Tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ sâm Việt Nam (Panax vietnamensis)

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học vietnamese ginseng panax vietnamensis ha et grushv hairy root culture, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyen Nhat Khang
• Người hướng dẫn: Phd. Do Manh Cuong
• Trường học: Nong Lam University-Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Vietnamese Ginseng (Panax Vietnamensis Ha Et Grushv.) Hairy Root Culture-Derived Somatic Embryogenesis
• Loại tài liệu: Undergraduate Thesis
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• DECLARATION
• ABSTRACT
• CONTENTS
• List Of tables
• List Of figures
• 1. CHAPTER 1: OVERVIEW
• 1.1. Background information
• 1.2. Research objectives
• 1.3. Research contents
• 1.4. Classification
• 2. CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. The medicinal value of Panax VietNamensis
• 2.2. Saponins
• 2.3. Other compounds
• 2.4. Application of biotechnology in P. vietnamensis
• 2.5. Transgenic technology in plant
• 2.6. Advantages and potential of transgenic plant in agriculture
• 2.7. Somatic embryogenesis in plant
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Places and duration for conducting eXp©rIIN€TIES
• 3.2. Plant materials
• 3.3. Equipments and tools
• 3.4. Plant cell, tissue and organs culture
• 3.5. Effect of NAA combined with cytokinins (BA, KIN and Adenine) on callus induction OfDalry TOOt
• 3.6. Effect of single cytokinin (BA, KIN and Adenine) or BA combined with auxin (2,4-D and NAA) on somatic embryogenesis from hairy roots-derived
• 3.7. Somatic embryo maturation and transgenic plantlet regeneration
• 3.8. Detection of target genes in regenerated transgenic plantlefs
• 3.9. Observe the surface of somatic embryos by SEM
• 3.10. Statistical analysts
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSIƠN
• 4.1. Effect of NAA combined with cytokinins (Ba or KIN or Adenine) on callus induction of hairy root explants
• 4.2. Effect of single cytokinins (BA, KIN and Adenine) or BA combined with auxin (2,4-D and NAA) on somatic embryogenesis from hairy roots-derived CALLUS
• 4.3. Somatic embryo maturation and transgenic plantlet regeneration
• 4.4. Detection of target genes in regenerated transgenic plantlets.
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• 5.1. CONCLUSIONS
• 5.2. SUGGESTIONS
• REFERENCES
• APPENDIX
• LIST OF ABBREVIATIONS

Tóm tắt

I. Tạo Phôi Soma Sâm Việt Nam Mở Ra Kỷ Nguyên Nhân Giống Mới

Sâm Việt Nam, hay còn gọi là Sâm Ngọc Linh (tên khoa học Panax vietnamensis), được xem là một trong những loài sâm quý hiếm và có giá trị dược liệu cao nhất thế giới. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức cùng với tốc độ sinh trưởng chậm trong tự nhiên đã đẩy loài cây dược liệu quý này đến bờ vực cạn kiệt. Để giải quyết vấn đề này, các phương pháp công nghệ sinh học thực vật hiện đại đã mở ra những hướng đi đột phá, trong đó kỹ thuật tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ nổi lên như một giải pháp đầy hứa hẹn. Phôi soma là những phôi được tạo ra từ tế bào sinh dưỡng (không phải tế bào sinh dục) và có khả năng phát triển thành một cây hoàn chỉnh, mang đặc tính di truyền y hệt cây mẹ. Phương pháp này không chỉ giúp vi nhân giống với số lượng lớn trong thời gian ngắn mà còn là công cụ hữu hiệu để bảo tồn nguồn gen sâm quý hiếm. Quá trình này bắt đầu từ việc tạo ra rễ tơ, một loại rễ đặc biệt được cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, sau đó nuôi cấy để tạo mô sẹo (callus) và từ đó biệt hóa thành phôi soma. Toàn bộ quy trình nuôi cấy in vitro này cho phép kiểm soát chặt chẽ các điều kiện, tạo ra cây giống sạch bệnh và đồng đều về chất lượng, vượt qua những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống.

1.1. Giá trị và thực trạng bảo tồn loài Panax vietnamensis

Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) chứa hàm lượng saponin Sâm Việt Nam (đặc biệt là saponin MR2) cao vượt trội, mang lại các hoạt tính sinh học quý giá như chống oxy hóa, giảm căng thẳng và tăng cường miễn dịch. Tuy nhiên, nguồn cung sâm tự nhiên rất hạn chế do phân bố hẹp (chủ yếu ở vùng núi Ngọc Linh), sinh trưởng chậm (mất hơn 5 năm để thu hoạch) và khả năng tái sinh thấp. Thực trạng này dẫn đến giá thành cao và nguy cơ tuyệt chủng, khiến việc bảo tồn nguồn gen sâm trở thành nhiệm vụ cấp bách. Các phương pháp nhân giống truyền thống bằng hạt hoặc thân rễ không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và mục tiêu bảo tồn.

1.2. Tổng quan về công nghệ phát sinh phôi soma vô tính

Sự phát sinh phôi soma là một quá trình mà tế bào sinh dưỡng, dưới tác động của các điều kiện nuôi cấy thích hợp, tái lập trình và phát triển thành phôi có cấu trúc lưỡng cực (chồi và rễ) tương tự phôi hợp tử. Đây là một kỹ thuật vi nhân giống tiên tiến, cho phép sản xuất hàng loạt phôi vô tính có độ đồng nhất di truyền cao. Ưu điểm của phương pháp này bao gồm hệ số nhân giống lớn, khả năng tự động hóa qua nuôi cấy bioreactor, và tạo ra nguồn cây giống sạch bệnh, không phụ thuộc vào mùa vụ. Đối với các cây dược liệu quý như Sâm Việt Nam, đây là công nghệ chìa khóa để công nghiệp hóa sản xuất giống.

