc miễn dịch học (ELISA). Tuy nhiên, các phương pháp này tồn tại nhiều nhược điểm. Triệu chứng lâm sàng như sốt cao, xuất huyết dưới da có thể bị nhầm lẫn với các bệnh khác. Phương pháp phân lập virus đòi hỏi thời gian dài và phòng thí nghiệm thú y có cấp độ an toàn sinh học cao. Kỹ thuật ELISA tuy nhanh hơn nhưng độ nhạy không đủ cao để phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm hoặc ở thể mãn tính, khi lượng virus trong cơ thể vật chủ thấp. Những hạn chế này làm giảm hiệu quả của việc phát hiện sớm, dẫn đến nguy cơ lây lan dịch bệnh ra cộng đồng trước khi các biện pháp kiểm soát được áp dụng.

II. Phương pháp Real time PCR Nền tảng của kit TraceDetectTM

Trước những thách thức của phương pháp truyền thống, công nghệ sinh học phân tử đã mang lại một bước đột phá quan trọng, trong đó nổi bật là kỹ thuật Real-time PCR (qPCR). Đây là phương pháp khuếch đại và định lượng DNA mục tiêu dựa trên tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ nhiệt. Ưu điểm vượt trội của phương pháp PCR này là độ nhạy, độ đặc hiệu cao, thời gian phân tích ngắn và khả năng định lượng virus chính xác. Kỹ thuật này đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán ASFV tại nhiều phòng thí nghiệm thú y trên thế giới. Dựa trên nền tảng công nghệ này, bộ sinh phẩm qPCR TraceDetectTM ASFV Kit được phát triển như một giải pháp toàn diện. Bộ kit này cung cấp đầy đủ các thành phần thiết yếu cho một phản ứng qPCR, bao gồm Master mix 2X, hỗn hợp mồi và mẫu dò (primer & probe) đặc hiệu cho gene p72 của virus ASFV, và chứng dương. Việc sử dụng mẫu dò TaqMan, với một đầu gắn chất phát quang (Reporter) và một đầu gắn chất dập tắt (Quencher), giúp tăng cường độ đặc hiệu của phản ứng. Tín hiệu huỳnh quang chỉ được ghi nhận khi mẫu dò bám đúng vào DNA mục tiêu và bị enzyme Taq polymerase phân cắt trong quá trình khuếch đại. Quy trình xét nghiệm PCR với kit TraceDetectTM được tối ưu hóa để đơn giản hóa thao tác, giảm nguy cơ ngoại nhiễm và cho kết quả nhanh chóng, thường chỉ trong vòng vài giờ sau khi tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm.

2.1. Nguyên lý hoạt động của công nghệ sinh học Real time PCR

Real-time PCR, hay còn gọi là PCR định lượng (qPCR), là một kỹ thuật tiên tiến của phương pháp PCR truyền thống. Nguyên lý của nó là theo dõi sự tích lũy sản phẩm khuếch đại DNA trong thời gian thực thông qua tín hiệu huỳnh quang. Trong mỗi chu kỳ phản ứng, lượng DNA mục tiêu tăng lên gấp đôi, kéo theo sự gia tăng tương ứng của tín hiệu huỳnh quang. Máy qPCR sẽ ghi nhận cường độ huỳnh quang này và biểu diễn dưới dạng biểu đồ khuếch đại. Dựa vào chu kỳ ngưỡng (Ct value) – thời điểm tín hiệu huỳnh quang vượt qua ngưỡng nền – có thể xác định sự hiện diện và định lượng virus hoặc tác nhân gây bệnh trong mẫu ban đầu. Đây là một công cụ mạnh mẽ, được ứng dụng rộng rãi trong y học, thú y và nghiên cứu công nghệ sinh học.

2.2. Giới thiệu thành phần bộ sinh phẩm qPCR TraceDetectTM

TraceDetect ASFV kit là một bộ sinh phẩm qPCR được thiết kế chuyên biệt cho việc phát hiện ASFV. Bộ kit bao gồm các thành phần chính đã được tối ưu hóa: Master mix 2X chứa enzyme Taq polymerase, dNTPs, và dung dịch đệm; hỗn hợp mồi và mẫu dò (primer & probe) được thiết kế đặc hiệu để nhận diện một đoạn gene bảo tồn trên bộ gene của ASFV; nước tinh sạch không chứa nuclease; và chứng dương (Positive Control) chứa plasmid DNA của ASFV để kiểm tra hiệu quả phản ứng. Việc đóng gói đồng bộ các thành phần giúp đảm bảo tính ổn định, độ lặp lại cao và giảm thiểu các thao tác chuẩn bị phức tạp tại phòng thí nghiệm thú y, qua đó nâng cao hiệu suất công việc.

III. Đánh giá bộ kit TraceDetectTM Độ nhạy và độ đặc hiệu 100

Một trong những yếu tố quyết định chất lượng của một kit chẩn đoán thú y là độ nhạy và độ đặc hiệu. Nghiên cứu đánh giá bộ kit qPCR TraceDetectTM ASFV của tác giả Ngô Thị Cẩm Phin (2023) tại trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã cung cấp những dữ liệu khoa học thuyết phục về hiệu năng của sản phẩm này. Kết quả nghiên cứu cho thấy độ đặc hiệu phân tích của bộ kit là tuyệt đối. Khi tiến hành xét nghiệm ASFV trên các mẫu DNA/RNA của các tác nhân gây bệnh phổ biến khác trên lợn như E. coli, Salmonella, PCV2, PRRSV, bộ kit không cho bất kỳ tín hiệu dương tính giả nào. Điều này khẳng định cặp mồi và mẫu dò được thiết kế có tính đặc hiệu cao, chỉ nhận diện duy nhất mục tiêu là virus Dịch tả lợn Châu Phi. Về độ nhạy, giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD) của bộ kit được xác định là 1 copy/μL. Đây là một ngưỡng phát hiện cực kỳ thấp, cho phép chẩn đoán bệnh ngay cả khi tải lượng virus trong mẫu bệnh phẩm còn rất ít, đặc biệt quan trọng trong giai đoạn ủ bệnh. Khi so sánh với một bộ kit tham chiếu thương mại trên 50 mẫu huyết thanh thực địa, TraceDetect ASFV kit cho kết quả trùng khớp 100%. Cụ thể, nghiên cứu đã xác định độ nhạy chẩn đoán và độ đặc hiệu chẩn đoán của bộ kit đều đạt 100%, với giá trị dự đoán dương và giá trị dự đoán âm cũng đạt 100%. Những con số này chứng minh rằng bộ sinh phẩm qPCR TraceDetectTM là một công cụ chẩn đoán có độ tin cậy và chính xác rất cao.

