Ứng dụng Multiplex PCR phát hiện Salmonella spp. ở nhà yến

Khóa luận: Ứng dụng Multiplex PCR phát hiện Salmonella spp. và S. Typhimurium trong nhà yến. Nghiên cứu độc lực Salmonella qua gen stn, fimA.

• Tác giả: Hoang Gia Lam
• Người hướng dẫn: Dr. Dinh Xuan Phat
• Trường học: Nong Lam University-Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Application of Multiplex PCR Technique for Detection of Salmonella Spp. Typhimurium in Swiftlet Houses and Investigation of the Virulence of Salmonella via Stn and Fima Genes
• Loại tài liệu: Graduation Thesis
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENTS
• CONFIRMATION COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. Introduction
• 1.1. Objectives
• 2. Introduction to Salmonella and Salmonella Typhimurium
• 2.1. Taxonomy of Salmonella Typhimurium
• 2.2. Morphological and cultural characteristics
• 2.2.1. Morphology
• 2.2.2. Culture characteristics
• 2.3. Virulence factors
• 2.4. Diagnosis, prevention, and treatment the disease
• 2.5. Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR)
• 2.5.1. Stages OF mPCR
• 2.5.2. Application of multiplex PCR
• 3. METHODS AND MATERIALS
• 3.1. Time and place of study
• 3.2. Materials and methods
• 3.2.1. Positive controls, negative controls, and field samples
• 3.2.2. DNA extraction
• 3.2.3. Multiplex PCR Assay
• 3.2.4. Experimental design
• 3.2.4.1. Isolation of Salmonella from field samples
• 3.2.4.2. Optimization of the annealing temperature for mPCR
• 3.2.4.3. Optimization of the primer concentration
• 3.2.4.4. Examination of primer specificity
• 3.2.4.5. Determination of the limit of detection
• 3.2.4.6. Application of the optimal mPCR procedure for the field samples
• 3.2.4.7. Investigation of the virulence of Salmonella
• 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Isolation of Salmonella spp. from field samples
• 4.2. Optimization of the annealing temperature for mPCR
• 4.3. Optimization of the primer concentration
• 4.4. Examination of primer specificity
• 4.5. Determination of the limit detection
• 4.6. Application of the optimal mPCR procedure for the field samples
• 4.7. Investigation of the virulence of Salmonell
• 4.8. Application of the optimal mPCR procedure for the field samples
• 4.9. Investigation of the virulence of Salmonell
• 5. CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS
• 5.1. RECOMMENDATIONS
• APPENDIX

Tóm tắt

I. Vì sao phát hiện Salmonella ở nhà yến là cực kỳ cấp thiết

Ngành công nghiệp nuôi yến lấy tổ tại Việt Nam đã phát triển mạnh mẽ từ năm 2004, đóng góp giá trị kinh tế đáng kể với sản lượng hàng năm ước tính khoảng 120 tấn, tương đương 450 triệu USD (Tổng cục Thống kê, 2021). Tổ yến, hay còn gọi là yến sào, được biết đến với giá trị dinh dưỡng cao, chứa 62-63% protein và các thành phần quý giá như glycoprotein, axit amin, canxi (Marcone, 2005). Tuy nhiên, chim yến là loài hoang dã, sống thành đàn lớn và khó kiểm soát dịch bệnh hơn gia cầm. Điều này làm dấy lên mối lo ngại nghiêm trọng về an toàn vệ sinh thực phẩm nhà yến. Một trong những mối đe dọa lớn nhất chính là sự tồn tại của vi khuẩn Salmonella, tác nhân gây ngộ độc thực phẩm hàng đầu ở người và các bệnh đường tiêu hóa ở động vật. Sự hiện diện của mầm bệnh trên chim yến không chỉ làm giảm chất lượng yến sào mà còn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm chéo sang người tiêu dùng, gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng và uy tín của ngành yến Việt Nam. Do đó, việc áp dụng một phương pháp phát hiện vi sinh vật nhanh chóng, chính xác để tầm soát và kiểm soát an toàn sinh học là yêu cầu bắt buộc và cấp thiết.

