Tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ sâm Việt Nam (Panax vietnamensis)

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học vietnamese ginseng panax vietnamensis ha et grushv hairy root culture, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyen Nhat Khang
• Người hướng dẫn: Phd. Do Manh Cuong
• Trường học: Nong Lam University-Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Vietnamese Ginseng (Panax Vietnamensis Ha Et Grushv.) Hairy Root Culture-Derived Somatic Embryogenesis
• Loại tài liệu: Undergraduate Thesis
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• DECLARATION
• ABSTRACT
• CONTENTS
• List Of tables
• List Of figures
• 1. CHAPTER 1: OVERVIEW
• 1.1. Background information
• 1.2. Research objectives
• 1.3. Research contents
• 1.4. Classification
• 2. CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. The medicinal value of Panax VietNamensis
• 2.2. Saponins
• 2.3. Other compounds
• 2.4. Application of biotechnology in P. vietnamensis
• 2.5. Transgenic technology in plant
• 2.6. Advantages and potential of transgenic plant in agriculture
• 2.7. Somatic embryogenesis in plant
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Places and duration for conducting eXp©rIIN€TIES
• 3.2. Plant materials
• 3.3. Equipments and tools
• 3.4. Plant cell, tissue and organs culture
• 3.5. Effect of NAA combined with cytokinins (BA, KIN and Adenine) on callus induction OfDalry TOOt
• 3.6. Effect of single cytokinin (BA, KIN and Adenine) or BA combined with auxin (2,4-D and NAA) on somatic embryogenesis from hairy roots-derived
• 3.7. Somatic embryo maturation and transgenic plantlet regeneration
• 3.8. Detection of target genes in regenerated transgenic plantlefs
• 3.9. Observe the surface of somatic embryos by SEM
• 3.10. Statistical analysts
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSIƠN
• 4.1. Effect of NAA combined with cytokinins (Ba or KIN or Adenine) on callus induction of hairy root explants
• 4.2. Effect of single cytokinins (BA, KIN and Adenine) or BA combined with auxin (2,4-D and NAA) on somatic embryogenesis from hairy roots-derived CALLUS
• 4.3. Somatic embryo maturation and transgenic plantlet regeneration
• 4.4. Detection of target genes in regenerated transgenic plantlets.
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• 5.1. CONCLUSIONS
• 5.2. SUGGESTIONS
• REFERENCES
• APPENDIX
• LIST OF ABBREVIATIONS

Tóm tắt

I. Tạo Phôi Soma Sâm Việt Nam Mở Ra Kỷ Nguyên Nhân Giống Mới

Sâm Việt Nam, hay còn gọi là Sâm Ngọc Linh (tên khoa học Panax vietnamensis), được xem là một trong những loài sâm quý hiếm và có giá trị dược liệu cao nhất thế giới. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức cùng với tốc độ sinh trưởng chậm trong tự nhiên đã đẩy loài cây dược liệu quý này đến bờ vực cạn kiệt. Để giải quyết vấn đề này, các phương pháp công nghệ sinh học thực vật hiện đại đã mở ra những hướng đi đột phá, trong đó kỹ thuật tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ nổi lên như một giải pháp đầy hứa hẹn. Phôi soma là những phôi được tạo ra từ tế bào sinh dưỡng (không phải tế bào sinh dục) và có khả năng phát triển thành một cây hoàn chỉnh, mang đặc tính di truyền y hệt cây mẹ. Phương pháp này không chỉ giúp vi nhân giống với số lượng lớn trong thời gian ngắn mà còn là công cụ hữu hiệu để bảo tồn nguồn gen sâm quý hiếm. Quá trình này bắt đầu từ việc tạo ra rễ tơ, một loại rễ đặc biệt được cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, sau đó nuôi cấy để tạo mô sẹo (callus) và từ đó biệt hóa thành phôi soma. Toàn bộ quy trình nuôi cấy in vitro này cho phép kiểm soát chặt chẽ các điều kiện, tạo ra cây giống sạch bệnh và đồng đều về chất lượng, vượt qua những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống.

