Luận văn thạc sĩ về thiết kế vector t cho tách dòng phân tử bằng enzyme xcmi

• Tác giả: Lương Thị Thúy Hằng
• Người hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Thiết Kế T- Vector Dùng Cho Tách Dòng Phân Tử Bằng Phương Pháp Sử Dụng Enzyme XcmI
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Cơ sở khoa học
• 2.2. Tách dòng gene từ sản phẩm PCR
• 2.3. Phương pháp tách dòng đầu bằng
• 2.4. Phương pháp tách dòng đầu dính
• 2.5. Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector
• 2.6. Các phương pháp tạo T-vector
• 2.6.1. Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase
• 2.6.2. Phương pháp tạo T-vector sử dụng enzyme giới hạn Eam1105I
• 2.6.3. Phương pháp tạo T-vector mang vị trí của enzyme XcmI
• 2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.7.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.7.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.2.1. Nội dung 1: Thiết kế T-vector pTUAF
• 3.2.2. Nội dung 2: Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM của hãng Thermo scientific
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Quy trình thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm
• 3.3.2. Thiết kế T-vector pTUAF
• 3.3.3. Thiết kế adapter
• 3.3.4. Gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T
• 3.3.5. Ứng dụng T–vector pTUAF trong tách dòng TA và đánh giá hiệu quả tách dòng
• 3.3.6. Thực hiện phản ứng TA cloning
• 3.3.7. Phương pháp biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt
• 3.3.8. Đánh giá hiệu quả tách dòng
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thiết kế T-vector pTUAF
• 4.2. Kết quả lựa chọn và kiểm tra vector làm vật liệu nghiên cứu
• 4.3. Kết quả gắn adapter vào vector PTZ57R/T tạo ra T-vector pTUAF
• 4.4. Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM
• 4.5. Kết quả gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng
• 4.6. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
• 4.7. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 4.8. Khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế 2 đầu sử dụng cùng một enzyme giới hạn
• 4.9. So sánh quy trình tạo T-vector bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI và phương pháp sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 1. Tài liệu trong nước
• 2. Tài liệu nước ngoài

I. Thiết kế vector

Thiết kế vector là một bước quan trọng trong công nghệ sinh học, đặc biệt khi ứng dụng trong tách dòng phân tử. Trong nghiên cứu này, vector pTUAF được thiết kế dựa trên vector pTZ57R/T thương mại, sử dụng enzyme XcmI để tạo ra T-vector. Phương pháp này tận dụng đặc điểm của enzyme XcmI khi cắt DNA, tạo ra đầu dính chứa nucleotide thymidine (T) ở đầu 3’, phù hợp cho tách dòng TA. Thiết kế vector này không chỉ đơn giản hóa quy trình mà còn giảm chi phí so với các bộ KIT thương mại.

1.1. Phương pháp sử dụng enzyme XcmI

Enzyme XcmI được chọn vì khả năng tạo đầu dính chứa nucleotide thymidine (T) ở đầu 3’ khi cắt DNA. Điều này phù hợp với tách dòng TA, nơi sản phẩm PCR thường có đầu adenosine (A) do hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq polymerase. Thiết kế vector bằng enzyme XcmI đơn giản hơn so với các phương pháp khác như sử dụng enzyme Eam1105I hoặc terminal transferase, đồng thời đảm bảo hiệu quả tách dòng cao (93%).

1.2. Quy trình thiết kế T vector

Quy trình thiết kế T-vector pTUAF bao gồm các bước chính: cắt mở vòng vector pTZ57R/T, gắn adapter chứa vị trí nhận biết của enzyme XcmI, và kiểm tra hiệu quả tách dòng. Adapter được thiết kế với hai vị trí cắt của enzyme XcmI, đảm bảo tạo ra đầu dính T ở cả hai đầu của vector. Kết quả cho thấy T-vector pTUAF có khả năng tách dòng hiệu quả, tương đương với các sản phẩm thương mại.

II. Tách dòng phân tử

Tách dòng phân tử là một kỹ thuật cơ bản trong kỹ thuật sinh học, giúp phân tích và nhân bản các đoạn DNA. Trong nghiên cứu này, T-vector pTUAF được ứng dụng để tách dòng phân tử sản phẩm PCR. Phương pháp tách dòng TA được sử dụng do tính đơn giản và hiệu quả cao. Tách dòng phân tử bằng T-vector pTUAF không chỉ giảm chi phí mà còn chủ động trong việc tạo ra vật liệu nghiên cứu.

2.1. Phương pháp tách dòng TA

Tách dòng TA dựa trên nguyên lý kết hợp đầu A của sản phẩm PCR với đầu T của T-vector. Phương pháp này không yêu cầu xử lý phức tạp sau PCR, giúp tiết kiệm thời gian và công sức. Tách dòng TA bằng T-vector pTUAF cho hiệu suất cao, đạt 93%, tương đương với các bộ KIT thương mại.

2.2. Ứng dụng thực tiễn

Tách dòng phân tử bằng T-vector pTUAF có thể ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học. Nghiên cứu này không chỉ giúp giảm chi phí mà còn mở ra hướng phát triển các vector tương tự cho các mục đích nghiên cứu khác nhau. Kết quả cho thấy T-vector pTUAF là một công cụ hiệu quả trong tách dòng phân tử.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu thiết kế vector t cho tách dòng phân tử bằng enzyme XcmI có ý nghĩa quan trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn. Về mặt khoa học, nghiên cứu này góp phần phát triển các phương pháp thiết kế vector mới, tận dụng đặc điểm của enzyme XcmI. Về mặt thực tiễn, T-vector pTUAF giúp giảm chi phí nghiên cứu và chủ động trong việc tạo ra vật liệu tách dòng.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu này mở ra hướng phát triển các vector tương tự bằng cách sử dụng enzyme XcmI trên các vector khác nhau. Điều này không chỉ nâng cao hiểu biết về thiết kế vector mà còn tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

T-vector pTUAF có thể được sản xuất với số lượng lớn, đáp ứng nhu cầu tách dòng phân tử trong các phòng thí nghiệm. Điều này giúp giảm chi phí nghiên cứu và tăng tính chủ động trong việc tạo ra vật liệu tách dòng, góp phần thúc đẩy các nghiên cứu về sinh học phân tử.