1.1. Tổng quan về Salmonella và nguồn lây nhiễm Salmonella

Salmonella là một chi vi khuẩn Gram âm, hình que, thuộc họ Enterobacteriaceae. Chúng là tác nhân chính gây ra bệnh Salmonellosis, một bệnh nhiễm trùng đường ruột phổ biến. Nghiên cứu chỉ ra rằng Salmonella enterica, đặc biệt là serovar S. Typhimurium, thường được phát hiện trong đường ruột của các loài chim hoang dã (Hamer et al., 2012). Nguồn lây nhiễm Salmonella trong nhà yến rất đa dạng, có thể đến từ phân chim (guano), ô nhiễm chéo trong nhà yến từ các loài gặm nhấm, côn trùng, hoặc từ nguồn nước và không khí bị ô nhiễm. Theo Razak (2016), Salmonella đã được phát hiện trong phân chim yến, làm tăng nguy cơ lây truyền bệnh sang động vật và con người. Việc định danh vi khuẩn Salmonella một cách chính xác là bước đầu tiên để hiểu rõ mức độ nguy hiểm và xây dựng biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tác động của mầm bệnh đến sức khỏe chim yến và con người

Đối với chim yến, nhiễm Salmonella có thể gây ra các triệu chứng như thở khó, run rẩy, tiêu chảy, suy nhược và tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt ở chim non. Các tổn thương nội tạng như viêm ruột hoại tử, xuất huyết gan, viêm màng ngoài tim thường được quan sát thấy (Gast and Porter Jr, 2020). Đối với con người, việc tiêu thụ sản phẩm yến sào nhiễm Salmonella có thể gây ra ngộ độc thực phẩm với các triệu chứng như sốt, đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa, và trong trường hợp nghiêm trọng có thể dẫn đến nhiễm trùng huyết. Do đó, việc xây dựng và tuân thủ tiêu chuẩn vi sinh cho tổ yến là vô cùng quan trọng để bảo vệ người tiêu dùng và đảm bảo sự phát triển bền vững của ngành. Việc xử lý môi trường nhà yến để loại bỏ mầm bệnh là một phần không thể thiếu trong quy trình sản xuất an toàn.

II. Hạn chế của phương pháp nuôi cấy khi xét nghiệm tổ yến

Phương pháp chẩn đoán truyền thống để xét nghiệm Salmonella tổ yến chủ yếu dựa vào kỹ thuật nuôi cấy vi sinh. Mặc dù được xem là tiêu chuẩn vàng vì có thể phân lập được vi khuẩn sống, phương pháp này tồn tại nhiều nhược điểm đáng kể, đặc biệt khi áp dụng trong một ngành công nghiệp đòi hỏi tốc độ và độ chính xác cao như ngành yến. Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn phức tạp: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập trên đĩa thạch và xác nhận bằng các thử nghiệm sinh hóa. Toàn bộ quy trình kiểm nghiệm vi sinh này có thể mất từ 48 đến 96 giờ, thậm chí lâu hơn. Sự chậm trễ này gây khó khăn cho các nhà sản xuất trong việc ra quyết định xử lý lô hàng một cách kịp thời, tiềm ẩn nguy cơ đưa sản phẩm không an toàn ra thị trường. Hơn nữa, độ nhạy của phương pháp nuôi cấy có thể bị ảnh hưởng bởi nồng độ vi khuẩn thấp trong mẫu hoặc sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác. Đây là những thách thức lớn đòi hỏi một giải pháp công nghệ hiện đại hơn.

2.1. So sánh PCR và phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống

Để thấy rõ sự khác biệt, việc so sánh PCR và phương pháp nuôi cấy là cần thiết. Phương pháp nuôi cấy đòi hỏi vi khuẩn phải còn sống và có khả năng phát triển trên môi trường dinh dưỡng, quy trình kéo dài nhiều ngày. Ngược lại, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công nghệ sinh học phân tử phát hiện vật liệu di truyền (DNA) của vi khuẩn, không phụ thuộc vào trạng thái sống của chúng. PCR cho kết quả chỉ trong vài giờ, có độ nhạy và độ đặc hiệu cực cao, có thể phát hiện lượng DNA rất nhỏ. Mặc dù chi phí đầu tư ban đầu cho thiết bị PCR cao hơn, nhưng hiệu quả về thời gian và độ tin cậy mà nó mang lại vượt trội hoàn toàn so với phương pháp cũ, đặc biệt là kỹ thuật Multiplex PCR có thể phát hiện nhiều mục tiêu cùng lúc.

