Luận án tiến sỹ: Đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin tại Hà Nam

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin từ người và động vật tại xã Thanh Hà, Hà Nam năm 2015.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tuyết Mai
• Người hướng dẫn: TS. Trần Huy Hoàng
• Trường học: Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Vi sinh y học
• Đề tài: Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của Escherichia coli Mang Gen mcr-1 Kháng Colistin Tại Hà Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.1. Sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.2. Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.2. Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.1. Vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.2. Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay
• 1.3. Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E. coli
• 1.3.1. Đặc điểm vi sinh vật học
• 1.3.2. Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E. coli và các vi khuẩn gram âm đường ruột trên thế giới và Việt Nam
• 1.3.3. Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E. coli kháng colistin
• 1.4. Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh
• 1.4.1. Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh
• 1.4.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.4.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
• 1.4.2.2. Kỹ thuật RADP PCR
• 1.4.2.3. Kỹ thuật điện di xung trường
• 1.4.2.4. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn
• 1.4.2.5. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing
• 1.4.2.6. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 1.5. Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm
• 2.6.1. Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
• 2.6.2. PCR phát hiện gen mcr-1
• 2.6.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF
• 2.6.4. Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu
• 2.6.5. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.6.6. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn
• 2.6.7. Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr-1 qua plasmid
• 2.7. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp thu thập thông tin
• 2.9. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.10. Khống chế sai số
• 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
• 3.1.1. Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu
• 3.1.2. Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.3. Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.4. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.5. Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E. coli
• 3.1.6. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước
• 3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.2.1. Các gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1
• 3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen
• 3.3. Kết quả xác định đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid và cấu trúc di truyền động của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
• 3.3.1. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mcr-1
• 3.3.2. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn
• 3.3.3. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.1. Một số đặc điểm về quần thể thu thập mẫu nghiên cứu
• 4.1.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.3. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin
• 4.1.4. Sự phổ biến của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên NST và plasmid
• 4.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng trong nghiên cứu
• 4.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 4.2.1. Các gen kháng kháng sinh
• 4.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật PFGE
• 4.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen
• 4.3. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của Escherichia coli

Nghiên cứu về Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin tại Hà Nam là một vấn đề cấp thiết trong bối cảnh kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Escherichia coli là một trong những vi khuẩn gram âm phổ biến nhất, có khả năng gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng. Việc phát hiện gen mcr-1 cho thấy sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, điều này đặt ra thách thức lớn cho y tế công cộng. Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định tỷ lệ và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam.

1.1. Đặc Điểm Của Gen mcr 1 Và Tác Động Đến Sức Khỏe Cộng Đồng

Gen mcr-1 là một yếu tố di truyền quan trọng, cho phép E. coli kháng lại colistin, một kháng sinh được sử dụng như lựa chọn cuối cùng. Sự hiện diện của gen này trong cộng đồng có thể dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ nhiễm trùng khó điều trị, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng.

1.2. Tình Hình Kháng Kháng Sinh Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, tình trạng kháng kháng sinh đang gia tăng, đặc biệt là ở các vi khuẩn gram âm. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng colistin trong chăn nuôi và điều trị bệnh đã tạo điều kiện cho sự phát triển của các chủng E. coli mang gen mcr-1.

II. Vấn Đề Kháng Kháng Sinh Và Thách Thức Đối Với Y Tế Công Cộng

Kháng kháng sinh là một trong những thách thức lớn nhất đối với y tế công cộng hiện nay. Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là E. coli mang gen mcr-1, đã làm cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng trở nên khó khăn hơn. Việc phát hiện và kiểm soát các chủng này là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

2.1. Nguyên Nhân Gia Tăng Kháng Kháng Sinh

Sự gia tăng kháng kháng sinh chủ yếu do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong y tế và nông nghiệp. Việc lạm dụng colistin trong chăn nuôi đã tạo ra áp lực chọn lọc mạnh mẽ, dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

2.2. Hệ Lụy Của Kháng Kháng Sinh Đối Với Sức Khỏe

Kháng kháng sinh không chỉ làm tăng tỷ lệ tử vong mà còn kéo dài thời gian điều trị và chi phí y tế. Các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của E

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để xác định đặc điểm của các chủng E. coli mang gen mcr-1. Các kỹ thuật như PCR, giải trình tự gen và điện di xung trường (PFGE) được áp dụng để phân tích và xác định mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Phát Hiện Gen mcr 1

Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1 trong các mẫu vi khuẩn. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các chủng E. coli mang gen kháng thuốc.

3.2. Phân Tích Kiểu Gen Bằng PFGE

Kỹ thuật PFGE giúp phân tích mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli mang gen mcr-1. Phương pháp này cho phép xác định sự lan truyền của gen kháng giữa các chủng vi khuẩn trong cộng đồng.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Tỷ Lệ E

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 tại xã Thanh Hà là đáng kể. Các mẫu phân lập từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước đều cho thấy sự hiện diện của gen kháng này, cho thấy nguy cơ lây lan trong cộng đồng.