II. Thách Thức Nhân Giống Sâm Việt Nam Vai Trò Của Nuôi Cấy Rễ Tơ

Bài toán nhân giống và bảo tồn Sâm Việt Nam đối mặt với nhiều thách thức cố hữu. Phương pháp gieo hạt truyền thống có tỷ lệ nảy mầm thấp và cây con sinh trưởng rất chậm, dễ bị sâu bệnh tấn công. Việc tách thân rễ để nhân giống lại có hệ số nhân thấp và làm tổn thương cây mẹ. Những rào cản này khiến việc sản xuất Sâm Việt Nam quy mô lớn trở nên bất khả thi, không đáp ứng được nhu cầu dược liệu ngày càng tăng. Trong bối cảnh đó, nuôi cấy rễ tơ (hairy root culture) đã trở thành một công nghệ nền tảng quan trọng. Rễ tơ là hệ thống rễ được tạo ra khi chuyển các gen rol từ plasmid Ri của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen thực vật. Hệ rễ này có đặc tính sinh trưởng mạnh, không cần bổ sung hormone ngoại sinh, ổn định về mặt di truyền và có khả năng sản xuất sinh khối cùng các hợp chất thứ cấp (như ginsenoside) với hiệu suất cao. Việc sử dụng rễ tơ làm vật liệu khởi đầu để tạo phôi soma là một bước tiến mang tính chiến lược, kết hợp ưu điểm của cả hai công nghệ để tạo ra một quy trình nhân giống hoàn chỉnh và hiệu quả.

2.1. Hạn chế của các phương pháp nhân giống sâm truyền thống

Các phương pháp truyền thống gặp nhiều giới hạn. Tỷ lệ nảy mầm của hạt Sâm Việt Nam trong tự nhiên rất thấp và không đồng đều. Cây con cần điều kiện sinh thái đặc thù (độ cao, độ ẩm, bóng râm) để phát triển, khiến việc canh tác trên diện rộng gặp nhiều khó khăn. Kỹ thuật nhân giống vô tính bằng cách tách các mầm trên thân rễ tuy hiệu quả nhưng hệ số nhân rất hạn chế, không thể đáp ứng nhu cầu sản xuất quy mô công nghiệp. Các phương pháp này cũng không giải quyết được vấn đề cây giống nhiễm bệnh, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng dược liệu.

2.2. Nuôi cấy rễ tơ Nền tảng cho việc tạo phôi soma hiệu quả

Nuôi cấy rễ tơ cung cấp một nguồn vật liệu khởi đầu lý tưởng cho sự phát sinh phôi soma. Rễ tơ có tốc độ sinh trưởng nhanh trong môi trường nuôi cấy in vitro, cho phép tạo ra một lượng lớn sinh khối sạch bệnh trong thời gian ngắn. Quan trọng hơn, các tế bào rễ tơ vẫn giữ được toàn tính di truyền và khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Việc sử dụng rễ tơ làm mẫu cấy giúp quy trình ổn định hơn so với việc dùng các bộ phận khác của cây (lá, thân), vốn chịu ảnh hưởng nhiều bởi tuổi và trạng thái sinh lý của cây mẹ. Đây là tiền đề vững chắc cho các bước cảm ứng tạo callus phôi hóa tiếp theo.

III. Phương Pháp Cảm Ứng Mô Sẹo Từ Nuôi Cấy Rễ Tơ Sâm Việt Nam

Giai đoạn đầu tiên và then chốt trong quy trình tạo phôi soma là cảm ứng hình thành mô sẹo (callus) từ rễ tơ. Callus là một khối tế bào chưa biệt hóa, có tiềm năng phát triển thành các cơ quan khác nhau hoặc thành phôi. Hiệu quả của quá trình này phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường nuôi cấy, đặc biệt là sự cân bằng giữa các loại chất điều hòa sinh trưởng (PGRs). Nghiên cứu của Nguyen Nhat Khang (2022) đã chỉ ra rằng môi trường nền SH (Schenk and Hildebrandt) là lựa chọn phù hợp. Để tối ưu hóa việc tạo callus, các thí nghiệm đã khảo sát sự kết hợp giữa auxin (cụ thể là NAA) và cytokinin (BA, KIN, Adenine). Kết quả cho thấy sự tương tác hiệp đồng giữa auxin và cytokinin là yếu tố quyết định. Cụ thể, môi trường tối ưu nhất để cảm ứng tạo callus từ rễ tơ Panax vietnamensis đã được xác định, mở đường cho giai đoạn phát sinh phôi tiếp theo. Đây là bước nền tảng để đảm bảo đủ lượng vật liệu cho quá trình sản xuất sinh khối và biệt hóa phôi.

3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy và nồng độ chất điều hòa

Thành công của việc tạo callus phụ thuộc vào việc lựa chọn đúng môi trường nuôi cấy MS hoặc SH và nồng độ hormone. Theo tài liệu gốc, môi trường nuôi cấy SH được bổ sung 0.5 mg/L NAA kết hợp với các nồng độ khác nhau của cytokinin (BA hoặc KIN) cho kết quả cảm ứng callus tốt. Các tế bào rễ tơ chỉ hình thành callus khi có mặt đồng thời cả auxin và cytokinin, cho thấy vai trò không thể thiếu của hai nhóm hormone này trong việc kích thích sự phân chia tế bào.

3.2. Kết quả tối ưu 100 cảm ứng callus với BA và NAA

Nghiên cứu đã xác định công thức vàng cho việc tạo callus. Kết quả xuất sắc nhất, với tỷ lệ cảm ứng đạt 100% và trọng lượng tươi mẫu cấy cao nhất (4.15 g), được ghi nhận trên môi trường SH có chứa 2.0 mg/L BA kết hợp với 0.5 mg/L NAA sau 6 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp này của chất điều hòa sinh trưởng đã tạo ra một môi trường lý tưởng, kích thích các tế bào rễ tơ phản biệt hóa và tăng sinh mạnh mẽ để tạo thành khối callus phôi hóa chất lượng cao, sẵn sàng cho giai đoạn tiếp theo của quá trình tạo phôi soma.

