Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Nấm Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là nhóm nấm ký sinh đặc hữu trên sâu non, nhộng hoặc côn trùng trưởng thành thuộc nhiều bộ khác nhau. Nhóm nấm này có giá trị dược liệu cao nhờ các hoạt chất sinh học đặc thù, tiêu biểu là cordycepin – hợp chất có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp các tế bào ung thư (đã được ghi nhận đối với ung thư vú, ung thư phổi, ung thư máu) và adenosine cùng nhiều polysaccharide, nguyên tố vi lượng, vitamin. Trong y học cổ truyền và hiện đại, nấm ĐTHT được chứng minh có tác dụng hỗ trợ điều trị các chứng rối loạn lipid máu, viêm thận mạn tính, rối loạn nhịp tim, huyết áp cao, cải thiện chức năng gan, tăng cường miễn dịch và chống oxy hóa.

Vườn Quốc gia (VQG) Hoàng Liên (tỉnh Lào Cai) có đặc điểm địa hình núi cao, khí hậu á nhiệt đới và ôn đới núi cao, sở hữu hệ sinh thái rừng phong phú cùng nguồn tài nguyên dược liệu quý. Tuy nhiên, trước thời điểm nghiên cứu, các công trình khoa học về khu hệ nấm tại VQG Hoàng Liên còn rất hạn chế. Phần lớn nguồn dược liệu tại địa phương mới chỉ dừng lại ở việc khai thác tự nhiên, chưa có danh mục phân loại đầy đủ về nguồn gen các loài nấm ĐTHT bản địa, thiếu các dẫn liệu sinh thái học, phân bố và đặc tính sinh học của từng loài. Đồng thời, loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) – một loài nấm dược liệu quý có giá trị kinh tế và y học cao – phân bố tự nhiên tại đây nhưng chưa được nghiên cứu quy trình công nghệ nhân nuôi nhân tạo trên các dạng giá thể khác nhau để chủ động cung cấp nguồn nguyên liệu. Do đó, việc thực hiện đề tài là yêu cầu cấp thiết nhằm phục vụ bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển nguồn tài nguyên rừng bền vững.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hệ thống mục tiêu nghiên cứu như sau:

1. Mục tiêu chung: Xác định được thành phần, tính đa dạng các loài thuộc nhóm nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên và cơ sở khoa học trong việc nuôi trồng loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes).

2. Mục tiêu cụ thể:

  • Mục tiêu 1: Xác định được thành phần loài nhóm nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên.
  • Mục tiêu 2: Xác định được tính đa dạng và đặc điểm sinh học của các loài nấm ĐTHT thu được tại VQG Hoàng Liên.
  • Mục tiêu 3: Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng loài nấm ĐTHT bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể nhân tạo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các loài nấm thuộc nhóm Đông trùng hạ thảo tự nhiên phân bố tại VQG Hoàng Liên; loài nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes).
  • Phạm vi không gian: Điều tra thu mẫu thực địa tại các sinh cảnh rừng thuộc VQG Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai. Phân lập giống gốc, lưu giữ nguồn gen, giải trình tự giám định ADN và bố trí thí nghiệm nuôi trồng thể quả đệm tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (phường Đức Thắng, quận Bắc Từ Liêm, thành phố Hà Nội).
  • Phạm vi thời gian: Quá trình điều tra thực địa được tiến hành liên tục trong 3 năm (2015 – 2017), mỗi năm tổ chức 4 đợt điều tra vào các tháng 4, tháng 6, tháng 8 và tháng 10. Toàn bộ chương trình nghiên cứu sinh thực hiện từ năm 2015 đến năm 2018 (hoàn thành năm 2019).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước mà tác giả điểm lại

Luận án đã tổng thuật hệ thống tài liệu nghiên cứu trong nước và quốc tế theo ba trục nội dung chính:

1. Lịch sử phân loại và hệ thống học nấm Đông trùng hạ thảo:

  • Trên thế giới, ghi nhận sớm nhất về ĐTHT xuất hiện từ năm 620 sau Công nguyên tại Trung Quốc và được mô tả khoa học đầu tiên bởi Wu-Yiluo (1757) trong sách Dược điển thời nhà Thanh.
  • Perennin Jean Baptiste du Halde giới thiệu ĐTHT sang phương Tây vào đầu thế kỷ 18. Đến năm 1843, Berkeley công bố kết quả nghiên cứu và đặt tên là Sphaeria sinensis, sau đó Pier Andrea Saccardo (1878) đổi danh pháp thành Cordyceps sinensis.
  • Năm 2007, Sung và cộng sự (Sung et al., 2007) sử dụng phương pháp phát sinh loài phân tử phân chia lại hai họ Clavicipitaceae và Cordycipitaceae, thiết lập họ mới Ophiocordycipitaceae và chuyển nhiều loài sang chi Ophiocordyceps. Nhóm nấm ĐTHT dược liệu trên thế giới có khoảng 700 loài, nằm trong 162 đơn vị phân loại thuộc các chi chủ yếu: Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps, Ophiocordyceps.
  • Đối với chi Isaria, Samson đã phân chia chi Paecilomyces thành các phân chi; Luangsard và cộng sự (2004) dùng trình tự vùng ITS rDNA và gen $\beta$-tubulin chứng minh Isarioidea là nhánh đa huyết thống (multiphyly). Isaria tenuipes (Peck) Samson được xác định là dạng vô tính của Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz (Fukatsu et al.).
  • Tại Việt Nam, Patouillard (1928) ghi nhận loài Aschersonia badia tại Thanh Hóa. Đến năm 1998, Trịnh Tam Kiệt công bố danh mục nấm ĐTHT chi Cordyceps phân bố tại nhiều tỉnh thành. Trần Ngọc Lân và cộng sự (2008, 2010) ghi nhận 17 đến 24 loài thuộc các họ Clavicipitaceae, Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae tại VQG Pù Mát và VQG Cát Tiên. Phạm Quang Thu và cộng sự (2009, 2010, 2011) công bố nhiều loài mới cho khu hệ nấm Việt Nam như Cordyceps militaris, Cordyceps gunnii, Cordyceps nutans, Cordyceps tuberculata, Cordyceps oxycephala, Cordyceps takaomontana. Trương Xuân Sinh và Nguyễn Thị Thúy (2013) ghi nhận 97 loài nấm ký sinh côn trùng tại VQG Pù Mát. Nguyễn Phương Đại Nguyên và cộng sự (2015) ghi nhận các loài Ophiocordyceps tại VQG Chư Yang Sin. Tính đến thời điểm luận án tổng hợp, toàn quốc có 38 công trình công bố 85 loài thuộc 18 chi thuộc 3 họ của bộ Hypocreales.

2. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu:

  • Các nghiên cứu quốc tế đã làm rõ thành phần của Isaria: Sano và cộng sự phát hiện cơ chế ức chế miễn dịch ISP-I từ Isaria sinclairii; Kawachi và cộng sự chiết xuất enzyme chitinase; Pae và cộng sự chứng minh hợp chất 4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol (AETD) từ Isaria japonica và I. tenuipes có tác dụng điều trị bệnh bạch cầu; Sakakura và cộng sự (2005) tách chiết pseudo-di-peptide chống oxy hóa; Nan và cộng sự (2001) phân lập ergosterol peroxide và acetoxyscirpendiol từ Paecilomyces tenuipes có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày, ung thư gan cao gấp 4–6,6 lần cisplatin; Kikuchi và cộng sự (2004) xác định adenosine và N6-(2-hydroxyethyl)adenosine trong thể quả I. tenuipes.
  • Tại Việt Nam, Đỗ Tất Lợi (1977), Phạm Quang Thu (2011) xác định hàm lượng cordycepin ở các chủng C. militaris dao động từ 20,59 đến 111,24 $\mu$g/ml; Lê Thị Thu Hiền (2015) đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư.