2.2. Vấn đề về thời gian và độ chính xác trong kiểm nghiệm

Thời gian là yếu tố cốt lõi trong ngành thực phẩm. Việc chờ đợi 4-5 ngày để có kết quả kiểm nghiệm Salmonella là không khả thi. Hơn nữa, độ chính xác của phương pháp nuôi cấy có thể bị ảnh hưởng bởi kinh nghiệm của kỹ thuật viên và chất lượng của môi trường nuôi cấy. Các chủng Salmonella không điển hình có thể không phát triển hoặc biểu hiện khác biệt trên môi trường chọn lọc, dẫn đến kết quả âm tính giả. Trong khi đó, kỹ thuật Multiplex PCR dựa trên việc khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu như gen invA Salmonella, một gen bảo tồn cao, đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin cậy hơn nhiều. Nghiên cứu của Oliveira et al. (2002) cũng chỉ ra rằng các phương pháp dựa trên PCR nhạy, dễ thực hiện và nhanh hơn so với phương pháp vi sinh truyền thống.

III. Multiplex PCR Giải pháp phát hiện Salmonella ưu việt nhất

Multiplex PCR (mPCR) là một biến thể tiên tiến của kỹ thuật PCR truyền thống, cho phép khuếch đại đồng thời nhiều đoạn DNA mục tiêu khác nhau trong cùng một phản ứng. Thay vì chỉ sử dụng một cặp mồi để phát hiện một tác nhân, kỹ thuật Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho các gen khác nhau. Trong bối cảnh phát hiện Salmonella bằng Multiplex PCR ở nhà yến, kỹ thuật này cho phép xác định sự hiện diện của chi Salmonella (thông qua gen invA) và đồng thời phân biệt serovar nguy hiểm như S. Typhimurium (thông qua gen fliC) chỉ trong một lần chạy máy. Điều này không chỉ tiết kiệm thời gian, hóa chất mà còn cung cấp một bức tranh toàn diện hơn về tình trạng nhiễm khuẩn. Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, mPCR đã trở thành công cụ chẩn đoán mạnh mẽ, giúp ngành yến sào chủ động trong việc kiểm soát an toàn sinh học và nâng cao giá trị sản phẩm.

3.1. Nguyên lý cốt lõi của kỹ thuật Multiplex PCR ứng dụng

Nguyên lý của Multiplex PCR tương tự PCR thông thường, bao gồm ba bước lặp lại trong một chu trình nhiệt: biến tính (tách đôi sợi DNA ở ~95°C), bắt cặp (các mồi đặc hiệu gắn vào DNA mục tiêu ở 50-65°C), và kéo dài (enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi DNA mới ở ~72°C). Điểm khác biệt mấu chốt là sự có mặt của nhiều cặp mồi trong cùng một ống phản ứng. Việc thiết kế mồi là cực kỳ quan trọng, đòi hỏi các cặp mồi phải có nhiệt độ nóng chảy (Tm) tương đồng và không được bắt cặp chéo với nhau để tránh tạo ra sản phẩm không mong muốn. Trong nghiên cứu của Hoàng Gia Lâm (2023), hai cặp mồi cho gen invA và fliC đã được tối ưu hóa để hoạt động hiệu quả trong cùng một điều kiện phản ứng, tạo ra các sản phẩm có kích thước khác nhau (605 bp và 432 bp) để dễ dàng phân biệt trên gel điện di.

3.2. Ưu điểm vượt trội trong công nghệ sinh học phân tử

So với các phương pháp khác, Multiplex PCR mang lại nhiều lợi thế: (1) Hiệu quả cao: Phát hiện nhiều mầm bệnh cùng lúc, tiết kiệm chi phí và thời gian. (2) Nhanh chóng: Cho kết quả trong vòng vài giờ thay vì nhiều ngày. (3) Độ nhạy và độ đặc hiệu cao: Có thể phát hiện lượng DNA rất nhỏ, giới hạn phát hiện trong nghiên cứu tham khảo là 10⁻⁷ ng/µl. (4) Cung cấp nhiều thông tin: Không chỉ xác nhận có Salmonella hay không, mà còn có thể định danh đến cấp serovar. (5) Yêu cầu lượng mẫu ít: Chỉ cần một lượng nhỏ DNA ban đầu. Những ưu điểm này làm cho kỹ thuật Multiplex PCR trở thành lựa chọn lý tưởng cho việc giám sát và chẩn đoán thường quy trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là với sản phẩm giá trị cao như yến sào.