3.1. Phân tích độ đặc hiệu Không phản ứng chéo với mầm bệnh khác

Để kiểm tra độ đặc hiệu, nghiên cứu đã thực hiện phản ứng Real-time PCR với bộ kit TraceDetectTM trên DNA/RNA của 7 loại vi khuẩn và virus thường gây bệnh trên lợn, bao gồm Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Streptococcus, Porcine Circovirus type 2 (PCV2), và Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV). Kết quả cho thấy, chỉ có mẫu chứng dương và mẫu nhiễm ASFV cho tín hiệu huỳnh quang trên kênh màu FAM, trong khi tất cả các mẫu mầm bệnh không liên quan đều không khuếch đại. Theo tài liệu của Ngô Thị Cẩm Phin (2023), "bộ kit thử nghiệm chỉ khuếch đại và đặc hiệu với ASFV và không khuếch đại với DNA/RNA không liên quan". Điều này chứng tỏ TraceDetect ASFV kit có thể phân biệt chính xác ASFV với các mầm bệnh khác, tránh được các kết quả dương tính giả.

3.2. Xác định giới hạn phát hiện LOD Chỉ 1 copy μL

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của tác nhân gây bệnh mà một xét nghiệm có thể phát hiện được một cách đáng tin cậy. Trong nghiên cứu, LOD của bộ sinh phẩm qPCR TraceDetectTM được xác định bằng cách pha loãng bậc 10 plasmid chuẩn chứa DNA của ASFV từ nồng độ 10^6 copies/μL xuống đến 10^0 copies/μL. Kết quả phản ứng qPCR cho thấy bộ kit có khả năng phát hiện tín hiệu dương tính một cách ổn định ở nồng độ thấp nhất là 1 copy/μL. Nghiên cứu kết luận: "giới hạn phát hiện của bộ kit thử nghiệm là 1 copy/uL" (Ngô Thị Cẩm Phin, 2023). Khả năng này cực kỳ quan trọng, giúp phát hiện sớm ca bệnh, ngay cả trước khi lợn biểu hiện triệu chứng rõ ràng, tạo điều kiện cho việc cách ly và xử lý kịp thời.

IV. Hiệu quả kit TraceDetectTM trên các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau

Tính ứng dụng thực tiễn của một kit chẩn đoán thú y không chỉ nằm ở các thông số kỹ thuật lý tưởng mà còn ở khả năng hoạt động hiệu quả trên nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác nhau. Trong thực tế giám sát dịch bệnh, mẫu thu thập không chỉ là huyết thanh mà còn có thể là mẫu mô (lách, hạch lympho) hoặc mẫu phân. Nghiên cứu đã mở rộng đánh giá hiệu năng của TraceDetect ASFV kit trên 20 mẫu mô và 20 mẫu phân, bên cạnh 50 mẫu huyết thanh đã được kiểm tra trước đó. Kết quả trên tổng số 90 mẫu thực địa cho thấy sự tương đồng tuyệt đối giữa bộ kit TraceDetectTM và bộ kit tham chiếu. Cụ thể, không có bất kỳ sự khác biệt nào về kết quả dương tính hay âm tính giữa hai bộ kit trên cả ba loại mẫu. Điều này chứng tỏ bộ sinh phẩm qPCR TraceDetectTM có khả năng phát hiện ASFV một cách ổn định và chính xác trên nền mẫu đa dạng, từ mẫu xâm lấn (mô, máu) đến không xâm lấn (phân). Một yếu tố quan trọng khác là độ ổn định và độ lặp lại của xét nghiệm. Phân tích trên 29 mẫu dương tính với 3 lần lặp lại cho mỗi mẫu cho thấy hệ số biến thiên (CV%) dao động từ 0.39%, một con số rất thấp. Kết quả này khẳng định rằng quy trình xét nghiệm PCR sử dụng kit TraceDetectTM cho kết quả nhất quán và đáng tin cậy, là yếu tố then chốt cho các phòng thí nghiệm thú y khi cần xử lý số lượng mẫu lớn và yêu cầu độ chính xác cao, góp phần vào nỗ lực kiểm soát dịch tả heo của các cơ quan chức năng như Cục Thú y.

4.1. Kết quả xét nghiệm ASFV trên mẫu huyết thanh mô và phân

Nghiên cứu đã kiểm tra tổng cộng 90 mẫu bệnh phẩm thực địa, bao gồm 50 mẫu huyết thanh, 20 mẫu mô và 20 mẫu phân. Toàn bộ các mẫu này đều được tiến hành xét nghiệm ASFV song song bằng kit TraceDetectTM và một kit tham chiếu. Kết quả cho thấy sự đồng nhất 100% giữa hai phương pháp trên tất cả các loại mẫu. Trong đó, 29/90 mẫu cho kết quả dương tính và 61/90 mẫu cho kết quả âm tính ở cả hai bộ kit. Điều này chứng minh rằng TraceDetect ASFV kit không bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế tiềm tàng có trong các nền mẫu phức tạp như mô hay phân, đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin cậy trong mọi tình huống.

4.2. Đánh giá độ lặp lại và ổn định qua hệ số biến thiên CV

Độ lặp lại là một chỉ số quan trọng để đánh giá sự ổn định của một phương pháp xét nghiệm. Trong nghiên cứu, 29 mẫu dương tính với ASFV đã được phân tích 3 lần lặp lại bằng kit TraceDetectTM. Dựa trên giá trị Ct thu được, hệ số biến thiên (CV%) được tính toán. Kết quả cho thấy CV% dao động ở mức rất thấp, lớn nhất chỉ là 0.39% ở mẫu W1. Theo tài liệu, "hệ số biến thiên giữa các lần lặp lại trên bộ thử nghiệm dao động từ 0.39%... và nhỏ hơn 15%" (Ngô Thị Cẩm Phin, 2023), cho thấy độ ổn định và độ chính xác cao của bộ kit. Điều này có ý nghĩa quan trọng đối với các phòng thí nghiệm thú y cần đảm bảo tính nhất quán của kết quả qua nhiều lần chạy.

V. Tương lai kiểm soát dịch tả heo với kit qPCR TraceDetectTM

Kết quả từ nghiên cứu của Ngô Thị Cẩm Phin (2023) đã cung cấp bằng chứng khoa học vững chắc, khẳng định bộ kit qPCR TraceDetectTM ASFV là một công cụ chẩn đoán mạnh mẽ, hiệu quả và đáng tin cậy. Với độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100%, giới hạn phát hiện cực thấp (1 copy/μL) và khả năng hoạt động ổn định trên nhiều loại mẫu bệnh phẩm, bộ kit này đáp ứng đầy đủ các yêu cầu khắt khe nhất của một phòng thí nghiệm thú y hiện đại. Việc áp dụng rộng rãi bộ kit này trong thực tiễn sẽ mang lại nhiều lợi ích to lớn. Nó cho phép các cơ quan thú y và người chăn nuôi thực hiện giám sát dịch bệnh chủ động, phát hiện sớm các ổ dịch ngay từ khi mới manh nha, từ đó triển khai các biện pháp khoanh vùng, cách ly và xử lý kịp thời. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế do Dịch tả lợn Châu Phi gây ra mà còn góp phần quan trọng vào chiến lược kiểm soát dịch tả heo quốc gia. Tương lai của công tác phòng chống ASFV phụ thuộc rất nhiều vào các công cụ chẩn đoán nhanh và chính xác. TraceDetect ASFV kit, với những ưu điểm đã được chứng minh, hứa hẹn sẽ trở thành một phần không thể thiếu trong bộ công cụ của ngành thú y Việt Nam, hỗ trợ đắc lực cho việc bảo vệ đàn lợn và đảm bảo sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi.

