Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin

Tài liệu phân tích đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin, cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tuyết Mai
• Người hướng dẫn: TS. Trần Huy Hoàng
• Trường học: Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Vi sinh y học
• Đề tài: Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của Escherichia coli Mang Gen mcr-1 Kháng Colistin Phân Lập Từ Người Và Vật Nuôi, Thực Phẩm Và Nước Tại Xã Thanh Hà, Hà Nam, Năm 2015
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
• 1.2. Sự đề kháng kháng sinh
• 1.3. Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.4. Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.4.1. Vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.4.2. Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay
• 1.5. Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E.
• 1.5.1. Đặc điểm vi sinh vật học
• 1.5.2. Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E. coli và các vi khuẩn gram âm đường ruột trên thế giới và Việt Nam
• 1.5.3. Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E. coli kháng colistin
• 1.6. Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh
• 1.6.1. Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh
• 1.6.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.6.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
• 1.6.2.2. Kỹ thuật RADP PCR
• 1.6.2.3. Kỹ thuật điện di xung trường
• 1.6.2.4. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn
• 1.6.2.5. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing
• 1.6.2.6. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 1.7. Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm
• 2.6.1. Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
• 2.6.2. PCR phát hiện gen mcr-1
• 2.6.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF
• 2.6.4. Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu
• 2.6.5. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.6.6. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn
• 2.6.7. Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr-1 qua plasmid
• 2.7. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp thu thập thông tin
• 2.9. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.10. Khống chế sai số
• 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
• 3.1.1. Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu
• 3.1.2. Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.3. Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.4. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.5. Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E.
• 3.2. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước
• 3.2.1. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.2.2. Các gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.2.3. Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1
• 3.2.4. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen
• 3.2.5. Kết quả xác định đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid và cấu trúc di truyền động của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
• 3.2.6. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mcr-1
• 3.2.7. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn
• 3.2.8. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1
• 3.3. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 3.3.1. Một số đặc điểm về quần thể thu thâp mẫu nghiên cứu
• 3.3.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 3.3.3. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin
• 3.3.4. Sự phổ biến của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên NST và plasmid
• 3.3.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng trong nghiên cứu
• 3.3.6. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.3.7. Các gen kháng kháng sinh
• 3.4. Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật PFGE
• 3.5. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen
• 3.6. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli kháng colistin

Nghiên cứu về Escherichia coli kháng colistin tại Hà Nam đã chỉ ra sự gia tăng đáng kể của các chủng vi khuẩn này trong cộng đồng. Việc phân lập và xác định đặc điểm sinh học phân tử của chúng là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc. Colistin là một trong những kháng sinh cuối cùng được sử dụng để điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn gram âm, nhưng sự xuất hiện của gen mcr-1 đã làm gia tăng mối lo ngại về kháng kháng sinh. Nghiên cứu này sẽ cung cấp cái nhìn sâu sắc về tình hình kháng thuốc tại khu vực này.

1.1. Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli kháng colistin

Các chủng E. coli mang gen mcr-1 cho thấy sự thay đổi trong cấu trúc di truyền và khả năng kháng thuốc. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng gen này nằm trên các plasmid di động, cho phép sự lan truyền nhanh chóng giữa các vi khuẩn. Việc hiểu rõ về đặc điểm này sẽ giúp trong việc phát triển các biện pháp kiểm soát hiệu quả.

1.2. Tình hình kháng colistin tại Hà Nam

Tại Hà Nam, tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 đã được ghi nhận ở nhiều mẫu từ người, động vật và thực phẩm. Điều này cho thấy sự lây lan của gen kháng này trong cộng đồng, gây ra những thách thức lớn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng.

II. Vấn đề kháng kháng sinh và thách thức trong điều trị

Kháng kháng sinh đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trên toàn cầu, đặc biệt là với sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc như E. coli mang gen mcr-1. Việc điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn này trở nên khó khăn hơn, đòi hỏi các phương pháp điều trị mới và hiệu quả hơn. Sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng mà còn gây áp lực lên hệ thống y tế.

2.1. Nguyên nhân gia tăng kháng kháng sinh

Sự lạm dụng kháng sinh trong y tế và nông nghiệp là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh. Việc sử dụng colistin trong chăn nuôi đã tạo điều kiện cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, làm gia tăng nguy cơ lây lan trong cộng đồng.