1.1. Giá trị và thực trạng bảo tồn loài Panax vietnamensis

Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) chứa hàm lượng saponin Sâm Việt Nam (đặc biệt là saponin MR2) cao vượt trội, mang lại các hoạt tính sinh học quý giá như chống oxy hóa, giảm căng thẳng và tăng cường miễn dịch. Tuy nhiên, nguồn cung sâm tự nhiên rất hạn chế do phân bố hẹp (chủ yếu ở vùng núi Ngọc Linh), sinh trưởng chậm (mất hơn 5 năm để thu hoạch) và khả năng tái sinh thấp. Thực trạng này dẫn đến giá thành cao và nguy cơ tuyệt chủng, khiến việc bảo tồn nguồn gen sâm trở thành nhiệm vụ cấp bách. Các phương pháp nhân giống truyền thống bằng hạt hoặc thân rễ không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và mục tiêu bảo tồn.

1.2. Tổng quan về công nghệ phát sinh phôi soma vô tính

Sự phát sinh phôi soma là một quá trình mà tế bào sinh dưỡng, dưới tác động của các điều kiện nuôi cấy thích hợp, tái lập trình và phát triển thành phôi có cấu trúc lưỡng cực (chồi và rễ) tương tự phôi hợp tử. Đây là một kỹ thuật vi nhân giống tiên tiến, cho phép sản xuất hàng loạt phôi vô tính có độ đồng nhất di truyền cao. Ưu điểm của phương pháp này bao gồm hệ số nhân giống lớn, khả năng tự động hóa qua nuôi cấy bioreactor, và tạo ra nguồn cây giống sạch bệnh, không phụ thuộc vào mùa vụ. Đối với các cây dược liệu quý như Sâm Việt Nam, đây là công nghệ chìa khóa để công nghiệp hóa sản xuất giống.

II. Thách Thức Nhân Giống Sâm Việt Nam Vai Trò Của Nuôi Cấy Rễ Tơ

Bài toán nhân giống và bảo tồn Sâm Việt Nam đối mặt với nhiều thách thức cố hữu. Phương pháp gieo hạt truyền thống có tỷ lệ nảy mầm thấp và cây con sinh trưởng rất chậm, dễ bị sâu bệnh tấn công. Việc tách thân rễ để nhân giống lại có hệ số nhân thấp và làm tổn thương cây mẹ. Những rào cản này khiến việc sản xuất Sâm Việt Nam quy mô lớn trở nên bất khả thi, không đáp ứng được nhu cầu dược liệu ngày càng tăng. Trong bối cảnh đó, nuôi cấy rễ tơ (hairy root culture) đã trở thành một công nghệ nền tảng quan trọng. Rễ tơ là hệ thống rễ được tạo ra khi chuyển các gen rol từ plasmid Ri của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen thực vật. Hệ rễ này có đặc tính sinh trưởng mạnh, không cần bổ sung hormone ngoại sinh, ổn định về mặt di truyền và có khả năng sản xuất sinh khối cùng các hợp chất thứ cấp (như ginsenoside) với hiệu suất cao. Việc sử dụng rễ tơ làm vật liệu khởi đầu để tạo phôi soma là một bước tiến mang tính chiến lược, kết hợp ưu điểm của cả hai công nghệ để tạo ra một quy trình nhân giống hoàn chỉnh và hiệu quả.

2.1. Hạn chế của các phương pháp nhân giống sâm truyền thống

Các phương pháp truyền thống gặp nhiều giới hạn. Tỷ lệ nảy mầm của hạt Sâm Việt Nam trong tự nhiên rất thấp và không đồng đều. Cây con cần điều kiện sinh thái đặc thù (độ cao, độ ẩm, bóng râm) để phát triển, khiến việc canh tác trên diện rộng gặp nhiều khó khăn. Kỹ thuật nhân giống vô tính bằng cách tách các mầm trên thân rễ tuy hiệu quả nhưng hệ số nhân rất hạn chế, không thể đáp ứng nhu cầu sản xuất quy mô công nghiệp. Các phương pháp này cũng không giải quyết được vấn đề cây giống nhiễm bệnh, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng dược liệu.

2.2. Nuôi cấy rễ tơ Nền tảng cho việc tạo phôi soma hiệu quả

Nuôi cấy rễ tơ cung cấp một nguồn vật liệu khởi đầu lý tưởng cho sự phát sinh phôi soma. Rễ tơ có tốc độ sinh trưởng nhanh trong môi trường nuôi cấy in vitro, cho phép tạo ra một lượng lớn sinh khối sạch bệnh trong thời gian ngắn. Quan trọng hơn, các tế bào rễ tơ vẫn giữ được toàn tính di truyền và khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Việc sử dụng rễ tơ làm mẫu cấy giúp quy trình ổn định hơn so với việc dùng các bộ phận khác của cây (lá, thân), vốn chịu ảnh hưởng nhiều bởi tuổi và trạng thái sinh lý của cây mẹ. Đây là tiền đề vững chắc cho các bước cảm ứng tạo callus phôi hóa tiếp theo.