5.1. Tóm tắt ưu điểm vượt trội của bộ kit chẩn đoán thú y này

Bộ kit qPCR TraceDetectTM ASFV thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội. Thứ nhất, độ chính xác tuyệt đối với độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán là 100%. Thứ hai, độ nhạy phân tích cao với LOD chỉ 1 copy/μL, giúp phát hiện sớm mầm bệnh. Thứ ba, tính linh hoạt cao khi có thể sử dụng trên nhiều loại mẫu bệnh phẩm (huyết thanh, mô, phân). Thứ tư, độ ổn định và lặp lại xuất sắc, đảm bảo kết quả nhất quán. Cuối cùng, quy trình xét nghiệm PCR được đơn giản hóa, giúp tiết kiệm thời gian và nguồn lực cho các phòng thí nghiệm. Đây là một kit chẩn đoán thú y toàn diện và hiệu quả.

5.2. Khuyến nghị và định hướng nghiên cứu phát triển trong tương lai

Dựa trên kết quả tích cực, nghiên cứu đề xuất tiếp tục đánh giá bộ sinh phẩm qPCR này trên quy mô mẫu lớn hơn và đa dạng hơn về mặt địa lý cũng như trên các nền tảng mẫu khác. Việc này sẽ củng cố thêm dữ liệu về hiệu quả của kit trong các điều kiện thực địa khác nhau. Đồng thời, cần có các nghiên cứu so sánh sâu hơn với nhiều bộ kit thương mại khác để xác định vị thế cạnh tranh của sản phẩm. Hướng phát triển trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA để rút ngắn thời gian tổng thể hoặc phát triển các phiên bản kit multiplex có khả năng phát hiện đồng thời ASFV và các mầm bệnh quan trọng khác như dịch tả lợn cổ điển, góp phần nâng cao hiệu quả công tác giám sát dịch bệnh.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Dịch tả lợn châu Phi (African Swine Fever - ASF) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất ở loài lợn, gây ra bởi virus Dịch tả lợn châu Phi (African Swine Fever Virus - ASFV). Bệnh đặc trưng bởi khả năng lây lan nhanh và tỷ lệ tử vong ở đàn lợn nhiễm bệnh có thể lên đến 100%. Về mặt lịch sử dịch tễ, ASF được ghi nhận lần đầu tiên tại Kenya vào những năm 1920, xuất hiện tại châu Âu năm 1957, sau đó lan sang khu vực Kavkaz và miền nam nước Nga vào năm 2007. Đến tháng 8 năm 2018, Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) ghi nhận đợt bùng phát đầu tiên tại khu vực Đông Á ở Trung Quốc, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn tại đây trước khi lan rộng ra nhiều quốc gia châu Á khác.

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Cục Thú y, virus ASFV được phát hiện lần đầu vào tháng 2 năm 2019 và bùng phát trên diện rộng chỉ trong vòng 5 tháng. Dịch bệnh tiếp tục tái bùng phát và diễn biến phức tạp trong các năm 2020, 2021 và 2022. Trong bối cảnh ngành chăn nuôi lợn chiếm tới 60% tổng sản lượng ngành chăn nuôi của Việt Nam, sự lưu hành của dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi và tác động tiêu cực đến tăng trưởng tổng sản phẩm quốc nội (GDP). Do chưa có nhiều biện pháp điều trị đặc hiệu ngoài việc tiêu hủy đàn nhiễm, việc phát hiện sớm mầm bệnh đóng vai trò quyết định trong việc khống chế sự lây lan. Bộ kit thử nghiệm TraceDetect™ qPCR ASFV được phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu xét nghiệm nhanh, chính xác và tiện lợi tại thực địa.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là đánh giá khả năng phát hiện virus ASFV trên lợn của bộ kit thử nghiệm TraceDetect™ qPCR ASFV. Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác định gồm:

1. Đánh giá các thông số kỹ thuật phân tích của bộ kit TraceDetect™ qPCR ASFV, bao gồm độ đặc hiệu phân tích và giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD) trên mẫu chuẩn plasmid DNA mang gen đích.
2. So sánh, đánh giá khả năng phát hiện và độ chính xác của bộ kit thử nghiệm trên các loại mẫu thực địa khác nhau (huyết thanh, mô, phân) khi đối chiếu với bộ kit thương mại đối chứng (Reference kit).

Đối tượng nghiên cứu chính là bộ kit thử nghiệm TraceDetect™ qPCR ASFV cùng các mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thập từ các trang trại chăn nuôi lợn. Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện từ ngày 24 tháng 3 năm 2023 đến ngày 17 tháng 7 năm 2023 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen BIO313, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Cơ sở sinh học của đề tài dựa trên các đặc tính cấu trúc, cơ chế xâm nhiễm và đặc điểm dịch tễ học của virus ASFV:

• Đặc tính cấu trúc ASFV: ASFV là virus DNA sợi đôi dạng mạch thẳng, kích thước hệ gen từ 170 đến 194 kbp, mã hóa 150–170 khung đọc mở (ORF), thuộc họ Asfarviridae, chi Asfivirus. Hạt virus hoàn chỉnh có cấu trúc đa lớp phức tạp gồm 5 lớp từ ngoài vào trong: màng bao ngoài (outer envelope chứa protein p12 trung gian gắn kết thụ thể), vỏ capsid đối xứng hình khối 20 mặt gồm 2.760 capsomer giả lục giác và 12 capsomer ngũ giác (chứa protein chính p72, cùng pB438L và pE120R), màng bao trong (inner envelope dày 70 Å bắt nguồn từ lưới nội chất, chứa protein p54, p17), vỏ lõi (core shell dày 30 nm tạo thành từ sự phân cắt hai tiền chất polyprotein pp220 và pp62 bởi protease pS273R), và thể nhân (nucleoid chứa DNA liên kết với protein pA104R và p10).
• Cơ chế xâm nhiễm và bệnh học: ASFV xâm nhập tế bào ký chủ (chủ yếu là đại thực bào) qua cơ chế nhập bào phụ thuộc thụ thể (nhập bào qua trung gian clathrin - CME và ẩm bào lớn - macropinocytosis). Biểu hiện lâm sàng của bệnh phân chia theo 4 thể: thể quá cấp tính (sốt cao >41°C, chết sau 1–4 ngày), thể cấp tính (sốt 40–42°C, xuất huyết da, tím tái vành tai, lách sưng to xuất huyết, tỷ lệ tử vong gần 100%), thể bán cấp tính (tỷ lệ tử vong 30–70%, biến đổi mạch máu và phù nề nội tạng), và thể mạn tính (hoại tử da, viêm khớp, sút cân, sảy thai).
• Nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR: Phương pháp qPCR sử dụng mẫu dò thủy phân TaqMan (TaqMan probe) mang phân tử phát huỳnh quang (Reporter dye - FAM) ở đầu 5' và phân tử dập tắt huỳnh quang (Quencher dye) ở đầu 3'. Dưới tác động của hoạt tính 5' exonuclease từ enzyme Taq DNA polymerase trong quá trình kéo dài chuỗi, mẫu dò bị phân cắt giải phóng tín hiệu huỳnh quang FAM (bước sóng kích thích 495 nm, bước sóng phát xạ 520 nm), cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm khuếch đại sau mỗi chu kỳ nhiệt.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm trong phòng thí nghiệm phân tử theo các bước chuẩn hóa:

• Nguồn dữ liệu và mẫu vật: Tổng cộng 90 mẫu lâm sàng thực địa được thu thập từ các trang trại lợn tại một số tỉnh thành của Việt Nam, bao gồm 50 mẫu huyết thanh (serum), 20 mẫu mô (tissue) và 20 mẫu phân (stool). Mẫu DNA chuẩn là plasmid mang đoạn gen đích của ASFV ở nồng độ ban đầu $10^6\text{ copies/}\mu\text{L}$. Nguồn mẫu kiểm tra độ đặc hiệu gồm DNA/RNA của 7 chủng vi sinh vật và virus gây bệnh phổ biến trên lợn do Công ty TNHH BIOMIN Việt Nam (Chi nhánh Bình Dương) cung cấp: Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Streptococcus, Porcine Circovirus type 2 (PCV2) và Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV).
• Quy trình xử lý và tách chiết nucleic acid:
  • Mẫu huyết thanh và phân được xử lý sơ bộ (mẫu phân pha huyền phù 10% trong PBS, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút). Tách chiết DNA/RNA tổng số từ mẫu dịch lỏng bằng bộ kit TracePure™ Viral DNA/RNA Extraction Kit qua 7 bước sử dụng hạt silica/cột lọc kết hợp Proteinase K, đệm ly giải và cồn tuyệt đối.
  • Mẫu mô (10–25 mg) được đồng hóa và tách chiết DNA bằng bộ kit TraceBead™ Nucleic Acid Extraction Kit kết hợp Proteinase K, đệm Digestion/Lysis và xử lý loại bỏ RNA bằng RNase A trước khi rửa và ly giải DNA tinh sạch.
• Quy trình Real-time PCR: Phản ứng được thực hiện với tổng thể tích $20,\mu\text{L}$ gồm $10,\mu\text{L}$ Master mix 2X, $3,\mu\text{L}$ hỗn hợp Primer/Probe ASFV, $2,\mu\text{L}$ nước không chứa nuclease (Nuclease-free water) và $5,\mu\text{L}$ DNA khuôn. Chu trình nhiệt trên máy LineGene K Plus (BIOER) được thiết lập: 1 chu kỳ tiền biến tính ở 95°C trong 2 phút; 45 chu kỳ biến tính ở 95°C trong 15 giây và bắt cặp/kéo dài ở 60°C trong 60 giây.
• Xử lý số liệu: Thu nhận giá trị chu kỳ ngưỡng ($C_t$), thiết lập phương trình hồi quy tuyến tính đường chuẩn ($y = ax + b$), xác định hệ số tương quan ($R^2$), độ dốc (Slope), hiệu suất khuếch đại ($E%$). Phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) bằng phần mềm SPSS để đánh giá sự khác biệt giá trị $C_t$ giữa các độ pha loãng. Độ lặp lại và tính ổn định của kit được đánh giá thông qua hệ số biến thiên ($CV%$). Các chỉ số độ nhạy chẩn đoán ($Se$), độ đặc hiệu chẩn đoán ($Sp$), giá trị dự đoán dương ($PPV$) và giá trị dự đoán âm ($NPV$) được tính toán dựa trên bảng đối chiếu 2x2 với bộ kit đối chứng thương mại.

Nội dung chính theo từng chương

Chapter 1. Introduction

Chương này đặt nền móng cho toàn bộ nghiên cứu bằng việc phân tích tính cấp thiết của công tác giám sát, chẩn đoán virus ASFV trong bối cảnh chăn nuôi lợn tại Việt Nam chịu áp lực nặng nề sau các đợt bùng phát dịch từ năm 2019 đến năm 2023. Tác giả chỉ ra rằng phương pháp Real-time PCR là công cụ chẩn đoán có độ tin cậy cao, đồng thời xác lập mục tiêu chính là đánh giá hiệu quả phát hiện của bộ kit thử nghiệm TraceDetect™ qPCR ASFV qua hai nội dung: đánh giá thông số phân tích (LOD, độ đặc hiệu) và thử nghiệm trên mẫu thực địa đa dạng.

Chapter 2. Literature Review

Chương tổng quan tài liệu hệ thống hóa các kiến thức khoa học chuyên sâu gồm 4 phần chính:

• Đặc tính cấu trúc hạt virus: Chi tiết 5 lớp cấu trúc từ màng ngoài, vỏ capsid đối xứng icosahedral tạo bởi protein p72, màng trong xuất phát từ lưới nội chất, vỏ lõi do polyprotein pp220 và pp62 tạo thành, đến thể nhân mang hệ gen sợi đôi 170–194 kbp.
• Cơ chế xâm nhiễm và biểu hiện gen: Phân tích 4 pha xâm nhập (hấp phụ, nội bào hóa qua trung gian clathrin/ẩm bào, cởi vỏ và giải phóng); ba giai đoạn biểu hiện gen theo thời gian: gen sớm (4–6 HPI), gen trung gian (6–8 HPI kích hoạt sao chép bởi DNA polymerase mã hóa từ gen G1211R) và gen muộn (8–16 HPI tổng hợp protein cấu trúc).
• Bệnh học, triệu chứng và dịch tễ: Phân loại 4 thể bệnh lâm sàng (quá cấp tính, cấp tính, bán cấp tính, mạn tính) cùng bệnh tích giải phẫu bệnh (xuất huyết hạch lympho, lách to nhồi huyết, ứ nước màng ngoài tim). Cơ chế truyền lây qua tiếp xúc trực tiếp, ve mềm họ Argasidae (Ornithodoros moubata, O. erraticus) và tính bền vững của virus trong môi trường (tồn tại 18 tháng ở nhiệt độ phòng, 15 tuần trong máu thối rữa, hàng tháng trong thịt đông lạnh).
• Kỹ thuật Real-time PCR và tình hình nghiên cứu: Nguyên lý ghi nhận huỳnh quang TaqMan probe FRET, các pha của đường cong khuếch đại (pha ủ/pha tiềm ẩn, pha lũy thừa, pha bình nguyên), nguyên lý định lượng tuyệt đối qua đường chuẩn. Lược khảo các nghiên cứu trong nước (Lê Thị Hồng Hạnh 2019, Phạm Thị Ngọc Tú 2020, Trần Trọng Vương 2022) và quốc tế (Zhiqiang Wu 2020, Hwang HJ et al. 2022).

