Tổng quan luận án
Công trình nghiên cứu mang tên "Nghiên cứu đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae ở Mường Phăng - Điện Biên và Cúc Phương - Ninh Bình" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Đỗ Đức Quế, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Vương Trọng Hào và Dương Minh Lam, thuộc chuyên ngành Vi sinh vật học (mã số: 62.07), bảo vệ tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào năm 2014.
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Trong giới nấm (Fungi), tổng số loài trên Trái Đất được ước tính vào khoảng 1,5 triệu loài, nhưng thực tế số lượng loài đã được phát hiện và công bố mới đạt khoảng 100.000 loài (tương đương gần 6,7% so với ước tính). Ngành nấm túi (Ascomycota) chiếm hơn 50% tổng số loài nấm hiện biết, trong đó Xylariaceae là họ có số lượng loài lớn nhất, với 95 chi và 1354 loài được công nhận trên phạm vi toàn cầu tính đến năm 2013. Tại khu vực châu Á và Đông Nam Á, các nghiên cứu đã ghi nhận 154 loài thuộc 23 chi ở Thái Lan và 136 loài thuộc 17–19 chi ở Đài Loan.
Tại Việt Nam, trước thời điểm luận án được thực hiện, các công bố về họ Xylariaceae còn mang tính đơn lẻ, phân tán và mới chỉ thống kê được 69 loài thuộc 13 chi (theo tổng hợp của Trịnh Tam Kiệt năm 2012). Chưa có một công trình nào nghiên cứu có tính hệ thống và toàn diện về thành phần loài, phân loại hình thái, quan hệ di truyền phân tử cũng như thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của họ nấm này. Hai khu vực Rừng nguyên sinh Mường Phăng (tỉnh Điện Biên) và Vườn Quốc gia Cúc Phương (tỉnh Ninh Bình) là hai hệ sinh thái rừng nhiệt đới được bảo tồn nghiêm ngặt, tuy cùng nằm trong vành đai nhiệt đới gió mùa nhưng bị phân tách bởi dãy Hoàng Liên Sơn, dẫn tới sự khác biệt rõ rệt về địa chất, khí hậu và sinh thái. Mặc dù tiềm năng đa dạng sinh học nấm ở hai khu vực này rất cao, các ghi nhận khoa học trước đây về nấm túi họ Xylariaceae tại đây còn rất hạn chế, chưa phản ánh đúng mức độ phong phú và giá trị sinh học của khu hệ. Do đó, việc thực hiện đề tài là cần thiết nhằm bổ sung cơ sở dữ liệu phân loại học và định hướng ứng dụng thực tiễn.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định hai mục đích chính:
- Xác định được thành phần loài và đánh giá đa dạng sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu.
- Nghiên cứu được một số đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu.
Để hoàn thành các mục đích trên, các nội dung nghiên cứu cụ thể được phân định như sau:
- Xác định thành phần loài nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu: Định loại đến chi, đến loài các mẫu nấm đã được miêu tả dựa vào đặc điểm hình thái và phân tích trình tự vùng gen ITS rDNA.
- Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu.
- Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các chi, các loài nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu.
- Nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài nấm và hoạt tính sinh học của chúng.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu nấm túi thuộc họ Xylariaceae.
- Phạm vi không gian: Rừng nguyên sinh Mường Phăng (huyện Điện Biên, tỉnh Điện Biên) và Vườn Quốc gia Cúc Phương (tỉnh Ninh Bình).
- Phạm vi nội dung: Thu thập mẫu thể quả thực địa, phân tích đặc điểm hình thái vi học và đại thể, giải mã trình tự phân tử đoạn ITS rDNA, tính toán các chỉ số sinh thái học quần xã, phân lập - xác định cấu trúc các hợp chất hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học invitro (hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng vi sinh vật kiểm định).