IV. Hướng Dẫn Quy Trình Tạo Phôi Soma Từ Mô Sẹo Sâm Việt Nam

Sau khi có được nguồn callus chất lượng, bước tiếp theo là cảm ứng sự phát sinh phôi soma. Giai đoạn này đòi hỏi sự điều chỉnh tinh vi về thành phần môi trường để chuyển hướng các tế bào callus từ trạng thái tăng sinh không định hướng sang phát triển có tổ chức thành các cấu trúc phôi. Trong nghiên cứu về tạo phôi soma từ Sâm Việt Nam, các nhà khoa học đã chuyển callus sang môi trường mới với sự điều chỉnh nồng độ hormone. Các thí nghiệm tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của cytokinin đơn lẻ (BA, KIN, Adenine) và sự kết hợp giữa BA với các loại auxin khác nhau (2,4-D, NAA). Kết quả cho thấy việc bổ sung cả auxin và cytokinin vào môi trường cảm ứng phôi mang lại hiệu quả vượt trội so với chỉ sử dụng cytokinin đơn lẻ. Quá trình này không chỉ làm tăng tỷ lệ hình thành phôi mà còn gia tăng đáng kể số lượng phôi trên mỗi cụm callus. Đây là một phát hiện quan trọng, giúp tối ưu hóa hiệu suất của toàn bộ quy trình nuôi cấy tế bào thực vật và vi nhân giống.

4.1. Tác động của BA và 2 4 D đến sự hình thành phôi soma

Kết quả nghiên cứu đã chứng minh sự kết hợp giữa BA và 2,4-D là hiệu quả nhất. Môi trường SH bổ sung 2.0 mg/L BA kết hợp với 1.0 mg/L 2,4-D được xác định là công thức tối ưu cho sự phát sinh phôi soma từ callus có nguồn gốc rễ tơ của Panax vietnamensis. Ở điều kiện này, tỷ lệ tạo phôi đạt mức rất cao và số lượng phôi trung bình lên tới 63.7 phôi trên mỗi mẫu cấy sau 6 tuần. Điều này khẳng định vai trò then chốt của auxin (đặc biệt là 2,4-D) trong việc khởi động quá trình phát sinh phôi.

4.2. Quá trình trưởng thành của phôi và tái sinh cây hoàn chỉnh

Các phôi vô tính sau khi được hình thành sẽ trải qua các giai đoạn phát triển tuần tự: hình cầu, hình tim, hình ngư lôi và giai đoạn lá mầm. Để thúc đẩy quá trình này, các phôi được chuyển sang môi trường SH không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Trong môi trường này, phôi sẽ trưởng thành và nảy mầm tự nhiên để phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Quá trình này mô phỏng sự phát triển của phôi trong tự nhiên, đảm bảo cây con có đầy đủ cấu trúc rễ, thân, lá và sẵn sàng cho giai đoạn vườn ươm.

V. Kết Quả Đột Phá Cây Sâm Việt Nam Chuyển Gen Từ Phôi Soma

Thành công của quy trình tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ không chỉ dừng lại ở việc tạo ra cây con mà còn ở việc xác nhận bản chất chuyển gen của chúng. Vì vật liệu ban đầu là rễ tơ cảm ứng bởi Agrobacterium rhizogenes, các cây con tái sinh từ phôi soma được kỳ vọng sẽ mang đoạn T-DNA của plasmid Ri trong bộ gen của chúng. Điều này có ý nghĩa quan trọng, vì các gen trên T-DNA (như các gen rol) có thể ảnh hưởng tích cực đến hình thái và khả năng sản xuất các hợp chất sinh học của cây. Để xác minh điều này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để kiểm tra sự hiện diện của các gen mục tiêu trong các cây con tái sinh. Kết quả đã khẳng định rằng các cây Sâm Việt Nam được tạo ra qua con đường phôi soma vẫn giữ lại các gen chuyển, mở ra tiềm năng tạo ra các dòng sâm mới có đặc tính nông học và dược học ưu việt. Đây là minh chứng rõ ràng cho hiệu quả của việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến cây dược liệu quý.

5.1. Xác nhận sự hiện diện của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Phản ứng chuỗi Polymerase) được sử dụng để phát hiện các gen rolA, rolB, rolC và aux1, vốn nằm trên đoạn Ri T-DNA đã được chuyển vào bộ gen của cây. Kết quả phân tích điện di cho thấy các vạch DNA có kích thước tương ứng với các gen mục tiêu đã xuất hiện ở cây tái sinh từ phôi soma, tương tự như mẫu đối chứng dương (DNA plasmid của vi khuẩn) và không xuất hiện ở cây đối chứng âm (cây không chuyển gen). Điều này chứng tỏ các cây con là cây chuyển gen thực sự và đã tích hợp thành công các gen từ Agrobacterium rhizogenes.

5.2. Đặc điểm hình thái và ưu điểm của cây Sâm chuyển gen

Về mặt hình thái, cây Panax vietnamensis chuyển gen tái sinh từ phôi soma không có sự khác biệt đáng kể so với cây không chuyển gen. Tuy nhiên, một đặc điểm nổi bật được ghi nhận là hệ thống rễ của cây chuyển gen phát triển tốt hơn rất nhiều. Đây là biểu hiện đặc trưng của "hội chứng rễ tơ" (hairy root syndrome) do sự hoạt động của các gen rol. Hệ rễ khỏe mạnh hơn là một lợi thế lớn, giúp cây con dễ dàng thích nghi khi chuyển ra điều kiện vườn ươm và có khả năng hấp thụ dinh dưỡng tốt hơn, hứa hẹn tiềm năng nâng cao sản lượng saponin Sâm Việt Nam.