3. Cơ chế xâm nhiễm và ứng dụng phòng trừ sinh học:

  • Cơ chế lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng (EPF) qua lớp biểu bì cuticula được phân tích bởi Evans (1988), Tạ Kim Chỉnh (1994), Phạm Văn Lầm (2000), Thomas và Read (2007) thông qua sự kết hợp của áp lực cơ học và hệ enzyme ngoại bào (protease, chitinase, lipase).
  • Ứng dụng chế phẩm sinh học kiểm soát dịch hại nông - lâm nghiệp của các loài Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea (Avery et al., 2013; David et al., 2012; Amjad et al.; Lê Doãn Diên et al.; Phạm Thị Thùy et al.).

4. Kỹ thuật nuôi cấy và nhân sinh khối:

  • Các tác giả quốc tế như Bouamama và cộng sự, Asaff và cộng sự (2009), Mascarin và cộng sự (2010), Ji và cộng sự (2011) nghiên cứu tối ưu hóa nguồn cacbon, nitơ, khoáng, pH, nhiệt độ, độ ẩm và thử nghiệm nuôi I. tenuipes trên nhộng tằm cho tỷ lệ sống đạt 97,6%. Trần Văn Mão (2002) tổng hợp kỹ thuật nuôi cấy Cordyceps sinensis.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù số lượng công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng tại Việt Nam tăng lên trong những năm gần đây, nhưng khu hệ nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên vẫn chưa có một công trình điều tra toàn diện, hệ thống nào về thành phần loài, cấu trúc phân bố sinh thái học (theo độ cao, sinh cảnh, độ tàn che, thời gian) và vật chủ côn trùng. Mặt khác, các quy trình kỹ thuật nuôi trồng loài nấm dược liệu bản địa Isaria tenuipes trên các dạng môi trường nhân tạo (môi trường dịch thể tạo giống gốc, giá thể lỏng, giá thể rắn, và ký chủ nhộng tằm) chưa được thực nghiệm bài bản và chuẩn hóa thành quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh tại Việt Nam. Luận án được thực hiện nhằm giải quyết trực tiếp các khoảng trống khoa học này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân loại và khái niệm cơ sở

  • Hệ thống phân loại: Luận án áp dụng hệ thống phân loại nấm túi Ascomycota của Kirk và cộng sự (Kirk et al., 2008), có cập nhật và hiệu chỉnh theo Sung và cộng sự (Sung et al., 2007) và Danh lục nấm lớn Việt Nam của Trịnh Tam Kiệt (2014).
  • Khái niệm nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic Fungi - EPF): Nhóm sinh vật gây bệnh trên côn trùng, bao gồm 4 phương thức quan hệ: ký sinh trong, ký sinh ngoài, nấm mọc trên côn trùng và cộng sinh; phân loại theo mức độ chuyên tính gồm ký sinh sơ cấp (nhiễm vào côn trùng khỏe) và ký sinh thứ cấp/cơ hội (nhiễm qua vết thương hoặc khi cá thể suy yếu).
  • Cơ chế xâm nhiễm: Gồm 3 giai đoạn kế tiếp:
    1. Giai đoạn xâm nhập: Bào tử nảy mầm hình thành vòi và giác bám, tiết enzyme ngoại bào (protease, chitinase, esterase, cellulase...) kết hợp áp lực cơ học phá hủy tầng cuticula.
    2. Giai đoạn phát triển ký sinh trong xoang cơ thể: Sợi nấm phát tán qua dịch máu, phá hủy tế bào mô, làm tắc khí quản, tiết độc tố làm tê liệt và giết chết vật chủ.
    3. Giai đoạn sinh trưởng hoại sinh và tạo quả thể: Nấm tiết chất kháng sinh ức chế vi khuẩn hoại sinh ngoài môi trường, tiêu thụ cạn kiệt dinh dưỡng trong xác côn trùng rồi đâm xuyên qua vỏ kitin mọc thành thể quả đệm (stroma) và hình thành bào tử phát tán.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án kết hợp giữa phương pháp điều tra sinh thái thực địa, giám định hình thái hiển vi, phân tích sinh học phân tử và phương pháp bố trí thí nghiệm nhân nuôi thực nghiệm trong điều kiện kiểm soát:

1. Phương pháp điều tra, thu thập và bảo quản mẫu thực địa:

  • Thiết lập tuyến điều tra đại diện qua các sinh cảnh rừng, đai độ cao và độ tàn che tại VQG Hoàng Liên theo 4 đợt trong năm (tháng 4, 6, 8, 10) từ 2015 đến 2017.
  • Thu thập toàn bộ phần thể quả và phần xác côn trùng ký chủ nằm dưới thảm mục hoặc trong đất; ghi nhận tọa độ GPS, sinh cảnh, độ ẩm, nhiệt độ, tình trạng vật chủ.