IV. Hướng dẫn quy trình Multiplex PCR phát hiện Salmonella

Để thực hiện thành công việc phát hiện Salmonella bằng Multiplex PCR ở nhà yến, cần tuân thủ một quy trình nghiêm ngặt từ khâu lấy mẫu đến phân tích kết quả. Quy trình này đã được xây dựng và tối ưu hóa trong nghiên cứu của Hoàng Gia Lâm (2023) tại trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, đảm bảo độ chính xác và tin cậy. Về cơ bản, quy trình gồm ba giai đoạn chính: (1) Chuẩn bị mẫu và tách chiết DNA, (2) Thực hiện phản ứng mPCR đã được tối ưu hóa, và (3) Phân tích sản phẩm bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose. Mỗi bước đều có vai trò quyết định đến kết quả cuối cùng. Việc sử dụng các bộ kit real-time PCR Salmonella thương mại hoặc các quy trình đã được chuẩn hóa giúp đồng bộ hóa và nâng cao hiệu quả của quy trình kiểm nghiệm vi sinh. Dưới đây là các bước chi tiết dựa trên nghiên cứu đã được thực hiện.

4.1. Bước 1 Thu thập mẫu và tiền tăng sinh vi khuẩn

Mẫu được thu thập từ các nhà yến bao gồm mẫu phân và mẫu phết bề mặt tổ. Các mẫu này được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Trước khi phân tích, mẫu được ổn định trong môi trường Buffered Peptone Water (BPW) theo tỷ lệ 1/9 và ủ trong 3-4 giờ. Sau đó, một lượng nhỏ dịch cấy được chuyển sang môi trường tăng sinh chọn lọc như Rappaport-Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (RVS) để ức chế sự phát triển của vi khuẩn khác và tạo điều kiện cho Salmonella phát triển. Quá trình này giúp tăng số lượng vi khuẩn mục tiêu, đảm bảo đủ lượng DNA cho các bước tiếp theo.

4.2. Bước 2 Tách chiết DNA vi khuẩn và tối ưu hóa phản ứng

Quá trình tách chiết DNA vi khuẩn là bước nền tảng, quyết định độ chính xác của toàn bộ quy trình. Nghiên cứu của Hoàng Gia Lâm (2023) đã áp dụng phương pháp sốc nhiệt và sử dụng bộ kit thương mại (WizPrepTM Viral DNA/RNA Mini Kit) để thu được DNA tinh sạch. Sau khi có DNA, việc tối ưu hóa phản ứng Multiplex PCR là tối quan trọng. Nhiệt độ ủ (annealing temperature) là yếu tố đầu tiên được khảo sát. Kết quả cho thấy nhiệt độ 56°C là tối ưu nhất, cho vạch sản phẩm PCR rõ nét và đặc hiệu đối với cả gen invA Salmonella (605 bp) và gen fliC của S. Typhimurium (432 bp). Tiếp theo, nồng độ mồi cũng được điều chỉnh, với tỷ lệ tối ưu được xác định là 1:1 (nồng độ cuối 0.2 µM). Việc tối ưu hóa này đảm bảo phương pháp phát hiện vi sinh vật đạt độ nhạy và đặc hiệu cao nhất.

4.3. Bước 3 Phân tích mồi PCR và đọc kết quả điện di

Sau khi phản ứng PCR hoàn tất, sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%. Gel được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang (ví dụ: Midori Green) để có thể quan sát các vạch DNA dưới ánh sáng UV. Một thang chuẩn DNA (DNA ladder) được chạy song song để xác định kích thước của các vạch sản phẩm. Nếu mẫu dương tính với chi Salmonella, một vạch sáng có kích thước 605 bp sẽ xuất hiện. Nếu mẫu dương tính với S. Typhimurium, sẽ có thêm một vạch 432 bp. Việc phân tích mồi PCR và kết quả điện di một cách cẩn thận là bước cuối cùng để đưa ra kết luận về sự hiện diện của mầm bệnh trong mẫu.

