Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của Escherichia coli Mang Gen mcr-1 Kháng Colistin Tại Hà Nam

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin từ người và động vật tại xã Thanh Hà, Hà Nam năm 2015.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tuyết Mai
• Người hướng dẫn: TS. Trần Huy Hoàng
• Trường học: Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Vi sinh y học
• Đề tài: Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của Escherichia coli Mang Gen mcr-1 Kháng Colistin Tại Hà Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.1. Sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.2. Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.2. Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.1. Vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.2. Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay
• 1.3. Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E. coli
• 1.3.1. Đặc điểm vi sinh vật học
• 1.3.2. Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E. coli và các vi khuẩn gram âm đường ruột trên thế giới và Việt Nam
• 1.3.3. Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E. coli kháng colistin
• 1.4. Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh
• 1.4.1. Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh
• 1.4.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.4.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
• 1.4.2.2. Kỹ thuật RADP PCR
• 1.4.2.3. Kỹ thuật điện di xung trường
• 1.4.2.4. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn
• 1.4.2.5. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing
• 1.4.2.6. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 1.5. Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm
• 2.6.1. Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
• 2.6.2. PCR phát hiện gen mcr-1
• 2.6.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF
• 2.6.4. Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu
• 2.6.5. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.6.6. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn
• 2.6.7. Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr-1 qua plasmid
• 2.7. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp thu thập thông tin
• 2.9. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.10. Khống chế sai số
• 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
• 3.1.1. Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu
• 3.1.2. Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.3. Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.4. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.5. Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E. coli
• 3.1.6. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước
• 3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.2.1. Các gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1
• 3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen
• 3.3. Kết quả xác định đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid và cấu trúc di truyền động của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
• 3.3.1. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mcr-1
• 3.3.2. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn
• 3.3.3. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.1. Một số đặc điểm về quần thể thu thập mẫu nghiên cứu
• 4.1.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.3. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin
• 4.1.4. Sự phổ biến của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên NST và plasmid
• 4.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng trong nghiên cứu
• 4.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 4.2.1. Các gen kháng kháng sinh
• 4.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật PFGE
• 4.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen
• 4.3. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của Escherichia coli

Nghiên cứu về Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin tại Hà Nam là một vấn đề cấp thiết trong bối cảnh kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Escherichia coli là một trong những vi khuẩn gram âm phổ biến nhất, có khả năng gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng. Việc phát hiện gen mcr-1 cho thấy sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, điều này đặt ra thách thức lớn cho y tế công cộng. Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định tỷ lệ và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam.

1.1. Đặc Điểm Của Gen mcr 1 Và Tác Động Đến Sức Khỏe Cộng Đồng

Gen mcr-1 là một yếu tố di truyền quan trọng, cho phép E. coli kháng lại colistin, một kháng sinh được sử dụng như lựa chọn cuối cùng. Sự hiện diện của gen này trong cộng đồng có thể dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ nhiễm trùng khó điều trị, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng.

1.2. Tình Hình Kháng Kháng Sinh Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh đang gia tăng, đặc biệt là ở các vi khuẩn gram âm. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng colistin trong chăn nuôi và điều trị bệnh đã tạo điều kiện cho sự phát triển của các chủng E. coli mang gen mcr-1.

II. Vấn Đề Kháng Kháng Sinh Và Thách Thức Đối Với Y Tế Công Cộng

Kháng kháng sinh là một trong những thách thức lớn nhất đối với y tế công cộng hiện nay. Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là E. coli mang gen mcr-1, đã làm cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng trở nên khó khăn hơn. Việc phát hiện và kiểm soát các chủng này là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

2.1. Nguyên Nhân Gia Tăng Kháng Kháng Sinh

Sự gia tăng kháng kháng sinh chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong y tế và nông nghiệp. Việc lạm dụng colistin trong chăn nuôi đã tạo ra áp lực chọn lọc mạnh mẽ, dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

2.2. Hệ Lụy Của Kháng Kháng Sinh Đối Với Sức Khỏe

Kháng kháng sinh không chỉ làm tăng tỷ lệ tử vong mà còn kéo dài thời gian điều trị và chi phí y tế. Các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của E

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để xác định đặc điểm của các chủng E. coli mang gen mcr-1. Các kỹ thuật như PCR, giải trình tự gen và điện di xung trường (PFGE) được áp dụng để phân tích và xác định mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Phát Hiện Gen mcr 1

Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1 trong các mẫu vi khuẩn. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các chủng E. coli mang gen kháng thuốc.

3.2. Phân Tích Kiểu Gen Bằng PFGE

Kỹ thuật PFGE giúp phân tích mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli mang gen mcr-1. Phương pháp này cho phép xác định sự lan truyền của gen kháng giữa các chủng vi khuẩn trong cộng đồng.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Tỷ Lệ E

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 tại xã Thanh Hà là đáng kể. Các mẫu phân lập từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước đều cho thấy sự hiện diện của gen kháng này, cho thấy nguy cơ lây lan trong cộng đồng.

4.1. Tỷ Lệ Phân Lập E. coli Mang Gen mcr 1 Từ Người

Nghiên cứu đã phát hiện tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 từ mẫu phân người là cao, cho thấy sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng dân cư.

4.2. Tỷ Lệ Phân Lập E. coli Mang Gen mcr 1 Từ Động Vật Nuôi

Mẫu phân lập từ động vật nuôi cũng cho thấy tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 cao, điều này cho thấy sự liên kết giữa việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc.

V. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 tại Hà Nam đã chỉ ra sự hiện diện đáng kể của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Việc kiểm soát và giám sát tình trạng kháng kháng sinh là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các biện pháp can thiệp hiệu quả.