2. Phương pháp giám định mẫu vật:

  • Giám định hình thái: Giải phẫu cấu trúc thể quả đệm, túi bào tử (ascus), bào tử túi (ascospore), bào tử đính (conidia), thể bình dưới kính hiển vi quang học, đối chiếu khóa định loại chuyên ngành.
  • Giám định sinh học phân tử: Tách chiết ADN tổng số từ hệ sợi nấm nuôi cấy thuần khiết; nhân bản vùng gen chỉ thị ribosome (rDNA/rAND vùng ITS) bằng phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR); giải trình tự gen và so sánh độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) để định danh chính xác loài và xác định các đơn vị phân loại mới.

3. Phương pháp nghiên cứu nuôi trồng thực nghiệm nấm Isaria tenuipes:

  • Nghiên cứu tạo giống gốc: Khảo sát sinh trưởng hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng dịch thể (công thức CT1, CT2).
  • Nghiên cứu nuôi trồng trên giá thể lỏng: Khảo sát các thông số kỹ thuật gồm nhiệt độ môi trường, độ pH, thành phần khoáng - dinh dưỡng, và tốc độ lắc bình nuôi cấy (thử nghiệm các mức 110 vòng/phút và 150 vòng/phút).
  • Nghiên cứu nuôi trồng trên giá thể rắn: Thử nghiệm cơ chất phối trộn hạt ngũ cốc và phụ phẩm dinh dưỡng.
  • Nghiên cứu nuôi trồng trên nhộng tằm: Đánh giá hiệu quả tạo thể quả đệm qua 3 phương thức lây nhiễm: (1) Tiêm dịch huyền phù bào tử trực tiếp vào cơ thể nhộng; (2) Phun dịch giống nấm bao phủ bề mặt nhộng tằm; (3) Phun dịch giống nấm gây nhiễm lên sâu non tằm dâu ở tuổi 5 (giai đoạn ăn rỗi chuẩn bị hóa nhộng).

4. Phương pháp xử lý số liệu:

  • Số liệu thí nghiệm được thu thập, xử lý thống kê sinh học để xác định các giá trị trung bình, sai số, phân tích phương sai, tính khoảng sai biệt nhỏ nhất có ý nghĩa ($LSD$) và xác suất kiểm tra của chuẩn Fisher ($Fpr$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu

Chương 1 cung cấp cơ sở lý luận về giới Nấm, đặc điểm hình thái giải phẫu của hệ sợi, thể quả đệm, nang nấm, bào tử hữu tính và vô tính; phân tích chi tiết chu trình sống và cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng. Chương này điểm luận chi tiết tình hình nghiên cứu ĐTHT trên thế giới và ở Việt Nam về thành phần loài, hóa học lập thể của các hợp chất có hoạt tính sinh học, giá trị dược liệu và công nghệ nuôi trồng.

Bên cạnh đó, chương 1 tổng hợp các số liệu định lượng về thành phần hóa học, nguyên tố khoáng, acid amin và vitamin của nấm Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) từ công trình của Kikuchi và cộng sự (2004):

Bảng 1: Thành phần sinh hóa và nguyên tố khoáng trong nấm Đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes

STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Hàm lượng
1 Protein % chất khô 7,75
2 Mannitol % chất khô 1,21
3 Lipid % chất khô 7,77
4 Đồng (Cu) mg/kg 21,1
5 Sắt (Fe) mg/kg 43,9
6 Mangan (Mn) mg/kg 22,2
7 Selen (Se) mg/kg 0,32
8 Kẽm (Zn) mg/kg 2,55
9 Canxi (Ca) mg/10g 12,0
10 Crom (Cr) $\mu$g/10g 0,80
11 Kali (K) mg/10g 186,0
12 Natri (Na) mg/10g 3,0