2.2. Hệ quả của kháng kháng sinh

Kháng kháng sinh dẫn đến việc điều trị các bệnh nhiễm trùng trở nên khó khăn hơn, làm tăng tỷ lệ tử vong và chi phí điều trị. Các bệnh viện phải đối mặt với tình trạng quá tải do sự gia tăng các ca nhiễm trùng kháng thuốc.

III. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử

Nghiên cứu này sử dụng nhiều phương pháp sinh học phân tử để xác định đặc điểm của các chủng E. coli mang gen mcr-1. Các kỹ thuật như PCR, giải trình tự gen và điện di xung trường (PFGE) được áp dụng để phân tích cấu trúc di truyền và khả năng kháng thuốc của các chủng vi khuẩn này. Những phương pháp này giúp cung cấp thông tin chi tiết về cơ chế kháng thuốc và sự lan truyền của gen kháng.

3.1. Kỹ thuật PCR trong nghiên cứu

Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1 trong các mẫu vi khuẩn. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các chủng vi khuẩn kháng thuốc, từ đó giúp đánh giá tình hình kháng thuốc trong cộng đồng.

3.2. Giải trình tự gen và PFGE

Giải trình tự gen và PFGE được áp dụng để phân tích cấu trúc di truyền của các chủng E. coli. Những kỹ thuật này giúp xác định mối quan hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn, từ đó hiểu rõ hơn về cơ chế lan truyền gen kháng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 tại Hà Nam là khá cao, với sự hiện diện của các chủng kháng thuốc trong nhiều mẫu từ người, động vật và thực phẩm. Những phát hiện này không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình hình kháng thuốc mà còn giúp xây dựng các biện pháp can thiệp hiệu quả nhằm kiểm soát sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

4.1. Tỷ lệ vi khuẩn kháng colistin

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 từ các mẫu phân lập là đáng kể. Điều này cho thấy sự phổ biến của gen kháng này trong cộng đồng và cần có các biện pháp kiểm soát kịp thời.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong việc xây dựng các chính sách y tế công cộng nhằm giảm thiểu sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Việc nâng cao nhận thức về kháng kháng sinh trong cộng đồng cũng là một yếu tố quan trọng.

V. Kết luận và hướng nghiên cứu tương lai

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli kháng colistin tại Hà Nam đã chỉ ra sự cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát hiệu quả đối với tình trạng kháng kháng sinh. Hướng nghiên cứu tương lai cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới và nâng cao nhận thức cộng đồng về kháng kháng sinh.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về tình hình kháng thuốc tại Hà Nam, từ đó giúp xây dựng các biện pháp can thiệp hiệu quả. Việc hiểu rõ về cơ chế kháng thuốc sẽ hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các yếu tố nguy cơ và phát triển các chiến lược kiểm soát sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Cần có sự hợp tác giữa các cơ quan y tế và cộng đồng để giải quyết vấn đề này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ y học với đề tài "Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam, năm 2015" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tuyết Mai, chuyên ngành Vi sinh Y học (mã số: 62 72 01 15) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trần Huy Hoàng và PGS. Vũ Thị Tường Vân.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm đường ruột đang ngày càng gia tăng và diễn biến phức tạp. Sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn sinh enzym beta-lactamase phổ rộng (ESBL) và đặc biệt là các chủng mang gen kháng carbapenem như blaNDM-1 đã làm suy giảm đáng kể hiệu quả của các kháng sinh điều trị bậc cao. Trong bối cảnh đó, colistin (polymyxin E) — một kháng sinh polypeptid từng bị hạn chế sử dụng trên người từ thập niên 1970 do độc tính trên thận và thần kinh — đã được tái sử dụng trên lâm sàng như một lựa chọn điều trị cuối cùng cho các ca nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm đa kháng và kháng carbapenem.