III. Phương Pháp Cảm Ứng Mô Sẹo Từ Nuôi Cấy Rễ Tơ Sâm Việt Nam

Giai đoạn đầu tiên và then chốt trong quy trình tạo phôi soma là cảm ứng hình thành mô sẹo (callus) từ rễ tơ. Callus là một khối tế bào chưa biệt hóa, có tiềm năng phát triển thành các cơ quan khác nhau hoặc thành phôi. Hiệu quả của quá trình này phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường nuôi cấy, đặc biệt là sự cân bằng giữa các loại chất điều hòa sinh trưởng (PGRs). Nghiên cứu của Nguyen Nhat Khang (2022) đã chỉ ra rằng môi trường nền SH (Schenk and Hildebrandt) là lựa chọn phù hợp. Để tối ưu hóa việc tạo callus, các thí nghiệm đã khảo sát sự kết hợp giữa auxin (cụ thể là NAA) và cytokinin (BA, KIN, Adenine). Kết quả cho thấy sự tương tác hiệp đồng giữa auxin và cytokinin là yếu tố quyết định. Cụ thể, môi trường tối ưu nhất để cảm ứng tạo callus từ rễ tơ Panax vietnamensis đã được xác định, mở đường cho giai đoạn phát sinh phôi tiếp theo. Đây là bước nền tảng để đảm bảo đủ lượng vật liệu cho quá trình sản xuất sinh khối và biệt hóa phôi.

3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy và nồng độ chất điều hòa

Thành công của việc tạo callus phụ thuộc vào việc lựa chọn đúng môi trường nuôi cấy MS hoặc SH và nồng độ hormone. Theo tài liệu gốc, môi trường nuôi cấy SH được bổ sung 0.5 mg/L NAA kết hợp với các nồng độ khác nhau của cytokinin (BA hoặc KIN) cho kết quả cảm ứng callus tốt. Các tế bào rễ tơ chỉ hình thành callus khi có mặt đồng thời cả auxin và cytokinin, cho thấy vai trò không thể thiếu của hai nhóm hormone này trong việc kích thích sự phân chia tế bào.

3.2. Kết quả tối ưu 100 cảm ứng callus với BA và NAA

Nghiên cứu đã xác định công thức vàng cho việc tạo callus. Kết quả xuất sắc nhất, với tỷ lệ cảm ứng đạt 100% và trọng lượng tươi mẫu cấy cao nhất (4.15 g), được ghi nhận trên môi trường SH có chứa 2.0 mg/L BA kết hợp với 0.5 mg/L NAA sau 6 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp này của chất điều hòa sinh trưởng đã tạo ra một môi trường lý tưởng, kích thích các tế bào rễ tơ phản biệt hóa và tăng sinh mạnh mẽ để tạo thành khối callus phôi hóa chất lượng cao, sẵn sàng cho giai đoạn tiếp theo của quá trình tạo phôi soma.

IV. Hướng Dẫn Quy Trình Tạo Phôi Soma Từ Mô Sẹo Sâm Việt Nam

Sau khi có được nguồn callus chất lượng, bước tiếp theo là cảm ứng sự phát sinh phôi soma. Giai đoạn này đòi hỏi sự điều chỉnh tinh vi về thành phần môi trường để chuyển hướng các tế bào callus từ trạng thái tăng sinh không định hướng sang phát triển có tổ chức thành các cấu trúc phôi. Trong nghiên cứu về tạo phôi soma từ Sâm Việt Nam, các nhà khoa học đã chuyển callus sang môi trường mới với sự điều chỉnh nồng độ hormone. Các thí nghiệm tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của cytokinin đơn lẻ (BA, KIN, Adenine) và sự kết hợp giữa BA với các loại auxin khác nhau (2,4-D, NAA). Kết quả cho thấy việc bổ sung cả auxin và cytokinin vào môi trường cảm ứng phôi mang lại hiệu quả vượt trội so với chỉ sử dụng cytokinin đơn lẻ. Quá trình này không chỉ làm tăng tỷ lệ hình thành phôi mà còn gia tăng đáng kể số lượng phôi trên mỗi cụm callus. Đây là một phát hiện quan trọng, giúp tối ưu hóa hiệu suất của toàn bộ quy trình nuôi cấy tế bào thực vật và vi nhân giống.