Bảng 2: Thành phần 18 acid amin trong nấm Đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes

STT Tên acid amin Hàm lượng (%) STT Tên acid amin Hàm lượng (%)
1 Arginine 5,30 10 Valin 1,00
2 Tyrosine 2,89 11 Threonine 0,83
3 Proline 2,83 12 Histidine 0,80
4 Lysine 2,66 13 Serin 0,73
5 Glutamic acid 2,46 14 Isoleucin 0,69
6 Asparatic acid 1,44 15 Tryptophan 0,29
7 Leucin 1,44 16 Methionine 0,25
8 Alanin 1,40 17 Cystine 0,12
9 Phenylalanine 1,30 18 Glycin 1,32

Bảng 3: Hàm lượng vitamin trong nấm Đông trùng hạ thảo Isaria tenuipes

STT Chỉ tiêu Đơn vị tính Hàm lượng
1 Vitamin D mg/10g 242,0
2 Vitamin B1 $\mu$g/10g 89,4
3 Vitamin B6 $\mu$g/10g 19,1
4 Vitamin C mg/10g 1,25
5 Vitamin B3 mg/10g 0,37
6 Vitamin E mg/10g 0,23
7 Vitamin A mg/10g 0,12

Chương 1 cũng tổng kết điều kiện tự nhiên của khu vực nghiên cứu: VQG Hoàng Liên thuộc dãy Hoàng Liên Sơn, địa hình chia cắt phức tạp, độ dốc lớn, biên độ nhiệt độ và độ ẩm biến động mạnh theo đai cao, tạo nên các tiểu vùng khí hậu đặc thù cho sự phát triển của nấm côn trùng.

Chương 2: Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết kế hoạch thực nghiệm, quy cách thu mẫu, vật liệu sinh học và trang thiết bị nghiên cứu. Nội dung chương mô tả đầy đủ:

  • Kỹ thuật điều tra ô tiêu chuẩn và tuyến khảo sát thu mẫu nấm tự nhiên tại VQG Hoàng Liên.
  • Quy trình phân lập hệ sợi thuần khiết từ mẫu nấm tươi trên môi trường PDA, thạch chiết xuất cà rốt - sucrose (CSA), cao malt (MEA), và peptone yeast extract glucose (PYEG).
  • Quy trình ly trích rADN, khuếch đại gen bằng PCR và giải trình tự vùng ITS để giám định nguồn gen.
  • Bố trí các công thức thí nghiệm nhân giống dịch thể, thử nghiệm các chế độ nuôi trồng trên 3 nhóm giá thể (lỏng, rắn, nhộng tằm), các chỉ tiêu theo dõi về tỷ lệ nhiễm bệnh, thời gian hình thành mầm thể quả, tốc độ tăng trưởng chiều dài, đường kính và năng suất sinh khối thể quả đệm tươi/khô.
  • Phương pháp phân tích phương sai và xử lý thống kê sinh học ($Lsd, Fpr$).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

1. Thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo tại VQG Hoàng Liên:

  • Đã xác định được danh mục gồm 18 loài nấm ĐTHT thuộc 3 họ: Clavicipitaceae, Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae. Trong đó, phát hiện và ghi nhận 2 dạng mẫu nấm mới chưa định danh loài là Beauveria sp. và Isaria sp. (chủng HL15 và HL46).
  • Các loài tiêu biểu được giải phẫu và mô tả chi tiết hình thái thể quả đệm, túi bào tử, bào tử túi hoặc bào tử đính gồm: Beauveria bassiana, Beauveria sp., Cordyceps militaris, Cordyceps tenuipes (dạng vô tính Isaria tenuipes, dạng hữu tính Cordyceps takaomontana), Isaria cateniannulatus, Isaria sp., Ophiocordyceps annulata, Ophiocordyceps crinalis, Ophiocordyceps formicarum, Ophiocordyceps formosana, Ophiocordyceps nutans, Ophiocordyceps oxycephala, Ophiocordyceps sphaecocephala.