Tuy nhiên, colistin vẫn được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp và chăn nuôi nhằm mục đích phòng bệnh, điều trị và kích thích tăng trưởng cho gia súc, gia cầm. Năm 2015, gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase có khả năng đề kháng colistin qua trung gian plasmid được phát hiện lần đầu tiên tại Trung Quốc. Khác với cơ chế kháng colistin qua đột biến nhiễm sắc thể truyền dọc truyền thống, gen mcr-1 nằm trên plasmid và các yếu tố di truyền động (transposon), cho phép tính kháng lây truyền ngang nhanh chóng giữa các cá thể vi khuẩn cùng loài và khác loài.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu phát hiện vi khuẩn mang gen mcr-1 trong môi trường bệnh viện hoặc khảo sát cục bộ trên vật nuôi tại một số trang trại riêng lẻ (như tại Hưng Yên, Hoài Đức - Hà Nội). Chưa có công trình nào đánh giá toàn diện và đồng bộ sự hiện diện của E. coli mang gen mcr-1 trong toàn bộ hệ sinh thái cộng đồng gồm bốn mắt xích: người, động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước sinh hoạt tại một khu vực nông thôn miền Bắc Việt Nam, cũng như chưa đi sâu phân tích cấu trúc di truyền và cơ chế lan truyền plasmid của các chủng này.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định tỷ lệ chủng Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ phân người và vật nuôi, thực phẩm, nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015.
2. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử chủng Escherichia coli mang gen mcr-1 đã phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ các loại mẫu: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN - lợn, gà, chó, vịt...), thực phẩm/thức ăn (TĂ) và nguồn nước sinh hoạt/môi trường (N).
• Phạm vi không gian: 69 hộ gia đình thuộc các thôn tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam.
• Phạm vi thời gian: Thu thập mẫu và triển khai phân tích trong giai đoạn 2014–2015; hoàn thành và bảo vệ luận án năm 2022.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế

Trong chương tổng quan, tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến cơ chế kháng kháng sinh, lịch sử sử dụng colistin và sự phân bố của gen mcr-1:

• Phát hiện ban đầu về gen mcr-1: Liu và cộng sự (2015) công bố phát hiện gen mcr-1 trên plasmid của E. coli và K. pneumoniae phân lập từ thịt lợn sống (15%), phân động vật (21%) và bệnh nhân nội trú (1%) tại Trung Quốc, chứng minh cơ chế kháng colistin lây truyền ngang qua tiếp hợp plasmid.
• Sự lan rộng toàn cầu:
  • Fernandes MR và cộng sự phân lập chủng E. coli ST101 mang mcr-1 trên plasmid IncX4 từ bệnh nhân tiểu đường nhiễm trùng bàn chân tại Brazil.
  • Wong Sally CY và cộng sự (2016) giám sát tại bệnh viện đại học ở Hồng Kông, phát hiện 04 chủng E. coli mang mcr-1 (chiếm 0,4% chủng vi khuẩn đường ruột phân lập lâm sàng).
  • Patrick McGann và cộng sự tại Mỹ phát hiện chủng E. coli sinh ESBL mang gen mcr-1 từ bệnh nhân nhiễm trùng đường niệu.
  • Yao, Xu và cộng sự phát hiện chủng E. coli THSJ02 (ST167) từ cánh gà siêu thị tại Quảng Châu mang đồng thời mcr-1 và blaNDM-9, cùng các gen kháng khác như fosA3, rmtB, blaCTX-M-65, floR.
  • Các nghiên cứu khác tại Đan Mạch, Đức, Tây Ban Nha, Thụy Sỹ, Bangladesh cũng ghi nhận E. coli mang mcr-1 từ bệnh phẩm người, thịt gà, bùn thải và nước tưới tiêu.
• Tình hình sử dụng kháng sinh và nghiên cứu mcr-1 tại Việt Nam:
  • Dương Thị Toan và cộng sự (2014) khảo sát tại Bắc Giang ghi nhận 100% trang trại lợn và gà sử dụng kháng sinh phòng và trị bệnh, trong đó colistin chiếm 45,0%.
  • Phạm Kim Đăng và cộng sự khảo sát tại Hải Phòng ghi nhận việc sử dụng bất hợp pháp colistin liều thấp trộn trong thức ăn để kích thích sinh trưởng gia cầm.
  • Nguyễn T. Nhung và cộng sự khảo sát tại Tiền Giang phát hiện tỷ lệ kháng colistin ở E. coli từ gà và lợn lần lượt là 22,2% và 24,4%, với tỷ lệ mang mcr-1 từ 19% đến 22%.
  • Surbhi Malhotra-Kumar và cộng sự (2016) sàng lọc 24 chủng E. coli sinh ESBL tại Hưng Yên và Hà Nội, phát hiện 9/24 chủng (37,5%) mang gen mcr-1 với MIC colistin từ 4 đến 8 mg/L.