Chapter 3. Materials and Method

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ vật liệu, hóa chất, thiết bị và các bước thực hiện thí nghiệm tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen BIO313:

• Thành phần bộ kit TraceDetect™ qPCR ASFV (Master mix 2X, Primer/Probe mix, Nuclease-free water, Positive control).
• Quy trình tách chiết DNA từ 50 mẫu huyết thanh bằng TracePure™ Viral DNA/RNA Extraction Kit và từ 20 mẫu mô bằng TraceBead™ Nucleic Acid Extraction Kit.
• Thiết lập phản ứng qPCR trên máy LineGene K Plus theo thể tích phản ứng $20,\mu\text{L}$, chu trình nhiệt 45 chu kỳ ở kênh đọc tín hiệu FAM.
• Các thí nghiệm đánh giá: Xác định LOD trên dung dịch chuẩn plasmid pha loãng bậc 10 ($10^6$ đến $10^0\text{ copies/}\mu\text{L}$); kiểm tra độ đặc hiệu phân tích trên 7 tác nhân gây bệnh không phải ASFV; xác định LOD trên nền mẫu thực địa (pha loãng mẫu $10^1$ đến $10^4$ lần kết hợp phân tích ANOVA); kiểm tra độ chính xác chẩn đoán trên 50 mẫu huyết thanh; thử nghiệm khả năng phát hiện trên 20 mẫu mô và 20 mẫu phân; kiểm tra độ tin cậy và tính ổn định ($CV%$) qua 3 lần lặp lại trên 29 mẫu dương tính.

Chapter 4. Results and Discussion

Chương này trình bày và thảo luận toàn bộ các phát hiện thực nghiệm thu được:

• Giới hạn phát hiện (LOD) và đường chuẩn: Bộ kit thử nghiệm khuếch đại ổn định qua toàn bộ dải nồng độ từ $10^6$ đến $10^0\text{ copies/}\mu\text{L}$ trên cả 3 lần lặp, xác lập LOD đạt $1\text{ copy/}\mu\text{L}$ (tương đương 5 copies/phản ứng). Đường chuẩn tuyến tính có phương trình $y = -3{,}5854x + 33{,}722$ với hệ số tương quan $R^2 = 0{,}9998$, độ dốc $\text{Slope} = -3{,}5854$ và hiệu suất khuếch đại $E% = 90{,}06%$.

Nồng độ plasmid ($\text{copies/}\mu\text{L}$)	Lượng bản sao/phản ứng ($\text{copies/rxn}$)	$C_t$ lần 1	$C_t$ lần 2	$C_t$ lần 3	$C_t$ trung bình
$10^6$	$5 \times 10^6$	15,56	15,96	15,88	15,80
$10^5$	$5 \times 10^5$	19,66	19,74	19,34	19,58
$10^4$	$5 \times 10^4$	23,02	23,07	22,86	22,98
$10^3$	$5 \times 10^3$	26,72	26,88	25,74	26,45
$10^2$	$5 \times 10^2$	30,35	30,22	29,83	30,13
$10^1$	$5 \times 10^1$	34,61	33,34	33,22	33,72
$10^0$	$5 \times 10^0$	Dương tính	Dương tính	Dương tính	Dương tính

• Độ đặc hiệu phân tích: Tín hiệu huỳnh quang kênh FAM chỉ xuất hiện ở mẫu ASFV và mẫu chứng dương; không có tín hiệu khuếch đại nào ở các mẫu DNA/RNA của E. coli, Salmonella spp., S. aureus, C. perfringens, Streptococcus, PCV2, PRRSV và chứng âm, chứng minh độ đặc hiệu phân tích đạt 100%.
• LOD trên nền mẫu thực địa: Phân tích ANOVA trên 10 mẫu dương tính pha loãng bậc 10 ($10^{-1}$ đến $10^{-4}$) cho thấy giá trị mức ý nghĩa $p < 0{,}05$, chứng minh sự khác biệt $C_t$ giữa các độ pha loãng có ý nghĩa thống kê; giới hạn phát hiện trên nền mẫu thực địa đạt tương đương $1\text{ copy/}\mu\text{L}$.
• Độ chính xác chẩn đoán trên mẫu huyết thanh: Kiểm tra trên 50 mẫu huyết thanh thực địa cho kết quả 21 mẫu dương tính (42%) và 29 mẫu âm tính (58%), trùng khớp hoàn toàn (100%) với bộ kit đối chứng thương mại (Reference kit), không ghi nhận âm tính giả hoặc dương tính giả ($Se = 100%$, $Sp = 100%$, $PPV = 100%$, $NPV = 100%$).
• Khả năng phát hiện trên các loại nền mẫu: Trên 40 mẫu gồm mô và phân, kit phát hiện 8/20 mẫu mô dương tính (40%) và 0/20 mẫu phân dương tính (0%). Tỷ lệ phát hiện đạt tương đồng 100% so với Reference kit trên cả 2 nền mẫu này.

Loại mẫu bệnh phẩm	Tổng số mẫu	Dương tính cả 2 kit (+/+)	Âm tính cả 2 kit (-/-)	Kit thử (+)/Kit chuẩn (-)	Kit thử (-)/Kit chuẩn (+)	Tỷ lệ tương đồng
Huyết thanh (Serum)	50	21	29	0	0	100%
Mô (Tissue)	20	8	12	0	0	100%
Phân (Stool)	20	0	20	0	0	100%
Tổng cộng	90	29 (32,2%)	61 (67,8%)	0 (0%)	0 (0%)	100%

• Độ ổn định và độ tin cậy: Hệ số biến thiên ($CV%$) của giá trị $C_t$ qua 3 lần lặp trên 29 mẫu dương tính dao động từ 0,39% đến dưới 15%, chứng minh kit có độ lặp lại và độ ổn định cao.

Chapter 5. Conclusion and Recommendations

Tác giả đúc kết các kết quả định lượng khẳng định bộ kit thử nghiệm đạt đầy đủ các tiêu chuẩn kỹ thuật về độ nhạy, độ đặc hiệu, LOD và tính ổn định để ứng dụng trong chẩn đoán thực địa. Đồng thời, đề xuất khuyến nghị tiếp tục mở rộng quy mô thử nghiệm trên các nền mẫu khác và số lượng mẫu lớn hơn.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã cung cấp một bộ dữ liệu thực nghiệm toàn diện nhằm chứng minh giá trị ứng dụng của bộ kit TraceDetect™ qPCR ASFV với các kết quả cụ thể:

• Giới hạn phát hiện (LOD) của bộ kit trên plasmid chuẩn đạt $1\text{ copy/}\mu\text{L}$ (5 copies/phản ứng), và duy trì được độ nhạy tương đương $1\text{ copy/}\mu\text{L}$ khi thử nghiệm trên nền mẫu thực địa pha loãng.
• Đường chuẩn định lượng thiết lập trên dải nồng độ rộng ($10^6$ đến $10^0\text{ copies/}\mu\text{L}$) có độ tuyến tính cao với phương trình hồi quy $y = -3{,}5854x + 33{,}722$, hệ số xác định $R^2 = 0{,}9998$, hệ số góc $\text{Slope} = -3{,}5854$ và hiệu suất khuếch đại đạt $90{,}06%$, nằm trong khoảng tiêu chuẩn chấp nhận của phản ứng Real-time PCR ($90% - 105%$).
• Độ đặc hiệu phân tích đạt 100%, không xảy ra hiện tượng phản ứng chéo hay khuếch đại không đặc hiệu đối với 7 tác nhân gây bệnh đường ruột, hô hấp và toàn thân thường gặp ở lợn (E. coli, Salmonella spp., S. aureus, C. perfringens, Streptococcus, PCV2, PRRSV).
• Thử nghiệm trên 90 mẫu lâm sàng thực địa thuộc 3 nền mẫu khác nhau (huyết thanh, mô, phân) cho kết quả tương đồng 100% so với kit thương mại đối chứng. Các chỉ số dịch tễ học phân tích đạt mức tối đa: Độ nhạy chẩn đoán ($Se$) = 100%, Độ đặc hiệu chẩn đoán ($Sp$) = 100%, Giá trị dự đoán dương ($PPV$) = 100%, Giá trị dự đoán âm ($NPV$) = 100%.
• Độ lặp lại và tính ổn định cao với hệ số biến thiên $CV%$ qua các lần lặp lại dao động từ 0,39% và luôn duy trì ở mức dưới 15%.

Về mặt đóng góp khoa học và thực tiễn, nghiên cứu đóng góp một quy trình kiểm tra, thẩm định độc lập và bài bản cho một sản phẩm kit chẩn đoán phân tử trong nước. Kết quả thực nghiệm khẳng định bộ kit TraceDetect™ qPCR ASFV đủ năng lực kỹ thuật và độ tin cậy để đưa vào ứng dụng thực tế phục vụ công tác xét nghiệm, phát hiện sớm và giám sát dịch bệnh ASFV tại các cơ sở chăn nuôi và phòng thí nghiệm thú y.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung được trình bày trong khóa luận, nghiên cứu còn một số hạn chế:

• Cỡ mẫu thực địa mới dừng lại ở 90 mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thập tại một số tỉnh thành nhất định.
• Nền mẫu thử nghiệm tập trung chủ yếu vào 3 loại (huyết thanh, mô, phân); các loại mẫu dịch tiết khác như nước bọt, dịch ngoáy mũi hay mẫu môi trường chuồng trại chưa được khảo sát chuyên sâu trong đợt thử nghiệm này.

Từ những hạn chế trên, hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả kiến nghị là tiếp tục triển khai đánh giá bộ kit TraceDetect™ qPCR ASFV trên số lượng mẫu thực địa lớn hơn, đồng thời mở rộng thử nghiệm trên nhiều loại nền mẫu sinh học và dịch tễ khác nhau để hoàn thiện tối đa tính ứng dụng của sản phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp này mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho các đối tượng:

• Sinh viên, học viên ngành Công nghệ Sinh học, Bác sĩ Thú y, Chăn nuôi - Thú y: Là tài liệu tham khảo cụ thể về phương pháp luận và kỹ thuật thực nghiệm chẩn đoán phân tử (Real-time PCR sử dụng TaqMan probe, nguyên lý FRET, quy trình tách chiết cột silica cho từng loại mô/dịch).
• Cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên phòng xét nghiệm thú y: Cung cấp quy trình chuẩn để thẩm định (validation) một bộ kit chẩn đoán sinh học phân tử theo các tiêu chí: xác định LOD, dựng đường chuẩn định lượng, kiểm tra phản ứng chéo, tính toán độ nhạy/độ đặc hiệu chẩn đoán và phân tích thống kê phương sai (ANOVA), hệ số biến thiên ($CV%$).
• Các đơn vị phát triển kit xét nghiệm thương mại: Cung cấp dữ liệu đối chiếu độc lập giữa sản phẩm thử nghiệm và kit đối chứng thương mại trên các nền mẫu thực địa phức tạp.

Câu hỏi thường gặp

1. Giới hạn phát hiện (LOD) của bộ kit TraceDetect™ qPCR ASFV được xác định là bao nhiêu? Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện của bộ kit thử nghiệm đạt $1\text{ copy/}\mu\text{L}$ (tương đương 5 copies/phản ứng khi sử dụng $5,\mu\text{L}$ mẫu DNA khuôn) trên cả dung dịch chuẩn plasmid DNA và trên nền mẫu thực địa pha loãng.

2. Các thông số kỹ thuật của đường chuẩn định lượng trong nghiên cứu gồm những gì? Đường chuẩn của bộ kit được xây dựng từ dải nồng độ pha loãng bậc 10 ($10^6$ đến $10^0\text{ copies/}\mu\text{L}$) với phương trình hồi quy tuyến tính $y = -3{,}5854x + 33{,}722$, hệ số tương quan $R^2 = 0{,}9998$, độ dốc $\text{Slope} = -3{,}5854$ và hiệu quả khuếch đại phản ứng ($E%$) đạt $90{,}06%$.

3. Bộ kit thử nghiệm có xảy ra phản ứng chéo với các tác nhân gây bệnh nào khác trên lợn không? Bộ kit không xảy ra phản ứng chéo. Khi thử nghiệm độ đặc hiệu phân tích trên 7 tác nhân vi khuẩn và virus gây bệnh phổ biến trên lợn (E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Streptococcus, PCV2, PRRSV), không có bất kỳ mẫu nào ghi nhận tín hiệu khuếch đại trên kênh huỳnh quang FAM.

4. Kết quả kiểm tra độ chính xác của kit trên các mẫu thực địa ra sao khi so sánh với kit đối chứng? Trên 50 mẫu huyết thanh và 40 mẫu mô/phân (tổng cộng 90 mẫu thực địa), bộ kit thử nghiệm cho kết quả trùng khớp 100% với bộ kit thương mại đối chứng (Reference kit). Các giá trị độ nhạy chẩn đoán ($Se$), độ đặc hiệu chẩn đoán ($Sp$), giá trị dự đoán dương ($PPV$) và giá trị dự đoán âm ($NPV$) đều đạt 100%.

