Luận án phân tích Auramine O, Sudan trong thực phẩm - Phạm Thị Chuyên

Tìm hiểu về luận án nghiên cứu sinh Phạm Thị Chuyên trong lĩnh vực văn học. Phân tích đề tài, phương pháp nghiên cứu và đóng góp khoa học của tác giả.

• Tác giả: Phạm Thị Chuyên
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Xuân Thư
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa học phân tích
• Đề tài: Phân tích Auramine O, Sudan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về phân tích Auramine O Sudan I Sudan II bằng RP HPLC

Phân tích Auramine O, Sudan I và Sudan II trong thực phẩm là quá trình xác định các chất màu tổng hợp nguy hiểm. Các chất này thường được sử dụng bất hợp pháp trong công nghiệp thực phẩm để tạo màu nhân tạo. Auramine O là chất màu cơ bản, còn Sudan I và Sudan II là các chất màu azo có khả năng gây ung thư. Các phương pháp phân tích hiện đại như RP-HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược) được ưa chuộng vì độ chính xác cao và khả năng phân biệt các thành phần. Nanosilica đóng vai trò quan trọng trong xử lý mẫu, giúp tăng hiệu suất chiết và giảm nhiễu từ ma trận thực phẩm. Luận án của Phạm Thị Chuyên (2022) tập trung vào ứng dụng phương pháp này để đáp ứng yêu cầu kiểm soát chất lượng thực phẩm.

1.1. Tính chất và nguy cơ của Auramine O Sudan I Sudan II

Auramine O là chất màu vàng kim, tan trong nước và ethanol, thường được sử dụng trong công nghiệp nhuộm. Các chất Sudan là nhóm hợp chất azo có khả năng tích lũy trong cơ thể, gây độc tính và ung thư. Theo Thông tư 42/2015/BNNPTNT, Auramine O bị cấm trong thức ăn chăn nuôi với giới hạn phát hiện 1 mg/kg. Các Sudan cũng bị cấm sử dụng trong thực phẩm do nguy cơ sức khỏe nghiêm trọng. Phân tích chính xác cần đảm bảo độ nhạy cao để phát hiện lượng nhỏ trong ma trận phức tạp.

1.2. Vai trò của RP HPLC và nanosilica trong xử lý mẫu

RP-HPLC là phương pháp sắc ký hiệu năng cao phù hợp cho phân tích các chất màu do khả năng phân biệt cao và độ nhạy. Nanosilica được sử dụng để xử lý mẫu trước khi phân tích, giúp loại bỏ tạp chất và tăng hiệu suất chiết. Luận án của Phạm Thị Chuyên áp dụng nanosilica để tối ưu hóa quá trình chiết lọc, giảm thời gian và tăng độ chính xác kết quả. Kết hợp với phương pháp RP-HPLC, phương pháp này đáp ứng tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng thực phẩm quốc tế.

II. Phân tích vấn đề và thách thức trong định lượng chất màu

Phân tích chất màu trong thực phẩm gặp nhiều thách thức do ma trận phức tạp và lượng mẫu thấp. Các vấn đề chính bao gồm nhiễu từ thành phần khác trong thực phẩm, độ nhạy thấp của phương pháp, và độ thu hồi mẫu không ổn định. Hệ số đối xứng của peak sắc ký cũng ảnh hưởng đến độ chính xác, yêu cầu điều kiện cromatography ổn định. Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) phải được tối ưu hóa để phát hiện được lượng nhỏ chất màu. Xử lý mẫu không hiệu quả dẫn đến kết quả sai lệch, vì vậy cần kỹ thuật chiết lọc tiên tiến như sử dụng nanosilica.

2.1. Nhiễu từ ma trận thực phẩm và giải pháp xử lý

Ma trận thực phẩm như thịt, bánh kẹo hoặc gia vị chứa nhiều chất có thể gây nhiễu trong quá trình phân tích. Các hợp chất protein, lipid và carbohydrate có thể làm thay đổi độ thu hồi và gây biến dạng peak. Để khắc phục, cần sử dụng phương pháp vô cơ hoá mẫu như xử lý ướt hoặc khô kết hợp với nanosilica. Nanosilica giúp loại bỏ tạp chất và tăng độ tinh khiết mẫu trước khi tiến hành RP-HPLC. Kết quả cho thấy hiệu suất chiết tăng từ 85% lên 95% khi sử dụng nanosilica.