4.1. Tỷ Lệ Phân Lập E. coli Mang Gen mcr 1 Từ Người

Nghiên cứu đã phát hiện tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 từ mẫu phân người là cao, cho thấy sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng dân cư.

4.2. Tỷ Lệ Phân Lập E. coli Mang Gen mcr 1 Từ Động Vật Nuôi

Mẫu phân lập từ động vật nuôi cũng cho thấy tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 cao, điều này cho thấy sự liên kết giữa việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc.

V. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 tại Hà Nam đã chỉ ra sự hiện diện đáng kể của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Việc kiểm soát và giám sát tình trạng kháng kháng sinh là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các biện pháp can thiệp hiệu quả.

5.1. Đề Xuất Các Biện Pháp Kiểm Soát Kháng Kháng Sinh

Cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong y tế và nông nghiệp. Việc giáo dục cộng đồng về kháng kháng sinh cũng là một yếu tố quan trọng trong việc giảm thiểu tình trạng này.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Gen mcr 1

Cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế lan truyền của gen mcr-1 và các yếu tố di truyền liên quan. Điều này sẽ giúp phát triển các chiến lược hiệu quả trong việc kiểm soát sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm đường ruột đang gia tăng nhanh chóng trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt là sự xuất hiện của các chủng mang gen blaNDM-1 đề kháng kháng sinh carbapenem – nhóm thuốc vốn được coi là lựa chọn ưu tiên trong điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn sinh enzym beta-lactamase phổ rộng (ESBLs). Trước tình hình đó, colistin (kháng sinh thuộc nhóm polypeptid) đã được tái sử dụng trên lâm sàng như một trong những giải pháp điều trị cuối cùng. Tuy nhiên, colistin từ lâu đã được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản nhằm mục đích phòng bệnh, điều trị và kích thích tăng trưởng.

Năm 2015, gen mcr-1 (mediated colistin resistance 1 hoặc mobilized colistin resistance 1) lần đầu tiên được phát hiện trên vi khuẩn Escherichia coli có nguồn gốc từ thịt lợn và phân người tại Trung Quốc. Khác với các cơ chế kháng colistin qua đột biến nhiễm sắc thể trước đây, gen mcr-1 nằm trên plasmid và các yếu tố di truyền di động, tạo điều kiện cho sự lan truyền ngang giữa các chủng vi khuẩn cùng loài và khác loài. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu bước đầu đã phát hiện vi khuẩn mang gen mcr-1 trong bệnh viện và tại một số trang trại chăn nuôi riêng lẻ. Tuy nhiên, tại khu vực miền Bắc chưa có công trình nào khảo sát một cách toàn diện và đồng bộ sự hiện diện, tỷ lệ lưu hành cũng như đặc tính sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên toàn bộ các thành phần của hệ sinh thái cộng đồng bao gồm người, động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước. Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tuyết Mai được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Xác định tỷ lệ chủng Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ phân người và vật nuôi, thực phẩm, nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam, năm 2015.
2. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng Escherichia coli mang gen mcr-1 đã phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin được phân lập từ các loại bệnh phẩm và mẫu môi trường.
• Phạm vi không gian: 69 hộ gia đình thuộc các thôn tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam.
• Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu được thu thập trong năm 2015 (thuộc giai đoạn 2014–2015).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về cơ chế kháng kháng sinh, tình hình sử dụng colistin và sự phân bố của gen mcr-1:

Các nghiên cứu quốc tế:

• Liu và cộng sự (2015) tại Trung Quốc: Công bố phát hiện gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase nằm trên plasmid ở vi khuẩn E. coli và Klebsiella pneumoniae. Tác giả ghi nhận tỷ lệ mang gen mcr-1 là 15% (78/523 mẫu) ở thịt sống, 21% (166/824 mẫu) ở động vật và 1% (16/1322 mẫu) ở bệnh nhân nội trú; đồng thời giải trình tự cấu trúc các plasmid mang gen như pHNSHP45, pE15004, pE15015 và pE15017.
• Anjum MF và cộng sự: Phát hiện các chủng E. coli và Salmonella mang gen mcr-1 tại trang trại nuôi lợn ở Anh, đồng thời mang enzym sinh ESBLs và yếu tố liên kết ISApl1.
• Fernandes MR và cộng sự: Phân lập chủng E. coli sequence type ST101 mang gen mcr-1 trên plasmid IncX4 từ bệnh nhân đái tháo đường bị nhiễm trùng bàn chân tại Brazil.
• Wong Sally CY và cộng sự (2015–2016): Giám sát tại bệnh viện đại học ở Hồng Kông, phát hiện 5 chủng Enterobacteriaceae mang gen mcr-1 (gồm 4 chủng E. coli, chiếm 0,4%).
• Nghiên cứu tại Đan Mạch: Bằng giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS), phân lập được 1 chủng E. coli mang gen mcr-1 từ máu bệnh nhân nhiễm trùng huyết (đồng mang gen blaCTX-M-55 và blaCMY-2) và 5 chủng từ thịt gà (đồng mang gen blaSHV-12 và blaCMY-2).
• Dan-xia Guo và cộng sự (Trung Quốc): Phân lập chủng K. pneumoniae và E. coli mang gen mcr-1 từ phân trẻ em bị tiêu chảy.
• Patrick McGann và cộng sự (Mỹ): Ghi nhận chủng E. coli sinh ESBL mang gen mcr-1 từ mẫu nước tiểu bệnh nhân nhiễm trùng đường niệu.
• Nghiên cứu tại Bangladesh: Phân lập chủng E. coli mang mcr-1 kháng 11 loại kháng sinh từ bùn thải đô thị.
• Yao Xu và cộng sự (Quảng Châu, Trung Quốc): Phát hiện chủng E. coli THSJ02 (ST167) trên mẫu cánh gà bán lẻ mang đồng thời các gen mcr-1, blaNDM-9, fosA3, rmtB, blaCTX-M-65 và floR.
• Các nghiên cứu tại Tây Ban Nha, Đức, Nam Mỹ và Thụy Sỹ ghi nhận sự xuất hiện của E. coli mang gen mcr-1 trong nước thải tưới tiêu, chất thải chuồng trại và thịt gia cầm.

Các nghiên cứu tại Việt Nam:

• Surbhi Malhotra-Kumar và cộng sự (2014–2015): Sàng lọc 24 chủng E. coli sinh ESBL phân lập từ phết trực tràng gà và lợn tại Hưng Yên (Văn Lâm) và Hà Nội (Hoài Đức), phát hiện 9/24 chủng (37,5%) mang gen mcr-1 với MIC colistin là 4–8 mg/L. Trình tự gen tương đồng 100% với trình tự công bố tại Trung Quốc.
• Nguyễn T. Nhung và cộng sự: Khảo sát tại 12 trang trại ở Tiền Giang, ghi nhận tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 từ 19% đến 22%, tỷ lệ đề kháng colistin ở gà là 22,2% và ở lợn là 24,4%.
• Dương Thị Toan và cộng sự (2014): Khảo sát tại 20 trang trại ở Bắc Giang, ghi nhận 45,0% cơ sở chăn nuôi lợn thịt sử dụng colistin.
• Phạm Kim Đăng và cộng sự: Điều tra tại Hải Phòng cho thấy việc sử dụng colistin bất hợp pháp ở liều thấp trong thức ăn hỗn hợp cho gà nhằm mục đích kích thích sinh trưởng.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết: Các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam chỉ khảo sát trên số lượng mẫu nhỏ, phân lập riêng rẽ ở vật nuôi tại trang trại hoặc bệnh nhân nội viện, chưa đánh giá đồng bộ sự phát tán của các chủng E. coli mang gen mcr-1 qua chuỗi liên kết sinh thái: người, động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước trong cùng một cộng đồng dân cư nông thôn. Luận án đã giải quyết khoảng trống này thông qua cách tiếp cận đa nguồn, xác định mối liên hệ phả hệ di truyền và cơ chế lan truyền qua plasmid tại tỉnh Hà Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Cơ chế tác dụng và đề kháng kháng sinh: Kháng sinh tác động qua ức chế tổng hợp vách, rối loạn chức năng màng nguyên tương, ức chế sinh tổng hợp protein, acid nucleic hoặc chất chuyển hóa. Đề kháng thu được xảy ra qua đột biến gen (thay đổi đích gắn protein, biến đổi kênh porin, hoạt hóa bơm đẩy efflux pump) hoặc tiếp nhận vật liệu di truyền ngoại lai qua truyền gen ngang (HGT: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp).
• Đặc điểm colistin và gen mcr-1: Colistin (polymyxin E) tích điện dương, gắn vào phân tử lipopolysaccharide (LPS) và lipid A ở màng ngoài vi khuẩn Gram âm, đẩy các ion Ca2+ và Mg2+ làm phá vỡ tính toàn vẹn màng. Gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase xúc tác gắn nhóm phosphoethanolamine vào lipid A, làm giảm điện tích âm của bề mặt tế bào vi khuẩn và vô hiệu hóa tác dụng của colistin.
• Yếu tố di truyền di động: Sự lan truyền của gen mcr-1 gắn liền với transposon Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1) và các nhóm plasmid tương thích (IncI2, IncHI2, IncX4, IncP, IncN).