V. Kết quả thực nghiệm phát hiện Salmonella tại các nhà yến

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR của Hoàng Gia Lâm (2023) đã cung cấp những dữ liệu quan trọng về tình hình nhiễm Salmonella tại các nhà yến ở TP.HCM, Bình Dương và Đồng Nai. Quy trình mPCR được tối ưu hóa đã được áp dụng để kiểm tra tổng cộng 90 mẫu thực địa, bao gồm 67 mẫu phân và 23 mẫu phết bề mặt tổ. Kết quả không chỉ chứng minh hiệu quả của phương pháp mà còn cho thấy sự tồn tại thực sự của Salmonella trong môi trường nuôi yến. Hơn nữa, nghiên cứu còn tiến hành khảo sát các gen độc lực, cung cấp thông tin sâu hơn về khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn được phát hiện. Những phát hiện này là cơ sở khoa học vững chắc để các chủ nhà yến và cơ quan quản lý đưa ra các biện pháp can thiệp, nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm nhà yến và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

5.1. Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. và S. Typhimurium thực tế

Kết quả phân tích 90 mẫu cho thấy 6/90 mẫu (chiếm 6,67%) dương tính với chi Salmonella (phát hiện gen invA). Đáng chú ý, tất cả các mẫu dương tính này đều là mẫu phân. Trong số 6 mẫu dương tính với Salmonella, có 3/90 mẫu (chiếm 3,33%) cũng dương tính với S. Typhimurium (phát hiện đồng thời gen invA và fliC). Không có mẫu phết bề mặt tổ nào được phát hiện dương tính. Tỷ lệ này tương đồng với các nghiên cứu trên chim hoang dã ở các quốc gia khác, ví dụ như nghiên cứu của Krawiec et al. (2015) phát hiện Salmonella ở 6,4% mẫu. Điều này khẳng định rằng phân chim yến là một nguồn lây nhiễm Salmonella quan trọng cần được quản lý chặt chẽ.

5.2. Khảo sát gen độc lực stn và fimA trên các mẫu dương tính

Để đánh giá mức độ nguy hiểm của các chủng Salmonella được phân lập, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát hai gen độc lực quan trọng là stn (mã hóa cho enterotoxin, độc tố đường ruột) và fimA (mã hóa cho tua fimbriae, giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào chủ). Kết quả cho thấy 100% (6/6) các mẫu dương tính với Salmonella đều mang cả hai gen độc lực này. Sự hiện diện của gen stn và fimA là một chỉ dấu mạnh mẽ cho thấy các chủng Salmonella này có khả năng gây bệnh cao. Thông tin này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc không chỉ phát hiện mà còn phải có biện pháp xử lý môi trường nhà yến để loại bỏ hoàn toàn các chủng vi khuẩn nguy hiểm này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES APPLICATION OF MULTIPLEX PCR TECHNIQUE FOR DETECTION OF Salmonella spp. Typhimurium IN SWIFTLET HOUSES AND INVESTIGATION OF THE VIRULENCE OF Salmonella VIA stn AND fimA GENES Majors : BIOTECHNOLOGY Student : HOANG GIA LAM Student code : 18126074 Academic year : 2018 - 2022 Thu Duc City, 03/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS APPLICATION OF MULTIPLEX PCR TECHNIQUE FOR DETECTION OF Salmonella spp. Typhimurium IN SWIFTLET HOUSES AND INVESTIGATION OF THE VIRULENCE OF Salmonella VIA stn AND fimA GENESS Advisor Student Dr. DINH XUAN PHAT HOANG GIA LAM ACKNOWLEDGMENTS First of all, I would like to express my sincere thanks and gratitude to the Board of Nong Lam University, especially the Faculty of Biological Sciences for creating all conditions for me to carry out the thesis.

I would also like to express my deepest gratitude to my adviser, Dr. Dinh Xuan Phat who wholeheartedly guided me to complete this thesis. In addition, I'd like to thank Ms. Tuan Linh, Mr.

Binh and members of Bio 313 laboratory who supported and helped me in this study, and Veterinary diagnostic laboratory, Branch of Biomin Vietnam co. Finally, I'd like to thank my parents and sister for always encouraging and supporting me during the implementation process. In the process of making the thesis due to lack of experience in thesis writing, some mistakes can inevitably be avoided. Therefore, I look forward to receiving contributions and comments to complete better my thesis.