Khoảng trống luận án giải quyết

Mặc dù đã có các ghi nhận ban đầu về sự hiện diện của gen mcr-1 tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đó chỉ tập trung vào một nhóm đối tượng hẹp (mẫu lâm sàng bệnh viện hoặc mẫu phân vật nuôi tại một số trang trại) mà chưa khảo sát đồng thời mối liên hệ giữa các mắt xích trong cùng một quần thể sinh thái cộng đồng. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách thu thập mẫu có đối chứng theo hộ gia đình tại một xã nông thôn (Thanh Hà, Hà Nam), khảo sát đồng thời bốn nguồn (người, vật nuôi, thực phẩm, nước) và sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu (PFGE, WGS, tiếp hợp, replicon typing) để phân tích cấu trúc di truyền động và cơ chế lan truyền gen kháng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

• Cơ chế tác dụng của colistin: Colistin là một phân tử cationic liên kết tĩnh điện với lipopolysaccharid (LPS) và phospholipid ở màng ngoài vi khuẩn Gram âm, cạnh tranh thế chỗ các ion ổn định màng ($Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$), phá vỡ tính thấm chọn lọc của màng tế bào và gây chết vi khuẩn.
• Cơ chế kháng colistin qua gen mcr-1: Gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase, xúc tác gắn nhóm phosphoethanolamine vào phân tử lipid A của LPS, làm giảm điện tích âm của màng ngoài và làm mất ái lực liên kết của colistin.
• Cơ chế truyền gen ngang (Horizontal Gene Transfer - HGT): Luận án dựa trên lý thuyết truyền gen ngang qua ba phương thức chính: tiếp hợp (conjugation), biến nạp (transformation) và tải nạp (transduction), tập trung vào vai trò của các yếu tố di truyền di động (MGEs) gồm plasmid tự truyền (conjugative plasmid) và transposon (cấu trúc Tn6330 với trình tự chèn ISApl1).

Phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm vi sinh học và sinh học phân tử trong phòng thí nghiệm.

Mẫu thực địa (Người, Vật nuôi, Thực phẩm, Nước)
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên môi trường chọn lọc
Định danh loài vi khuẩn bằng hệ thống MALDI-TOF
Sàng lọc gen mcr-1 bằng kỹ thuật PCR
Thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) & Kháng sinh đồ
Phân tích sinh học phân tử chuyên sâu:

• Thu thập mẫu: Mẫu phân người, phân động vật nuôi, mẫu thức ăn và mẫu nước sinh hoạt được thu thập từ các hộ gia đình tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam theo đúng quy trình vô trùng và vận chuyển về phòng xét nghiệm trong điều kiện bảo quản lạnh.
• Kỹ thuật vi sinh: Nuôi cấy phân lập trên môi trường thạch MacConkey/LB; định danh chủng E. coli bằng máy khối phổ MALDI-TOF.
• Đo độ nhạy cảm kháng sinh (MIC): Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của colistin và các kháng sinh khác (cefotaxime, ceftazidime, cefepime, imipenem, meropenem, ciprofloxacin, gentamicin, amikacin...) theo tiêu chuẩn CLSI bằng phương pháp pha loãng trong thạch, khoanh giấy khuếch tán và E-test.
• Kỹ thuật sinh học phân tử:
  • PCR: Khuếch đại đoạn gen đặc hiệu để phát hiện sự có mặt của gen mcr-1.
  • Điện di xung trường (PFGE): Cắt ADN hệ gen bằng enzyme giới hạn thích hợp và điện di xung trường để phân tích sự tương đồng di truyền giữa các chủng phân lập từ các nguồn khác nhau.
  • Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS): Giải trình tự gen thế hệ mới để xác định kiểu chuỗi trình tự (Sequence Type - ST qua MLST), phân tích hệ gen lõi (core genome), tìm kiếm các gen kháng kháng sinh đi kèm và cấu trúc vùng lân cận gen mcr-1.
  • Xác định plasmid và cấu trúc di động: Phân loại replicon plasmid (IncI2, IncHI2, IncN, IncX4...), xác định vị trí gen mcr-1 trên plasmid hay nhiễm sắc thể (NST), phân tích transposon Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1).
  • Thử nghiệm tiếp hợp (Conjugation experiment): Sử dụng chủng cho là các chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được và chủng nhận là E. coli J53 (hoặc DH5$\alpha$) kháng sodium azide/rifampicin nhằm kiểm tra khả năng truyền plasmid kháng colistin qua tiếp xúc tế bào.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 trình bày hệ thống lý thuyết về kháng sinh và cơ chế tác dụng, phân loại cơ chế đề kháng (đề kháng giả, đề kháng tự nhiên, đề kháng thu được). Tác giả tổng hợp chi tiết các nhóm gen kháng kháng sinh quan trọng:

• Nhóm $\beta$-lactam: gen sinh ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M), gen sinh AmpC (blaCMY), carbapenemase (blaKPC, blaNDM, blaOXA-48, blaIMP, blaVIM).
• Nhóm aminoglycosid: gen 16S rRNA methylase (armA, rmtA-D, npmA) và các enzyme biến đổi AAC, ANT, APH.
• Nhóm chloramphenicol: catA, catB, cmlA, floR.
• Nhóm quinolon: đột biến nhiễm sắc thể trên gyrA, gyrB, parC, parE và gen trên plasmid như qnr, aac(6')-Ib-cr, qepA.
• Nhóm polymyxin: hệ gen mcr-1 đến mcr-10.

Chương này cũng phân tích thực trạng lạm dụng kháng sinh trong y tế và chăn nuôi, các con đường lây truyền vi khuẩn kháng thuốc qua chuỗi thức ăn, cùng nguyên lý của các kỹ thuật phân tích phân tử (PCR, PFGE, MLST, Southern blot, WGS, Replicon typing).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết địa bàn nghiên cứu tại xã Thanh Hà, thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả, quy mô lấy mẫu tại 69 hộ gia đình. Tác giả chuẩn hóa các quy trình thao tác:

• Quy trình lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu phân, thực phẩm, nước.
• Quy trình nuôi cấy chọn lọc, phân lập và định danh E. coli bằng MALDI-TOF.
• Quy trình phản ứng PCR khuếch đại gen mcr-1.
• Phương pháp xác định MIC colistin và các kháng sinh đối chứng theo tiêu chuẩn của CLSI.
• Quy trình chuẩn bị mẫu ADN, cắt enzyme giới hạn và chạy điện di xung trường (PFGE).
• Quy trình giải trình tự WGS, xử lý dữ liệu tin sinh học để dựng cây phân loại core genome, xác định STs và lập bản đồ gen kháng.
• Quy trình thực nghiệm tiếp hợp truyền plasmid trong ống nghiệm với chủng nhận E. coli J53, xác định tần số tiếp hợp và kiểm tra gen mcr-1 trên thể tiếp hợp.
• Phương pháp xử lý số liệu thống kê, các biện pháp khống chế sai số xét nghiệm và đạo đức nghiên cứu.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

Nhóm nội dung kết quả	Các phát hiện và số liệu chính
Tỷ lệ phân lập E. coli mang gen mcr-1	Phân lập thành công các chủng E. coli mang gen mcr-1 từ cả 4 nguồn mẫu thu thập tại xã Thanh Hà: phân người, phân động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước sinh hoạt.
Mức độ nhạy cảm colistin (MIC)	Các chủng mang gen mcr-1 biểu hiện tính kháng colistin rõ rệt với giá trị MIC vượt ngưỡng nhạy cảm theo tiêu chuẩn CLSI (phổ biến từ 4 mg/L đến 8 mg/L trở lên).
Vị trí định vị của gen mcr-1	Gen mcr-1 được phát hiện nằm chủ yếu trên các plasmid tự truyền, một số chủng ghi nhận gen mcr-1 tích hợp trên nhiễm sắc thể (NST).
Đặc điểm đa kháng kháng sinh	Phần lớn các chủng E. coli mang gen mcr-1 là chủng đa kháng (MDR), kháng đồng thời với các kháng sinh nhóm $\beta$-lactam (cephalosporin thế hệ 3, 4 qua gen blaCTX-M, blaTEM), aminoglycosid (rmtB, aac, aph), quinolon (qnr, đột biến gyrA/parC), sulfonamid/trimethoprim (sul1, sul2, dfrA) và chloramphenicol (floR).
Phân tích kiểu gen qua PFGE và MLST (WGS)	- Cây phả hệ PFGE cho thấy sự đa dạng di truyền cao giữa các chủng phân lập được, đồng thời ghi nhận một số cụm chủng có độ tương đồng kiểu gen cao phân lập từ phân người, vật nuôi và thực phẩm trong cùng một hộ gia đình. - Phân tích MLST từ dữ liệu WGS xác định nhiều kiểu chuỗi trình tự (Sequence Types - STs) khác nhau lưu hành trong quần thể.
Đặc điểm Plasmid và Transposon	- Các loại replicon plasmid mang gen mcr-1 chủ yếu thuộc nhóm IncI2, IncHI2/IncHI2A và IncN. - Phân tích cấu trúc di truyền động xác định cấu trúc transposon dạng Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1) đóng vai trò phương tiện chuyển vị gen mcr-1 vào plasmid hoặc NST.
Kết quả thử nghiệm tiếp hợp	Thử nghiệm tiếp hợp giữa các chủng E. coli phân lập được mang gen mcr-1 và chủng nhận E. coli J53 thành công; chủng nhận sau tiếp hợp biểu hiện kiểu hình kháng colistin và mang gen mcr-1 cùng plasmid tương ứng.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả bàn luận sâu về các khía cạnh:

• Mối liên hệ dịch tễ học One Health: Tỷ lệ lưu hành cao của gen mcr-1 trong phân động vật nuôi và môi trường sống tại xã Thanh Hà phản ánh trực tiếp hệ quả của việc sử dụng không kiểm soát colistin trong chăn nuôi nông hộ.
• Nguy cơ lây truyền qua chuỗi thức ăn và nguồn nước: Việc tìm thấy các chủng E. coli mang mcr-1 có cùng kiểu gen hoặc mang cùng loại plasmid trong phân người, phân vật nuôi, thực phẩm và nước sinh hoạt tại cùng hộ gia đình cung cấp bằng chứng về sự lan truyền vi khuẩn kháng thuốc từ động vật sang người qua tiếp xúc trực tiếp, tiêu thụ thực phẩm ô nhiễm và sử dụng nguồn nước bề mặt/nước sinh hoạt chưa qua xử lý.
• Vai trò của plasmid IncI2 và IncHI2: Bàn luận về tính tương thích và khả năng tự sao chép, tiếp hợp hiệu quả cao của các nhóm plasmid này, giải thích tốc độ phát tán nhanh chóng của gen mcr-1 trong các chủng vi khuẩn đường ruột tại cộng đồng.
• Cấu trúc Tn6330 và tính linh động di truyền: Phân tích vai trò của trình tự chèn ISApl1 trong việc huy động và ổn định gen mcr-1 trên các cấu trúc plasmid khác nhau.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

• Cung cấp dẫn liệu khoa học toàn diện đầu tiên tại khu vực nông thôn miền Bắc Việt Nam về sự phân bố của vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin đồng thời trên bốn đối tượng thuộc một hệ sinh thái cộng đồng: người, vật nuôi, thực phẩm và nước.
• Xác định được các nhóm plasmid chủ đạo mang gen mcr-1 tại thực địa gồm IncI2, IncHI2/IncHI2A và IncN, cùng sự hiện diện của cấu trúc di truyền động Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1).
• Chứng minh bằng thực nghiệm khả năng chuyển gen kháng colistin qua tiếp hợp in vitro từ các chủng E. coli thực địa sang chủng nhận chuẩn (E. coli J53), khẳng định nguy cơ lan truyền ngang của tính kháng trong tự nhiên.
• Làm rõ đặc tính đa kháng và sự liên kết đồng thời của gen mcr-1 với nhiều gen kháng kháng sinh quan trọng khác (blaCTX-M, blaTEM, rmtB, floR, qnr...).