2. Đa dạng sinh học và đặc điểm phân bố:

  • Phân bố theo đai độ cao: Nhóm nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên xuất hiện tập trung ở các đai độ cao từ trung bình đến núi cao, nơi có ẩm độ không khí cao và nhiệt độ mát mẻ.
  • Phân bố theo sinh cảnh và độ tàn che: Tần suất bắt gặp mẫu nấm cao nhất tại các sinh cảnh rừng tự nhiên ít bị tác động, dưới tán rừng có độ tàn che lớn và lớp thảm mục ẩm dày.
  • Phân bố theo thời gian: Nấm ĐTHT xuất hiện nhiều vào các tháng có lượng mưa và độ ẩm cao trong năm (các đợt điều tra tháng 6 và tháng 8).
  • Đa dạng ký chủ: Xác định các loài nấm ký sinh trên các bộ côn trùng chủ yếu gồm bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Cánh cứng (Coleoptera), bộ Cánh màng (Hymenoptera), bộ Cánh nửa (Hemiptera/Homoptera).

3. Kết quả nghiên cứu nuôi trồng nấm Isaria tenuipes trên giá thể nhân tạo:

  • Tạo giống gốc: Đã xác định môi trường dịch thể thích hợp cho sự sinh trưởng hệ sợi nấm (công thức giống CT2 cho kết quả sinh trưởng hệ sợi tối ưu so với CT1).
  • Nuôi trồng trên giá thể lỏng: Xác định ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái; trong đó tốc độ lắc 150 vòng/phút cho mật độ sinh khối và khả năng hình thành mầm thể quả vượt trội so với tốc độ lắc 110 vòng/phút. Đồng thời xác định ngưỡng nhiệt độ không khí và pH môi trường tối ưu cho sự hình thành thể quả đệm.
  • Nuôi trồng trên giá thể rắn: Nấm hình thành thể quả đệm đồng đều trên cơ chất phối chế nhân tạo.
  • Nuôi trồng trên nhộng tằm: So sánh 3 phương thức lây nhiễm cho thấy: Phương thức phun dịch giống nấm lên sâu non tuổi 5 (ngay trước khi nhả tơ hóa nhộng) đạt tỷ lệ nhiễm nấm, tỷ lệ sống và khả năng phát sinh thể quả đệm cao nhất và đồng đều nhất, vượt trội so với phương thức tiêm trực tiếp vào nhộng hoặc phun dịch giống lên nhộng đã hình thành. Thể quả đệm thu được có màu vàng chanh đặc trưng, bao phủ lớp bột phấn bào tử màu trắng/kem tương tự như mẫu thu hái tự nhiên.

4. Xây dựng hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng: Luận án đã hoàn thiện 3 bản hướng dẫn kỹ thuật chi tiết:

  • Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I. tenuipes trên giá thể lỏng.
  • Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I. tenuipes trên giá thể rắn.
  • Hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm I. tenuipes trên ký chủ nhộng tằm.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  • Lần đầu tiên xây dựng được danh lục khoa học đầy đủ gồm 18 loài nấm Đông trùng hạ thảo thuộc 3 họ (Clavicipitaceae, Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae) phân bố tự nhiên tại VQG Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai; ghi nhận 2 dạng loài mới là Beauveria sp. và Isaria sp.
  • Cung cấp bộ cơ sở dữ liệu giải phẫu hiển vi (hình thái thể quả đệm, túi bào tử, bào tử nang, bào tử đính) kết hợp mã vạch sinh học rADN (vùng ITS) của các loài ĐTHT tại khu vực nghiên cứu.
  • Làm sáng tỏ các đặc tính phân bố sinh thái học (theo đai độ cao, sinh cảnh, độ tàn che tán rừng, mùa vụ xuất hiện) và mối quan hệ ký chủ giữa các loài nấm ĐTHT với các bộ côn trùng rừng tại VQG Hoàng Liên.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và công nghệ