VI. Tương Lai Sâm Việt Nam Với Công Nghệ Phôi Soma Từ Rễ Tơ

Nghiên cứu về tạo phôi soma từ nuôi cấy rễ tơ Sâm Việt Nam đã đặt một nền móng vững chắc cho việc bảo tồn và phát triển bền vững loài dược liệu quốc bảo này. Công nghệ này không chỉ cung cấp một phương pháp vi nhân giống hiệu quả để sản xuất cây giống quy mô lớn, sạch bệnh mà còn mở ra cơ hội cải tiến di truyền. Những cây chuyển gen thu được có thể là nguồn vật liệu quý giá cho các chương trình chọn tạo giống Sâm Việt Nam trong tương lai, hướng tới các dòng có năng suất sinh khối cao hơn và hàm lượng hoạt chất ginsenoside được cải thiện. Tuy nhiên, vẫn còn một số thách thức cần được giải quyết, bao gồm việc tối ưu hóa tỷ lệ cây sống sau khi chuyển ra vườn ươm và đánh giá sự ổn định biểu hiện của các gen chuyển qua nhiều thế hệ. Dù vậy, những kết quả ban đầu là vô cùng hứa hẹn, khẳng định vai trò tiên phong của công nghệ sinh học thực vật trong việc khai thác và phát triển bền vững nguồn tài nguyên dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đặc biệt là trong nuôi cấy bioreactor để sản xuất dược chất.

6.1. Tóm tắt thành tựu và ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu đã xây dựng thành công một quy trình hoàn chỉnh để tái sinh cây Panax vietnamensis chuyển gen thông qua con đường phát sinh phôi soma từ rễ tơ. Thành tựu này có ý nghĩa to lớn trong việc bảo tồn nguồn gen sâm, cung cấp giải pháp nhân giống nhanh, hiệu quả, đáp ứng nhu cầu về cây giống chất lượng cao. Nó cũng mở ra tiềm năng sản xuất các hợp chất thứ cấp trực tiếp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ hoặc từ các cây chuyển gen có năng suất cao.

6.2. Hướng nghiên cứu và phát triển công nghệ trong tương lai

Các hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc đánh giá khả năng thích nghi của cây chuyển gen trong điều kiện nhà kính và ngoài thực địa. Đồng thời, cần phân tích, so sánh hàm lượng saponin Sâm Việt Nam giữa cây chuyển gen và cây thường để xác định hiệu quả cải tiến. Ngoài ra, việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy dịch huyền phù tế bào và nuôi cấy trong bioreactor từ phôi soma hoặc rễ tơ sẽ là bước đi quan trọng để tiến tới sản xuất các hợp chất dược liệu ở quy mô công nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv., 1985), hay còn gọi là sâm Ngọc Linh, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), là một trong những loài dược liệu đặc hữu quý hiếm của Việt Nam và được xếp vào nhóm năm loài sâm hàng đầu thế giới. Loài thực vật này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 ở độ cao 1.800 m so với mực nước biển trên núi Ngọc Linh, thuộc dãy Trường Sơn trải dài qua bốn tỉnh Kon Tum, Quảng Nam, Quảng Ngãi và Gia Lai, nơi có độ che phủ rừng trên 80%, nhiệt độ trung bình từ 15 đến 18,5°C cùng độ ẩm và lượng mưa cao. Về mặt hóa sinh thực vật, sâm Việt Nam chứa 52 hợp chất saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc, trong đó phần thân rễ và rễ củ ngầm chứa 26 saponin đã biết cùng 26 saponin cấu trúc mới (được định danh là vina-ginsenoside-R1 đến R24 và 20-O-Me-G-Rh1). Đáng chú ý, hàm lượng saponin nhóm dammarane chiếm 12 - 15% và majonoside-R2 (MR2) chiếm tới 50% tổng lượng saponin, mang lại hoạt tính sinh học cao gấp 48 lần so với một số loài sâm khác. Ngoài ra, loài này còn chứa 2 dẫn xuất saponin của axit oleanolic, 7 hợp chất polyacetylene (tiêu biểu là panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol), 18 loại axit béo, 18 loại axit amin và 20 nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng.

Tuy nhiên, nguồn cung sâm Việt Nam ngoài tự nhiên rất hạn chế do vùng phân bố hẹp, tốc độ sinh trưởng chậm (cần hơn 5 năm nuôi trồng mới có thể thu hoạch) và khả năng tái sinh tự nhiên thấp, dẫn đến tình trạng khan hiếm và giá thành rất cao. Sâm Việt Nam đã được đưa vào Sách Đỏ IUCN Việt Nam với quy định nghiêm cấm khai thác tự nhiên. Để giải quyết vấn đề sinh khối và bảo tồn, công nghệ chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mang plasmid Ri (Root-inducing) đã được ứng dụng để tạo rễ tơ (hairy root). Rễ tơ sâm Việt Nam có ưu điểm sinh trưởng nhanh trong điều kiện in vitro mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, duy trì tính ổn định di truyền và có khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp với hàm lượng cao. Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã cảm ứng thành công rễ tơ, việc tái sinh hoàn chỉnh cây sâm Việt Nam chuyển gen từ mô rễ tơ thông qua con đường phát sinh phôi soma vẫn chưa được thực hiện.

Khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau:

1. Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGRs) tối ưu cho quá trình cảm ứng tạo mô sẹo (callus induction) từ rễ tơ sâm Việt Nam.
2. Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật tối ưu cho quá trình phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis) từ mô sẹo có nguồn gốc rễ tơ.
3. Xác định sự hiện diện và tích hợp của các gen chuyển mục tiêu trong hệ gen của cây con Panax vietnamensis chuyển gen tái sinh từ rễ tơ.