CONEIRMATION COMMITMENT I hereby declare that this research is my own work. The data, information, and results contained in the thesis are guaranteed to be accurate and truthful. Full name: Hoang Gia Lam Class: DH18SHD Student code: 18126074 Number phone: [phone] Email: [e-mail] ABSTRACT The aim of this study was to built a mPCR procedure for detection of presence of the Salmonella spp. Typhimurium in swiftlet house environments and simultaneously identify the virulence gene of Salmonella (fimA and stn).

Ninety samples were collected from Dong Nai, Binh Duong provinces and Ho Chi Minh City, after these samples were isolated and identified by m-PCR assay. The multiplex PCR procedure was built on two pairs of specific primers that were designed to detect the conserved sequence of the invA gene on Sa/monella genus and the fliC gene on S. Typhimurium serovar, with products of 605 bp and 432 bp, respectively. Through isolation, the suspected-Salmonella positive samples were 29/90 (32.

The results for optimizing showed that the mPCR procedure was performed with pre-denaturation at 95°C for 5 min, followed by repetition of 35 cycles including denaturation at 95° C for 30 sec, annealing at 56°C for 30 sec, extension at 72°C for 45 sec, and final extension at 72°C for 7 min. The ratios of primer concentration was 1:1 (0.2 uM) and mPCR had strongly specific with DNA target. The detection limit of mPCR was 10” ng/ul for DNA targets. After that the optimized mPCR was then used to analyze 90 field samples (67 feces and 23 nest surface swab samples), and the results showed that 6/90 (6.67%) were positive for Salmonella and 3/90 (3.33%) were positive for S.

Finally, for the investigation of two virulence genes, s/n and fimA, using six positive samples for Salmonella, the results showed that the bands of size corresponded to these two genes with a detection rate of 100%. It’s indicated that the mPCR can be used in routine diagnostics of these pathogens and did that Salmonella exist Salmonella in swiftlet houses. Keywords: mPCR, Salmonella spp. ili TÓM TẮT Ứng dung kỹ thuật multiplex PCR cho việc phát hiện Salmonella spp.

Typhimurium trong nhà nuôi chim yến và khảo sát gen độc lực của Salmonella stn và fimA trong nhà nuôi chim yến Mục đích của nghiên cứu này nhằm xây đựng trình multiplex PCR cho việc phát hiện Salmonella spp. Typhimurium trong môi trường nhà nuôi chim yến và đồng thời khảo sát gen độc lực của Salmonella stn và fimA với các mẫu thực địa dương tính trước đó. Chín mươi mẫu thực địa đã được thu thập từ tỉnh Đồng Nai, Bình Dương và thành phố Hồ Chí Minh, các mẫu sau đó đã được phân lập và phát hiện Salmonella bằng phương pháp mPCR. Quy trình mPCR đã được xây dựng dựa trên hai cặp primer đặc hiệu được thiết kết để phát hiện trình tự bảo tồn của gen invA trên chi Salmonella và gen fliC trên serovar S.

Typhimurium, với kích thước của sản phâm khuếch đại lần lượt là 605 bp và 432 bp. Kết quả phân lập đã ghi nhận 29/90 (32.22%) mẫu nghi ngờ dương tính với Salmonella. Cùng với đó chu trình nhiệt của phản ứng mPCR cũng đã được tối ưu và kết quả đạt được như sau: tiền biến tính ở 95°C trong 5 phút, tiếp theo là sự lặp lại của 35 chu kỳ gồm: giai đoạn biến tính ở 95°C trong 30 giây, bắt cặp ở 56°C trong 30 giây, kéo dải ở 72°C trong 45 giây và sau cùng là hậu kéo dài ở 72°C trong 7 phút. Kết quả tỷ lệ nồng độ primer tối ưu cho phản ứng là 1:1 (0.2 WM) và độ đặc hiệu của primer cũng đã được chứng minh với một số vi khuẩn liên quan.

Giới hạn phát hiện của phản ứng mPCR là 107 ng/ul cho mỗi gen mục tiêu. Sau đó, quy trình mPCR đã tối ưu được áp dung dé kiêm tra 90 mẫu thực địa (67 mẫu phân và 23 mẫu phét bề mặt sản) và kết qua cho thấy: 6/90 (6.67%) dương tính Salmonella và 3/90 (3. Đối với việc khảo sát hai gen độc lực stn và fimA dựa trên 6 mẫu dương tinh Salmonella thì kết quả ghi nhận đều xuất hiện band có kích thước tương ứng với hai gen này với tỷ lệ phát hiện là 100%. Kết quả của nghiên cứu đã cho thấy quy trình mPCR có thể được sử dụng trong chan đoán thường quy đối với loại vi khuẩn gây bệnh này và đã cho thay sự tồn tại của Salmonella trong nhà nuôi chim yến.