  • Xây dựng thành công cơ sở khoa học và quy trình thực nghiệm nuôi trồng loài Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) trên cả 3 loại giá thể nhân tạo: giá thể lỏng, giá thể rắn và trên nhộng tằm.
  • Xác định được giải pháp kỹ thuật tối ưu trong việc nhân nuôi trên ký chủ côn trùng: lây nhiễm bào tử nấm vào sâu non tằm dâu ở tuổi 5 (trước khi hóa nhộng), giúp tăng tỷ lệ phát sinh thể quả đệm, giảm tỷ lệ hư hao so với phương pháp tiêm trực tiếp vào nhộng.
  • Ban hành 3 bộ hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm Isaria tenuipes trên giá thể lỏng, giá thể rắn và nhộng tằm, tạo tiền đề công nghệ để sản xuất dược liệu thương phẩm mang thương hiệu ĐTHT Sa Pa, phục vụ phát triển kinh tế - xã hội địa phương.

Kiến nghị, giải pháp đề xuất

  • Cần có biện pháp quản lý, bảo vệ nghiêm ngặt các sinh cảnh tự nhiên tại VQG Hoàng Liên nhằm bảo tồn nguồn gen nấm ĐTHT quý hiếm.
  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu thành phần hóa sinh và hoạt tính sinh học của 2 dạng loài mới (Beauveria sp. và Isaria sp.) phát hiện tại VQG Hoàng Liên.
  • Khuyến nghị chuyển giao quy trình kỹ thuật nuôi trồng nấm Isaria tenuipes trên nhộng tằm và giá thể rắn vào sản xuất bán công nghiệp để tạo sản phẩm hàng hóa phục vụ thị trường du lịch và chăm sóc sức khỏe.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Do điều kiện thời gian và nguồn lực nghiên cứu thực địa vùng núi cao hiểm trở, 2 dạng mẫu nấm (Beauveria sp. và Isaria sp.) mới chỉ được phân lập và mô tả đặc điểm sinh học, chưa thể định danh chính xác đến bậc loài.
  • Các thí nghiệm nuôi trồng thể quả mới chỉ tập trung chuyên sâu trên một đối tượng là loài Isaria tenuipes, chưa mở rộng thử nghiệm quy trình nhân nuôi cho các loài có giá trị dược liệu cao khác trong khu hệ (như Cordyceps militaris, Ophiocordyceps nutans).
  • Quy trình nuôi trồng nhân tạo mới được tối ưu hóa ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa triển khai thử nghiệm ở quy mô công nghiệp đại trà.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Tiếp tục giải trình tự mở rộng đa gen để định danh chính xác bậc phân loại của 2 mẫu Beauveria sp. và Isaria sp.
  • Nghiên cứu sâu hơn về thành phần các hợp chất trao đổi bậc hai, hoạt tính ức chế tế bào ung thư và thử nghiệm tiền lâm sàng đối với sinh khối nấm Isaria tenuipes nuôi trồng nhân tạo tại Việt Nam.
  • Mở rộng thử nghiệm hoàn thiện công nghệ nuôi trồng thể quả cho các loài nấm ĐTHT quý hiếm khác thu thập được tại VQG Hoàng Liên.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo đối với các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên ngành Quản lý tài nguyên rừng, Lâm học, Sinh học, Bảo vệ thực vật, Công nghệ sinh học: Tham khảo phương pháp điều tra thực địa nấm côn trùng, kỹ thuật giải phẫu hiển vi nấm túi, phương pháp phân lập thuần khiết và quy trình định danh sinh học phân tử qua vùng gen ITS rDNA.
  • Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các Viện, Trường Đại học: Sử dụng các dẫn liệu về thành phần loài, phổ ký chủ và đặc tính sinh thái của 18 loài nấm ĐTHT tại VQG Hoàng Liên làm tài liệu giảng dạy môn Tài nguyên Nấm, Đa dạng sinh học và Dược liệu rừng.
  • Các nhà hoạch định chính sách, cơ quan quản lý rừng đặc dụng (Ban quản lý VQG Hoàng Liên, Chi cục Kiểm lâm Lào Cai): Sử dụng danh mục nguồn gen và bản đồ phân bố để xây dựng chiến lược bảo tồn đa dạng sinh học và quy hoạch khai thác dược liệu bền vững.
  • Các doanh nghiệp sản xuất nấm dược liệu và công nghệ sinh học: Trực tiếp ứng dụng 3 hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng nấm Isaria tenuipes trên giá thể lỏng, giá thể rắn và nhộng tằm để phát triển sản phẩm thương mại.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã ghi nhận bao nhiêu loài nấm Đông trùng hạ thảo tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên? Trả lời: Luận án đã xác định được danh mục gồm 18 loài nấm ĐTHT thuộc 3 họ: Clavicipitaceae, Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae; trong đó có 2 dạng mẫu nấm mới được ghi nhận là Beauveria sp. và Isaria sp.