Nhiệm vụ nghiên cứu bao gồm:

1. Khảo sát ảnh hưởng của auxin NAA kết hợp với các cytokinins (BA, KIN, Adenine) ở các nồng độ khác nhau lên sự tạo mô sẹo từ đoạn rễ tơ.
2. Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin đơn lẻ (BA, KIN, Adenine) hoặc BA kết hợp với auxin (2,4-D, NAA) lên sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo nguồn gốc rễ tơ.
3. Tái sinh cây con chuyển gen hoàn chỉnh từ phôi soma và sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các gen chuyển rolA, rolB, rolC, aux1 cùng việc kiểm tra gen virD2 nhằm xác nhận tính sạch khuẩn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Dòng rễ tơ HR2 của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) hình thành từ quá trình lây nhiễm mô sẹo với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 02/2022 đến tháng 02/2023.
• Phạm vi không gian: Các thí nghiệm nuôi cấy mô và cơ quan tế bào thực vật được thực hiện tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống thực vật - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên (TP. Đà Lạt, Lâm Đồng); các phân tích sinh học phân tử được thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM (TP. Thủ Đức, TP.HCM); việc chụp ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) được thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (Hà Nội).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của nghiên cứu dựa trên các nguyên lý chuyển gen thực vật nhờ Agrobacterium rhizogenes và cơ chế phát sinh phôi soma in vitro:

• Cơ chế chuyển gen bằng plasmid Ri: Chủng vi khuẩn A. rhizogenes chuyển các đoạn T-DNA (gồm TL-DNA chứa các gen rolA, rolB, rolC, rolD điều khiển quá trình hình thành rễ tơ và TR-DNA chứa các gen aux1, aux2 kiểm soát sinh tổng hợp auxin nội sinh) tích hợp vào hệ gen của tế bào chủ, tạo ra rễ tơ có khả năng phân nhánh mạnh và sinh trưởng độc lập.
• Con đường phát sinh phôi soma gián tiếp: Các tế bào mô sẹo chuyển hóa ngược thành tế bào phôi mang tính toàn năng, phát triển thành cấu trúc lưỡng cực (gồm cực chồi và cực rễ) trải qua các giai đoạn tương tự phôi hợp tử: dạng cầu (globular), dạng tim (heart), dạng thủy lôi (torpedo), dạng lá mầm (cotyledon) và nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh.
• Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng: Sự cân bằng giữa auxin (NAA, 2,4-D tác động lên sự phân chia tế bào, tái lập tính phôi và sự phân cực) và cytokinin (BA, KIN, Adenine thúc đẩy phân chia tế bào chất, cảm ứng phân hóa chồi) đóng vai trò quyết định hướng phát triển hình thái của mô cấy.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Nuôi cấy mô và tế bào thực vật:
  • Môi trường cơ bản: Môi trường khoáng Schenk and Hildebrandt (SH, 1972) bổ sung 30 g/L sucrose, 8 g/L agar, điều chỉnh pH = 5,8 và khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 15 phút.
  • Thí nghiệm tạo mô sẹo (MT1): Mẫu rễ tơ dòng HR2 (đường kính 0,1 cm, cắt thành đoạn dài 1,0 cm) được cấy trên môi trường SH bổ sung 0,5 mg/L NAA kết hợp với BA, KIN hoặc Adenine ở các dải nồng độ từ 0,5 đến 2,5 mg/L; đối chứng là môi trường SH không bổ sung PGRs. Thời gian nuôi cấy là 6 tuần.
  • Thí nghiệm phát sinh phôi soma đơn cytokinin (MT2): Cụm mô sẹo (khối lượng 1,0 g) được cấy trên môi trường SH bổ sung BA, KIN hoặc Adenine đơn lẻ (0,5 - 2,5 mg/L) trong 6 tuần.
  • Thí nghiệm phát sinh phôi soma kết hợp auxin - cytokinin (MT3): Cụm mô sẹo được cấy trên môi trường SH bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp với 2,4-D (0,5 - 2,5 mg/L) hoặc NAA (0,5 - 2,5 mg/L) trong 6 tuần.
  • Thành thục phôi và tái sinh cây (MT4): Các phôi soma hình thành được chuyển sang môi trường SH không bổ sinh chất điều hòa sinh trưởng (PGR-free) để phát triển thành cây con hoàn chỉnh.
  • Điều kiện phòng nuôi cấy: Nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 55 - 60%, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang với cường độ 40 - 45 µmol/m²/s.
• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) theo quy trình của Doyle (1987).
  • Kỹ thuật PCR: Sử dụng hệ thống máy luân nhiệt Thermal Cycler Bioer (T100, Bio-Rad) với các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại các gen rolA (kích thước sản phẩm 239 bp), rolB (393 bp), rolC (600 bp), aux1 (900 bp) và gen kiểm tra vi khuẩn tồn dư virD2 (338 bp). Đối chứng dương là DNA plasmid của A. rhizogenes ATCC 15834; đối chứng âm là DNA cây sâm Việt Nam không chuyển gen in vitro. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose.
• Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM): Mẫu phôi ở các giai đoạn được cố định trong dung dịch paraformaldehyde 4% qua đêm ở 4°C, rửa ba lần bằng đệm natri photphat 25 mM (pH = 7), khử nước bằng thang cồn từ 10% đến cồn tuyệt đối, làm khô tới hạn bằng CO2, gắn lên giá nhôm, phủ lớp kim loại Palladium dày 60 nm và quan sát hình thái bề mặt trên kính hiển vi FE-SEM S4800.
• Xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần (10 bình nuôi cấy dung tích 250 mL cho mỗi nghiệm thức), xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 và kiểm tra sai khác trung bình bằng kiểm định khoảng đa biến LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa p < 0,05.

Nội dung chính theo từng chương

CHAPTER 1: OVERVIEW

Chương này giới thiệu bối cảnh chung về vị thế của sâm Việt Nam trong ngành dược liệu, phân tích các rào cản về sinh trưởng chậm và phân bố tự nhiên hạn chế. Tác giả đặt ra tính cấp thiết của việc áp dụng công nghệ chuyển gen qua vi khuẩn A. rhizogenes để tạo rễ tơ và xác định khoảng trống nghiên cứu trong việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ nguồn vật liệu này. Chương 1 xác lập rõ ràng 3 mục tiêu nghiên cứu và 3 nội dung thực nghiệm chính của đề tài.

CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW

Chương tổng quan tài liệu hệ thống hóa các kiến thức học thuật chuyên sâu:

• Phân loại thực vật học: Vị trí của Panax vietnamensis trong giới Thực vật (Plantae), bộ Hoa tán (Apiales), họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Sâm (Panax), phát hiện năm 1973 và được công bố chính thức tại Viện Thực vật Komarov.
• Giá trị dược liệu: Tổng hợp cấu trúc hóa học và hàm lượng của các saponin nhóm dammarane (đặc biệt là majonoside-R2), các polyacetylene (panaxynol, heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol), 18 axit béo, 18 axit amin và 20 khoáng chất.
• Ứng dụng công nghệ sinh học trên sâm Việt Nam: Tổng kết các công trình vi nhân giống in vitro, nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL), tác động của ánh sáng đơn sắc/LED lên tích lũy saponin, nuôi cấy rễ bất định và kỹ thuật chuyển gen tạo rễ tơ bằng A. rhizogenes.
• Công nghệ chuyển gen và phát sinh phôi soma ở thực vật: Phân tích cơ chế chuyển gen qua trung gian vi khuẩn và súng bắn gen; ưu thế của phôi soma so với lai hữu tính; phân tích cơ chế phân cực tế bào của auxin thông qua hệ protein vận chuyển PINs và cơ chế kích thích phân bào của cytokinins.

CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS

Chương 3 mô tả chuẩn hóa toàn bộ vật liệu nghiên cứu (dòng rễ tơ HR2), trang thiết bị phòng thí nghiệm (máy PCR Bioer T100, tủ sấy Memmert/Sanyo, cân phân tích Precisa, kính hiển vi FE-SEM S4800) và thành phần các môi trường nuôi cấy (MT1, MT2, MT3, MT4). Chương này trình bày chi tiết trình tự mồi oligonucleotide, nhiệt độ bắt mồi và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR của từng gen:

Tên mồi	Chiều mồi	Trình tự nucleotide (5' - 3')	Kích thước sản phẩm (bp)	Nhiệt độ gắn mồi (°C)
rolA	Xuôi Ngược	5'-GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG-3' 5'-TGCGTATTAATCCCGTAGGTC-3'	239	60
rolB	Xuôi Ngược	5'-AAAGTATGCTACCATTCCCCA-3' 5'-CCCATAAGCCACGACATCATA-3'	393	61
rolC	Xuôi Ngược	5'-CATTAGCCGATTGCAAACTTG-3' 5'-ATGGCTGAAGACGACCTG-3'	600	58
aux1	Xuôi Ngược	5'-CCAAGCTTGTCAGAAAACTTCAGGG-3' 5'-CCGGATCCAATACCCAGCGCTTT-3'	900	61
virD2	Xuôi Ngược	5'-ATGCCCGAATCGAGCTCAAG-3' 5'-GACCCAAACATCTCGGCTG-3'	338	62

Chương cũng quy định chi tiết quy trình xử lý mẫu chụp SEM qua thang cồn và phương pháp phân tích thống kê trên phần mềm SPSS 16.0.

CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION

Chương 4 trình bày và thảo luận các kết quả đạt được qua 4 phần nội dung:

• Cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn rễ tơ: Mô sẹo chỉ hình thành trên môi trường có bổ sung kết hợp auxin và cytokinin; môi trường đối chứng không có PGRs không tạo được mô sẹo. Nồng độ cytokinin tăng làm tăng tỷ lệ tạo sẹo. Tổ hợp môi trường SH bổ sung 0,5 mg/L NAA kết hợp 2,0 mg/L BA cho kết quả tối ưu nhất với tỷ lệ tạo sẹo đạt 100% và khối lượng tươi đạt cực đại 4,15 g sau 6 tuần.
• Phát sinh phôi soma từ mô sẹo:
  • Nghiệm thức cytokinin đơn lẻ: BA cho hiệu quả cao hơn KIN và Adenine. Nghiệm thức 2,0 mg/L BA đạt tỷ lệ phôi 100% và số phôi trung bình cao nhất là 30 phôi/mẫu. Adenine cho tỷ lệ tạo phôi tối đa 96,7% và số lượng phôi thấp hơn.
  • Nghiệm thức BA kết hợp auxin: Việc kết hợp 2,0 mg/L BA với 2,4-D nâng cao đáng kể số lượng phôi so với BA đơn lẻ hoặc BA kết hợp NAA. Môi trường SH bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L 2,4-D là môi trường tối ưu nhất, đạt tỷ lệ phát sinh phôi 100% và số phôi trung bình đạt 63,7 phôi/mẫu sau 6 tuần.
• Sự thành thục của phôi và tái sinh cây con: Khi cấy phôi lên môi trường SH không chứa PGRs, phôi phát triển tuần tự qua các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình thủy lôi, hình lá mầm và tái sinh thành cây con hoàn chỉnh. Sau 12 tuần, cây con đạt chiều cao 2,0 cm được tách cấy. Cây con chuyển gen có hình thái thân lá tương đồng với cây đối chứng không chuyển gen nhưng hệ rễ phát triển mạnh vượt trội (biểu hiện của hội chứng rễ tơ do Ri plasmid quy định).
• Phân tích gen chuyển bằng PCR: Kết quả điện di gel agarose xác nhận sự hiện diện rõ ràng của các băng DNA kích thước 239 bp (rolA), 393 bp (rolB), 600 bp (rolC) và 900 bp (aux1) ở cây tái sinh, trùng khớp với đối chứng dương. Không xuất hiện băng gen virD2 (338 bp) ở cây tái sinh, chứng minh mô cây hoàn toàn sạch khuẩn Agrobacterium rhizogenes.