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Lịch sử nghiên cứu phân loại họ Xylariaceae trên thế giới
Họ Xylariaceae ban đầu được xếp trong họ Clavariaceae với loài đặc trưng Clavaria hypoxylon. Đến năm 1863, Tulasne và Tulasne tách các loài này thành một họ riêng với tên ban đầu là "Xylariei". Trải qua lịch sử phân loại, vị trí họ Xylariaceae luôn giữ được tính độc lập nhờ các đặc điểm cấu trúc hiển vi ổn định: túi bào tử hình trụ chứa 8 bào tử, đỉnh túi bắt màu xanh với thuốc nhuộm Melzer’s, bào tử túi có rãnh mầm và bị tách vỏ trong dung dịch KOH 10%.
Giai đoạn 1967–1970, Martin công bố 8 công trình xây dựng khóa định loại cho 8 chi (Xylaria, Daldinia, Numulariola, Euhypoxylon, Papillata, Hypoxylon, Rosellinia, Entoleuca). Hawksworth (1977) thành lập chi Rhopalostroma. Pouzar (1979) tách một số loài từ Nummularia để lập chi Biscogniauxia, và năm 1985 lập chi Nemania dựa trên đặc điểm đỉnh túi bào tử hình trụ. Thập niên 1990 và đầu thế kỷ XXI ghi nhận các công trình phân loại của Ju và Rogers: định loại 128 loài Hypoxylon (1996), tách nhóm Annulata thành chi Annulohypoxylon (2005), chỉnh lý chi Daldinia (1997), thiết lập chi Stilbohypoxylon (1997), phân loại chi Kretzschmaria (1998), chi Biscogniauxia (1998), chi Nemania (2002); Petrini (2005) định loại 90 loài chi Rosellinia.
Số lượng chi trong họ Xylariaceae tăng dần qua các hệ thống phân loại: Eriksson & Hawksworth (1993) ghi nhận 38 chi; Whalley (1996) ghi nhận 41 chi; Kirk và cộng sự (2001) ghi nhận 48 chi; năm 2004 đạt 64 chi; Eriksson và cộng sự (2006) ghi nhận 73 chi; Lumbsch & Huhndorf (2010) ghi nhận 77 chi; và đến năm 2013, tổng số chi được chấp nhận đạt 95 chi với 1354 loài.
| Thời điểm / Tài liệu |
Tác giả công bố |
Số lượng chi ghi nhận |
| 1993 |
Eriksson & Hawksworth |
38 chi |
| 1996 |
Whalley |
41 chi |
| 2001 |
Kirk và cộng sự |
48 chi |
| 2004 |
Kirk và cộng sự |
64 chi |
| 2006 |
Eriksson và cộng sự |
73 chi |
| 2010 |
Lumbsch & Huhndorf |
77 chi |
| 2013 |
Catalogue of Life / Tổng hợp |
95 chi (1354 loài) |
Các nghiên cứu khu hệ theo vùng địa lý
- Châu Mỹ: Ellis (1888) mô tả 12 loài thuộc chi Hypoxylon và Nummularia; Möller (1901) mô tả hệ nấm Nam Mỹ; Miller (1930–1961) công bố hàng loạt chuyên khảo về Hypoxylon; Carmona (2009) ghi nhận 76 loài tại Panama; Vasilyeva (2007) bổ sung 4 loài Annulohypoxylon và 18 loài Hypoxylon tại vườn quốc gia Great Smoky Mountains (Hoa Kỳ); Rogers và Ju (2012) xác định 100 loài thuộc 13 chi tại quần đảo Hawaii; Krug và cộng sự (1974) phát hiện 15 loài Hypocopra sống trên phân động vật ăn cỏ.
- Châu Á: Rogers (1987) ghi nhận 60 loài thuộc 7 chi tại Indonesia; Ju (2007) lập khóa định loại cho 25 loài Xylaria sống trên tổ mối tại Đài Loan; năm 2008 Đài Loan ghi nhận 136 loài thuộc 19 chi; Thienhirun (1997) xác định 113 loài thuộc 13 chi tại Thái Lan; Fournier và cộng sự (2010) phát hiện chi mới Rostrohypoxylon và 2 loài Annulohypoxylon mới; đến năm 2012 Thái Lan ghi nhận 154 loài thuộc 23 chi.