2. Loài nấm nào được lựa chọn để nghiên cứu quy trình nuôi trồng nhân tạo và tên đồng nghĩa của nó là gì? Trả lời: Loài nấm được lựa chọn nuôi trồng là Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes (Peck) Samson). Loài này có hai tên đồng nghĩa là Isaria japonica Yasuda và Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson; là dạng sinh sản vô tính của loài Cordyceps takaomontana Yakush. & Kumaz.

3. Phương thức lây nhiễm nấm Isaria tenuipes nào trên nhộng tằm cho kết quả tốt nhất? Trả lời: Trong 3 phương thức thử nghiệm (tiêm dịch nấm vào nhộng, phun dịch nấm lên nhộng, và phun dịch nấm lên sâu non tuổi 5), phương thức phun dịch giống nấm lên sâu non tằm dâu ở tuổi 5 (giai đoạn trước khi hóa nhộng) cho kết quả tốt nhất về tỷ lệ nhiễm bệnh, tỷ lệ sống và khả năng phát sinh thể quả đệm đồng đều.

4. Trong các thí nghiệm nuôi nấm Isaria tenuipes trên giá thể lỏng, tốc độ lắc nào mang lại hiệu quả sinh trưởng hệ sợi cao hơn? Trả lời: Thí nghiệm so sánh cho thấy tốc độ lắc 150 vòng/phút mang lại khả năng sinh trưởng hệ sợi nấm và tạo mầm thể quả đệm tốt hơn so với tốc độ lắc 110 vòng/phút.

5. Thành phần hoạt chất sinh học và khoáng chất chính trong sinh khối nấm Isaria tenuipes gồm những gì? Trả lời: Sinh khối Isaria tenuipes chứa protein (7,75%), lipid (7,77%), mannitol (1,21%), cùng các nguyên tố khoáng như Kali (186,0 mg/10g), Canxi (12,0 mg/10g), Sắt (43,9 mg/kg), Mangan (22,2 mg/kg), Đồng (21,1 mg/kg), Kẽm (2,55 mg/kg), Selen (0,32 mg/kg); 18 loại acid amin (tiêu biểu: Arginine 5,30%, Tyrosine 2,89%, Proline 2,83%, Lysine 2,66%, Glutamic acid 2,46%) và giàu các vitamin D, B1, B6, C, B3, E, A.

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Lâm nghiệp của tác giả Hoàng Quốc Bảo đã hoàn thành việc điều tra, giám định và lập danh mục 18 loài nấm Đông trùng hạ thảo thuộc 3 họ tại VQG Hoàng Liên, bổ sung 2 dạng mẫu mới (Beauveria sp. và Isaria sp.) cho khu hệ nấm Việt Nam. Công trình đã làm sáng tỏ các quy luật phân bố sinh thái học và phổ ký chủ côn trùng của nấm ĐTHT tại vùng núi cao Hoàng Liên. Đồng thời, nghiên cứu đã xây dựng thành công cơ sở khoa học và 3 bộ hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng loài nấm dược liệu Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) trên giá thể lỏng, giá thể rắn và nhộng tằm với giải pháp lây nhiễm tối ưu ở sâu non tuổi 5. Kết quả của luận án đóng góp quan trọng cả về mặt lý luận bảo tồn tài nguyên nấm rừng lẫn thực tiễn phát triển công nghệ sản xuất nấm dược liệu thương phẩm tại Việt Nam.