5. Hệ số biến thiên ($CV%$) của bộ kit đạt giá trị bao nhiêu và mang ý nghĩa gì? Hệ số biến thiên ($CV%$) của giá trị $C_t$ qua 3 lần lặp lại trên 29 mẫu thực địa dương tính dao động từ 0,39% và luôn duy trì ở mức dưới 15%. Điều này chứng minh bộ kit thử nghiệm có độ lặp lại cao và hoạt động ổn định trong việc phát hiện virus ASFV.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Ngô Thị Cẩm Phìn đã thực hiện thành công việc đánh giá toàn diện các thông số kỹ thuật và hiệu quả thực địa của bộ kit thử nghiệm TraceDetect™ qPCR ASFV. Kết quả nghiên cứu xác nhận bộ kit đạt độ đặc hiệu tuyệt đối (100%), giới hạn phát hiện đạt $1\text{ copy/}\mu\text{L}$, hiệu suất khuếch đại $90{,}06%$, độ ổn định cao ($CV% < 15%$) và có độ tương đồng hoàn toàn (100%) so với kit đối chứng thương mại trên 90 mẫu bệnh phẩm huyết thanh, mô và phân. Công trình khẳng định tính khả thi và độ tin cậy của bộ kit thử nghiệm trong việc ứng dụng vào chẩn đoán thường quy, phục vụ hiệu quả cho công tác giám sát và kiểm soát dịch tả lợn châu Phi tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATING ABILITY OF DETECTION OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS (ASFV) IN SWINE OF THE TRIAL KIT TraceDetectTM qPCR ASFV Major : BIOTECHNOLOGY Student implementation: : NGO THI CAM PHIN Student code: : 19126132 Academic year: : 2019-2023 Thu Duc City, 8/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS EVALUATING ABILITY OF DETECTION OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS (ASFV) IN SWINE OF THE TRIAL KIT TraceDetectTM qPCR ASFV Advisor Student Dr. DINH XUAN PHAT NGO THI CAM PHIN Thu Duc City, 8/2023 ACKNOWLEDGMENTS I would like to express my sincere gratitude towards the Board of Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Board of Faculty of Biological Sciences for creating the most favorable conditions for me to finish this study. I would also like to thank all the teachers of the Faculty of Biological Sciences who have transferred valuable knowledge during my years. And especially, I would like to express my deep gratitude to Dinh Xuan Phat Ph.

for wholeheartedly teaching, guiding and supporting me during the thesis process. Many thanks to Ms. Nguyen Thi Mi Mi, Mr. Le Thanh Binh, Mr.

Nguyen Thanh Canh, Ms. Tran Nguyen Minh Thanh, Ms. Chau Ngoc Huynh Nhu and other members of Gene Technology Laboratory BIO313 for always helping, sharing, and supporting me to reach my goals. Finally, I would like to thank my family for always loving and trusting me.

And my friends have accompanied me on this journey. CONEIRMATION COMMITMENT My name is Ngo Thi Cam Phin, Student ID: 19126132, Class: DH19SHD, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University Ho Chi Minh City. I guarantee that: This research was conducted by myself, the data and information in the research are completely honest and objective. I take full responsibility before the Council for these commitments.

Thu Due City, September 2023 Student’s signature il ABSTRACT The topic research “Evaluating ability of detection of African Swine Fever Virus (ASFV) in swine of the trial kit TraceDetectTM qPCR ASFV” was performed to Virus (ASFV) in swine of the TraceDetectTM qPCR ASFV kit” was performed to check effectiveness of trial kit through evaluating specificity and limit of detection in field samples. In this study, limit of detection of trial kit was 1 copy/uL and the trial kit only amplified and specific for ASFV and not amplified for unrelated DNA/RNA. Standard curve of trial kit was y = -3.722 with parameters of Slope = -3. The diagnostic sensitivity and specificity values of the trial kit were determined to be 100%; besides, the predicted positive value and the predicted negative value were 100%.

The coefficient of variation between replications on the test kit ranged from 0. In summary, the study showed that the trial kit was competent to be used in diagnosis of ASFV in field samples. Keywords: African Swine Fever Virus, ASFV, trial kit, real-time PCR. ill TÓM TẮT Đề tài “Đánh giá khả năng phát hiện African Swine Fever Virus (ASFV) trên lợn của bộ kit thử nghiệm TraceDetectTM qPCR ASFV” được thực hiện dé kiểm tra hiệu quả của bộ kit thử nghiệm thông qua việc đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện trên mẫu thực địa.

Trong nghiêm cứu này, giới hạn phát hiện của bộ kit thử nghiệm là 1 copy/uL và bộ kit thử nghiệm chỉ khuếch đại và đặc hiệu với ASFV và không khuếch đại với DNA/RNA không liên quan. Đường chuẩn của bộ kit thử nghiệm là y = -3.722 với các thông số Độ dốc = -3.5854; và Hiệu quả khuếch đại (E%) = 90. Các giá trị độ nhạy chuẩn đoán và độ đặc hiệu chan đoán của bộ thử nghiệm được xác định là 100%; bên cạnh đó, giá trị dự đoán dương và giá trị dự đoán âm là 100%. Hệ số biến thiên giữa các lần lặp lại trên bộ thử nghiệm dao động từ 0.

Tóm lại, nghiên cứu cho thấy rằng bộ thử nghiệm có thé được sử dụng dé chân đoán ASFV trên các mẫu thực địa. Từ khóa: African Swine Fever Virus, ASFV, kit thử nghiệm, realtime PCR. IV TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGMENTS cece cuercommnernsewscnuemene gerne ee ear i 0 0))3316//. 1 IBS TRACT guosgstointtSioiitGAHGBGE-GEHGGS.,Ô iv TABLE OF CONTENTS 32.2253 ee See Or oe oe oe ca.

V LIST OF ABBREVIATIONS nseiniieeuiioeoodsnodisdoooostvetasslkigSgsglbsBSsssiSsS0008003081490380 Vil LSE OR ABLES cussissemisenccasamescsmeres cesarean tear dean ean REG eS vill LIST OF BIGUIRES escevescsmmesssommmavmnsercee wesecemarswmeiunsatewe ur masmunenraacuanes swe ceesauecummcstic 1X CHAPTER 1.oocececeeceeceecceseeeceeceeseeeceeseeeeeeaeceneeaeeeseeeeeneeeeeeseeaes 1 Ì;1;_THEOCGOÏI! eesergeeene sneer eee en Se eee ESS 1 [ESO lo) (Sch i ee ee 1 1B. ARES CATCH) COMLEI ES bssssoesisteoseoEttenlztitsiseiodbdstioszs2S80SeisBa0Mđ8nđtdg,x8gstbidbebtokielotlgsegzitgazsindasssisinsrdi 2 CHAPTER 2. Introduction of African Swine Fever virus (ASTFV).-- 2c 2 S2ccc+ssceeecseecexeee2 2 Ale StCUCHital Pr0 PCY ncqeeensescemese eee sua 2. Invasion mechanism, replication, and gene expression 1n host cells of ASFV.

Diseases and associated syndromes .-- ---- 5 2+ + +2 +21 *2E 221 2121 1E se rrke 5 PP 00 520000000. Real-time PCR 0:-90. 10 2nlơ PYIMCIPIES secrcsscour comnts ere cucemnnwunuer cen aanmeuueamaren enum eae eee UEEE 10 22:2.cccccseswonssncsweusvscuvestecnusstia LH Ha ngà i0 g4440144144210040000188 4422006 10 2. Real amplification chart - PCR heart.

Quantification in Real-time PCR. Situation of ASFV diagnostic researcHh.- --- -- 5c S+ + + *+ + srrrerrrrrxee 14 223: NatiOfial Studies sang e6 51654013 61445 0485B0544E95BSSHSSESESDSISLASH4Q3S14251EVLREESESSRSSHIELEEEHSE-SER48SĐ8 14 Phu su 0008. MATERIALS AND METHOD s.sccccce nen n2 101101 12 G2 long nee 16 3. Location and duration na ố .2, Objectiand materialS sang gu 060116605 50015800115G399G100GGN5E0IS88650NSNGbyGUAIBSBN RARE ERS EEE 16 9:5: 1L» CD |EGLTGSGAIGN seessoissssorohttoiesietxot9GI2I130/9083EE0SĐ081612303ES0NGTGRSBHGSOSEUNABHSHSEHI.