CHAPTER 5: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS

Chương 5 tóm tắt các kết luận cốt lõi về môi trường tối ưu cho tạo mô sẹo, tạo phôi soma và tính ổn định di truyền của cây tái sinh; đồng thời đưa ra các đề xuất về việc tiếp tục đánh giá cây chuyển gen trong điều kiện nhà kính và phân tích hàm lượng saponin.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu được các kết quả định lượng cụ thể qua từng giai đoạn nuôi cấy và phân tích phân tử:

Giai đoạn nuôi cấy	Thành phần môi trường tối ưu	Tỷ lệ cảm ứng (%)	Chỉ tiêu định lượng sau nuôi cấy
Cảm ứng tạo mô sẹo	SH + 0,5 mg/L NAA + 2,0 mg/L BA	100%	Khối lượng tươi mẫu cấy đạt 4,15 g (sau 6 tuần)
Phát sinh phôi soma	SH + 2,0 mg/L BA + 1,0 mg/L 2,4-D	100%	Số lượng phôi đạt 63,7 phôi/mẫu cấy (sau 6 tuần)
Tái sinh cây con	SH không bổ sung PGRs (PGR-free)	-	Cây con đạt chiều cao 2,0 cm sau 12 tuần, rễ phát triển mạnh
Kiểm tra sinh học phân tử	Phản ứng PCR mồi đặc hiệu	-	Dương tính với rolA (239 bp), rolB (393 bp), rolC (600 bp), aux1 (900 bp); Âm tính với virD2 (338 bp)

Đóng góp của khóa luận:

• Xây dựng thành công quy trình in vitro hoàn chỉnh để tái sinh cây sâm Việt Nam chuyển gen từ mô sẹo rễ tơ thông qua con đường phát sinh phôi soma gián tiếp.
• Xác định được sự tương tác hiệp đồng giữa BA và 2,4-D trong việc thúc đẩy số lượng phôi soma vượt trội so với các nghiệm thức cytokinin đơn lẻ hoặc tổ hợp BA với NAA.
• Cung cấp bằng chứng sinh học phân tử khẳng định các gen chuyển từ Ri plasmid (rolA, rolB, rolC, aux1) đã tích hợp ổn định vào hệ gen của cây sâm tái sinh, đồng thời loại trừ được sự tồn dư của vi khuẩn chuyển gen bằng kiểm chứng gen virD2.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế:

• Nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở phạm vi đánh giá sự phát triển in vitro và kiểm tra gen chuyển ở mức độ phân tử, chưa tiến hành thử nghiệm đưa cây ra vườn ươm hoặc nhà kính.
• Chưa tiến hành phân tích định tính và định lượng thành phần các saponin đặc hữu tích lũy trong cây chuyển gen tái sinh.

Hướng nghiên cứu tiếp do tác giả đề xuất:

1. Đánh giá khả năng sinh trưởng, tỷ lệ sống và sự thích nghi (acclimatization) của các cây con Panax vietnamensis chuyển gen trong điều kiện nhà kính.
2. Đánh giá năng suất và hàm lượng sinh tổng hợp các hợp chất saponin ở cây sâm Việt Nam chuyển gen sau quá trình nuôi trồng.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận này hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ sinh học thực vật, Di truyền học, Nuôi cấy mô tế bào và Dược học.
• Tham khảo trực tiếp công thức phối hợp chất điều hòa sinh trưởng (NAA, 2,4-D, BA, KIN, Adenine) trên nền môi trường SH trong kỹ thuật nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh.
• Tham khảo quy trình kỹ thuật khuếch đại PCR với các cặp mồi đặc hiệu để kiểm định sự tích hợp của Ri T-DNA (rolA, rolB, rolC, aux1) và kiểm tra sạch khuẩn (virD2).
• Tham khảo phương pháp cố định và chuẩn bị mẫu mô sẹo, phôi soma sấy khô điểm tới hạn phục vụ phân tích hình thái bề mặt bằng kính hiển vi điện tử quét (FE-SEM).

Câu hỏi thường gặp

1. Vật liệu rễ tơ ban đầu được sử dụng trong đề tài có nguồn gốc từ đâu?
Vật liệu ban đầu là dòng rễ tơ HR2 của sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), được tạo ra từ quá trình lây nhiễm mô sẹo sâm với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834, do Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống thực vật - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên cung cấp.

2. Công thức môi trường nào tối ưu nhất cho sự hình thành mô sẹo từ đoạn rễ tơ sâm Việt Nam?
Môi trường tối ưu cho sự tạo mô sẹo là môi trường SH bổ sung 30 g/L sucrose, 8 g/L agar, 0,5 mg/L NAA kết hợp với 2,0 mg/L BA, cho tỷ lệ cảm ứng mô sẹo đạt 100% và khối lượng tươi mẫu cấy đạt 4,15 g sau 6 tuần nuôi cấy.

3. Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng nào thúc đẩy số lượng phôi soma cao nhất từ mô sẹo rễ tơ?
Môi trường SH bổ sung 2,0 mg/L BA kết hợp với 1,0 mg/L 2,4-D cho hiệu quả phát sinh phôi soma cao nhất, đạt tỷ lệ tạo phôi 100% và số phôi trung bình đạt 63,7 phôi/mẫu cấy sau 6 tuần.

4. Kỹ thuật PCR đã phát hiện những gen chuyển nào trong cây tái sinh và kích thước sản phẩm là bao nhiêu?
Phản ứng PCR đã khuếch đại thành công 4 gen chuyển từ Ri T-DNA bao gồm rolA (239 bp), rolB (393 bp), rolC (600 bp) và aux1 (900 bp).

5. Việc kiểm tra gen virD2 bằng PCR nhằm mục đích gì trong nghiên cứu?
Gen virD2 (kích thước sản phẩm 338 bp) nằm ngoài vùng T-DNA của plasmid Ri. Việc kiểm tra gen này nhằm chứng minh cây tái sinh không xuất hiện vạch khuếch đại virD2, từ đó xác nhận mô cây thực vật hoàn toàn sạch vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tồn dư sau chuyển gen.