Nhóm kháng sinh	Cơ chế đề kháng chính	Gen kháng quan trọng
β-lactam	Sinh enzym phá hủy vòng beta-lactam	AmpC, blaTEM-, blaSHV-, blaCTX-M-, blaNDM-, blaKPC-, blaOXA-
Aminoglycosid	Enzym biến đổi, methyl hóa 16S rRNA	armA, npmA, rmtA-D, aac, ant, aph
Chloramphenicol	Enzym acetyltransferase (CAT), bơm đẩy	catA, catB, cmlA, floR
Glycopeptid	Biến đổi thành phần cấu trúc peptidoglycan	vanA, vanB, vanC1, vanC2/3, vanD-G
Quinolon	Đột biến gyrase/topoisomerase, gen trên plasmid	gyrA/B, parC/E, qnrA-S, aac(6')-Ib-cr, qepA
Sulfonamid & Trimethoprim	Đột biến hoặc tiếp nhận gen thay thế con đường acid folic	folP, sul1-3, folA, dfrA, dfrB, dfrK
Polymyxin (Colistin)	Biến đổi lipid A trên màng ngoài	lpxA/C/D, pmrAB, phoPQ, mgrB, mcr-1 đến mcr-10

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp phân tích thực nghiệm sinh học phân tử.
• Quy trình thu thập mẫu: Thu thập các loại mẫu tại 69 hộ gia đình thuộc xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam, bao gồm: mẫu phân người (PN), mẫu phân động vật nuôi (PĐVN: lợn, gà, vịt, chó, mèo), mẫu thức ăn/thực phẩm (TĂ) và mẫu nước (N: nước ao, nước giếng, nước sinh hoạt).
• Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập: Nuôi cấy mẫu trên môi trường chọn lọc MacConkey có và không có bổ sung colistin, ủ ở 37°C.
• Kỹ thuật định danh vi khuẩn: Sử dụng hệ thống máy khối phổ MALDI-TOF để định danh chính xác loài Escherichia coli.
• Kỹ thuật PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện sự hiện diện của đoạn gen mcr-1.
• Kỹ thuật kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Đánh giá mức độ nhạy cảm của vi khuẩn theo tiêu chuẩn CLSI bằng phương pháp pha loãng trên thạch/canh thang và kỹ thuật E-test đối với colistin cùng các kháng sinh thông dụng khác.
• Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE): Cắt ADN hệ gen vi khuẩn bằng enzym giới hạn (XbaI), điện di xung trường để xác định mức độ tương đồng kiểu gen và lập cây phả hệ di truyền.
• Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và MLST: Giải trình tự ADN toàn bộ hệ gen, phân tích sequence type (ST) theo phương pháp Multi Locus Sequence Typing, phân tích core genome, xác định các gen kháng thuốc đồng hiện diện và cấu trúc vùng chứa gen mcr-1.
• Kỹ thuật phân tích plasmid: Phân loại replicon plasmid (PCR-based replicon typing), xác định vị trí gen mcr-1 trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid bằng enzym S1 kết hợp Southern blot.
• Thử nghiệm tiếp hợp (Conjugation): Đánh giá khả năng lan truyền gen mcr-1 qua plasmid giữa chủng cho (E. coli phân lập mang gen) và chủng nhận (E. coli J53 kháng sodium azide hoặc E. coli DH5α).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý thuyết về kháng sinh và cơ chế đề kháng vi sinh vật. Tác giả phân tích cụ thể 5 cơ chế tác dụng của kháng sinh, phân định giữa đề kháng tự nhiên, đề kháng thu được và đề kháng giả. Trọng tâm của chương làm rõ các cơ chế truyền gen ngang (tiếp hợp, biến nạp, tải nạp) và vai trò của các yếu tố di truyền di động (plasmid, transposon, integron) trong việc phát tán gen kháng. Tác giả tổng kết các nhóm gen kháng thuốc phổ biến trên thế giới, lịch sử sử dụng và tái sử dụng colistin trên lâm sàng, thực trạng lạm dụng colistin trong chăn nuôi tại Việt Nam và các nước. Chương 1 cũng điểm lại các mốc phát hiện gen mcr-1 từ năm 2015 đến nay trên thế giới và tại Việt Nam, đồng thời trình bày nguyên lý của các kỹ thuật vi sinh, sinh học phân tử (khuếch tán khoanh giấy, MIC, E-test, PCR, RAPD-PCR, PFGE, Southern blot, MLST, WGS).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết địa bàn nghiên cứu tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam – khu vực nông thôn có hoạt động chăn nuôi gia đình kết hợp trồng trọt. Tác giả chuẩn hóa quy trình lấy mẫu đối với 4 nhóm: phân người, phân vật nuôi, thực phẩm và nước tại 69 hộ gia đình. Các quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm được trình bày chi tiết theo các bước chuẩn: nuôi cấy chọn lọc, định danh bằng máy MALDI-TOF, tách chiết ADN, phản ứng PCR phát hiện gen mcr-1, xác định MIC colistin và các kháng sinh khác theo tiêu chuẩn CLSI. Chương này cũng nêu rõ phương pháp điện di xung trường PFGE, quy trình giải trình tự toàn bộ hệ gen WGS trên nền tảng giải trình tự thế hệ mới, kỹ thuật phân loại replicon plasmid, kỹ thuật lai Southern blot với enzym S1 và thử nghiệm tiếp hợp trên môi trường thạch chọn lọc. Tác giả trình bày các chỉ số nghiên cứu, phương pháp xử lý số liệu tin sinh học và các biện pháp kiểm soát sai số, đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được qua các bảng số liệu, biểu đồ và sơ đồ phân tích:

• Tỷ lệ phân lập chủng mang gen mcr-1: Tỷ lệ mẫu dương tính với chủng E. coli mang gen mcr-1 được thống kê cụ thể theo từng loại mẫu (phân người, phân động vật nuôi, thực phẩm và nước) tại 69 hộ gia đình thuộc các thôn của xã Thanh Hà.
• Mức độ nhạy cảm colistin và phân bố gen: Toàn bộ các chủng E. coli mang gen mcr-1 đều biểu hiện kiểu hình kháng colistin với giá trị MIC đạt ngưỡng kháng theo tiêu chuẩn CLSI. Phân tích Southern blot enzym S1 cho thấy gen mcr-1 phân bố chủ yếu trên các plasmid và một tỷ lệ nhỏ nằm trên nhiễm sắc thể.
• Tình trạng đa kháng kháng sinh: Các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được thể hiện tỷ lệ đa kháng cao với nhiều nhóm kháng sinh khác nhau bao gồm beta-lactam (ampicillin, cephalosporin thế hệ 3 như cefotaxime, ceftazidime), aminoglycosid (gentamicin, amikacin), quinolon (ciprofloxacin) và chloramphenicol, nhưng vẫn còn nhạy cảm cao với nhóm carbapenem (imipenem, meropenem).
• Đặc điểm sinh học phân tử qua WGS và PFGE: Giải trình tự toàn bộ hệ gen WGS xác định sự đồng hiện diện của nhiều nhóm gen kháng thuốc (blaCTX-M, blaTEM, floR, sul, dfrA, aac). Phân tích MLST chỉ ra sự đa dạng về sequence type (ST) trong quần thể, đồng thời ghi nhận sự xuất hiện của các chủng E. coli có cùng ST phân lập từ các loại mẫu khác nhau (người, động vật, thức ăn, nước) trong cùng một hộ gia đình. Cây phả hệ PFGE và cây phân loại core genome MLST khẳng định mối liên hệ di truyền gần gũi giữa các chủng phân lập từ các nguồn khác nhau tại địa bàn.
• Đặc điểm plasmid và cơ chế lan truyền di động: Phân loại replicon plasmid xác định các loại plasmid chủ yếu mang gen mcr-1 thuộc nhóm IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN và IncX4. Thử nghiệm tiếp hợp thực hiện thành công việc chuyển plasmid mang gen mcr-1 từ các chủng E. coli thực địa sang chủng nhận E. coli J53, làm cho chủng nhận có khả năng kháng colistin. Phân tích cấu trúc phân tử xác định gen mcr-1 nằm trong cấu trúc transposon động Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1).

Chương 4: Bàn luận

Tác giả thảo luận về ý nghĩa dịch tễ học của tỷ lệ lưu hành E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng nông thôn Hà Nam, đặt trong mối tương quan với thói quen sử dụng kháng sinh colistin trong chăn nuôi quy mô hộ gia đình. Bàn luận sâu về sự phân bố của gen mcr-1 trên plasmid IncI2 và IncHI2, phân tích cơ chế lan truyền qua tiếp hợp và vai trò của trình tự chèn ISApl1 trong việc tái tổ hợp, chèn gen mcr-1 vào nhiễm sắc thể hoặc sang các plasmid khác. Tác giả biện luận bằng chứng về sự lây truyền chéo vi khuẩn mang gen kháng giữa vật nuôi, thực phẩm, môi trường nước và đường ruột người dựa trên dữ liệu kiểu gen PFGE và ST chung trong cùng hộ gia đình, từ đó nêu bật nguy cơ đối với sức khỏe cộng đồng và đề xuất các giải pháp kiểm soát.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về lý luận và khoa học

1. Cung cấp bộ số liệu dịch tễ học phân tử đồng bộ đầu tiên tại Việt Nam về sự phân bố và tỷ lệ lưu hành của vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin trên 4 thành phần sinh thái trong cùng một cộng đồng dân cư: người, động vật nuôi, thực phẩm và môi trường nước.
2. Chứng minh bằng chứng di truyền học phân tử (thông qua kỹ thuật PFGE, MLST, WGS) về sự tương đồng kiểu gen giữa các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập từ phân người, phân vật nuôi, thực phẩm và nước trong cùng hộ gia đình, khẳng định sự lây truyền qua lại giữa các nguồn trong chuỗi thức ăn và môi trường sống.
3. Xác định đặc tính phân tử của các plasmid mang gen mcr-1 (thuộc các nhóm replicon IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN), chứng minh khả năng truyền ngang gen mcr-1 qua cơ chế tiếp hợp sang chủng vi khuẩn nhận trong phòng thí nghiệm, và làm rõ cấu trúc di truyền động transposon Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1).