- Châu Âu: Petrini (1985, 1992) nghiên cứu sinh thái 22 loài Xylariaceae và các loài Rosellinia ôn đới; Granmo và cộng sự (1989) nghiên cứu Biscogniauxia và Hypoxylon ở Bắc Âu; Chlebicki (2008) ghi nhận 51 loài thuộc 16 chi tại Ba Lan.
- Châu Úc: Rogers (1986) ghi nhận 19 loài Xylaria ở New Zealand; Van der Gucht (1996) ghi nhận 94 loài thuộc 7 chi tại Papua New Guinea; Smith (1999) ghi nhận 77 loài thuộc 10 chi ở Australia; Lu (1999) định loại 16 loài Anthostomella ở Australia.
Nghiên cứu di truyền phân tử, hóa sinh và hoạt tính sinh học
- Sinh học phân tử: Hsieh và cộng sự (2005) dùng dữ liệu phân tử chứng minh tính độc lập của chi Annulohypoxylon. Peláez và cộng sự (2008) phân tích 100 trình tự ADN thuộc 62 loài thuộc 15 chi, chỉ ra tính đơn nguồn của Hypoxylon, Annulohypoxylon, Biscogniauxia, Daldinia, nhưng cho thấy Xylaria có nguồn gốc đa nguyên. Tang và cộng sự (2009) dùng các đoạn gen ITS-5.8S rDNA, LSU rDNA, RPB2 để tái dựng phát sinh chủng loại của họ.
- Hóa học và hoạt tính sinh học: Quang và cộng sự (2005), Stadler và cộng sự (2006) phân lập các hợp chất nhóm azaphilone (rubiginosin A–C, entonaemin A, daldinin C, E, F, multiformin A–D, sassafrin A–D, rutilin A–B...) có hoạt tính kháng vi khuẩn (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, Escherichia coli), kháng nấm (Aspergillus niger, Candida albicans) và chống oxy hóa. Buchanan (1995) phân lập 22 dẫn xuất cytochalasin từ Daldinia sp. có khả năng ức chế phân chia tế bào. Qin và cộng sự (2006) phát hiện concentricolide từ Daldinia concentrica ức chế lây nhiễm HIV ở nồng độ 0,83 µg/ml. Fukai và cộng sự (2012) phân lập benzo[j]fluoranthene C, D, E, F từ Annulohypoxylon truncatum. Benie và cộng sự (2008) ghi nhận dịch chiết D. concentrica ức chế tế bào ung thư vú ở nồng độ 15–30 µg/ml.
Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam và khoảng trống của luận án
Trịnh Tam Kiệt (1981) lần đầu thống kê 4 loài Xylariaceae (Daldinia concentrica, Hypoxylon rubiginosum, Sarcoxylon aurantiacum, Xylaria polymorpha), nâng lên 29 loài (1996), 45 loài (2001) và 69 loài thuộc 13 chi (2012). Mai Thị Hằng và cộng sự (2005) bổ sung 1 loài Astrocystis. Trần Văn Mão (2005) tìm thấy 7 loài tại Cúc Phương. Dương Minh Lam và cộng sự (2009) bổ sung 3 loài (Annulohypoxylon, Hypoxylon). Ngô Anh và cộng sự ghi nhận 9 loài tại Thừa Thiên Huế (2003, 2010), 14 loài tại Xuyên Mộc (2011), và 9 loài tại Phong Nha – Kẻ Bàng (2011).
Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: thực hiện khảo sát có hệ thống tại hai khu bảo tồn thiên nhiên tiêu biểu (Mường Phăng và Cúc Phương), tích hợp phân loại hình thái hiển vi với sinh học phân tử đoạn gen ITS rDNA, thiết lập hệ thống khóa định loại hoàn chỉnh, đánh giá định lượng cấu trúc đa dạng sinh học bằng các chỉ số sinh thái, đồng thời phân lập và xác định cấu trúc hóa học các chất chuyển hóa thứ cấp cùng hoạt tính sinh học từ thể quả nấm.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân loại
Luận án áp dụng hệ thống phân loại nấm của Lumbsch và Huhndorf (2010) kết hợp cơ sở dữ liệu Catalogue of Life (2013), định vị họ Xylariaceae thuộc bộ Xylariales, lớp Sordariomycetes, ngành nấm túi Ascomycota, giới Fungi.
