Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu và Phân lập Enzyme Laccase từ Chủng Nấm tại Vườn Quốc Gia Bidoup - Núi Bà

• Tác giả: Trần Thị Thu Hiền
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Cẩm Hà
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu và Phân lập Enzyme Laccase từ Chủng Nấm tại Vườn Quốc Gia Bidoup - Núi Bà
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm tự nhiên của Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà
• 1.2. Giới thiệu về laccase
• 1.3. Cấu trúc của phân tử laccase
• 1.4. Cơ chế xúc tác của laccase
• 1.5. Chất gắn kết
• 1.6. Tính chất của laccase
• 1.7. pH tối ưu và độ bền pH
• 1.8. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt
• 1.9. Hằng số động học của phản ứng laccase
• 1.10. Chất ức chế laccase
• 1.11. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase
• 1.12. Gene mã hóa enzyme laccase
• 1.13. Ứng dụng của laccase
• 1.13.1. Xử lý rác thải và loại màu thuốc nhuộm
• 1.13.2. Ứng dụng xử lý khí độc môi trường ô nhiễm và chuyển hóa polymer mạch dài
• 1.13.3. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
• 1.13.4. Ứng dụng trong công nghệ dược phẩm và công nghệ nano
• 1.13.5. Các ứng dụng khác của laccase
• 1.14. Chi Polyporus và những đặc tính của nó
• 1.15. Thuốc nhuộm và các đặc tính cơ bản của chúng
• 1.15.1. Khái quát và phân loại về thuốc nhuộm
• 1.16. Khả năng phân hủy, loại màu thuốc nhuộm bởi vi sinh vật sinh laccase
• 1.17. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và tác hại
• 1.17.1. Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm do thuốc nhuộm
• 1.17.2. Tác hại của ô nhiễm thuốc nhuộm
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu và phương pháp
• 2.2. Các môi trường nuôi cấy
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
• 2.3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
• 2.3.3. Phương pháp thu dịch laccase trên môi trường lên men lỏng để xác định hoạt tính
• 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase
• 2.3.5. Phân loại chủng nấm. Phân loại theo phương pháp truyền thống
• 2.3.6. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS
• 2.3.7. Phương pháp xác định trình tự vùng ITS. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp laccase
• 2.3.7.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
• 2.3.7.2. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng
• 2.3.7.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
• 2.3.7.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
• 2.3.7.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ
• 2.3.7.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ
• 2.4. Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase thô từ chủng nấm FBD154
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
• 3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
• 3.3. Đặc điểm hình thái, phân loại và định danh chủng nấm FBD154
• 3.3.1. Đặc điểm hình thái
• 3.3.2. Phân loại chủng FBD154
• 3.3.3. Phân loại theo phương pháp truyền thống
• 3.3.4. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2)
• 3.4. Chọn lọc môi trường và điều kiện nuôi cấy
• 3.4.1. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp.
• 3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp.
• 3.4.3. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp.
• 3.4.4. Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 môi trường lên khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp.
• 3.4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp.
• 3.4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp.
• 3.4.6.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ
• 3.4.6.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ
• 3.5. Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng enzyme thô sinh tổng hợp từ chủng nấm Polyporus sp.
• 3.5.1. Khả năng loại màu nhóm anthraquinone (RBBR, NY5) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.
• 3.5.2. Khả năng loại màu azo (NY1, NY7) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.
• 3.5.3. Khả năng loại màu thương mại (CLS và LF-2B) bởi laccase thô của chủng Polyporus sp.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Enzyme Laccase Từ Nấm Bidoup Núi Bà

Nghiên cứu về enzyme laccase từ các chủng nấm bản địa đang thu hút sự quan tâm lớn bởi tiềm năng ứng dụng rộng rãi của chúng. Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, với hệ sinh thái rừng phong phú, là một kho tàng tiềm năng để khám phá các chủng nấm có khả năng sản sinh laccase với các đặc tính ưu việt. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc tính của các chủng nấm đảm thu thập từ vườn quốc gia này, nhằm khai thác nguồn enzyme laccase phục vụ các ứng dụng khác nhau. Việc này góp phần vào việc bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển các giải pháp sinh học bền vững.