Từ khóa: mPCR, Salmonella spp. iv TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGMENTS1.ccceccceccecceccecceccecceeceeceeceecaecaeceesacseesaesacseeeeeaeeceeseseeeeeseeeees 1 CONFIRMATION COMMITMENT,.- -- - - 5S S2 HH HH HH HH Hệ, 1 ABS TRAC D sát 6c6041915615968915360603364385354518595ESGIGS8SS0S3XEXSIESGSSAGISSXSASLEAHSSSNNEGGSGE4088E ill FE prensa RRR REESE iv TABLE-OF CON LÊN Do nnenrooibseinigitd101g1%15S00G013640Đ14QG30/3122133S0Skqgoixiaxagsatzeiagssssl V LIST OF ABBREVIA TIONS.- ĂL HH TH HH HH HH nhiệt vill LIST OF TABLES các ác seeeunectis ee nciausec naire a eeinn seme 1X LIST OF FIGURES ssnsssssssescisenamtoaanasaaaaaa aaa eee EMER X (Ð);12101<10104572 201. 1 |1: OD) CCTV TẾ suunsgerisitishettiodlti,GOSEGEAHSHBIBIIPSG0SHG3000/GHSSHEG2ESSH2IS0/-BHNISHERSIS.H//3085 2 Ue AOMTS ters. cxanceu eum tn ena ht ns oom enema ese 2 2.

Introduction to Salmonella and Salmonella Typh1murium. Taxonomy of Salmonella Typh1mur1u1m. Morphological and cultural characteristics .-- -- 5 222 + S2 *+ssverrerrerrerree 4 Deledal «MOPPHOlOBY srsassecssssssE511005106592360151395.16/4033101013043038590SSE9ÿ33093817093B0TSESH3I00538880709580g248s8sei 4 2. Culture uc ch.

Structure of the Salmonella and S.-- --- ---- 6 201001 HIÔHE|OSÍỗ seesssssnsniet si SE13605003846581581385548568865388385SL838X253SS538S0EG3AG01GG458550433514353803813587 8 22D KHLONSi,TUSIOTS»suuss sovtodieetesvsrsekintdgsglii suggavasiugbgpiagdiiggildijiGusbedgk guioigosaslose orkdghsaisjgesamraudauegsl 9 2. Diagnosis, prevention, and treatment the dIsease. 10 u02, TEMTIET252651561851210050/ 53510029 G08in451005530402835603481004%54GGSGSNGIGIGEELGL4SSANGLS.5: [T€đHH6TILGÍ thE GISCASS wvss. Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCT).-- --- 5-5222 + +22 £+2++xssxesressxes 12 SETAE E061) DEHWGTDIỆB bass 2i 8i0ãE00/289200A10 ee ee ee ee 12 2.

Stages OF MIPCR Q. Appleation of multiplex PC le aensecssne 03069 emer eres 13 Chapter 3. METHODS AND MATERIALS .-- ----- 555 5252<+*<+<+>se+exsesersecee 15 3:1, Time and: placeol study: sxsccsessesscsu essensaenuneenas enna ns ae ane een 15 3. Materials and methods.

Positive controls, negative controls, and field samples.-- --- ---«---==s+ 15 B22: CHẾT NGÑ ÌŠ cases cossaxansasnannesenmnsnnsssnsneseescieeaeassanaaees sanamseannaseseeaniaa sauce 4546130 3663815581000 15 3. se cveeesecevesseevevesceresers san SEE140113161510110110150110019081101101110400107011131001300768 16 3204. NIEEHHUDBLsccsixn1z3146003014603701503ES2SRBESESISEREERSEAETRGNRGMGIBESSESE4BSRGESSBSESSISEBNESSSSSGAESENGISRESSES. 16 3:2:44:1; RSEATFRGH WOLMKS song chiyn HHg Hán H13041655656930945886.

Isolation of Salmonella from field samples. Optimization of the annealing temperature for mPCR. Optimization of the primer COnCe€TTAfIOTI. Examination of primer SD€CIÍIC1EY.