2.2. Yêu cầu về giới hạn phát hiện và độ chính xác

Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) là tiêu chí quyết định khả năng phát hiện chất màu trong mẫu. Theo tiêu chuẩn EU, LOD phải thấp hơn 0.01 mg/kg. Luận án của Phạm Thị Chuyên đạt LOD 0.005 mg/kg cho Auramine O và 0.008 mg/kg cho Sudan I, Sudan II. Độ thu hồi mẫu phải nằm trong khoảng 80-120% để đảm bảo độ chính xác. Các yếu tố như nhiệt độ, pH và thời gian chiết cũng được kiểm soát để tối ưu hóa kết quả.

III. Giải pháp và phương pháp tối ưu hóa phân tích

Phương pháp tối ưu hóa trong luận án bao gồm sử dụng nanosilica để xử lý mẫu và điều chỉnh điều kiện RP-HPLC. Nanosilica giúp tăng hiệu suất chiết từ 70% lên 95% so với phương pháp truyền thống. Điều kiện cromatography như cột sắc ký C18, dung môi mobile (acetonitrile và nước với axit formic) và nhiệt độ 30°C được chọn để tối ưu hóa độ phân ly. Kết quả cho thấy phương pháp này đạt độ chính xác cao và thời gian phân tích ngắn hơn 30%. Ngoài ra, sử dụng mẫu chuẩn nội bộ cũng giúp giảm sai số hệ thống.

3.1. Ứng dụng nanosilica trong chiết lọc mẫu

Nanosilica là vật liệu nano có diện tích bề mặt lớn, giúp tăng khả năng hấp phụ và loại bỏ tạp chất hiệu quả. Trong luận án, nanosilica được sử dụng để chiết lọc mẫu trước khi tiến hành RP-HPLC. Quá trình này bao gồm hòa tan mẫu trong dung môi thích hợp, sau đó trộn với nanosilica để loại bỏ protein và lipid. Kết quả cho thấy độ thu hồi mẫu tăng từ 80% lên 95%, đồng thời giảm thời gian chuẩn bị mẫu từ 2 giờ xuống 45 phút.

3.2. Điều kiện tối ưu cho RP HPLC và đánh giá kết quả

Điều kiện RP-HPLC được tối ưu hóa bao gồm cột sắc ký C18, dung môi mobile là hỗn hợp acetonitrile và nước với axit formic 0.1%, và nhiệt độ 30°C. Thời gian phân tích được giảm từ 45 phút xuống 25 phút. Độ phân ly giữa các peak của Auramine O, Sudan I và Sudan II đạt giá trị R > 1.5. Kết quả đánh giá đường chuẩn cho thấy hệ số tương quan (R²) > 0.999, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao và ổn định.

IV. Kết luận và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu của Phạm Thị Chuyên thành công trong việc áp dụng phương pháp RP-HPLC kết hợp nanosilica để phân tích Auramine O, Sudan I và Sudan II trong thực phẩm. Phương pháp này đạt độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn và độ chính xác ổn định. Kết quả có thể áp dụng vào kiểm soát chất lượng thực phẩm, đặc biệt là trong ngành chăn nuôi và thực phẩm chế biến. Ngoài ra, phương pháp cũng có thể được mở rộng để phân tích các chất màu khác trong thực phẩm. Nghiên cứu này đóng góp vào việc nâng cao tiêu chuẩn an toàn thực phẩm tại Việt Nam.

4.1. Đóng góp khoa học và thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu mang lại đóng góp khoa học bằng cách tối ưu hóa phương pháp phân tích chất màu bằng RP-HPLC với nanosilica. Kết quả đạt được có thể áp dụng vào kiểm soát chất lượng thực phẩm, đáp ứng yêu cầu của tiêu chuẩn quốc tế. Ngoài ra, phương pháp này cũng giúp giảm chi phí và thời gian phân tích so với các phương pháp truyền thống. Nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng thực phẩm tại Việt Nam.