1.1. Vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà Nguồn Tài Nguyên Nấm Tiềm Năng

Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà có địa hình phức tạp, khí hậu đa dạng tạo điều kiện cho sự phát triển của nhiều loài nấm khác nhau. Nghiên cứu hệ nấm tại đây còn hạn chế, đặc biệt là các loài nấm có khả năng sinh enzyme laccase. Sự đa dạng sinh học cao và môi trường sống đặc biệt tạo nên tiềm năng lớn cho việc tìm kiếm các chủng nấm mới với các đặc tính enzyme độc đáo. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào nấm cộng sinh, trong khi nấm ngoại sinh và các vi sinh vật khác còn ít được quan tâm.

1.2. Ứng Dụng Tiềm Năng Của Enzyme Laccase Phân Lập Từ Nấm

Enzyme laccase có nhiều ứng dụng quan trọng trong các lĩnh vực khác nhau như xử lý môi trường, công nghiệp dệt nhuộm, công nghệ thực phẩm, dược phẩm và công nghệ nano. Khả năng oxy hóa nhiều loại cơ chất khác nhau giúp laccase trở thành một công cụ hữu hiệu trong việc loại bỏ các chất ô nhiễm, phân hủy thuốc nhuộm và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ phức tạp. Nghiên cứu này hướng đến việc tìm kiếm các chủng nấm có khả năng sản xuất laccase với hoạt tính cao và các đặc tính phù hợp cho các ứng dụng cụ thể.

II. Thách Thức Trong Phân Lập và Nghiên Cứu Enzyme Laccase

Việc phân lập và nghiên cứu enzyme laccase từ nấm bản địa đối mặt với nhiều thách thức. Sự đa dạng sinh học lớn đòi hỏi các phương pháp sàng lọc hiệu quả để chọn lọc các chủng nấm có khả năng sinh laccase cao. Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cần được xác định để đạt được năng suất enzyme cao nhất. Ngoài ra, cần có các phương pháp phân tích và đánh giá hoạt tính enzyme chính xác để so sánh và lựa chọn các chủng nấm ưu việt. Cuối cùng, việc tinh sạch và ổn định enzyme cũng là một thách thức quan trọng để đảm bảo tính ứng dụng thực tiễn.

2.1. Sàng Lọc và Tuyển Chọn Chủng Nấm Sinh Laccase Hiệu Quả Cao

Việc sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh laccase hiệu quả cao đòi hỏi các phương pháp tiếp cận có hệ thống và hiệu quả. Các phương pháp sàng lọc truyền thống dựa trên khả năng tạo vòng halo trên môi trường thạch có chứa cơ chất đặc hiệu có thể được kết hợp với các phương pháp phân tích hoạt tính enzyme định lượng để đánh giá chính xác khả năng sinh laccase của từng chủng. Việc sử dụng các chất cảm ứng thích hợp cũng có thể giúp tăng cường khả năng sinh laccase của các chủng nấm được chọn lọc.

2.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Nuôi Cấy Để Tăng Sinh Tổng Hợp Laccase

Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp laccase của nấm. Các yếu tố như thành phần môi trường, pH, nhiệt độ, độ ẩm và sự có mặt của các chất cảm ứng đều có thể ảnh hưởng đến năng suất enzyme. Việc tối ưu hóa các yếu tố này đòi hỏi các thí nghiệm được thiết kế cẩn thận để xác định các điều kiện nuôi cấy phù hợp nhất cho từng chủng nấm. Các phương pháp thống kê và mô hình hóa cũng có thể được sử dụng để dự đoán và tối ưu hóa hiệu quả quá trình nuôi cấy.

2.3. Xác Định Hoạt Tính và Đặc Tính Enzyme Laccase Thuần Khiết

Để đánh giá tiềm năng ứng dụng của enzyme laccase, việc xác định chính xác hoạt tính và các đặc tính của enzyme là vô cùng quan trọng. Cần sử dụng các phương pháp sắc ký để tinh sạch enzyme, loại bỏ các tạp chất. Các phương pháp phân tích hoạt tính enzyme khác nhau, như phương pháp sử dụng ABTS, cần được áp dụng để đo lường khả năng xúc tác của enzyme đối với các cơ chất khác nhau. Các đặc tính như pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu và độ bền enzyme cũng cần được xác định để hiểu rõ hơn về đặc tính và phạm vi ứng dụng của enzyme.