4.1. Tác động của BA và 2 4 D đến sự hình thành phôi soma

Kết quả nghiên cứu đã chứng minh sự kết hợp giữa BA và 2,4-D là hiệu quả nhất. Môi trường SH bổ sung 2.0 mg/L BA kết hợp với 1.0 mg/L 2,4-D được xác định là công thức tối ưu cho sự phát sinh phôi soma từ callus có nguồn gốc rễ tơ của Panax vietnamensis. Ở điều kiện này, tỷ lệ tạo phôi đạt mức rất cao và số lượng phôi trung bình lên tới 63.7 phôi trên mỗi mẫu cấy sau 6 tuần. Điều này khẳng định vai trò then chốt của auxin (đặc biệt là 2,4-D) trong việc khởi động quá trình phát sinh phôi.

4.2. Quá trình trưởng thành của phôi và tái sinh cây hoàn chỉnh

Các phôi vô tính sau khi được hình thành sẽ trải qua các giai đoạn phát triển tuần tự: hình cầu, hình tim, hình ngư lôi và giai đoạn lá mầm. Để thúc đẩy quá trình này, các phôi được chuyển sang môi trường SH không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Trong môi trường này, phôi sẽ trưởng thành và nảy mầm tự nhiên để phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Quá trình này mô phỏng sự phát triển của phôi trong tự nhiên, đảm bảo cây con có đầy đủ cấu trúc rễ, thân, lá và sẵn sàng cho giai đoạn vườn ươm.

V. Kết Quả Đột Phá Cây Sâm Việt Nam Chuyển Gen Từ Phôi Soma

Thành công của quy trình tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ không chỉ dừng lại ở việc tạo ra cây con mà còn ở việc xác nhận bản chất chuyển gen của chúng. Vì vật liệu ban đầu là rễ tơ cảm ứng bởi Agrobacterium rhizogenes, các cây con tái sinh từ phôi soma được kỳ vọng sẽ mang đoạn T-DNA của plasmid Ri trong bộ gen của chúng. Điều này có ý nghĩa quan trọng, vì các gen trên T-DNA (như các gen rol) có thể ảnh hưởng tích cực đến hình thái và khả năng sản xuất các hợp chất sinh học của cây. Để xác minh điều này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để kiểm tra sự hiện diện của các gen mục tiêu trong các cây con tái sinh. Kết quả đã khẳng định rằng các cây Sâm Việt Nam được tạo ra qua con đường phôi soma vẫn giữ lại các gen chuyển, mở ra tiềm năng tạo ra các dòng sâm mới có đặc tính nông học và dược học ưu việt. Đây là minh chứng rõ ràng cho hiệu quả của việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến cây dược liệu quý.

5.1. Xác nhận sự hiện diện của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Phản ứng chuỗi Polymerase) được sử dụng để phát hiện các gen rolA, rolB, rolC và aux1, vốn nằm trên đoạn Ri T-DNA đã được chuyển vào bộ gen của cây. Kết quả phân tích điện di cho thấy các vạch DNA có kích thước tương ứng với các gen mục tiêu đã xuất hiện ở cây tái sinh từ phôi soma, tương tự như mẫu đối chứng dương (DNA plasmid của vi khuẩn) và không xuất hiện ở cây đối chứng âm (cây không chuyển gen). Điều này chứng tỏ các cây con là cây chuyển gen thực sự và đã tích hợp thành công các gen từ Agrobacterium rhizogenes.

5.2. Đặc điểm hình thái và ưu điểm của cây Sâm chuyển gen

Về mặt hình thái, cây Panax vietnamensis chuyển gen tái sinh từ phôi soma không có sự khác biệt đáng kể so với cây không chuyển gen. Tuy nhiên, một đặc điểm nổi bật được ghi nhận là hệ thống rễ của cây chuyển gen phát triển tốt hơn rất nhiều. Đây là biểu hiện đặc trưng của "hội chứng rễ tơ" (hairy root syndrome) do sự hoạt động của các gen rol. Hệ rễ khỏe mạnh hơn là một lợi thế lớn, giúp cây con dễ dàng thích nghi khi chuyển ra điều kiện vườn ươm và có khả năng hấp thụ dinh dưỡng tốt hơn, hứa hẹn tiềm năng nâng cao sản lượng saponin Sâm Việt Nam.