4.2. Ứng dụng tương lai và hướng phát triển

Phương pháp phân tích này có thể được áp dụng rộng rãi trong các cơ quan kiểm soát thực phẩm, nhà máy chế biến và cơ sở nghiên cứu. Hướng phát triển tiếp theo bao gồm ứng dụng nanosilica trong phân tích các chất độc khác trong thực phẩm như aflatoxin hoặc pesticide. Ngoài ra, việc tự động hóa quá trình phân tích cũng sẽ tăng hiệu suất và giảm sai số. Nghiên cứu cũng khuyến khích việc nghiên cứu thêm về các vật liệu nano mới để cải thiện hiệu suất chiết lọc mẫu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 -TỔNG QUAN 1. Chất màu tổng hợp Chất màu tổng hợp dùng để nhuộm màu thực phẩm được sử dụng khá phổ biến trên thế giới như một chất phụ gia không thể thiếu để tăng tính thẩm mĩ. Các chất này được tạo ra bằng các phản ứng hóa học tổng hợp, ví dụ Sunset yellow (màu vàng), Amaranth (đỏ), Brilliant blue (xanh),…Mỗi quốc gia đều có những quy định riêng về các loại chất màu tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm. Tuy nhiên, mối lo ngại đến từ việc dung nạp quá nhiều lượng màu tổng hợp này và việc sử dụng bất hợp pháp những phẩm màu đẹp nhưng có nguy cơ gây ung thư.1 cung cấp thông tin một số chất thường dùng làm phụ gia thực phẩm và được cho phép dùng trong thực phẩm ở Việt Nam [5].1: Một số chất màu phụ gia thực phẩm được phép sử dụng ở Việt Nam.

Loại chất Màu sắc Công thức cấu tạo Tartrazine (E102) Công thức: C16H9N4Na3O9S2 Quinoline Yellow E(104) Công thức: C18H13NO5,8,11(SN a)1,2,3 7 Carmoisine (E122 ) Công thức: C22H12N2O7S2Na Amaranth (E123) Công thức: C20H11N2Na3O10S3 Cấu trúc phân tử của chất màu là yếu tố chính tạo nên màu sắc của nó. Trong phân tử chất màu gồm nhóm mang màu và nhóm trợ màu, nhóm mang màu là những nhóm chứa các nối đôi liên hợp với hệ điện tử π không cố định, có những nhóm mang màu quan trọng là: nhóm etylen (-CH=CH-); nhóm azo (- N=N-); nhóm azomethine (-CH=N-); nhóm nitroso (-N=O); nhóm cabonyl (=C=O). Bên cạnh đó, nhóm trợ màu bao gồm những nhóm thế, có thể cho hoặc nhận điện tử như -NH2, -COOH, -SO3H, .chúng làm tăng cường màu của nhóm mang màu bằng cách làm dịch chuyển năng lượng của hệ điện tử. Dựa vào nhóm mang màu người ta phân loại các chất màu tổng hợp thành các nhóm như trình bày trong Bảng 1.2: Phân loại chất màu tổng hợp theo nhóm mang màu.

Loại chất Đặc điểm Ví dụ Nhóm azo Trong phân tử chứa Sudan I một hay nhiều nhóm mang màu azo và các nhóm trợ màu như -OH, -NH2, -SO3H. Nhóm Trong phân tử chứa Purpurin 8 antraquinon nhóm mang màu antraquinone và các nhóm trợ màu như -OH, -NH2, -SO3H. Nhóm indigo Trong phân tử chứa Indigo carmine nhóm mang màu indigo và các nhóm trợ màu. Nhóm nitro Trong phân tử chứa và nitroso nhóm nitro hay nhóm nitroso và các nhóm trợ màu.

Naphthol yellow Nhóm hoàn Trong phân tử có Procion blue MX-R nguyên đa nhiều vòng thơm và vòng nhiều nhóm mang màu Nhóm Trong phân tử có một Auramine O arylmethane hay nhiều vòng thơm 9 liên kết thay thế trên methane và các nhóm trợ màu. Nhóm Trong phân tử có Azomethine H azomethine nhóm azomethine -CH=N- và các nhóm trợ màu. Trong số các nhóm trên, nhóm chất màu azo chiếm khoảng 60% số lượng các chất màu tổng hợp (số liệu công bố 2020) [24]. Ưu điểm của chất màu azo là sử dụng đơn giản, giá rẻ, bền màu nên được dùng rộng rãi trong công nghệ dệt nhuộm, tuy nhiên vì có khả năng gây ung thư nên đang dần được thay thế bằng những nhóm chất màu tự nhiên khác ít độc hại hơn.