III. Phương Pháp Phân Lập và Định Danh Chủng Nấm FBD154 Sinh Laccase

Nghiên cứu này đã áp dụng các phương pháp phân lập và định danh chủng nấm FBD154 từ Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà. Đầu tiên, các mẫu nấm được thu thập từ các khu vực khác nhau trong vườn quốc gia. Sau đó, các chủng nấm được phân lập bằng phương pháp cấy ria trên môi trường PDA. Chủng nấm FBD154 được chọn lọc dựa trên khả năng sinh laccase cao. Việc định danh chủng nấm được thực hiện bằng cả phương pháp truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và phương pháp sinh học phân tử bằng cách giải trình tự vùng ITS.

3.1. Thu Thập và Phân Lập Chủng Nấm Từ Mẫu Đất và Thực Vật Phân Hủy

Mẫu đất và các mẫu thực vật phân hủy là nguồn tiềm năng để phân lập các chủng nấm có khả năng sinh laccase. Các mẫu được thu thập từ các khu vực khác nhau trong Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà. Việc lựa chọn vị trí thu thập mẫu dựa trên sự đa dạng sinh học và sự hiện diện của các chất hữu cơ phức tạp, là cơ chất tiềm năng cho laccase. Các mẫu được xử lý và cấy trên môi trường PDA để phân lập các chủng nấm khác nhau.

3.2. Định Danh Chủng Nấm FBD154 Bằng Phương Pháp Truyền Thống và PCR ITS

Chủng nấm FBD154 được định danh bằng cả phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử. Phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, hệ sợi và cấu trúc sinh sản của nấm. Phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS của DNA nấm, sau đó giải trình tự và so sánh với các trình tự đã biết trong các cơ sở dữ liệu di truyền để xác định chủng nấm.

3.3. Xác Định Đặc Điểm Hình Thái và Cấu Trúc Tế Bào của Chủng Nấm

Nghiên cứu chi tiết về đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào của chủng nấm FBD154 được tiến hành. Việc quan sát hình thái khuẩn lạc, hệ sợi và cấu trúc sinh sản của nấm bằng kính hiển vi quang học giúp cung cấp thông tin quan trọng cho việc định danh và phân loại chủng nấm. Các đặc điểm này bao gồm hình dạng, màu sắc, kết cấu và tốc độ tăng trưởng của khuẩn lạc, cũng như hình dạng và kích thước của các tế bào nấm.

IV. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Nuôi Cấy Chủng Polyporus sp

Nghiên cứu đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để tăng cường khả năng sinh laccase của chủng Polyporus sp. FBD154. Các yếu tố như pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen và chất cảm ứng đã được khảo sát để xác định các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm và sự sản xuất enzyme. Kết quả cho thấy rằng pH, nguồn carbon và nitrogen thích hợp có thể làm tăng đáng kể hoạt tính laccase.

4.1. Ảnh Hưởng của pH Môi Trường Đến Khả Năng Sinh Tổng Hợp Laccase

pH môi trường nuôi cấy là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm và khả năng sinh tổng hợp laccase. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng từ 4.0 đến 7.0. Kết quả cho thấy pH tối ưu cho sự sinh trưởng và sản xuất laccase của chủng Polyporus sp. FBD154 nằm trong khoảng 5.0 - 6.0.

4.2. Tác Động Của Nguồn Cacbon và Nitơ Lên Quá Trình Sản Xuất Enzyme

Nguồn carbon và nitrogen là các chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự sinh trưởng của nấm và sản xuất laccase. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau như glucose, sucrose và tinh bột, cũng như các nguồn nitrogen khác nhau như ammonium sulfate, urea và peptone. Kết quả cho thấy rằng một số nguồn carbon và nitrogen nhất định có thể thúc đẩy quá trình sản xuất laccase hiệu quả hơn các nguồn khác.