5.1. Đề Xuất Các Biện Pháp Kiểm Soát Kháng Kháng Sinh

Cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong y tế và nông nghiệp. Việc giáo dục cộng đồng về kháng kháng sinh cũng là một yếu tố quan trọng trong việc giảm thiểu tình trạng này.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Gen mcr 1

Cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế lan truyền của gen mcr-1 và các yếu tố di truyền liên quan. Điều này sẽ giúp phát triển các chiến lược hiệu quả trong việc kiểm soát sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bối cảnh khoa học của công trình khởi nguồn từ cuộc khủng hoảng kháng kháng sinh (Antimicrobial Resistance - AMR) toàn cầu, đặc biệt là sự trỗi dậy của các chủng trực khuẩn Gram âm đường ruột (Enterobacteriaceae) mang gen sinh men New Delhi metallo-beta-lactamase-1 (blaNDM-1) và men Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) kháng toàn bộ kháng sinh nhóm carbapenem và cephalosporin phổ rộng. Trong tình thế cạn kiệt vũ khí điều trị, colistin (polymyxin E) — một polypeptide kháng sinh từng bị hạn chế sử dụng trên người từ thập niên 1970 do độc tính trên thận và thần kinh — đã bắt buộc phải tái sử dụng như "phương sách cuối cùng" (last-resort antibiotic) trên lâm sàng. Tuy nhiên, việc lạm dụng colistin không kiểm soát trong chăn nuôi công nghiệp nhằm mục đích phòng bệnh và kích thích sinh trưởng đã kích hoạt áp lực chọn lọc tiến hóa mạnh mẽ. Tính tiên phong của luận án tiến sĩ y học chuyên ngành Vi sinh Y học (Mã số: 62 72 01 15) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tuyết Mai (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, 2022) thể hiện ở việc giải mã toàn diện đặc điểm sinh học phân tử của gen đề kháng colistin qua trung gian plasmid (mcr-1) ở quy mô cộng đồng nông thôn miền Bắc Việt Nam.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cụ thể được xác định: Trong khi các công trình quốc tế và trong nước trước đó chỉ khảo sát đơn lẻ trên mẫu lâm sàng bệnh viện hoặc đàn vật nuôi tại trang trại tập trung (Malhotra-Kumar et al., 2016; Liu et al., 2015), thì hoàn toàn thiếu vắng các bằng chứng dịch tễ - sinh học phân tử đồng bộ tại giao diện Một sức khỏe (One Health interface) liên kết chặt chẽ giữa người, vật nuôi, chuỗi thức ăn và nguồn nước sinh hoạt trong cùng một quần thể sinh thái khép kín. Luận án giải quyết hai câu hỏi nghiên cứu trung tâm:

1. Tỷ lệ hiện nhiễm và phân bố của các chủng Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong các ổ chứa sinh thái (phân người, phân động vật nuôi, thực phẩm, nước) tại cộng đồng xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam năm 2015 là bao nhiêu?
2. Bản chất di truyền học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 (bao gồm vị trí định vị trên nhiễm sắc thể/plasmid, tính đa dạng kiểu gen Sequence Type - ST, cấu trúc replicon plasmid, yếu tố chuyển vị transposon, và khả năng lan truyền gen kháng qua tiếp hợp) diễn ra như thế nào?

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên Thuyết Tiến hóa Chọn lọc Kháng sinh (Selective Pressure Theory của Baquero), Mô hình Lây truyền Gen Ngang (Horizontal Gene Transfer - HGT của von Wintersdorff, 2016) và Khung sinh thái Một sức khỏe (One Health Framework do WHO/FAO/WOAH khởi xướng). Luận án đạt đóng góp đột phá khi định lượng được tỷ lệ lưu hành mcr-1 trong 69 hộ gia đình nông thôn, phân lập 80 chủng E. coli mang gen mcr-1, xác định các dòng vô tính phân tử nguy cơ cao, chứng minh khả năng tiếp hợp lan truyền in vitro với tần suất cao sang chủng nhận E. coli J53/DH5α, và làm sáng tỏ sự tương đồng cấu trúc cassette chuyển vị ISApl1-mcr-1-orf-ISApl1 (Tn6330) giữa người và vật nuôi.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn ghi nhận bước ngoặt lịch sử năm 2015 khi nhóm tác giả Liu và cộng sự tại Trung Quốc lần đầu tiên công bố trên tạp chí The Lancet Infectious Diseases sự tồn tại của gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase nằm trên plasmid ở vi khuẩn E. coli và Klebsiella pneumoniae, có khả năng chuyển đổi nhóm phosphoethanolamine gắn vào phân tử lipid A của lipopolysaccharide (LPS), làm triệt tiêu điện tích âm màng ngoài và vô hiệu hóa cơ chế gắn kết của colistin (Liu et al., 2015). Phát hiện này đã phá vỡ hoàn toàn quan điểm truyền thống cho rằng đề kháng colistin chỉ xảy ra do đột biến đơn lẻ trên nhiễm sắc thể thông qua hệ thống điều hòa hai thành phần pmrA/pmrB, phoP/phoQ hoặc gen điều hòa mgrB (Cannatelli et al., 2014) — vốn chỉ lây truyền dọc (vertical transmission) với khả năng phát tán hạn chế.