VI. Tương Lai Sâm Việt Nam Với Công Nghệ Phôi Soma Từ Rễ Tơ

Nghiên cứu về tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ Sâm Việt Nam đã đặt một nền móng vững chắc cho việc bảo tồn và phát triển bền vững loài dược liệu quốc bảo này. Công nghệ này không chỉ cung cấp một phương pháp vi nhân giống hiệu quả để sản xuất cây giống quy mô lớn, sạch bệnh mà còn mở ra cơ hội cải tiến di truyền. Những cây chuyển gen thu được có thể là nguồn vật liệu quý giá cho các chương trình chọn tạo giống Sâm Việt Nam trong tương lai, hướng tới các dòng có năng suất sinh khối cao hơn và hàm lượng hoạt chất ginsenoside được cải thiện. Tuy nhiên, vẫn còn một số thách thức cần được giải quyết, bao gồm việc tối ưu hóa tỷ lệ cây sống sau khi chuyển ra vườn ươm và đánh giá sự ổn định biểu hiện của các gen chuyển qua nhiều thế hệ. Dù vậy, những kết quả ban đầu là vô cùng hứa hẹn, khẳng định vai trò tiên phong của công nghệ sinh học thực vật trong việc khai thác và phát triển bền vững nguồn tài nguyên dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đặc biệt là trong nuôi cấy bioreactor để sản xuất dược chất.

6.1. Tóm tắt thành tựu và ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu đã xây dựng thành công một quy trình hoàn chỉnh để tái sinh cây Panax vietnamensis chuyển gen thông qua con đường phát sinh phôi soma từ rễ tơ. Thành tựu này có ý nghĩa to lớn trong việc bảo tồn nguồn gen sâm, cung cấp giải pháp nhân giống nhanh, hiệu quả, đáp ứng nhu cầu về cây giống chất lượng cao. Nó cũng mở ra tiềm năng sản xuất các hợp chất thứ cấp trực tiếp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ hoặc từ các cây chuyển gen có năng suất cao.

6.2. Hướng nghiên cứu và phát triển công nghệ trong tương lai

Các hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc đánh giá khả năng thích nghi của cây chuyển gen trong điều kiện nhà kính và ngoài thực địa. Đồng thời, cần phân tích, so sánh hàm lượng saponin Sâm Việt Nam giữa cây chuyển gen và cây thường để xác định hiệu quả cải tiến. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy dịch huyền phù tế bào và nuôi cấy trong bioreactor từ phôi soma hoặc rễ tơ sẽ là bước đi quan trọng để tiến tới sản xuất các hợp chất dược liệu ở quy mô công nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES VIETNAMESE GINSENG (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) HAIRY ROOT CULTURE-DERIVED SOMATIC EMBRYOGENESIS Major : BIOTECHNOLOGY Student : NGUYEN NHAT KHANG ID : 18126227 School year =: 2018 - 2022 Thu Duc City, 03/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS VIETNAMESE GINSENG (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) HAIRY ROOT CULTURE-DERIVED SOMATIC EMBRYOGENESIS Supervisors Student PhD. Do Manh Cuong Nguyen Nhat Khang MSc. Hoang Dac Khai Thu Duc city, 03/2023 ACKNOWLEDGEMENT To complete this thesis, I would like to express my special thanks and gratitude to my supervisors PhD. Do Manh Cuong and MSc.

Hoang Dac Khai, especially Prof. Duong Tan Nhut who gave me the opportunity to do this thesis which also helped me in doing a lot of experiment. I am really thankful to them. Secondly, I would like to thank the teachers of Faculty of biological sciences- Nong Lam university and the members of the Department of molecular biology and plant breeding who helped me in finishing this thesis in a limited time.

It really helped me increase my knowledge and skills. Finally, I would like to thank the financial support of the Department of molecular biology and plant breeding under grant number NCXS01.03/22-24 DECLARATION My name is Nguyen Nhat Khang, ID: 18126227, Class: DH18SHC of Biotechnology major, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. All data in this thesis are my and our research group under funding of project with grant number “NCXS01.03/22-24” of Vietnam Academy of Sciencs and Technology. This thesis's results were used as a part of the work "Efficient transgenic plantlet regeneration from hairy roots via somatic embryogenesis and hardening plantlets of Panax vietnamensis by iron nanoparticles-supplied culture" that published in 2022, in which I am the co-author.