4.3. Vai Trò của Chất Cảm Ứng Trong Việc Kích Thích Sản Xuất Laccase

Các chất cảm ứng có thể kích thích quá trình sản xuất laccase của nấm. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của một số chất cảm ứng như CuSO4 và veratryl alcohol. Kết quả cho thấy rằng việc bổ sung CuSO4 với nồng độ thích hợp vào môi trường nuôi cấy có thể làm tăng đáng kể hoạt tính laccase của chủng Polyporus sp. FBD154.

V. Ứng Dụng Laccase Thô Từ Polyporus sp

Nghiên cứu đã đánh giá khả năng loại màu của laccase thô thu được từ chủng Polyporus sp. FBD154 đối với một số loại thuốc nhuộm khác nhau. Kết quả cho thấy rằng laccase thô có khả năng loại bỏ màu hiệu quả đối với cả thuốc nhuộm azo và thuốc nhuộm anthraquinone. Hiệu quả loại màu có thể được tăng cường bằng cách bổ sung các chất trung gian redox.

5.1. Khả Năng Loại Màu Thuốc Nhuộm Azo và Anthraquinone của Laccase

Laccase có khả năng loại bỏ màu của nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau, bao gồm cả thuốc nhuộm azo và thuốc nhuộm anthraquinone. Cơ chế loại màu liên quan đến quá trình oxy hóa các liên kết trong phân tử thuốc nhuộm, dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc và mất màu. Hiệu quả loại màu phụ thuộc vào loại thuốc nhuộm, nồng độ laccase, pH và nhiệt độ.

5.2. Tăng Cường Hiệu Quả Loại Màu Bằng Chất Trung Gian Redox

Các chất trung gian redox có thể tăng cường hiệu quả loại màu của laccase. Các chất này hoạt động như các chất vận chuyển electron, giúp mở rộng phạm vi cơ chất của laccase và cải thiện khả năng oxy hóa các phân tử thuốc nhuộm khó phân hủy. Một số chất trung gian redox phổ biến bao gồm ABTS, HBT và violuric acid.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Enzyme Laccase

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và định danh chủng nấm Polyporus sp. FBD154 từ Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà, có khả năng sinh laccase cao. Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sản xuất enzyme đã được xác định. Laccase thô thu được từ chủng nấm này có tiềm năng ứng dụng trong việc loại bỏ màu thuốc nhuộm. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tinh sạch enzyme, nghiên cứu cơ chế loại màu và ứng dụng laccase trong xử lý nước thải.

6.1. Tinh Sạch và Nghiên Cứu Cấu Trúc Chức Năng Enzyme Laccase

Việc tinh sạch enzyme laccase là bước quan trọng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của enzyme một cách chi tiết. Các phương pháp sắc ký như sắc ký ái lực và sắc ký trao đổi ion có thể được sử dụng để tinh sạch enzyme từ dịch nuôi cấy. Sau khi tinh sạch, các phương pháp phân tích protein như điện di và khối phổ có thể được sử dụng để xác định khối lượng phân tử và cấu trúc protein.

6.2. Phát Triển Ứng Dụng Laccase Trong Xử Lý Ô Nhiễm Môi Trường

Laccase có tiềm năng lớn trong việc xử lý ô nhiễm môi trường, đặc biệt là ô nhiễm thuốc nhuộm và các hợp chất hữu cơ độc hại. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc phát triển các quy trình xử lý nước thải sử dụng laccase để loại bỏ các chất ô nhiễm. Việc sử dụng laccase cố định trên các vật liệu mang có thể cải thiện độ ổn định và khả năng tái sử dụng của enzyme.