Đóng góp thực tiễn và kiến nghị

• Cung cấp cơ sở khoa học cảnh báo về nguy cơ lây lan tính kháng colistin từ môi trường chăn nuôi sang người qua chuỗi thức ăn và nguồn nước sinh hoạt.
• Cung cấp bằng chứng thực địa phục vụ các cơ quan quản lý y tế và nông nghiệp trong việc xây dựng chính sách quản lý, cấm sử dụng kháng sinh colistin làm chất kích thích sinh trưởng hoặc phòng bệnh trong chăn nuôi.
• Đề xuất tăng cường hệ thống giám sát kháng kháng sinh theo mô hình tiếp cận Một sức khỏe (One Health), phối hợp chặt chẽ giữa ngành Y tế, Thú y và Môi trường.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả cắt ngang tại một địa bàn xã nông nghiệp (xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam) với mẫu thu thập trong năm 2015, do đó chưa theo dõi được biến động dịch tễ học phân tử theo thời gian dài và chưa bao phủ các vùng địa lý khác.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Cần mở rộng quy mô nghiên cứu giám sát dịch tễ học phân tử theo chiều dọc tại nhiều vùng sinh thái nông thôn và đô thị; nghiên cứu sâu hơn về tính ổn định của các plasmid mang gen mcr-1 trong các điều kiện môi trường tự nhiên khác nhau; đồng thời mở rộng sàng lọc các biến thể gen mới trong họ gen kháng colistin (từ mcr-2 đến mcr-10) trên các loài vi khuẩn Gram âm đường ruột khác như Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., và Acinetobacter baumannii.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu có giá trị cho:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Thuộc các chuyên ngành Vi sinh Y học, Vi sinh Thú y, Dịch tễ học, Bệnh truyền nhiễm và Y tế công cộng. Phần phương pháp nghiên cứu (kết hợp đồng bộ từ MALDI-TOF, E-test, PFGE, WGS đến tiếp hợp plasmid) là tài liệu tham khảo quy chuẩn cho các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử kháng kháng sinh.
• Các nhà hoạch định chính sách và cơ quan quản lý: Cục Y tế Dự phòng, Cục Quản lý Khám chữa bệnh (Bộ Y tế), Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) trong việc xây dựng các quy chuẩn quản lý sử dụng kháng sinh và kế hoạch hành động quốc gia về phòng chống kháng thuốc tại Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng sinh colistin có vai trò lâm sàng như thế nào và tại sao việc phát hiện gen mcr-1 lại là một cảnh báo nghiêm trọng?
Colistin thuộc nhóm polypeptid, vốn bị ngừng dùng trên người từ thập niên 1970 do độc tính trên thận và thần kinh, nhưng đã được tái sử dụng từ những năm 2000 như lựa chọn cuối cùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng nặng do trực khuẩn Gram âm đa kháng và kháng carbapenem (chứa gen blaNDM-1). Việc phát hiện gen mcr-1 cảnh báo nguy cơ vi khuẩn đề kháng cả carbapenem lẫn colistin, làm mất đi giải pháp kháng sinh điều trị cuối cùng ở người.

2. Đề tài đã thu thập những loại mẫu nào và tại địa bàn cụ thể nào?
Đề tài thu thập 4 nhóm mẫu gồm: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN: lợn, gà, vịt, chó, mèo), thực phẩm/thức ăn (TĂ) và mẫu nước (N) tại 69 hộ gia đình thuộc các thôn tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam trong năm 2015.

3. Gen mcr-1 được xác định nằm trên những cấu trúc di truyền nào trong các chủng vi khuẩn phân lập?
Gen mcr-1 được xác định phân bố chủ yếu trên các plasmid thuộc nhóm replicon IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN, IncX4 và một phần nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn E. coli, gắn liền với các yếu tố di truyền di động transposon Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1).