I fully responsible to the board for these commitments. Thu Duc, Monday, 6th February 2023 Student NGUYEN NHAT KHANG ABSTRACT In this study, the plantlet regeneration of Panax vietnamensis via somatic embryogenesis derived from hairy root callus was investigated. The results showed that the maximum callus induction (100%) and explant fresh weight (4.15 g) were recorded on the SH medium supplemented with 2.0 mg/L BA in combination with 0.5 mg/L NAA and 30 g/L sucrose after 6 weeks of culture. Callus was transferred to SH medium containing 1.0 mg/L BA for somatic embryogenesis.

The somatic embryogenesis was 100%, and the average number of embryos was 63.7 embryos after 6 weeks of culture on SH medium containing 1. Then, the somatic embryos were transferred to the plant growth regulators-free SH medium for the maturation. They developed progressively through the globular, heart, torpedo, cotyledon stages, and finally formed plantlets. The plantlets derived from hairy roots retained the Ri T-DNA was revealed by PCR analysis.

The morphology of these plantlets were not different from the non-transformed plantlets as a control, but the root growth was better. Keywords: Agrobacterium rhizogenes, rhizome proliferation, somatic embryogenesis callus CONTENTS Page ANCRTTOWILEA S CHIBI NGA cans ốnốớố.ốaố cố ốc Cố CO CỐ 1 Declaration of authorSlIpD. - --- - 22 2222221223 1231151 1231153123111 12111111211 111111 1x ray ul TAN thờ Cl Ieee arian OES renee re re ne Tee ere etre Rarer ROT eer eM Nene mene ere nee? 11 COHÍẾH [Ss xssgigsgsesosg16116154758183103041606100310438314445381453353381543653935915E83813155403913 3985303501504 IV List Of 1a1) 2211010. Sẽ ẽnốốốố ốc VI DE TSEO LADIES is.

“Số CC cÔ VI List Of figures. Vill CHAPTER J) OVER VIEW seccacensee ne eeeemare eee | Lal. Backs rotiid 21 ott OB excesses eeecou sacra coun crease nian suey SUS2. IRESCGT Cl CONTESTS wc scssonsssevenasacesesse 800G613800-3084/00486G22368E ast 560038.3838110408 2 CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW.

Ặ ST SH re, 3 Dali FP ONOK VICINOINCNSIS accusers tặgnhgi4gì02)Ag13S08880011Q83§tSgE230835⁄G;SG8N2NGS289ES22IGGXN8E9/SGU85gt2S0kmidiog 3 Ds lạc La C855IHEBEDÏsssseeseesnbtisss4214363111455135585E0101985SS1/460150000%03/391013330161102102303% 3 2. The medicinal value of Panax VietNAMeNSis .120: SAPONINS a cacescanscsssanasemacaxeam mmm mate eR 3 J8 QUIET COM POUT S x"n. Application of biotechnology on Panax Vi€f@I1€HSỈS. Transgenic technology in pÏATIE.

Advantages and potential of transgenic plant in agriculfure. Somatic embryogenesis in pÏaTI(. krrke 7 2:2: SODMALC omDEVODGTICSS ssscc erence sea G0 4 016196:363610168 810 8p339360310SH98SDEGBA1Si0130300988150. Advantage and potential of somatic embryogenesis.

Some factors effect on somatic embryogenesis. ---- 5555-55 <+ss+ss+ 8 20013; PLAN STOW IDLE SU ALOLS sonseassseceetiig518S:813804l.38 8 20-51: ERP lanl SOUICE aan mumnewe seme tenes ete E ERE ETE 9 2. Somatic embryogenesis of Panax. Vi€ÍHđINI€THSÏS.

7 5-55 sS+s+e+sxs+ 10 CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS. Places and duration for conducting eXp©rIIN€TIES. Plant materials nh. Equipments and tools .cecceeeecesceeceeseesceeseeeceesececeeseceeeeseeeeeeseeeeeeseeeeenees 11 13258 2n: be TEIULHDITELĐTELEEcosessesk.cooo=oHke,chs4 x6 g0300610m 3A 8816311a463302300.0800/805đE2d-kecao238AdoA,4S0Ad.dL 11 Dedede: -LOO lỔÏgssssoiceiussPi500099003900906950005853830/5683809S85.