Tổng quan nghiên cứu

Ô nhiễm môi trường do nước thải chứa thuốc nhuộm từ ngành công nghiệp dệt nhuộm đang là vấn đề cấp thiết toàn cầu, trong đó Việt Nam cũng không ngoại lệ. Theo ước tính, khoảng 10-20% thuốc nhuộm không bám vào sợi vải và bị thải ra môi trường, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm. Thuốc nhuộm azo chiếm khoảng 60-70% tổng số thuốc nhuộm tổng hợp, có khả năng gây đột biến và ung thư, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người và hệ sinh thái thủy sinh. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc tính của chủng nấm đảm sinh enzyme laccase có khả năng phân hủy thuốc nhuộm, thu thập từ Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. Nghiên cứu tập trung vào việc xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để tăng sinh tổng hợp laccase, đồng thời đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và thương mại bằng enzyme thô từ chủng nấm được chọn. Phạm vi nghiên cứu bao gồm thu thập mẫu nấm từ khu vực rừng kín thường xanh mưa ẩm á nhiệt đới tại Bidoup – Núi Bà, với điều kiện khí hậu đặc trưng nhiệt độ trung bình 18ºC, lượng mưa trung bình 1.755 mm/năm. Ý nghĩa nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ sinh học thân thiện môi trường trong xử lý nước thải dệt nhuộm, đồng thời khai thác nguồn enzyme ngoại bào bản địa có hiệu quả cao, giảm thiểu ô nhiễm và thúc đẩy phát triển bền vững ngành công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết enzyme oxy hóa khử, đặc biệt là enzyme laccase thuộc nhóm oxidoreductase, có khả năng oxy hóa đa dạng cơ chất như diphenol, polyphenol, amine thơm và các hợp chất hữu cơ phức tạp. Laccase có cấu trúc trung tâm xúc tác gồm 4 nguyên tử đồng phân bố thành ba nhóm T1, T2 và T3, chịu trách nhiệm cho quá trình oxy hóa cơ chất và khử oxy phân tử thành nước. Cơ chế xúc tác của laccase bao gồm chuyển electron từ cơ chất đến nguyên tử đồng T1, sau đó truyền đến cụm đồng T2/T3, cuối cùng oxy phân tử bị khử thành nước. Laccase có phổ cơ chất rộng nhờ sự hỗ trợ của các chất gắn kết (mediator) như HBT, VIO, ABTS, giúp oxy hóa các hợp chất có cấu trúc cồng kềnh hoặc có thế oxy hóa khử cao. Các khái niệm chính bao gồm: enzyme laccase, chất gắn kết, hoạt tính enzyme, pH và nhiệt độ tối ưu, hằng số Michaelis-Menten (Km), và khả năng loại màu thuốc nhuộm. Ngoài ra, mô hình phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8S - ITS2) được sử dụng để xác định chủng nấm đảm Polyporus sp. có hoạt tính laccase cao.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là 60 mẫu nấm thu thập từ gỗ mục và gỗ tươi tại Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. Các mẫu được phân lập trên môi trường PDA bổ sung guaiacol để sàng lọc chủng nấm sinh enzyme ngoại bào. Hoạt tính laccase được xác định bằng phương pháp đo quang phổ dựa trên oxy hóa ABTS ở bước sóng 420 nm, với đơn vị hoạt độ enzyme tính theo µM sản phẩm tạo thành/phút. Phân loại chủng nấm FBD154 được thực hiện kết hợp phương pháp truyền thống (quan sát hình thái khuẩn lạc và sợi nấm dưới kính hiển vi) và phương pháp phân tích trình tự vùng ITS bằng PCR và giải trình tự gen. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy gồm môi trường nuôi cấy (PDB, GYMP, Czapek, Mechi, TSH1, VIS), pH (2-11), nguồn cacbon (glucose, xylose, saccharose, rỉ đường, mannose, lactose), nguồn nitơ vô cơ (NaNO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4NO3, NH4Cl) và nguồn nitơ hữu cơ (cao malt, cao nấm men, cao thịt, peptone, tripton, casein). Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 2 lần, nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml, 200 vòng/phút, 30ºC. Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được đánh giá bằng phản ứng enzyme thô với nồng độ 1000 U/l, sử dụng các chất gắn kết như VIO, HBT, Si, Ace, Syr, trên các thuốc nhuộm nhóm anthraquinone (RBBR, NY5), azo (NY1, NY7) và màu thương mại (LF-2B, CLS). Phần trăm loại màu được tính dựa trên sự giảm độ hấp thụ quang học tại bước sóng đặc trưng trong 24 giờ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và sàng lọc chủng nấm sinh enzyme ngoại bào: Từ 60 mẫu nấm thu thập, đã phân lập được 38 chủng nấm đảm, trong đó 24 chủng sinh enzyme ngoại bào, 17 chủng có hoạt tính laccase tự nhiên dao động từ 5 đến 496 U/l. Chủng FBD154 có hoạt tính laccase cao nhất đạt 4.233 U/l, vượt trội so với các chủng còn lại (tăng hơn 8 lần so với chủng đứng thứ hai).