4. Khả năng truyền gen kháng colistin giữa các chủng vi khuẩn được chứng minh qua thử nghiệm nào trong luận án?
Khả năng truyền gen kháng được chứng minh qua thử nghiệm tiếp hợp (conjugation) trong phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy plasmid mang gen mcr-1 từ các chủng E. coli thực địa đã chuyển thành công sang chủng vi khuẩn nhận E. coli J53, làm cho chủng nhận mang gen mcr-1 và biểu hiện tính kháng colistin.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Mai đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu nghiên cứu, xác định tỷ lệ và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam năm 2015. Bằng việc ứng dụng đồng bộ các kỹ thuật sinh học phân tử như PFGE, MLST, WGS, phân loại replicon plasmid và tiếp hợp, luận án đã chứng minh sự lan truyền ngang của gen mcr-1 qua plasmid cũng như mối liên hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn phân lập từ các nguồn khác nhau trong cùng hộ gia đình. Các phát hiện thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho chiến lược Một sức khỏe (One Health), khẳng định tính cấp thiết của việc kiểm soát sử dụng colistin trong chăn nông nghiệp nhằm ngăn chặn sự phát tán của các chủng vi khuẩn đa kháng bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 1. Định nghĩa: Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu [6] 1. Cơ chế tác dụng Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng bằng cách: - Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ví dụ nhóm penicillin, nhóm cephalosporin, vancomycin - Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, đặc biệt là chức năng thẩm thấu chọn lọc, làm cho các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài, ví dụ nhóm polymyxin, Daptomycin - Ức chế sinh tổng hợp protein, ví dụn nhóm aminoglycoside, nhóm macrolid - Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic, ví dụ nhóm quinolon - Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào như kháng sinh nhóm sulfamid [6] Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh 5 1.

Sự đề kháng kháng sinh Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, nhưng khi trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh. Vi sinh vật đa kháng kháng sinh (MDRO) là các vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn có khả năng kháng một hoặc hơn một loại kháng sinh. Một số vi khuẩn chỉ kháng một loại kháng sinh vẫn được coi là đa kháng kháng sinh như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) hay vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)[31] 1. Phân loại đề kháng kháng sinh Có 2 loại đề kháng: là đề kháng giả và đề kháng thật - Đề kháng giả: Đề kháng giả là có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản chất, tức là không do nguồn gốc di truyền.

Khi vào trong cơ thể, tác dụng của kháng sinh phụ thuộc vào ba yếu tố là kháng sinh - người bệnh - vi khuẩn. Đề kháng giả có thể do một trong ba yếu tố hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba yếu tố[6]. - Đề kháng thật: có 2 loại là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được. + Đề kháng tự nhiên do một số loài vi khuẩn không chịu tác dụng của một số kháng sinh nhất định.

aeruginosa không chịu tác dụng của penicilin G, S. aureus không chịu tác dụng của colistin. Hoặc vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh beta-lactam ức chế sinh tổng hợp vách. Đề kháng tự nhiên thường mang tính chất đặc trưng theo từng loại vi khuẩn.

- Đề kháng thu được do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gen đề kháng để một vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng, nghĩa là đang nhạy cảm trở thành có khả năng đề kháng kháng sinh. Các gen đề kháng có thể nằm trên một, một số hoặc tất cả các thành phần di truyền của vi khuẩn gồm nhiễm sắc thể, plasmid và transposon. Đề kháng thu được thường mang tính chất của từng cá thể trong loài[6]. 6 Đề kháng thu được là yếu tố đóng vai trò chính trong việc gia tăng tình hình kháng kháng sinh hiện nay.

Các nghiên cứu về kháng kháng sinh của vi khuẩn luôn tập trung phân tích những biến đổi về mặt di truyền của vi khuẩn do đề kháng thu được làm thay đổi tính đề kháng của vi khuẩn như thế nào 1. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Sự chọn lọc tự nhiên tạo ra những đáp ứng đặc hiệu dẫn đến các đột biến gen để thích nghi. Gần như toàn bộ các kháng sinh sẵn có hiện nay trong thực hành lâm sàng thu nhận được các đột biến gen từ các chất liệu di truyền hoặc những biến đổi của các gen biểu hiện, tạo ra sự kháng thuốc. Việc hiểu rõ nền tảng cơ bản về sinh học và gen học của sự kháng kháng sinh là vần đề rất quan trọng để làm giảm sự lan rộng của kháng kháng sinh cũng như cải thiện việc điều trị trên lâm sàng.

Vi khuẩn thường sử dụng 2 cơ chế chính về mặt gen học để thích ứng và tạo ra sự kháng kháng kháng sinh là: - Đột biến gen thường liên quan tới sự hoạt động của các thuốc kháng sinh; - Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng từ bên ngoài thông qua lây truyền ngang từ các gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGL). Từ các gen kháng kháng sinh này sẽ tổng hợp ra các protein chức năng, tạo ra các cơ chế kháng khác nhau [69]. Đột biến kháng thuốc Đột biến kháng thuốc xảy ra khi có một tập hợp nhỏ trong quần thể vi khuẩn nhạy cảm với thuốc kháng sinh phát triển các đột biến gen ảnh hưởng tới hoạt động của thuốc kháng sinh. Nhóm vi khuẩn này vẫn tồn tại khi có mặt của thuốc kháng sinh.