12 1, NI C LHS5: 7526660616120 20L10E06SEERGGEGBGEBEEBEILIE BI EEe 12 3. Plant cell, tissue and organs culture. Effect of NAA combined with cytokinins (BA, KIN and Adenine) on callus miduction OfDalry TOOt GKD BH <ccssercrseoncavsearannos sarnesancconssumonercrsnonawnss 12 3. Effect of single cytokinin (BA, KIN and Adenine) or BA combined with auxin (2,4-D and NAA) on somatic embryogenesis from hairy roots-derived GBIÌesssespsesbbsesvrsepossgoltthderlttoxosszgbosibisztos 3ipisicRussgissteksrgisnpstsggvlindlrsrgrgtinrdegnagistgitrngjcber 13 3.

Somatic embryo maturation and transgenic plantlet regeneration. Detection of target genes in regenerated transgenic plantlefs. Observe the surface of somatic embryos by SEM. Statistical analysts: sssaseesdaeiisidasorritkieinbtiedzesVBpgig0 8 006 nhitdirdin-iebdtirooig 1i 00p sáo 15 CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSIƠN.

Effect of NAA combined with cytokinins (Ba or KIN or Adenine) on callus induction of hairy root explants. Effect of single cytokinins (BA, KIN and Adenine) or BA combined with auxin (2,4-D and NAA) on somatic embryogenesis from hairy roots-derived CALLUS eoscaxssassansonnes saazsems sexe 1388 8128018148/368gEÄ5BSL4SEI058/4S833SĐ083h4Sã. Somatic embryo maturation and transgenic plantlet regeneration. Detection of target genes in regenerated transgenic plantlets.- 24 CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS.---- 26 Dill MOTE ISTO seaceontcsnecrenstielneei sein set oneal wit acessories 26 5.a 01S (0) | ee ee ee 26 REFERENCES APPENDIX LIST OF ABBREVIATIONS 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BA : 6-Benzylaminopurine Kin : Kinetin SH : Schenk and Hildebrandt medium (1972) NAA : 1-Axit naphtalenaxetic PCR : Polymerase-Chain-Reaction PGRs : Plant growth regulators vi LIST OF TABLES Page Table 3.

Nucleotide sequence of the PCR primers used for detection of T-DNA integration in plantlet derived from hairy root of P. Thermo cycle for PCR reactIOI. Effect of plant growth regulators (PGRs) on the callus induction from Waly TOO SIE G WEEKS OL CHINE sonccsssssacnss ti idgohi Ti Gia1360801-G013G33818809Đ5300353803JE0. Effect of BA, KIN and Adenine on somatic embryogenesis from callus derived from hairy roots after 6 weeks of cuÏfUTe.- --- 55+ sxs+xssscssrersxrs 22 Table 4.

Effect of NAA or 2,4-D combined with BA on somatic embryogenesis from callus derived from hairy roots after 6 weeks of culÌture.- ------ 23 vii LIST OF FIGURES Page Fig 4. Callus induction from hairy TOOI. Plantlets drived from somatic embryos .- --- --¿---++-+>+sc++erzee+xer+ 25 Fig 4. Detection of integration of the rol A, B, C and aux! genes in plantlets derived from the hairy root of P.

vietnamensis transformed by A. rhizogenes strain PCG HỆ XG II Ranguziseseiðda8acsGioa.usadSeiEstis23iia8u3isase25gBskasisass3uisisksaBa3ontieagisBEnsfos4BiL8iusslGlonSGin. Background information Panax vietnamensis |Panax vietnamensis Ha et Grushv (1985)] is one of the rare and top-class medicinal plants. This species has been used for centuries in traditional medicine and has recently been identified as a potential source of novel bioactive compounds.

It is used to support for antioxidant treatments, anti-stress, and immune system enhancement, etc. Saponin is the main active compound in P. vietnamensis like other ginseng in the world. The formation of protopanaxadiol oxid II and 52 saponin mixture have been isolated and identified in the P.

The high quantity of saponin dammarane (12-15%) and saponin MR2 (50%), P. vietnamensis showed biological activity 48-fold higher than P. vietnamensis also contains 2 oleanolic acid saponin derivatives, compounds that were first discovered in the Araliaceae family. vietnamensis become one of the most valuable medicinal species in Vietnam (Dong ef al.