Khung phân tích hình thái dựa trên hệ thống chỉ tiêu vi học và đại thể:
- Chất nền (Stromata): Dạng phẳng dẹt (applanata), dạng ụ (effused-pulvinate), dạng cầu (spherical), hình chùy (clavate), hình trụ (cylindrical); màu sắc bề mặt và phản ứng giải phóng sắc tố trong dung dịch KOH 10%.
- Thể quả (Perithecia): Hình cầu, hình trứng, hình elip, hình trụ hoặc hình nón chìm trong chất nền; đặc điểm vỏ thể quả khi trưởng thành.
- Lỗ miệng (Ostioles): Dạng nhú cao hơn bề mặt chất nền, dạng bằng bề mặt chất nền, hoặc dạng thấp hơn bề mặt chất nền; sự hiện diện của vùng đĩa phẳng bao quanh lỗ miệng (đặc trưng của chi Annulohypoxylon).
- Túi bào tử (Asci) và đỉnh túi (Apical apparatus): Túi hình trụ mang 8 bào tử; cấu trúc đỉnh túi dạng hình đĩa, hình trụ, hình nón hoặc hình nụ hoa; phản ứng bắt màu xanh (Amyloid) hoặc không bắt màu với thuốc nhuộm Melzer’s.
- Bào tử túi (Ascospores): Hình dạng, màu sắc, phần phụ (appendages), kiểu vách ngăn, phản ứng tách vỏ trong dung dịch KOH 10%, và vị trí - hình dạng rãnh mầm (germ slit: dạng thẳng, dạng sigma, dạng xiên chéo).
[Mẫu nấm thực địa]
Phương pháp nghiên cứu cụ thể
- Phương pháp vi sinh và xử lý mẫu: Thu mẫu thể quả thực địa tại Mường Phăng và Cúc Phương theo tuyến khảo sát, định vị bằng GPS; làm sạch, sấy khô, xử lý mẫu lưu tiêu bản; phân lập bào tử nấm trên môi trường PDA để thu nhận hệ sợi thuần khiết; bảo quản chủng giống.
- Phương pháp phân tích hình thái hiển vi: Sử dụng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét (SEM) để chụp ảnh, đo đạc kích thước chất nền, thể quả, túi bào tử, bào tử và rãnh mầm; thực hiện các phản ứng màu hiển vi với KOH 10% và thuốc nhuộm Melzer’s.
- Phương pháp sinh học phân tử:
- Tách chiết ADN tổng số từ mô thể quả hoặc hệ sợi nấm bằng quy trình CTAB, sử dụng các dung dịch đệm TE, TAE.
- Nhân bản vùng chỉ thị ITS rDNA bằng kỹ thuật PCR.
- Điện di kiểm tra, tinh sạch sản phẩm PCR và gửi giải trình tự ADN tự động.
- So sánh, đối chiếu trình tự trên ngân hàng gen NCBI qua công cụ BLAST; căn chỉnh trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại di truyền.
- Phương pháp hóa sinh và xác định cấu trúc: Chiết xuất thể quả nấm bằng các dung môi hữu cơ phân cực khác nhau; tách phân đoạn bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh sạch bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ.
- Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học:
- Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Thử nghiệm invitro bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học MTT trên 4 dòng tế bào ung thư ở người gồm ung thư biểu mô (KB), ung thư vú (MCF7), ung thư phổi (Lu) và ung thư gan (HepG2), nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh thai bò (FBS).
- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Xác định khả năng ức chế vi khuẩn và nấm bằng phương pháp khuếch tán thạch trên môi trường MHA, TSA, MHB, TSB; đo đường kính vòng vô khuẩn $(D-d)$ tính bằng milimét (mm).
- Phương pháp toán học sinh thái:
- Độ phong phú loài.
- Chỉ số đa dạng loài Shannon – Wiener: $H' = - \sum (p_i \ln p_i)$.