2. Phân loại chủng FBD154: Chủng FBD154 được xác định thuộc chi Polyporus, ngành Basidiomycota, dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích trình tự vùng ITS dài 592 nucleotide. Cây phát sinh chủng loại cho thấy FBD154 có quan hệ gần với các loài Polyporus đã được công bố.

3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh tổng hợp laccase: Môi trường TSH1 cho hoạt tính laccase cao nhất, pH tối ưu là 4-5, hoạt tính giảm mạnh ở pH kiềm. Nguồn cacbon glucose và rỉ đường kích thích sinh laccase tốt hơn các nguồn khác, với hoạt tính tăng khoảng 20-30% so với môi trường không bổ sung cacbon. Nguồn nitơ hữu cơ như peptone và cao malt làm tăng hoạt tính laccase lên đến 40% so với nitơ vô cơ.

4. Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm: Laccase thô từ chủng FBD154 có khả năng loại màu cao với thuốc nhuộm anthraquinone RBBR và NY5 đạt trên 85% sau 24 giờ, thuốc nhuộm azo NY1 và NY7 đạt 70-75%. Sự có mặt của chất gắn kết VIO và HBT làm tăng hiệu suất loại màu lên 10-15%. Màu thương mại CLS và LF-2B cũng được loại bỏ hiệu quả trên 65%.

Thảo luận kết quả

Hoạt tính laccase cao của chủng FBD154 phản ánh tiềm năng ứng dụng trong xử lý sinh học nước thải dệt nhuộm. Kết quả phân loại bằng phương pháp phân tử vùng ITS khẳng định tính chính xác trong xác định chủng nấm, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về Polyporus sinh laccase. Điều kiện pH và nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng rõ rệt đến sinh tổng hợp enzyme, tương đồng với các nghiên cứu quốc tế cho thấy pH acid và nguồn cacbon hữu cơ là yếu tố kích thích enzyme. Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm cao, đặc biệt khi sử dụng chất gắn kết, chứng tỏ cơ chế xúc tác của laccase được tăng cường nhờ mediator, mở rộng phổ cơ chất và tăng khả năng oxy hóa các hợp chất khó phân hủy. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hoạt tính laccase theo thời gian và pH, bảng so sánh hiệu suất loại màu với và không có chất gắn kết, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của enzyme. So với các nghiên cứu khác, chủng FBD154 có hoạt tính laccase và hiệu quả loại màu vượt trội, phù hợp để phát triển công nghệ xử lý nước thải sinh học tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình nuôi cấy tối ưu: Áp dụng môi trường TSH1, pH 4-5, bổ sung glucose hoặc rỉ đường và nguồn nitơ hữu cơ như peptone để tăng sinh tổng hợp laccase, nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme trong vòng 7-10 ngày. Chủ thể thực hiện: các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

2. Ứng dụng enzyme laccase thô trong xử lý nước thải dệt nhuộm: Triển khai thử nghiệm xử lý nước thải quy mô pilot tại các nhà máy dệt nhuộm, sử dụng enzyme thô từ chủng FBD154 kết hợp chất gắn kết VIO hoặc HBT để tăng hiệu quả loại màu trong vòng 5-7 ngày. Chủ thể thực hiện: doanh nghiệp ngành dệt nhuộm và các trung tâm nghiên cứu môi trường.

3. Nghiên cứu cải tiến enzyme tái tổ hợp: Tách gene laccase từ FBD154 để biểu hiện trên hệ vi sinh vật tái tổ hợp, nhằm tăng năng suất và ổn định enzyme, phục vụ sản xuất công nghiệp trong 1-2 năm tới. Chủ thể thực hiện: viện nghiên cứu công nghệ sinh học.