Kết luận

Khóa luận đã xây dựng thành công quy trình tái sinh cây sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) chuyển gen từ mô sẹo rễ tơ thông qua con đường phát sinh phôi soma. Nghiên cứu đã xác định được công thức môi trường tối ưu cho từng giai đoạn cảm ứng mô sẹo (SH + 0,5 mg/L NAA + 2,0 mg/L BA) và tạo phôi soma (SH + 2,0 mg/L BA + 1,0 mg/L 2,4-D). Các phân tích sinh học phân tử bằng PCR đã xác nhận sự tích hợp ổn định của các gen rolA, rolB, rolC, aux1 trong hệ gen cây tái sinh và đảm bảo độ sạch khuẩn chuyển gen. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học và quy trình kỹ thuật nền tảng phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và phát triển giống sâm Việt Nam cho ngành công nghiệp dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES VIETNAMESE GINSENG (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) HAIRY ROOT CULTURE-DERIVED SOMATIC EMBRYOGENESIS Major : BIOTECHNOLOGY Student : NGUYEN NHAT KHANG ID : 18126227 School year =: 2018 - 2022 Thu Duc City, 03/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS VIETNAMESE GINSENG (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) HAIRY ROOT CULTURE-DERIVED SOMATIC EMBRYOGENESIS Supervisors Student PhD. Do Manh Cuong Nguyen Nhat Khang MSc. Hoang Dac Khai Thu Duc city, 03/2023 ACKNOWLEDGEMENT To complete this thesis, I would like to express my special thanks and gratitude to my supervisors PhD. Do Manh Cuong and MSc.

Hoang Dac Khai, especially Prof. Duong Tan Nhut who gave me the opportunity to do this thesis which also helped me in doing a lot of experiment. I am really thankful to them. Secondly, I would like to thank the teachers of Faculty of biological sciences- Nong Lam university and the members of the Department of molecular biology and plant breeding who helped me in finishing this thesis in a limited time.

It really helped me increase my knowledge and skills. Finally, I would like to thank the financial support of the Department of molecular biology and plant breeding under grant number NCXS01.03/22-24 DECLARATION My name is Nguyen Nhat Khang, ID: 18126227, Class: DH18SHC of Biotechnology major, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. All data in this thesis are my and our research group under funding of project with grant number “NCXS01.03/22-24” of Vietnam Academy of Sciencs and Technology. This thesis's results were used as a part of the work "Efficient transgenic plantlet regeneration from hairy roots via somatic embryogenesis and hardening plantlets of Panax vietnamensis by iron nanoparticles-supplied culture" that published in 2022, in which I am the co-author.

I fully responsible to the board for these commitments. Thu Duc, Monday, 6th February 2023 Student NGUYEN NHAT KHANG ABSTRACT In this study, the plantlet regeneration of Panax vietnamensis via somatic embryogenesis derived from hairy root callus was investigated. The results showed that the maximum callus induction (100%) and explant fresh weight (4.15 g) were recorded on the SH medium supplemented with 2.0 mg/L BA in combination with 0.5 mg/L NAA and 30 g/L sucrose after 6 weeks of culture. Callus was transferred to SH medium containing 1.0 mg/L BA for somatic embryogenesis.

The somatic embryogenesis was 100%, and the average number of embryos was 63.7 embryos after 6 weeks of culture on SH medium containing 1. Then, the somatic embryos were transferred to the plant growth regulators-free SH medium for the maturation. They developed progressively through the globular, heart, torpedo, cotyledon stages, and finally formed plantlets. The plantlets derived from hairy roots retained the Ri T-DNA was revealed by PCR analysis.

The morphology of these plantlets were not different from the non-transformed plantlets as a control, but the root growth was better. Keywords: Agrobacterium rhizogenes, rhizome proliferation, somatic embryogenesis callus CONTENTS Page ANCRTTOWILEA S CHIBI NGA cans ốnốớố.ốaố cố ốc Cố CO CỐ 1 Declaration of authorSlIpD. - --- - 22 2222221223 1231151 1231153123111 12111111211 111111 1x ray ul TAN thờ Cl Ieee arian OES renee re re ne Tee ere etre Rarer ROT eer eM Nene mene ere nee? 11 COHÍẾH [Ss xssgigsgsesosg16116154758183103041606100310438314445381453353381543653935915E83813155403913 3985303501504 IV List Of 1a1) 2211010. Sẽ ẽnốốốố ốc VI DE TSEO LADIES is.

“Số CC cÔ VI List Of figures. Vill CHAPTER J) OVER VIEW seccacensee ne eeeemare eee | Lal. Backs rotiid 21 ott OB excesses eeecou sacra coun crease nian suey SUS2. IRESCGT Cl CONTESTS wc scssonsssevenasacesesse 800G613800-3084/00486G22368E ast 560038.3838110408 2 CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW.

Ặ ST SH re, 3 Dali FP ONOK VICINOINCNSIS accusers tặgnhgi4gì02)Ag13S08880011Q83§tSgE230835⁄G;SG8N2NGS289ES22IGGXN8E9/SGU85gt2S0kmidiog 3 Ds lạc La C855IHEBEDÏsssseeseesnbtisss4214363111455135585E0101985SS1/460150000%03/391013330161102102303% 3 2. The medicinal value of Panax VietNAMeNSis .120: SAPONINS a cacescanscsssanasemacaxeam mmm mate eR 3 J8 QUIET COM POUT S x"n. Application of biotechnology on Panax Vi€f@I1€HSỈS. Transgenic technology in pÏATIE.

Advantages and potential of transgenic plant in agriculfure. Somatic embryogenesis in pÏaTI(. krrke 7 2:2: SODMALC omDEVODGTICSS ssscc erence sea G0 4 016196:363610168 810 8p339360310SH98SDEGBA1Si0130300988150. Advantage and potential of somatic embryogenesis.

Some factors effect on somatic embryogenesis .