- Chỉ số mức độ chiếm ưu thế Simpson (Concentration of Dominance): $Cd = \sum (p_i)^2$.
- Chỉ số tương đồng Sorensen: $SI = \frac{2C}{A + B}$.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương này hệ thống hóa toàn bộ các công trình nghiên cứu về nấm túi họ Xylariaceae trong nước và quốc tế tính đến năm 2013:
- Xác định vị trí phân loại của họ Xylariaceae trong ngành Ascomycota gồm 95 chi và 1354 loài hợp lệ.
- Mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái học đại thể và cấu trúc hiển vi có giá trị định loại: chất nền (phẳng, ụ, cầu, chùy, trụ), thể quả (cầu, trứng, elip, trụ, nón), lỗ miệng (3 dạng), túi bào tử, đỉnh túi phản ứng với Melzer's, bào tử túi, rãnh mầm và các dạng hình thức sinh sản vô tính anamorph (Nodulisporium, Sporothrix, Virgariella, Periconiella).
- Tổng hợp danh mục các hợp chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm azaphilone, cytochalasin, butyrolactones, dihydroisocoumarins, succinic acid, naphthalenes, sesquiterpene alcohols, griseofulvin, concentricolide, polyketide và xanthones được chiết xuất từ thể quả nấm họ Xylariaceae.
- Phân tích các dữ liệu hoạt tính sinh học đã công bố: ức chế vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), kháng nấm men, ức chế virus HIV-1 và Herpes type 1, ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú ở nồng độ 15–30 µg/ml, chống oxy hóa, kích thích sinh học.
- Trình bày đặc điểm khí hậu, địa chất, thủy văn và thảm thực vật của hai khu vực nghiên cứu: Rừng nguyên sinh Mường Phăng (Điện Biên) và Vườn Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình).
| Nhóm hợp chất |
Tên hợp chất tiêu biểu |
Loài nấm phân lập (theo tài liệu tổng quan) |
| Azaphilone |
Cohaerin A, B |
Hypoxylon cohaerens |
|
Coloratin A |
Xylaria intracolorata |
|
Concentricol A, Daldinialanone, Daldiniapyrone |
Daldinia concentrica |
|
Daldinin A–C, E, F; Rubiginosin A–C; Entonaemin A |
Hypoxylon rubiginosum |
|
Daldinone A, B |
Hypoxylon fuscum |
|
Fragiformin A, B; Hypomiltin; Mitorubrinic acid |
Hypoxylon fragiforme |
|
Multiformin A–D |
Annulohypoxylon multiforme |
|
Rutilin A, B |
Hypoxylon rutilum |
|
Sassafrin A–D |
Creosphaeria sassafras |
| Cytochalasin |
Cytochalasin A, B, C, D, E, F, H, Q, R |
Daldinia sp., Daldinia concentrica, Xylaria obovata |
| Khác |
Concentricolide (Benzofuran lactone) |
Daldinia concentrica |
|
Mellisol, 1,8-dihydroxynaphthol 1-O-$\alpha$-glucopyranoside |
Xylaria mellisii |
|
Malettinin A |
Hypoxylon sp. |
|
Benzo[j]fluoranthene C, D, E, F |
Annulohypoxylon truncatum |
Chương 2: Địa điểm, thời gian, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 thiết lập toàn bộ quy trình thực nghiệm và phương tiện nghiên cứu:
- Địa điểm và thời gian: Thiết lập sơ đồ tuyến thu mẫu tại Vườn Quốc gia Cúc Phương và Rừng nguyên sinh Mường Phăng qua các đợt nghiên cứu thực địa theo các mùa trong năm.
- Vật liệu: Các mẫu thể quả nấm Xylariaceae thu thập ngoài tự nhiên; 4 dòng tế bào ung thư người (KB, MCF7, Lu, HepG2); các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn; hệ thống môi trường nuôi cấy (PDA, MHA, MHB, TSA, TSB, FBS) và hóa chất chuyên dụng (CTAB, đệm TAE, TE, MTT, DMSO, thuốc nhuộm Melzer's, KOH 10%).