However, the supply of P. vietnamensis 1s very limited due to limited distribution (mainly in Ngoc Linh Mountain area, Vietnam), slow growth (it takes more than 5 years to harvest), and reproduction leading to low yields and high prices. The hairy root is a plant disease caused by the infection of the bacterium Agrobacterium rhizogenes. Hairy root culture based on transgenic technology is now being widely applied for biomass multiplication to extract saponins (Khan ef a/., 2018; Gharari ef al.

vietnamenis, Nhut et al. (2017) successfully induced the hairy roots by transferring ro/ and aux genes with A. rhizogenes-mediated transgenic, achieving a remarkable step in P. vietnamensis multiplication biomass.

However, there is still no research on the regeneration of transgenic P. vietnamensis, which was the main aim of this study. The present thesis was carried out to determine the optimal culture medium for callus induction from hairy roots, somatic embryogenesis from callus, germination of somatic embryos into plantlets, and determining the presence of target genes in regenerated transgenic plantlets. The present results are the basic tool for P.

vietnamensis breeding with enhanced secondary compounds biosynthesis for the pharmaceutical industry in Vietnam. Research objectives Determining the optimal concentration of PGRs for callus induction. Determining the optimal concentration of PGRs for embryogenesis. Determining the target gene of transgenic P.

vietnamensis planlets derived from hairy roots. Research contents Effect of NAA combined with cytokinins (BA or KIN or Adenine) on callus induction of hairy root explants. Effect of single cytokinin (BA, KIN and Adenine) or BA combined with auxin (2,4-D and NAA) on somatic embryogenesis from hairy roots-derived callus. Obtaining the transgenic P.

viefnamensis plantlets derived from hairy roots. Classification Panax vietnamensis [Panax vietnamensis Ha et Grushv (1985)] is also known as P. This 1s one of the rare and top-class herbal medicines in Vietnam, and it is also one of the five best ginseng in the world. Panax vietnamensis was first discovered in 1973 at a height of 1.800 m above sea level on Ngoc Linh Mountain, which is within the Truong Son Range-straddles 4 provinces Kon Tum, Quang Nam, Quang Ngai, and Gia Lai with over 80% forest coverage, the average temperature roughly around 15 to 18.5°C, the average humidity and rain level approximately high (Chu ef a/.

vietnamensis was officially introduced at Komarov Botanical Institute (Soviet Union) by H. Dung and IV. Grushvistky with it scientific name P. vietnamesis belonging to the Araliaceae family.

Scientific classification Kingdom : Plantae Order : Aplales Family : Araliaceae Genus : Panax Species ; P. vietnamensis Binomial Name : Panax vietnamensis Ha et Grushv (1985) 2. The medicinal value of Panax vietnamensis 2. Saponins Saponin or saponosid is a heterogeneous mixture, which contains sterol glycoside and triterpenoid glycoside, and it can be found in many plant species.

Saponin distributes all over the bark, leaf, stem, root, and even the flower (Milgate ef a/. Saponin is the main active compound in P. vietnamensis like other ginseng in the world. The formation of protopanaxadiol oxid II and 52 saponins have been isolated and identified in the P.

Especially, the underground parts of the ginseng (rhizome and lateral root) containing 26 known saponins and 26 new structural saponins were named vina-ginsenoside-R1-R24 and 20-O-Me-G.Rhl vina-ginsenoside-R1-R24 and 20-O- Me-G.Rh1 (Dong ef al. Dammarane saponin is the decisive active element for the valuable biological active compound of the ginseng genus. It accounted for a large amount in the saponin mixture of P. Based on the high quantity of saponin dammarane (12-15%) and saponin MR¿ (50%), P.

vietnamensis showed biological activity 48-fold higher than P. vietnamensis also contains 2 oleanolic acid saponin derivatives, compounds that were first discovered in the family Araliaceae. vietnamensis become one of the most valuable medicinal species in Vietnam (Dong ef al. Other compounds According to Dong ef al.

(2007), the rhizome and lateral root of P. vietnamensis have 7 identified polyacetylene mixtures, which is 5 mixtures that have a confirmed structure with panaxynol and heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol is 2 main polyacetylene and 2 new mixture which 1s heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4,6-diyn-3,10- diol and 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol. Fatty acid: 18 types of fatty acids (acid caprylic, acid capric, acid lauric, acid myristic, acid pentadecausic, acid palmitic, acid palmitoleic, acid heptadecausic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic and acid arachidic).