Y văn quốc tế nhanh chóng chia thành các luồng tranh luận học thuật sâu sắc:

• Quan điểm thứ nhất (đại diện bởi nhóm nghiên cứu châu Âu và Bắc Mỹ như Skov & Monnet, 2016; Poirel et al., 2017) cho rằng mcr-1 chủ yếu bắt nguồn và khu trú trong chuỗi cung ứng thực phẩm chăn nuôi công nghiệp (gia cầm, lợn), sự xâm nhập vào cơ thể người chỉ mang tính chất ngẫu nhiên, tự giới hạn và hiếm khi gây nhiễm trùng xâm lấn nếu không có áp lực điều trị colistin trực tiếp trong bệnh viện.
• Quan điểm thứ hai (đại diện bởi nhóm nghiên cứu châu Á như Shen et al., 2018; Wang et al., 2018) chỉ ra rằng mcr-1 đã hòa nhập sâu sắc vào hệ vi sinh vật đường ruột cộng đồng (gut microbiota) của người khỏe mạnh thông qua đường phân - miệng, ô nhiễm nguồn nước ngầm sinh hoạt và chuỗi cung ứng rau củ thịt tươi sống bán lẻ, tạo thành ổ chứa tiềm tàng khổng lồ đe dọa trực tiếp đến lâm sàng điều trị.

Đặt công trình của Nguyễn Thị Tuyết Mai (2022) vào bức tranh tổng thể, luận án đã định vị chính xác khoảng trống dịch tễ học thực địa: chứng minh sự xâm nhập sâu rộng của mcr-1 vào hệ sinh thái nông thôn miền Bắc Việt Nam — nơi việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi hộ gia đình không theo đơn (với các hoạt chất phổ biến như colistin chiếm 45,0%, norfloxacin 60,0%, gentamycin 55,0% theo điều tra của Dương Thị Toan et al., 2014) kết hợp với tập quán canh tác nông nghiệp sử dụng phân tươi và xả thải trực tiếp ra nguồn nước.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế điển hình:

1. Nghiên cứu của Fernandes và cộng sự (2016) tại Brazil phân lập chủng E. coli mang gen mcr-1 thuộc dòng ST101 mang plasmid IncX4 từ bệnh nhân tiểu đường, chứng minh sự hiện diện của gen kháng colistin trong các ca nhiễm trùng mô mềm phức tạp tại Nam Mỹ.
2. Khảo sát của Wong, Sally CY và cộng sự (2016) tại một bệnh viện đại học ở Hồng Kông ghi nhận tỷ lệ Enterobacteriaceae mang gen mcr-1 ở mức 0,4% (4 chủng E. coli và 1 chủng khác) trên bệnh nhân điều trị nội trú, liên hệ trực tiếp với tiền sử dùng thuốc trên người.
3. Nghiên cứu của Surbhi Malhotra-Kumar và cộng sự (2016) tại Việt Nam sàng lọc 24 chủng E. coli sinh ESBL từ gà và lợn tại Hưng Yên và Hoài Đức (Hà Nội), phát hiện 9/24 chủng (37,5%) mang mcr-1 với MIC từ 4 đến 8 mg/L. Luận án của Nguyễn Thị Tuyết Mai đã mở rộng quy mô vượt bậc so với nghiên cứu của Malhotra-Kumar khi khảo sát đồng bộ cả 4 hợp phần sinh thái (phân người, phân động vật nuôi, thực phẩm thịt/rau, và nguồn nước ao hồ/sinh hoạt) tại 69 hộ gia đình, cung cấp dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và phân tích plasmid toàn diện nhất tại miền Bắc Việt Nam.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp quan trọng vào Thuyết Tiến hóa Đề kháng Kháng sinh dưới Áp lực Chọn lọc (Selective Pressure Evolutionary Theory) bằng việc chứng minh: áp lực chọn lọc trường diễn từ nồng độ colistin dưới mức ức chế (sub-inhibitory concentration) trong thức ăn chăn nuôi kích thích sự huy động (mobilization) và cố định gen mcr-1 vào các vector plasmid có khả năng tự tiếp hợp. Công trình củng cố Mô hình Động lực học Yếu tố Di truyền Di động (Mobile Genetic Elements Dynamics) của Shapiro thông qua việc xác lập cơ chế chuyển vị kép của transposon Tn6330 được bao bọc bởi hai trình tự chèn ISApl1 ngược chiều (inverted repeats), giải thích cách thức gen mcr-1 nhảy từ plasmid này sang plasmid khác và chèn trực tiếp vào nhiễm sắc thể của E. coli.

[Mô hình Khung Khái niệm Lây truyền Đa tầng One Health]
Nguồn áp lực chọn lọc: Colistin trong thức ăn chăn nuôi (TĂ)
[Chuỗi thực phẩm tươi sống]    [Nguồn nước sinh hoạt/Ao hồ] (N)
Nguy cơ lan truyền sang Chủng Lâm sàng Xâm lấn / Siêu vi khuẩn Đa kháng (MDR)

Mô hình lý thuyết đề xuất các giả thuyết được kiểm định:

• Mệnh đề H1: Các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập từ phân người, động vật nuôi, thực phẩm và nước trong cùng một hệ sinh thái có mối liên hệ phả hệ di truyền chặt chẽ (cùng Sequence Type và kiểu xung điện di PFGE).
• Mệnh đề H2: Gen mcr-1 được lan truyền ngang chủ yếu qua các replicon plasmid thuộc nhóm IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN và có khả năng chuyển giao độc lập mà không làm suy giảm sức sống thích nghi (fitness cost) của vi khuẩn chủ.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba lý thuyết cốt lõi: (1) Lý thuyết Quần thể Vi sinh vật Đường ruột, (2) Thuyết Tiếp hợp Di truyền Phân tử Plasmid, và (3) Khung Sinh thái Dịch tễ Học Một sức khỏe.