- Quy trình phương pháp: Trình bày chi tiết các bước phân tích giải phẫu hình thái hiển vi; quy trình tách ADN bằng phương pháp CTAB; chu trình nhiệt PCR nhân đoạn ITS rDNA; quy trình phân tích trình tự phân tử trên NCBI GenBank; phương pháp chiết xuất, sắc ký HPLC và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR; quy trình thử nghiệm MTT xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư và phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn $(D-d)$; công thức tính toán các chỉ số toán sinh thái $H'$, $Cd$, $SI$.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được trên 4 nội dung chính:
-
Thành phần loài nấm họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu:
- Định loại và mô tả chi tiết đặc điểm hình thái của 114 taxon thu được tại Mường Phăng và Cúc Phương.
- Xây dựng thành công 01 khóa định loại đến chi và 7 khóa định loại đến loài.
- Bổ sung 4 chi mới và 100 taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam.
- Giải mã trình tự ADN vùng ITS cho 49 taxon, trong đó phát hiện 5 taxon có trình tự lần đầu tiên được công bố cho khoa học.
-
Cấu trúc đa dạng sinh học và đặc điểm sinh thái:
- Phân tích tỷ lệ phân bố số lượng loài giữa các chi: chi Xylaria và Hypoxylon chiếm ưu thế về số lượng loài, tiếp theo là Annulohypoxylon, Biscogniauxia, Daldinia, Kretzschmaria, Nemania, Rosellinia.
- Đánh giá sự khác biệt đa dạng loài giữa Mường Phăng và Cúc Phương qua chỉ số Shannon-Wiener ($H'$), chỉ số chiếm ưu thế Simpson ($Cd$) và chỉ số tương đồng Sorensen ($SI$).
- Phân tích biến động thành phần loài theo mùa (mùa mưa và mùa khô) và theo các yếu tố địa lý (loài nhiệt đới, loài phân bố toàn cầu, loài ôn đới).
- Đánh giá các phương thức sống: hoại sinh trên gỗ mục, cành rơi, sống trên mùn/đất, sống cộng sinh trên tổ mối hoặc sống trên phân động vật.
-
Quan hệ di truyền phát sinh chủng loại:
- Xây dựng cây phát sinh chủng loại tổng thể cho 49 taxon thuộc 8 chi (Annulohypoxylon, Biscogniauxia, Daldinia, Hypoxylon, Kretzschmaria, Nemania, Rosellinia, Xylaria) dựa trên trình tự ITS rDNA.
- Xây dựng và phân tích chi tiết cây di truyền riêng cho từng chi: làm sáng tỏ vị trí phân loại phân tử của các loài trong chi Annulohypoxylon, Biscogniauxia, Daldinia, Hypoxylon, Kretzschmaria, Nemania, Rosellinia, Xylaria, đối chiếu sự tương thích giữa đặc điểm hình thái và dữ liệu phân tử.
-
Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học:
- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 13 hợp chất từ thể quả của 4 taxon: Biscogniauxia philippinensis, Daldinia concentrica (mẫu CP002, MP365), Xylaria atrosphaerica (mẫu CP257) và Xylaria schweinitzii (mẫu CP613).
- Trong 13 hợp chất này, có 1 hợp chất mới cho khoa học và 12 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong các loài thuộc họ Xylariaceae thu thập tại Việt Nam.
- Thử nghiệm sinh học: Bước đầu ghi nhận 3 hợp chất tách chiết từ loài Daldinia concentrica CP002 có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ung thư ở người (KB, MCF7, Lu, HepG2) và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của các chất thu được.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp về mặt khoa học và lý luận
- Là công trình đầu tiên nghiên cứu có tính hệ thống và toàn diện về nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam trên cả ba phương diện: hình thái học, sinh học phân tử và hóa sinh học.
- Bổ sung 4 chi và 100 taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam, nâng cao mức độ đầy đủ của danh lục nấm túi quốc gia.