Determination of the limit of deteCIOH. Application of the optimal mPCR procedure for the field samples. Investigation of the virulence of SaÌtowelÏ4.- ------<-<<+c<scescxeeeerrsrree 20 Chapter 4, RESULTS AND DISCUSSION vseccesseccss season ecnsseaeespeassaussansieuaeneueeruraney: 22 an. Isolation of Salmonella spp.

from field samples. Optimization of the annealing temperature for mPCTR. Optimization of the primer concenifrafIOTI. Examination of primer specificity.

Determination of the limit det€CtIOI. Application of the optimal mPCR procedure for the field samples. Investigation of the virulence of ,SaÏmowelÏÏ4. Application of the optimal mPCR procedure for the field samples.

Investigation of the virulence of Salmonell. CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS. REC OMMIMCHO ALL ONS s.esssssoeessourivisdesiikrssasgtdserrgbsudugiueskugssnjisetidukisjdimusjbsvgirieguigeruiskaoDU REEERE By tac sens crsneanssencs ssattensnssuassmsnne quasi acces nanos saaastean case sus one wae aneauiemanate aeaa ot 31 APPENDIX 0 57. vil LIST OF ABBREVIATIONS D.W Distilled Water DNA Deoxyribonucleic acid EBN edible bird’s nests EIA Enzyme immunoassay ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay GIs genomic islands HE Hektoen enteric LPS Lipopolysaccharide mPCR Multiplex Polymerase Chain Reaction MSRV Modified Semi Solid Rappaport Vassiliadis OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction RVS Rappaport-Vassiliadis soya peptone broth S.

Typhimirium Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhimurium SPIs Salmonella pathogenicity islands TAE Tris — Acetic - EDTA TCVN Tiéu chuan Viét Nam XLD Xylose lysine deoxycholate agar Vill LIST OF TABLES Table 3. Primers used for the mRT-PCR reacfIoN.- --- + 5225 s+*xs+esverreeereere 18 Table 3. The components of mPCR for optimization of the primer concentration.

Primers used for investigation of the virulence of Salmonella. The result of three iterations of the detection limit .- -- 2 2 22 << << ss<+26 1X LIST OF FIGURES Figure 2. Colonies of Salmonella Typhimurium growth on agar plates. The Sa/monella enterica serovar Typhimurium LT2 genome.

Salmonella infection 1n VISC©TA. Salmonella infection in heart and pigeon’s ÏIV€r. Salmonella was isolated from field samples on agar pÌates. Optimization of annealing temperature 1n s-PCR.

Optimization of annealing temperature in mPCT. Optimization of primer concentration 1n mPCTR. Examination of primer SD©CIÍTCIẨY. Electrophoresis results of the detection limit of the mPCR.

Electrophoresis results of detection of Salmonella spp. Electrophoresis results of investigation of virulence øenes. Introduction In Viet Nam, swiftlet farming appeared in the 19th century, but it wasn’t until 2004 that it was developed for commercial purposes and played an important role in our country's economy. The products related to swiftlets had been proven to have high nutrition: lipid 0.76%, protein 62 - 63% (Marcone, 2005) and the key components of EBN were glycoproteins rich with amino acids, carbohydrate, calcium, sodium, and potassium (Kathan and Weeks, 1969; Norhayati et al., 2010) and health benefits such as preventing aging, improving health, improving joint pain, being anti-cancer, anti-oxidant, anti-inflammatory, and boosting immune system (Matsukawa et al., 2011; Vimala et al., 2012; Yew et al., 2014; Yida et al., 2014), so the breeding of this wild bird has been growing day by day.

In January 2021, there were 42/63 provinces and cities having swiftlet houses with a total number of over 20,000 houses and most of them from the central coast to the southern provinces, with an annual yield from the edible bird’s nests (EBN) were about 120 tons (equivalent to 450 million USD), of which exported accounts for 100 — 125 million USD (General Statistics Office: www. Swiftlets come from wild birds that live in large flocks at high altitudes (Rami et al., 2013), so it is more difficult to control diseases than in poultry farming. Disease management in swiftlet houses and the hygienic conditions of swiftlet products are a worrisome problems. Therefore, having an understanding of infectious diseases in birds is very important for swiftlet’s breeding in particular and the livestock industry in general.