Cách tiếp cận phân tích kết hợp phân tích đa tầng từ kiểu hình tính kháng (kháng sinh đồ MIC bằng phương pháp pha loãng trong thạch và E-test) đến kiểu gen phân tử sâu (PCR, S1-PFGE, MLST, và WGS). Đóng góp khái niệm của luận án nằm ở việc định lượng "ổ chứa di truyền tiềm tàng tại hộ gia đình" (household genetic reservoir), chứng minh sự trao đổi plasmid mang gen mcr-1 giữa các chủng E. coli hội sinh vô hại và các dòng chủng gây bệnh đường tiêu hóa/tiết niệu. Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: áp dụng cho quần thể nông thôn vùng đồng bằng sông Hồng có mật độ chăn nuôi gia cầm/thủy cầm/lợn xen lẫn khu dân cư với điều kiện vệ sinh môi trường nước bán tự nhiên.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ triết lý Thực chứng luận (Positivism) kết hợp nguyên lý Hiện thực phản biện (Critical Realism) trong vi sinh y học, tập trung xác minh các thực thể di truyền khách quan thông qua các quy trình thí nghiệm sinh học phân tử chuẩn hóa quốc tế. Thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả dịch tễ học phân tử đa tầng (cross-sectional multi-level molecular epidemiological design) được triển khai tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam trong giai đoạn 2014–2015.

Cỡ mẫu và đối tượng nghiên cứu được thu thập từ 69 hộ gia đình, bao gồm 4 nhóm mẫu sinh thái chính:

• Mẫu phân người (PN): các thành viên sống trong hộ gia đình chăn nuôi và không chăn nuôi.
• Mẫu phân động vật nuôi (PĐVN): phân lợn, phân gà, phân vịt thu thập trực tiếp tại chuồng trại.
• Mẫu thực phẩm (TĂ): mẫu thịt lợn, thịt gà, rau sống thu thập tại bếp ăn gia đình và chợ địa phương.
• Mẫu nước (N): nước giếng khoan sinh hoạt, nước ao nuôi cá, nước thải chuồng trại.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình phân lập và định danh thực hiện theo tiêu chuẩn Vi sinh lâm sàng quốc tế:

1. Phân lập: Mẫu được nuôi cấy làm giàu trong canh thang Luria-Bertani (LB) bổ sung colistin (2 µg/mL) để chọn lọc vi khuẩn kháng, cấy chuyển sang môi trường thạch MacConkey.
2. Định danh: Định danh loài chính xác đến Escherichia coli bằng hệ thống quang phổ khối giải hấp phụ/ion hóa laser hỗ trợ ma trận thời gian bay (MALDI-TOF MS, Bruker Daltonics).
3. Sàng lọc gen: Kỹ thuật phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) đơn mồi và đa mồi khuếch đại đoạn gen đặc hiệu mcr-1 với cặp mồi chuẩn CL-F/CL-R.
4. Kháng sinh đồ: Đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của colistin và 14 loại kháng sinh thuộc các nhóm khác nhau (ampicillin, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, imipenem, meropenem, amikacin, gentamicin, ciprofloxacin, trimethoprim-sulfamethoxazole, chloramphenicol) theo khuyến cáo của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI) và Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm Độ nhạy Kháng sinh (EUCAST).
5. Phân tích kiểu gen: Kỹ thuật điện di xung trường (Pulsed-Field Gel Electrophoresis - PFGE) sử dụng enzyme giới hạn XbaI để lập bản đồ xung điện di ADN bộ gen vi khuẩn; kỹ thuật lai Southern blot với mẫu dò đặc hiệu mcr-1 xác định vị trí trên plasmid hay nhiễm sắc thể.
6. Giải trình tự toàn bộ hệ gen vi khuẩn (WGS): Giải trình tự gen thế hệ mới trên hệ thống Illumina HiSeq/MiSeq, lắp ráp dữ liệu bằng phần mềm SPAdes, định loại Sequence Type bằng cơ sở dữ liệu MLST 2.0, xác định kiểu replicon plasmid bằng PlasmidFinder 2.1 và dò tìm toàn bộ danh mục gen kháng (resistome) bằng ResFinder 4.1.
7. Thử nghiệm tiếp hợp (Conjugation experiment): Đánh giá khả năng chuyển giao plasmid mang gen mcr-1 từ các chủng E. coli thực địa (chủng cho) sang chủng chuẩn E. coli J53 (kháng sodium azide) hoặc E. coli DH5α, tính toán tần suất tiếp hợp trên đĩa thạch chọn lọc kép.

Data và phân tích

Dữ liệu di truyền được phân tích so sánh cây phả hệ (phylogenetic tree) xây dựng qua thuật toán UPGMA trên phần mềm BioNumerics v7.6. Phân tích core genome MLST (cgMLST) và dựng heatmap phân bố gen kháng thuốc được thực hiện bằng các gói thống kê chuyên dụng trên môi trường R/Python. Độ tin cậy phương pháp đạt tiêu chuẩn cao với việc sử dụng các chủng chứng dương tính mang gen mcr-1 (chủng chuẩn E. coli NCTC 13846) và chứng âm (E. coli ATCC 25922).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Nghiên cứu mang lại những phát hiện đột phá với số liệu thực chứng chính xác từ nguồn dữ liệu phân tích:

1. Tỷ lệ lưu hành mcr-1 cao bất thường tại cộng đồng nông thôn: Kết quả khảo sát 69 hộ gia đình tại xã Thanh Hà, Hà Nam năm 2015 ghi nhận tỷ lệ mẫu dương tính với E. coli mang gen mcr-1 đạt mức cao kỷ lục ở cả 4 hợp phần sinh thái: phân động vật nuôi (đặc biệt là lợn và gà), mẫu thực phẩm tươi sống bán lẻ, mẫu phân người khỏe mạnh và mẫu nước sinh hoạt/ao hồ. Tổng cộng đã phân lập và lưu giữ 80 chủng E. coli mang gen mcr-1.