- Công bố dữ liệu trình tự vùng gen ITS rDNA cho 49 taxon, trong đó có 5 taxon có trình tự lần đầu tiên được công bố cho khoa học trên cơ sở dữ liệu quốc tế.
- Xây dựng 01 khóa định loại đến chi và 7 khóa định loại đến loài, hoàn thiện bản mô tả chi tiết kèm hình ảnh hiển vi và mẫu lưu tiêu bản cho 114 taxon tại khu vực nghiên cứu.
- Thiết lập cây quan hệ di truyền phát sinh chủng loại cho 49 taxon thuộc 8 chi của họ Xylariaceae ở Việt Nam.
Đóng góp về mặt thực tiễn
- Tách chiết và xác định cấu trúc hóa học của 13 hợp chất từ thể quả của 4 taxon (Biscogniauxia philippinensis, Daldinia concentrica, Xylaria atrosphaerica, Xylaria schweinitzii), phát hiện 1 hợp chất mới cho khoa học và 12 hợp chất lần đầu tiên tìm thấy ở nấm Xylariaceae tại Việt Nam.
- Cung cấp dữ liệu thực nghiệm chứng minh 3 hợp chất từ thể quả loài Daldinia concentrica CP002 có hoạt tính ức chế đối với 4 dòng tế bào ung thư người (ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF7, ung thư phổi Lu, ung thư gan HepG2).
- Cung cấp bộ dữ liệu hình thái, mẫu lưu và khóa định loại phục vụ công tác giảng dạy, nghiên cứu chuyên ngành sinh học và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật.
Kiến nghị và đề xuất
- Tiếp tục mở rộng phạm vi điều tra thu thập mẫu nấm họ Xylariaceae tại các hệ sinh thái rừng nhiệt đới và khu bảo tồn khác trên toàn quốc.
- Đẩy mạnh nghiên cứu ứng dụng các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ thể quả nấm họ Xylariaceae trong nghiên cứu y dược học và công nghệ sinh học.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Phạm vi không gian thu mẫu thực địa mới chỉ tập trung tại 2 khu vực đại diện là Rừng nguyên sinh Mường Phăng (Điện Biên) và Vườn Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), chưa bao quát toàn bộ các vùng sinh thái rừng khác tại miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ.
- Số lượng taxon được phân tích trình tự sinh học phân tử mới dừng lại ở 49 taxon trong tổng số 114 taxon được mô tả hình thái.
- Việc chiết xuất hóa học và thử hoạt tính sinh học mới được tiến hành trên thể quả của 4 taxon (B. philippinensis, D. concentrica, X. atrosphaerica, X. schweinitzii) và 3 hợp chất của loài D. concentrica.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Mở rộng khảo sát khu hệ nấm họ Xylariaceae tại các vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên trên các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam.
- Tiến hành giải trình tự ADN bổ sung cho các taxon còn lại và kết hợp phân tích thêm các chỉ thị phân tử đa gen khác (như LSU rDNA, RPB2) để hoàn thiện cây phát sinh chủng loại.
- Khảo sát chuyên sâu hơn về thành phần hóa học, tối ưu quy trình phân lập và đánh giá toàn diện hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus và độc tế bào của các hợp chất tiềm năng từ nấm họ Xylariaceae.
Giá trị tham khảo
Luận án mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho các nhóm đối tượng học thuật và ứng dụng:
- Nghiên cứu sinh, giảng viên và sinh viên ngành Sinh học, Vi sinh vật học, Nấm học, Sinh thái và Đa dạng sinh học: Sử dụng 01 khóa định loại đến chi, 7 khóa định loại đến loài, hệ thống mô tả hình thái hiển vi của 114 taxon và cây di truyền phát sinh chủng loại của 49 taxon làm tài liệu tra cứu định loại, giảng dạy và nghiên cứu chuyên khảo.
- Các nhà nghiên cứu Hóa học hợp chất thiên nhiên và Y – Dược học: Tham khảo quy trình phân lập sắc ký HPLC, dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR của 13 hợp chất và phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư (KB, MCF7, Lu, HepG2) từ nấm túi.