17 3 dele, Tredtiient Of Sati ples cnsssesrnmeercon meee nena nnpr mma EEE 17 DeBDin Bextra CLOT) NA eo csccctincnaewtt ramet etnias ttn eet ef see 1 3. Realtime PCR feRAGHDÍlicsssessaendidisdieBS20143830095504. Determination of detection ÏITIL.-- --- 5-2222 * 22+ 3z £+2EE+zE+zEseeezkeereerrrrseese 19 33. 4 estInơ:arialyfl@đ] speciietty xs.

ccc tise n 06x G0 b2 1b sec C06 ko E022 022 x<e 19 3. Determination of detection limits on field sampÌes. Check accuracy 1n ASFV def€CtIOH. Evaluation of the stability of the trial kit for the detection of ASFV.

Data processing na. RESULTS AND DISCUSSION. 22 VÌ; RESU TS sceeorermrenss semen ery s taunt ereernecivemneainnyssboer ee oerrmmerrererneemeeem eereeets 22 4. Determination of detection limit.

Testing analytical SD€CIÍÍC1EY. Determination of detection limits on field sampÏes. Comparative values between the trial kit and Reference KIf.ISGUISSTGTiSsxxssessbsisooEibsuesadlbssaiageduoisiergDadtsEisgriiigsglsseEngusoulizcuossdkicezosuEsbiessilSđoassiSfrbsrzodishrsnzed 28 Chapter 5. CONCLUSION AND RECOMMENDA TIONS.Ó REFERENCE ngán giáo in cece yr caterer tase a tte ce 31 BBE NOS cesses ee ni a rete Bw es ee eae 0 vi LIST OF ABBREVIATIONS ASF : African Swine Fever ASFV : African Swine Fever Virus CV : Coefficient of Variation DNA : Deoxyribonucleic Acid GDP : Gross Domestic Product LOD : Limited of Detection MGB : Minor Groove Binder NPV : Negative Predictive Value OTE : Office International des Epizooties PCR : Polymerase Chain Reaction PPV : Positive Predictive Value Se : Sensivity : Specificity Vii LIST OF TABLES Page Table 2.

Main lesions observed in the different forms of ASE. Evaluate the negative and positive results of the trial KIt. Results of three replicates for serial 10-fold dilutions of ASFV DNA. ASFV detection results on field samples of 2 Real-time PCR kIfs.

The trial kit's ability to detect ASFV in 2 samples platforms. 26 vill LIST OF FIGURES Page Figure 2. Structure and protein composition of ASEFV. Acute ASF post-mortem exam1naf1OI.

Schematic of TaqMan (5’ nuclease) aSSay.-- ---- 5c + ss+cee+ereexee 12 Figure 2. The graph shows the stages and parameters of Real-time PCR. Determine LOD of the ASFV TracdetectTM qPCR ASFV Kt. The standard curve of ASFV plasmid DNA.

Result Real-time PCR to testing analytIcalL. The results of real-time PCR of 10 samples after 4 times 10-fold. The result of detection ASFV of both kits in 2 field samples. The stability of the trial kit of 29 positives with ASFV samples.

Introduction African Swine Fever (ASF) 1s one of the perilous diseases caused by African Swine Fever virus in pigs. The ASF had high infectivity and mortality (up to 100%) (Galindo et al., 2017; Li et al. ASF first appeared in Kenya in the 1920s, Europe in 1957, the Caucasus region, and southern Russia in 2007 (Cwynar ef al., 2019; Sanchez ef al. According to the OIE, China was the first country that reported an outbreak of ASF in East Asia in August 2018 (Mighell and Ward, 2021).

It rapidly spread to most provinces in China within a short period of time and adversely affected the swine industry (Tao ef a/. Furthermore, ASF had been reported in other Asian countries since the end of 2018 (Mighell and Ward, 2021). According to a Department of Animal Health report, African Swine Fever Virus was first detected in Vietnam in February 2019. After that, the disease spread on a large scale within 5 months, causing heavy damage to pig production in our country.

In April 2020, the ASF epidemic in Vietnam appeared and continued to spread in 2021 and 2022 (Thinh Nguyen-Thi ef a/. Pig production occupied 60% of the total livestock output in Vietnam. The ASF outbreak and presence in the long term caused severe economic losses among farmers and posed adverse impacts on the pig industry in our country, leading to a decrease in the gross domestic product (GDP). Because of the seriousness of this virus, early detection of the virus in the sample is essential.

To meet this market demand, real-time PCR reaction kits were created and TraceDetectTM qPCR ASFV Kit is one of them. Currently, to simplify the process, many products on the market have a collection of key components for real-time PCR reactions, called real-time PCR kits. To establish a sensitive, specific assay for the detection and quantitation of ASFV, testing and evaluating the kit at the research stage is important. Therefore, "Evaluating ability of detection of African Swine Fever Virus (ASFV) on the trial kit TraceDetectTM qPCR ASFV" was performed.

Objective Evaluating ability of detection of African Swine Fever virus (ASFV) on the trial kit TraceDetectTM qPCR ASFV. Research contents Content 1: Evaluate the parameters (specificity and limit of detection) of TraceDetectTM qPCR ASFV kit. Content 2: Successfully comparison and evaluation the ability to detect ASFV on different field samples with a trial kit. Introduction of African Swine Fever virus (ASFV) 2.

Structural property ASFV is a large, icosahedral, linear double-stranded DNA virus and the only virus classified under the Asfarviridae family and Asfivirus genus (Dixon ef a/. The virion has a multiple-layer structure, including the envelope, capsid, inner envelope, core shell and nucleoid from outside to inside (Heath et a/., 2001; Xian and Xiao, 2020) as shown in Figure 2. Outer envelope The outer envelope is the outermost layer of ASFV virion which was acquired from the host cellular membrane during budding. The outer envelope is the outermost layer of ASFV which was acquired from the host cellular membrane during budding.

The morphology of the external envelope is by the budding process for virus exit from the cell (Breese and DeBoer, 1966). p12 was seen as a protein that promotes the adsorption of virus particles on host cells as an outer envelope protein by binding to specific receptors on the host cell membrane to mediate ASFV entry (Alejo ef a/. Capsid The capsid is composed of about 2,760 pseudo-hexameric capsomers and 12 pentameric capsomers. Protein p72 was seen as with the major capsid protein of iridoviruses, phycodnaviruses and mimiviruses, which also had icosahedral capsids surrounding an inner envelope (Iyer ef a/.

Three p72 protein molecules adopting a double jelly-roll structure form one pseudo-hexameric capsomer, and another five penton proteins could construct a pentameric capsomer (Wang ef a/. In addition to p72, protems such as pB438L and pE120R were constitutive proteins of the viral capsid. The protein pB438L is needed for the capsid to form its peaks. (Alejo ef al.