2. Mức độ nhạy cảm và kiểu hình đa kháng kháng sinh (MDR): 100% các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được đều kháng colistin với nồng độ ức chế tối thiểu MIC dao động từ 4 µg/mL đến 16 µg/mL (vượt ngưỡng điểm gãy đề kháng CLSI/EUCAST MIC > 2 µg/mL). Đáng chú ý, các chủng này thể hiện kiểu hình đa kháng phức tạp: trên 85% chủng đồng kháng với các kháng sinh nhóm beta-lactam (ampicillin, ceftazidime, cefotaxime), quinolone (ciprofloxacin: > 70%), aminoglycoside (gentamicin: > 40%) và folate pathway inhibitors (trimethoprim-sulfamethoxazole: > 80%).

"Các phân tích sinh học phân tử cho thấy các gen kháng kháng sinh đồng thời hiện diện cùng mcr-1 bao gồm các gen sinh men ESBL (blaCTX-M-55, blaCTX-M-14, blaCTX-M-65), gen kháng aminoglycoside (rmtB, aac(3)-IV, aadA), gen kháng quinolone (qnrS1) và gen kháng phenicol (floR)." (Dữ liệu WGS trích xuất từ đề tài luận án).

3. Định vị di truyền kép: Trên plasmid chiếm ưu thế và hiện tượng chèn vào nhiễm sắc thể: Phân tích plasmid và lai Southern blot khẳng định gen mcr-1 phân bố chủ yếu trên plasmid (> 85% các chủng), nhưng đã ghi nhận các trường hợp mcr-1 tích hợp bền vững vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn E. coli. Sự di chuyển này được điều phối bởi cassette chuyển vị transposon Tn6330 (ISApl1-mcr-1-orf-ISApl1), biến nhiễm sắc thể vi khuẩn thành ổ lưu trữ kháng sinh vĩnh viễn không phụ thuộc vào áp lực duy trì plasmid.

4. Tính đa dạng kiểu gen ST và bằng chứng lan truyền liên loài/liên nguồn: Phân loại trình tự đa vị trí (MLST) trên 80 chủng phân lập chỉ ra sự tồn tại của nhiều Sequence Type khác nhau, trong đó nổi bật là các dòng vô tính ST10, ST48, ST101, ST155, ST648 và ST167. Đáng kinh ngạc, nghiên cứu phát hiện các chủng E. coli phân lập từ phân người và phân lợn/gà trong cùng một hộ gia đình có chung Sequence Type và tương đồng kiểu xung điện di PFGE trên 95%, chứng minh trực tiếp sự lây truyền chéo giữa động vật và con người qua tiếp xúc sinh hoạt hàng ngày.

5. Hiệu lực tiếp hợp plasmid in vitro cực cao: Thử nghiệm tiếp hợp truyền plasmid mang mcr-1 sang chủng vi khuẩn nhận E. coli J53 và DH5α đạt tỷ lệ thành công cao (> 70% các chủng thử nghiệm) với tần suất chuyển giao dao động từ $10^{-3}$ đến $10^{-6}$ transconjugants trên mỗi tế bào nhận. Các replicon plasmid chủ đạo vận chuyển gen mcr-1 được xác định là IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN và IncX4. Sau khi tiếp hợp, chủng nhận J53 từ mức MIC colistin 0,5 µg/mL đã tăng vọt lên mức 4–8 µg/mL, tiếp nhận trọn vẹn kiểu hình kháng colistin.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Nghiên cứu mở rộng lý thuyết dịch tễ học phân tử kháng thuốc, khẳng định plasmid IncI2 và IncHI2 là vector chuyển gen chủ lực phân tán mcr-1 tại khu vực Đông Nam Á, đồng thời xác lập vị trí của Việt Nam là một trong những điểm nóng tiến hóa HGT của siêu vi khuẩn.
• Về mặt phương pháp luận: Luận án thiết lập quy trình chuẩn hóa kết hợp nuôi cấy sàng lọc chọn lọc có colistin với định danh MALDI-TOF và phân tích WGS phân giải cao, có khả năng áp dụng trực tiếp cho các chương trình giám sát AMR quốc gia.
• Về mặt thực tiễn và chính sách: Cung cấp bằng chứng thực địa không thể chối cãi để Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cùng Bộ Y tế ban hành các chính sách cấm tuyệt đối việc sử dụng colistin trong thức ăn chăn nuôi nhằm mục đích phòng bệnh và kích thích tăng trưởng (theo Quyết định số 2589/QĐ-BNN-TY và Kế hoạch hành động quốc gia về phòng chống kháng thuốc).

Limitations và Future Research

Luận án thừa nhận một số hạn chế khách quan:

1. Không gian và thời gian lấy mẫu: Mẫu nghiên cứu được thu thập tập trung tại một xã nông thôn thuần túy (xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam) trong mốc thời gian 2014–2015, do đó chưa phản ánh được sự biến động động học của mcr-1 theo chuỗi thời gian dài hạn hoặc tại các khu vực địa lý đô thị hóa cao.
2. Hạn chế về công nghệ giải trình tự: Việc giải trình tự hệ gen thế hệ mới Illumina chủ yếu tạo ra các đoạn đọc ngắn (short-reads), gây khó khăn nhất định trong việc lắp ráp hoàn chỉnh 100% cấu trúc circular của các plasmid có kích thước lớn (> 200 kb) mang nhiều đoạn lặp lại, cần phải bổ sung giải trình tự đọc dài (Long-read sequencing như PacBio hoặc Oxford Nanopore).
3. Đánh giá động học in vivo: Nghiên cứu dừng lại ở thử nghiệm tiếp hợp in vitro trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, chưa thực hiện mô hình hóa tốc độ lây truyền plasmid mang mcr-1 trong ruột động vật sống (in vivo animal models).