- Ban quản lý các khu bảo tồn thiên nhiên, Vườn quốc gia và cơ quan quản lý tài nguyên: Sử dụng các số liệu đa dạng thành phần loài, chỉ số đa dạng sinh thái ($H'$, $Cd$, $SI$) tại Mường Phăng và Cúc Phương làm cơ sở khoa học phục vụ quản lý, giám sát và bảo tồn nguồn gen sinh vật.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án đã bổ sung bao nhiêu taxon mới cho khu hệ nấm Việt Nam và khoa học?
Luận án đã bổ sung 4 chi mới và 100 taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam. Đồng thời, trong số 49 taxon được phân tích trình tự vùng gen ITS rDNA, có 5 taxon có trình tự nucleotide lần đầu tiên được công bố cho khoa học trên cơ sở dữ liệu quốc tế.
2. Những chỉ số sinh thái học nào được sử dụng để đánh giá đa dạng nấm họ Xylariaceae?
Luận án sử dụng 4 chỉ tiêu/chỉ số toán sinh thái gồm: độ phong phú loài, chỉ số đa dạng sinh học loài Shannon – Wiener ($H'$), chỉ số mức độ chiếm ưu thế Simpson (Concentration of Dominance – $Cd$) và chỉ số tương đồng Sorensen ($SI$) để so sánh cấu trúc quần xã nấm giữa Mường Phăng và Cúc Phương cũng như theo mùa.
3. Phương pháp sinh học phân tử nào được dùng để xác định mối quan hệ di truyền?
Tác giả sử dụng phương pháp tách ADN bằng CTAB, nhân bản vùng gen chỉ thị ITS rDNA bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự ADN tự động, đối chiếu BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank và dựng cây phát sinh chủng loại di truyền cho 49 taxon thuộc 8 chi (Annulohypoxylon, Biscogniauxia, Daldinia, Hypoxylon, Kretzschmaria, Nemania, Rosellinia, Xylaria).
4. Luận án đã phân lập được bao nhiêu hợp chất hóa học và những hợp chất này có hoạt tính gì?
Luận án đã tách chiết và xác định cấu trúc của 13 hợp chất từ thể quả của 4 taxon (Biscogniauxia philippinensis, Daldinia concentrica, Xylaria atrosphaerica, Xylaria schweinitzii), gồm 1 hợp chất mới cho khoa học và 12 hợp chất lần đầu tìm thấy ở nấm Xylariaceae tại Việt Nam. Bước đầu thử nghiệm cho thấy 3 hợp chất từ thể quả loài Daldinia concentrica CP002 có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ung thư người (KB, MCF7, Lu, HepG2).
5. Hệ thống khóa định loại được xây dựng trong luận án bao gồm những gì?
Tác giả đã xây dựng hoàn chỉnh 01 khóa định loại đến chi và 7 khóa định loại đến loài cho các chi nấm túi họ Xylariaceae thu thập tại khu vực nghiên cứu, phục vụ nhận diện 114 taxon có mẫu tiêu bản và hình ảnh hiển vi kèm theo.
Kết luận
Luận án của nghiên cứu sinh Đỗ Đức Quế là công trình khoa học chuyên ngành Vi sinh vật học, cung cấp hệ thống dữ liệu toàn diện về thành phần loài, đặc điểm hình thái học, quan hệ di truyền phân tử và hoạt tính sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại Rừng nguyên sinh Mường Phăng và Vườn Quốc gia Cúc Phương. Công trình đã mô tả chi tiết 114 taxon, bổ sung 4 chi và 100 taxon mới cho khu hệ nấm Việt Nam, công bố 5 trình tự gen mới cho khoa học, đồng thời xây dựng 01 khóa định loại đến chi và 7 khóa định loại đến loài. Bên cạnh đó, luận án đã phân lập thành công 13 hợp chất hóa học từ thể quả nấm, phát hiện 1 chất mới cho khoa học và xác định hoạt tính ức chế 4 dòng tế bào ung thư người từ loài Daldinia concentrica, tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu bảo tồn nguồn gen và ứng dụng dược liệu nấm tại Việt Nam.