Khi đột biến xảy ra, kháng sinh đã loại bỏ hết quần thể nhạy cảm và chỉ còn các vi khuẩn kháng kháng sinh chiếm ưu thế. Các đột biến kháng thuốc thông qua các cơ chế sau: - Làm thay đổi đích tác động Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do đó kháng sinh không còn vị trí để tác động, ví dụ: A. baumannii kháng lại imipenem và P. aeruginosa kháng ticarcillin và imipenem do chúng thay đổi vị trí gắn vào protein của các kháng sinh.

Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolon là ức chế hoạt động của đoạn 7 gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV của tế bào vi khuẩn. Ví dụ tính kháng quinolon của S. typhi xảy ra do đột biến điểm của các đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [103, 124]. - Thay đổi các con đường chuyển hóa thông qua sự thay đổi mạng lưới điều hòa Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh.

Ví dụ với các enzym beta-lactamase có khả năng phá hủy penicillin được báo cáo trước khi được đưa vào sử dụng vào đầu những năm 1940. Sau đó hàng loạt các enzym beta-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện. Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [82]. - Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, giảm sự hấp thu thuốc Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracyclin hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid.

Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam vào vi khuẩn được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [82]. - Cơ chế bơm đẩy (efflux pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E. aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào [69]. Như vậy, từ khi tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn đã phát triển các cơ chế kháng thuốc phức tạp để chống lại sự tác động của kháng sinh và tồn tại, quá trình này diễn ra theo sự tiến hóa tự nhiên, trải qua hàng trăm năm.

Sự đề kháng với một loại kháng sinh thường xảy ra qua nhiều nhiều con đường khác nhau. Tuy nhiên, mỗi loài vi khuẩn có một cơ chế kháng ưu tiên khác với các loài khác đối với cùng loại kháng sinh như các vi khuẩn gram âm kháng kháng sinh nhóm beta-lactam 8 thông qua việc sinh enzym beta-lactamase trong khi vi khuẩn gram dương lại kháng qua việc làm biến đổi vùng gắn kháng sinh trên vách, penicillin-binding proteins (PBPs) [69].2: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 1. Lây truyền ngang từ gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGT) Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua con đường lây truyền ngang từ gen chuyển là con đường rất thường gặp trong kháng kháng sinh. Vi khuẩn thường thu nhận các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua 03 cơ chế chính là: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp.

Biến nạp là hình thức đơn giản nhất nhưng chỉ có một số ít các vi khuẩn tự nhiên có thể tiếp nhận các DNA ngoại lai và phát triển tính kháng. Các vụ dịch lây lan các vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện thường liên quan đến cơ chế tiếp hợp- một phương pháp chuyển gen hiệu quả thông qua việc tiếp xúc giữa tế bào cho và tế bào nhận thông qua pili giới tính (như E. coli), thường xảy ra với tỷ lệ cao ở đường tiêu hóa dưới ở người khi được điều trị bằng kháng sinh. Tiếp hợp, theo nguyên tắc chung, thường sử dụng các yếu tố di truyền động (mobile genetic elements- MGEs) là phương tiện để chia sẻ các thông tin di truyền có giá trị trong đó có yếu tố kháng kháng sinh.

MGEs quan trọng nhất là plasmid và transposon-có vai trò quan trọng 9 trong việc phát triển và lây lan các vi khuẩn kháng kháng sinh trên lâm sàng. Một trong những cơ chế hiệu quả nhất để tích lũy các gen đề kháng kháng sinh thông qua các integron, integron cũng chứa trình tự ADN đặc biệt cho phép integraz chèn các nhóm gen gọi là cassette vào nhiễm sắc thể, mà trên đó có promoter cho phép các gen cassette mới được biểu hiện [97].3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông qua các yếu tố truyền gen (D) (nguồn: Christian von Wintersdorff (2016), Dissemination of Antimicrobial Resistance in Microbial Ecosystems through Horizontal Gene Transfer)[102]. Plasmid: Plasmid là các phân tử ADN vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể và có khả năng tự nhân lên. Plasmid chứa các gen mã hóa nhiều đặc tính khác nhau giúp tế bào chủ tồn tại được dưới áp lực của chọn lọc.

Một số plasmid có vai trò quan trọng trong vi sinh y học là plasmid mang gen đề kháng kháng sinh và kim loại nặng (R-plasmid), plasmid sinh độc tố, plasmid chứa yếu tố độc lực (khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào). Các plasmid lớn mang bộ gen tra (transfer) hoặc RTF (Resistance Transfer Factor) có khả năng tiếp hợp với vi khuẩn khác và truyền 10 chất liệu di truyền cho vi khuẩn nhận. Plasmid nhỏ có gen mob (mobilization) sẽ được gắn vào một plasmid có tra+ nào đó và cùng được dẫn truyền sang vi khuẩn nhận.