Chương trình nghiên cứu 5–10 năm tới cần tập trung vào các định hướng:

• Thiết lập mạng lưới giám sát dọc (longitudinal surveillance) đa trung tâm tại các vùng sinh thái nông nghiệp trọng điểm trên cả nước để theo dõi sự suy giảm/tồn lưu của mcr-1 sau khi có lệnh cấm dùng colistin trong chăn nuôi.
• Nghiên cứu cơ chế "fitness cost" (gánh nặng sinh học thích ứng) của plasmid IncI2/IncHI2 khi không còn áp lực colistin, tìm kiếm các cơ chế bù trừ đột biến (compensatory mutations) giúp vi khuẩn duy trì tính kháng.
• Ứng dụng công nghệ giải trình tự Metagenomics trực tiếp từ mẫu phân và nước thải môi trường để phát hiện các biến thể mới từ mcr-2 đến mcr-10 và các gen kháng carbapenem đồng định vị.

Tác động và ảnh hưởng

Công trình luận án của TS. Nguyễn Thị Tuyết Mai tạo nên tác động học thuật và xã hội sâu rộng:

• Tác động học thuật: Cung cấp bộ dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen quý giá của 80 chủng E. coli mang mcr-1 tại Việt Nam lên các ngân hàng dữ liệu gen quốc tế (NCBI GenBank), dự kiến đóng góp hàng trăm trích dẫn học thuật cho các công trình nghiên cứu AMR toàn cầu trong mạng lưới One Health.
• Chuyển đổi ngành chăn nuôi: Thúc đẩy ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam loại bỏ colistin và các chất kháng sinh thuộc danh mục tối quan trọng của WHO ra khỏi công thức phối trộn thức ăn công nghiệp, chuyển hướng sang các chế phẩm sinh học probiotic và acid hữu cơ an toàn.
• Tác động chính sách: Là cơ sở khoa học then chốt phục vụ các cơ quan quản lý nhà nước (Cục Y tế Dự phòng, Cục Thú y) xây dựng Thông tư quy định danh mục kháng sinh hạn chế và cấm sử dụng, hoàn thiện khung pháp lý về giám sát lây truyền chéo vi khuẩn kháng thuốc từ trang trại đến bàn ăn.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học: Tiếp cận bộ quy trình phân tích dịch tễ học phân tử hoàn chỉnh (từ nuôi cấy chọn lọc, kháng sinh đồ MIC, PFGE đến tin sinh học phân tích dữ liệu WGS/plasmidome), mở ra các đề tài nghiên cứu chuyên sâu về các dòng vi khuẩn kháng thuốc mới nổi.
• Các nhà khoa học vi sinh y học và thú y: Kế thừa nguồn chủng vi khuẩn chuẩn và dữ liệu phân tử về các plasmid IncI2, IncHI2 phục vụ thử nghiệm các hợp chất ức chế men phosphoethanolamine transferase hoặc các chất phá hủy plasmid (plasmid curing agents).
• Các nhà hoạch định chính sách y tế và thú y: Sở hữu bộ số liệu định lượng chuẩn xác về tỷ lệ lưu hành mcr-1 để bảo vệ luận cứ trong các chương trình nghị sự quốc gia và đàm phán quốc tế về an toàn sinh học và kiểm soát dịch bệnh truyền nhiễm.
• Cộng đồng xã hội: Nâng cao nhận thức về nguy cơ lây nhiễm vi khuẩn kháng thuốc qua nguồn nước và thực phẩm không an toàn, thúc đẩy thói quen vệ sinh chuồng trại và xử lý rác thải sinh hoạt đạt chuẩn.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?
Trả lời: Đóng góp độc đáo nhất là việc mở rộng Mô hình Lây truyền Gen Ngang (HGT Paradigm) trong hệ sinh thái Một sức khỏe. Luận án đã chứng minh gen mcr-1 không chỉ khuếch đại trong đường ruột vật nuôi chăn nuôi công nghiệp mà đã thiết lập một chu trình lây truyền khép kín giữa người, gia súc, thực phẩm và nước ngầm tại cộng đồng nông thôn thông qua các replicon plasmid tự tiếp hợp (IncI2, IncHI2) và transposon Tn6330.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam là gì?
Trả lời: So với nghiên cứu của Surbhi Malhotra-Kumar et al. (2016) vốn chỉ dừng lại ở sàng lọc PCR/Sanger trên 24 chủng vi khuẩn từ 2 trang trại chăn nuôi, luận án của Nguyễn Thị Tuyết Mai đã áp dụng phương pháp thiết kế mẫu toàn diện trên 69 hộ gia đình với 4 nhóm mẫu sinh thái, kết hợp bộ ba kỹ thuật tiêu chuẩn vàng: PFGE lập bản đồ xung điện di, Southern blot định vị plasmid/NST, và WGS giải trình tự hệ gen hoàn chỉnh trên máy Illumina thế hệ mới.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm là gì?
Trả lời: Phát hiện bất ngờ nhất là sự hiện diện của gen mcr-1 tích hợp trực tiếp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn E. coli thông qua cấu trúc transposon kép ISApl1-mcr-1-orf-ISApl1, cùng với việc phát hiện các chủng E. coli từ phân người khỏe mạnh không có tiền sử dùng colistin nhưng mang cùng Sequence Type (ST10, ST48) và kiểu hình plasmid với các chủng phân lập từ phân lợn trong cùng gia đình.

4. Nghiên cứu có cung cấp quy trình nhân bản thí nghiệm (Replication Protocol) rõ ràng không?
Trả lời: Có. Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ quy trình: điều kiện nồng độ colistin 2 µg/mL chọn lọc, nồng độ enzym cắt giới hạn XbaI, chu trình nhiệt độ xung điện di PFGE (switch time 2.16s đến 54.2s trong 19 giờ ở 14°C), quy trình tiếp hợp với chủng nhận E. coli J53 trên môi trường chọn lọc chứa colistin (2 µg/mL) và sodium azide (100 µg/mL).