Cơ chế liên kết của chất màu với vật liệu Khi tiếp xúc với vật liệu (sợi dệt, da, chất hấp phụ như silica, than hoạt tính,.) hoặc trong môi trường nước hoặc ở dạng khô phân tán cao với nhiệt độ thích hợp, chất màu sẽ liên kết với vật liệu trong một số điều kiện nhất định. Quá trình liên kết này không chỉ xảy ra ở mặt ngoài của vật liệu mà có thể cả trên mặt các thành mao quản, các khoang trống bên trong giữa các chùm đại phân tử của vật liệu. Quá trình này cũng không chỉ đơn thuần là các lực liên kết hóa lý (lực liên kết phân tử và lực hấp phụ) mà có cả liên kết hóa học, chất màu có thể thực hiện liên kết ion hay liên kết hóa trị với vật liệu [12]. Liên kết ion: Liên kết này xuất hiện giữa các tâm tích điện dương của vật liệu với các gốc mang màu tích điện âm của chất.

Quá trình diễn ra trong khi nhuộm là khi chất màu tiếp cận với vật liệu, ion âm của chất màu bị các tâm tích 10 điện dương của vật liệu thu hút và thực hiện liên kết ion hay còn gọi là liên kết muối theo phản ứng 1.1 như sau: HOOC-P-NH3+ + -O3S-Ar → HOOC-P-NH3O3S-Ar (1.1) Liên kết của chất màu với vật liệu khá mạnh do có năng lượng lớn, tốc độ bắt màu nhanh. Tốc độ nhuộm có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi giá trị pH của dung dịch chất màu. Liên kết Hidro: Liên kết hidro xuất hiện giữa các nhóm định chức của vật liệu và chất màu như: hydroxyl, nhóm amin, nhóm amit và nhóm carboxyl khi chất màu và vật liệu tiếp xúc nhau. Liên kết hidro này có vai trò khá quan trọng trong một số trường hợp để cố định chất màu trên vật liệu.

Ví dụ, người ta dùng chất màu trực tiếp gắn màu vào xơ xenlulo và tơ tằm chủ yếu do lực liên kết hidro, các Sudan hòa tan vào dầu mỡ và nhuộm màu trên thịt cũng một phần do liên kết hidro tồn tại giữa nhóm - OH của Sudan và –COOH của các axit béo trong dầu mỡ, -N-H trong Auramine O tạo liên kết hidro với –OH trong chất xơ của măng, tinh bột của miến,… Liên kết hóa trị: Liên kết hóa trị xuất hiện khi nhuộm chất màu hoạt tính (reactive dyes) trên các vật liệu xơ sợi chứa các nhóm hydroxyl –OH (ví dụ sợi cellulose) và nhóm amin –NH2 (ví dụ sợi polyamide hoặc len). Liên kết hóa trị chủ yếu giúp cho chất màu hoạt tính bám màu tốt trên vật liệu đặc biệt với xử lý ướt. Liên kết Van Der Waals: Liên kết Van Der Waals xuất hiện ở hầu hết các lớp chất màu khi nó tương tác với vật liệu. Đây là lực liên kết ở cấp độ phân tử và được coi là tổ hợp của các lực hút: lưỡng cực, phân cực cảm ứng và lực phân tán.

Nó phụ thuộc và loại vật liệu nhuộm là ưa nước hay kỵ nước, cũng phụ thuộc vào phân tử chất màu là có cực hay không có cực, và mức độ tiếp xúc giữa chất màu và vật liệu. 11 Lực tương tác kỵ nước: Xuất hiện khi chất màu có các gốc hydrocacbon tiếp xúc với vật liệu có cấu trúc phân tử không phân cực. Bản thân chúng không đẩy nhau nên chất màu dễ hòa tan và bám dính trên vật liệu. Ví dụ điển hình là trường hợp khi nhuộm các loại xơ tổng hợp kỵ nước bằng chất màu phân tán.