4. Xây dựng cơ sở dữ liệu đa dạng sinh học vi sinh vật bản địa: Tiếp tục khảo sát và phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào tại các khu bảo tồn khác, góp phần bảo tồn nguồn gen quý và phát triển bền vững ngành công nghiệp enzyme. Chủ thể thực hiện: các viện sinh thái và tài nguyên sinh vật.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học môi trường: Có thể ứng dụng kết quả nghiên cứu để phát triển các chế phẩm enzyme xử lý ô nhiễm nước thải dệt nhuộm, nâng cao hiệu quả và thân thiện môi trường.

2. Doanh nghiệp ngành dệt nhuộm: Tham khảo để áp dụng công nghệ sinh học xử lý nước thải, giảm chi phí và đáp ứng các tiêu chuẩn môi trường quốc tế.

3. Viện nghiên cứu đa dạng sinh học và bảo tồn: Sử dụng dữ liệu phân loại và đặc tính chủng nấm để xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen vi sinh vật bản địa, phục vụ công tác bảo tồn và khai thác bền vững.

4. Sinh viên và học giả ngành sinh học và công nghệ sinh học: Là tài liệu tham khảo quý giá về phương pháp phân lập, sàng lọc và nghiên cứu enzyme laccase, cũng như ứng dụng trong xử lý môi trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Laccase là gì và tại sao nó quan trọng trong xử lý nước thải?
   Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp như thuốc nhuộm, phenol, giúp loại bỏ chất ô nhiễm trong nước thải một cách hiệu quả và thân thiện môi trường.

2. Tại sao chọn Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà làm nơi thu thập mẫu nấm?
   Khu vực này có hệ sinh thái rừng kín thường xanh mưa ẩm á nhiệt đới với đa dạng sinh học cao, đặc biệt là hệ vi sinh vật phong phú, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tìm kiếm các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào có hoạt tính cao.

3. Phương pháp xác định chủng nấm FBD154 như thế nào?
   Chủng được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc và sợi nấm dưới kính hiển vi, kết hợp phân tích trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8S - ITS2) bằng PCR và giải trình tự gen, giúp xác định chính xác đến cấp loài.

4. Các yếu tố nào ảnh hưởng đến hoạt tính laccase của chủng nấm?
   Hoạt tính laccase phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, pH, nguồn cacbon và nitơ, cũng như sự có mặt của các chất cảm ứng hoặc chất gắn kết, ảnh hưởng đến sinh tổng hợp và ổn định enzyme.

5. Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm bằng laccase có thể đạt được bao nhiêu?
   Trong nghiên cứu, enzyme thô từ chủng FBD154 đã loại bỏ trên 85% thuốc nhuộm anthraquinone và 70-75% thuốc nhuộm azo sau 24 giờ, hiệu quả tăng thêm 10-15% khi sử dụng chất gắn kết như VIO hoặc HBT.

Kết luận

• Đã phân lập và tuyển chọn thành công chủng nấm Polyporus sp. FBD154 từ Vườn Quốc gia Bidoup – Núi Bà với hoạt tính laccase cao nhất đạt 4.233 U/l.
• Xác định đặc tính sinh học và phân loại chính xác chủng FBD154 bằng phương pháp truyền thống và phân tích trình tự vùng ITS.
• Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm môi trường TSH1, pH 4-5, nguồn cacbon glucose/rỉ đường và nguồn nitơ hữu cơ để tăng sinh tổng hợp laccase.
• Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và thương mại bằng enzyme thô, đạt hiệu suất cao, đặc biệt khi kết hợp với chất gắn kết.
• Đề xuất ứng dụng công nghệ enzyme laccase trong xử lý nước thải dệt nhuộm và phát triển các nghiên cứu tiếp theo về enzyme tái tổ hợp và đa dạng sinh học vi sinh vật bản địa.

Tiếp theo, cần triển khai thử nghiệm quy mô pilot xử lý nước thải, đồng thời nghiên cứu biểu hiện gene laccase tái tổ hợp để nâng cao năng suất enzyme. Mời các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm hợp tác phát triển công nghệ sinh học xử lý ô nhiễm môi trường bền vững.