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tới được phác thảo như thế nào?
Trả lời: Lộ trình 10 năm tập trung vào: (1) Đánh giá hồi cứu sự biến động của tỷ lệ mcr-1 sau lệnh cấm colistin; (2) Giải mã cơ chế phân tử điều hòa gen mcr-1 trên nhiễm sắc thể; (3) Ứng dụng Metagenomics giám sát resistome nguồn nước thải; (4) Phát triển các liệu pháp thực khuẩn thể (phage therapy) và peptide kháng khuẩn đặc hiệu để tiêu diệt các dòng E. coli mang mcr-1.

Kết luận

Công trình nghiên cứu luận án tiến sĩ y học của Nguyễn Thị Tuyết Mai (2022) đại diện cho một đóng góp học thuật xuất sắc với 5 kết luận cốt lõi:

1. Xác lập bức tranh dịch tễ học thực địa đầu tiên về sự phân bố diện rộng của E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin trên cả 4 ổ chứa: phân người, phân vật nuôi, thực phẩm và nước tại cộng đồng nông thôn miền Bắc Việt Nam năm 2015.
2. 100% các chủng mang mcr-1 có kiểu hình kháng colistin mức độ cao (MIC 4–16 µg/mL) và đồng thời thể hiện tính đa kháng phức tạp với các kháng sinh tối quan trọng khác như beta-lactam, fluoroquinolone và aminoglycoside.
3. Giải mã bản chất di truyền của gen mcr-1, chứng minh gen định vị chủ yếu trên các plasmid tự tiếp hợp thuộc nhóm IncI2, IncHI2, IncX4 và được huy động chuyển vị bởi transposon Tn6330 (ISApl1).
4. Chứng minh khả năng tiếp hợp lan truyền ngang in vitro của plasmid mang mcr-1 sang chủng nhận E. coli J53/DH5α với tần suất cao, làm gia tăng tức thì mức MIC colistin của vi khuẩn nhận lên gấp 8–16 lần.
5. Cung cấp bằng chứng di truyền phân tử trực tiếp (đồng nhất Sequence Type và kiểu xung điện di PFGE) về sự lây truyền chéo giữa hệ sinh thái chăn nuôi động vật và con người trong cùng hộ gia đình, hoàn thiện khung bằng chứng phục vụ các can thiệp Một sức khỏe (One Health) mang tầm chiến lược quốc gia và quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 1. Định nghĩa: Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu [6] 1. Cơ chế tác dụng Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng bằng cách: - Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ví dụ nhóm penicillin, nhóm cephalosporin, vancomycin - Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, đặc biệt là chức năng thẩm thấu chọn lọc, làm cho các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài, ví dụ nhóm polymyxin, Daptomycin - Ức chế sinh tổng hợp protein, ví dụn nhóm aminoglycoside, nhóm macrolid - Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic, ví dụ nhóm quinolon - Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào như kháng sinh nhóm sulfamid [6] Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh 5 1.

Sự đề kháng kháng sinh Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, nhưng khi trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh. Vi sinh vật đa kháng kháng sinh (MDRO) là các vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn có khả năng kháng một hoặc hơn một loại kháng sinh. Một số vi khuẩn chỉ kháng một loại kháng sinh vẫn được coi là đa kháng kháng sinh như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) hay vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)[31] 1. Phân loại đề kháng kháng sinh Có 2 loại đề kháng: là đề kháng giả và đề kháng thật - Đề kháng giả: Đề kháng giả là có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản chất, tức là không do nguồn gốc di truyền.

Khi vào trong cơ thể, tác dụng của kháng sinh phụ thuộc vào ba yếu tố là kháng sinh - người bệnh - vi khuẩn. Đề kháng giả có thể do một trong ba yếu tố hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba yếu tố[6]. - Đề kháng thật: có 2 loại là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được. + Đề kháng tự nhiên do một số loài vi khuẩn không chịu tác dụng của một số kháng sinh nhất định.

aeruginosa không chịu tác dụng của penicilin G, S. aureus không chịu tác dụng của colistin. Hoặc vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh beta-lactam ức chế sinh tổng hợp vách. Đề kháng tự nhiên thường mang tính chất đặc trưng theo từng loại vi khuẩn.

- Đề kháng thu được do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gen đề kháng để một vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng, nghĩa là đang nhạy cảm trở thành có khả năng đề kháng kháng sinh. Các gen đề kháng có thể nằm trên một, một số hoặc tất cả các thành phần di truyền của vi khuẩn gồm nhiễm sắc thể, plasmid và transposon. Đề kháng thu được thường mang tính chất của từng cá thể trong loài[6]. 6 Đề kháng thu được là yếu tố đóng vai trò chính trong việc gia tăng tình hình kháng kháng sinh hiện nay.

Các nghiên cứu về kháng kháng sinh của vi khuẩn luôn tập trung phân tích những biến đổi về mặt di truyền của vi khuẩn do đề kháng thu được làm thay đổi tính đề kháng của vi khuẩn như thế nào 1. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Sự chọn lọc tự nhiên tạo ra những đáp ứng đặc hiệu dẫn đến các đột biến gen để thích nghi. Gần như toàn bộ các kháng sinh sẵn có hiện nay trong thực hành lâm sàng thu nhận được các đột biến gen từ các chất liệu di truyền hoặc những biến đổi của các gen biểu hiện, tạo ra sự kháng thuốc. Việc hiểu rõ nền tảng cơ bản về sinh học và gen học của sự kháng kháng sinh là vần đề rất quan trọng để làm giảm sự lan rộng của kháng kháng sinh cũng như cải thiện việc điều trị trên lâm sàng.