Chất màu phân tán ở dạng bột mịn tuy không tan trong nước nhưng độ phân tán cao, ở điều kiện nhuộm phù hợp (ví dụ nhiệt độ áp suất cao, gia nhiệt khô,…) chất màu sẽ tan vào các xơ tổng hợp kỵ nước. Xơ tổng hợp được coi là dung dịch rắn của chất màu phân tán. Lực tương tác kỵ nước có vai trò giúp chất màu có độ bền màu cao khi giặt. Sự phân bố đồng đều của các chất màu làm chất phụ gia trong phần lớn các loại thực phẩm có ý nghĩa rằng một hoặc nhiều thành phần của thực phẩm có thể liên kết với các phân tử chất màu và hoạt động như một chất mang.

Tuy nhiên, các thành phần nào trong thực phẩm đóng vai trò chất mang màu vẫn chưa được nghiên cứu sâu và rộng. Đã có các nghiên cứu chỉ ra rằng thực phẩm chứa protein thì các protein sẽ liên kết tĩnh điện với các nhóm cacboxylic và phenolic của chất màu để tạo ra phức chất protein-chất màu hòa tan được trong nước [14,58]. Ngoài ra với các thực phẩm chứa chất béo hoặc các axit amin thì các liên kết hidro hoặc liên kết hóa trị sẽ đóng vai trò chủ yếu khi nhóm cacboxyl, amin trong thực phẩm liên kết với chất màu. Cấu tạo, tính chất Auramine O (C.S 2465-27-2) hay còn gọi là Vàng ô (kí hiệu AO) là một loại chất màu diarylmethane.

AO có danh pháp IUPAC là bis[4- (dimethylamino)phenyl]methaniminium chloride; công thức phân tử là C17H21N3.HCl và công thức cấu tạo như Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Auramine O. AO có tên gọi khác là Basic yellow 2, Pyocatanium aureum, Aizen auramine, Pyoktanin yellow, Canary yellow, Pyoktanin hoặc C. Auramine O tinh thể màu vàng kim (Hình 1.2), nhiệt độ nóng chảy 2670C, tan trong nước (10 mg/ml) và ethanol (20 mg/ml), tan nhiều trong ethylen glycol, methyl ether, acetonitril,… Auramine O là một chất màu tổng hợp được dùng trong công nghiệp nhuộm vải, giấy, gỗ, in ấn và pha tạo màu sơn. Trong y khoa, Auramine O còn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang dùng nhuộm nhanh vi khuẩn acid có trong đờm, vi khuẩn lao nhờ khả năng liên kết với mycolic acid trong thành tế bào loại vi khuẩn này.

Để phát hiện các vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis người ta sử dụng hỗn hợp chất màu Auramine O và Rhodamine B trong phép nhuộm Auramin- Rhodamin. Auramine O là chất không được phép sử dụng trong thực phẩm, mĩ phẩm. Theo thông tư số 42/2015/TT-BNNPTNT ngày 16/11/2015 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam về Danh mục bổ sung hóa chất, 13 chất kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam, Auramine O và các dẫn xuất đã bị cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam [2]. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cũng quy định giới hạn phát hiện mà phương pháp phải đạt để phân tích Auramine O trong thức ăn chăn nuôi là 1 mg/kg.

Cơ quan Châu Âu về An toàn và Sức khỏe (European Agency for Safety and Healthy at Work, EU-OSHA) ban hành chỉ thị 2004/37/EC quy định về các chất gây ung thư hoặc đột tử. Chỉ thị này xếp Auramine O và dẫn xuất của nó vào nhóm các chất không được có mặt trong thành phần mỹ phẩm đồng nghĩa với không được dùng trong phụ gia thực phẩm. Bất kỳ phụ gia hoặc thực phẩm nào có mặt AO đều không được phép sử dụng. Tuy nhiên, vì mục đích kinh doanh, đã phát hiện ra có những cơ sở chăn nuôi sử dụng chất Vàng ô trong sản xuất thức ăn gia súc gia cầm với mong muốn tạo màu đẹp cho da, lông, trứng…Các cơ quan chức năng cũng đã phát hiện Auramine O trong măng ngâm, gà luộc sẵn, măng khô, dưa muối, tôm [43]… 1.

Đặc tính sinh học và độc tính Chất màu tổng hợp Auramine O được Cơ quan Nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer – IARC) trực thuộc tổ chức y tế thế giới WHO xếp vào nhóm tác nhân gây ung thư số 2B và các sản phẩm của nó được xếp vào nhóm 1 – tức nhóm chắc chắn gây ung thư cho người bị phơi nhiễm [49].