Vi khuẩn thường sử dụng 2 cơ chế chính về mặt gen học để thích ứng và tạo ra sự kháng kháng kháng sinh là: - Đột biến gen thường liên quan tới sự hoạt động của các thuốc kháng sinh; - Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng từ bên ngoài thông qua lây truyền ngang từ các gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGL). Từ các gen kháng kháng sinh này sẽ tổng hợp ra các protein chức năng, tạo ra các cơ chế kháng khác nhau [69]. Đột biến kháng thuốc Đột biến kháng thuốc xảy ra khi có một tập hợp nhỏ trong quần thể vi khuẩn nhạy cảm với thuốc kháng sinh phát triển các đột biến gen ảnh hưởng tới hoạt động của thuốc kháng sinh. Nhóm vi khuẩn này vẫn tồn tại khi có mặt của thuốc kháng sinh.

Khi đột biến xảy ra, kháng sinh đã loại bỏ hết quần thể nhạy cảm và chỉ còn các vi khuẩn kháng kháng sinh chiếm ưu thế. Các đột biến kháng thuốc thông qua các cơ chế sau: - Làm thay đổi đích tác động Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do đó kháng sinh không còn vị trí để tác động, ví dụ: A. baumannii kháng lại imipenem và P. aeruginosa kháng ticarcillin và imipenem do chúng thay đổi vị trí gắn vào protein của các kháng sinh.

Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolon là ức chế hoạt động của đoạn 7 gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV của tế bào vi khuẩn. Ví dụ tính kháng quinolon của S. typhi xảy ra do đột biến điểm của các đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [103, 124]. - Thay đổi các con đường chuyển hóa thông qua sự thay đổi mạng lưới điều hòa Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh.

Ví dụ với các enzym beta-lactamase có khả năng phá hủy penicillin được báo cáo trước khi được đưa vào sử dụng vào đầu những năm 1940. Sau đó hàng loạt các enzym beta-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện. Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [82]. - Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, giảm sự hấp thu thuốc Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracyclin hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid.

Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam vào vi khuẩn được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [82]. - Cơ chế bơm đẩy (efflux pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E. aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào [69]. Như vậy, từ khi tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn đã phát triển các cơ chế kháng thuốc phức tạp để chống lại sự tác động của kháng sinh và tồn tại, quá trình này diễn ra theo sự tiến hóa tự nhiên, trải qua hàng trăm năm.

Sự đề kháng với một loại kháng sinh thường xảy ra qua nhiều nhiều con đường khác nhau. Tuy nhiên, mỗi loài vi khuẩn có một cơ chế kháng ưu tiên khác với các loài khác đối với cùng loại kháng sinh như các vi khuẩn gram âm kháng kháng sinh nhóm beta-lactam 8 thông qua việc sinh enzym beta-lactamase trong khi vi khuẩn gram dương lại kháng qua việc làm biến đổi vùng gắn kháng sinh trên vách, penicillin-binding proteins (PBPs) [69].2: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 1. Lây truyền ngang từ gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGT) Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua con đường lây truyền ngang từ gen chuyển là con đường rất thường gặp trong kháng kháng sinh. Vi khuẩn thường thu nhận các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua 03 cơ chế chính là: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp.

Biến nạp là hình thức đơn giản nhất nhưng chỉ có một số ít các vi khuẩn tự nhiên có thể tiếp nhận các DNA ngoại lai và phát triển tính kháng. Các vụ dịch lây lan các vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện thường liên quan đến cơ chế tiếp hợp- một phương pháp chuyển gen hiệu quả thông qua việc tiếp xúc giữa tế bào cho và tế bào nhận thông qua pili giới tính (như E. coli), thường xảy ra với tỷ lệ cao ở đường tiêu hóa dưới ở người khi được điều trị bằng kháng sinh. Tiếp hợp, theo nguyên tắc chung, thường sử dụng các yếu tố di truyền động (mobile genetic elements- MGEs) là phương tiện để chia sẻ các thông tin di truyền có giá trị trong đó có yếu tố kháng kháng sinh.

MGEs quan trọng nhất là plasmid và transposon-có vai trò quan trọng 9 trong việc phát triển và lây lan các vi khuẩn kháng kháng sinh trên lâm sàng. Một trong những cơ chế hiệu quả nhất để tích lũy các gen đề kháng kháng sinh thông qua các integron, integron cũng chứa trình tự ADN đặc biệt cho phép integraz chèn các nhóm gen gọi là cassette vào nhiễm sắc thể, mà trên đó có promoter cho phép các gen cassette mới được biểu hiện [97].3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông qua các yếu tố truyền gen (D) (nguồn: Christian von Wintersdorff (2016), Dissemination of Antimicrobial Resistance in Microbial Ecosystems through Horizontal Gene Transfer)[102]. Plasmid: Plasmid là các phân tử ADN vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể và có khả năng tự nhân lên. Plasmid chứa các gen mã hóa nhiều đặc tính khác nhau giúp tế bào chủ tồn tại được dưới áp lực của chọn lọc.

Một số plasmid có vai trò quan trọng trong vi sinh y học là plasmid mang gen đề kháng kháng sinh và kim loại nặng (R-plasmid), plasmid sinh độc tố, plasmid chứa yếu tố độc lực (khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào). Các plasmid lớn mang bộ gen tra (transfer) hoặc RTF (Resistance Transfer Factor) có khả năng tiếp hợp với vi khuẩn khác và truyền 10 chất liệu di truyền cho vi khuẩn nhận. Plasmid nhỏ có gen mob (mobilization) sẽ được gắn vào một plasmid có tra+ nào đó và cùng được dẫn truyền sang vi khuẩn nhận.