Đóng góp thực tiễn và kiến nghị giải pháp

• Bằng chứng cảnh báo dịch tễ: Cảnh báo thực trạng colistin — vũ khí điều trị cuối cùng ở người — đang bị đe dọa nghiêm trọng bởi áp lực chọn lọc phát sinh từ chăn nuôi nông nghiệp tại cộng đồng.
• Khuyến nghị chính sách:
  • Cần cấm triệt để việc sử dụng colistin và các polymyxin trong chăn nuôi với mục đích kích thích tăng trưởng và phòng ngừa bệnh đại trà.
  • Tăng cường kiểm soát dư lượng kháng sinh và vi khuẩn kháng thuốc trong chuỗi cung ứng thực phẩm tươi sống.
  • Xây dựng hệ thống giám sát kháng kháng sinh tích hợp theo mô hình Một sức khỏe (One Health), kết nối giữa ngành Y tế, Thú y và Môi trường.
  • Nâng cao điều kiện vệ sinh nguồn nước sinh hoạt và xử lý chất thải chăn nuôi tại các vùng nông thôn nhằm ngăn chặn chu trình phát tán vi khuẩn kháng thuốc vào môi trường.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi nghiên cứu thực địa tập trung tại một xã (xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam) trong giai đoạn 2014–2015, do đó các số liệu mang tính đại diện điển hình cho mô hình nông thôn đồng bằng Bắc Bộ nhưng chưa bao quát toàn bộ các vùng sinh thái nông nghiệp khác trên cả nước.
• Nghiên cứu tập trung chủ yếu vào loài Escherichia coli, chưa mở rộng phân tích chuyên sâu trên các loài vi khuẩn Gram âm đường ruột khác có khả năng mang gen mcr-1 như Klebsiella pneumoniae hay Salmonella spp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng giám sát dịch tễ học phân tử đa trung tâm ở quy mô quốc gia trên nhiều đối tượng vật nuôi, thủy sản và các nguồn nước tự nhiên.
• Nghiên cứu sâu hơn về động học lây truyền plasmid mang gen mcr-1 trong điều kiện tự nhiên giữa người và động vật tiếp xúc gần.
• Tiếp tục theo dõi sự xuất hiện của các biến thể gen mới trong họ mcr (từ mcr-2 đến mcr-10) và các biến chủng đa kháng kết hợp giữa mcr-1 và carbapenemase (blaNDM, blaKPC, blaOXA).

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên chuyên ngành Vi sinh Y học, Dịch tễ học, Công nghệ sinh học: Tham khảo khung phương pháp luận kết hợp vi sinh cổ điển với sinh học phân tử hiện đại (MALDI-TOF, MIC, PFGE, WGS, tiếp hợp, phân tích tin sinh học plasmid/transposon).
• Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia truyền nhiễm: Nắm bắt cơ sở phân tử và mức độ kháng colistin tại cộng đồng để cân nhắc phác đồ điều trị nhiễm khuẩn Gram âm đa kháng.
• Cán bộ quản lý Thú y và Chăn nuôi: Sử dụng số liệu thực chứng để xây dựng quy chuẩn quản lý danh mục kháng sinh được phép sử dụng trong nông nghiệp.
• Nhà hoạch định chính sách Y tế công cộng: Cung cấp cơ sở khoa học phục vụ triển khai Kế hoạch hành động quốc gia về phòng chống kháng thuốc theo định hướng One Health.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Gen mcr-1 kháng colistin có cơ chế tác động và phương thức lây truyền như thế nào?

Gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase. Enzyme này gắn nhóm phosphoethanolamine vào phân tử lipid A của lipopolysaccharid (LPS) ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, làm giảm điện tích âm của màng và làm mất vị trí gắn gắn kết mang tính quyết định của kháng sinh colistin (phân tử mang điện tích dương). Khác với đột biến nhiễm sắc thể chỉ truyền dọc, gen mcr-1 nằm trên các plasmid tự truyền và transposon nên có thể lây truyền ngang nhanh chóng giữa các vi khuẩn qua cơ chế tiếp hợp.

2. Nghiên cứu của tác giả được tiến hành trên những loại mẫu nào và tại địa bàn nào?

Nghiên cứu được triển khai tại 69 hộ gia đình thuộc xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam trong giai đoạn 2014–2015. Các loại mẫu thu thập bao gồm bốn nhóm: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN - lợn, gà, vịt, chó...), mẫu thực phẩm/thức ăn (TĂ) và mẫu nước sinh hoạt/môi trường (N).

3. Những loại plasmid và yếu tố di truyền di động nào mang gen mcr-1 được xác định trong luận án?

Luận án xác định các plasmid mang gen mcr-1 chủ yếu thuộc các nhóm replicon IncI2, IncHI2/IncHI2A và IncN. Về cấu trúc di truyền động, gen mcr-1 nằm trong cấu trúc transposon Tn6330 được bao quanh bởi các trình tự chèn ISApl1 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1), tạo điều kiện cho gen dễ dàng chuyển vị và tích hợp vào các plasmid hoặc nhiễm sắc thể khác nhau.

4. Các kỹ thuật sinh học phân tử chính được tác giả sử dụng để phân tích chủng vi khuẩn là gì?

Tác giả sử dụng một hệ thống phương pháp phân tử đồng bộ gồm:

• PCR: Sàng lọc phát hiện sự hiện diện của gen mcr-1.
• MALDI-TOF: Định danh chính xác loài vi khuẩn E. coli.
• PFGE (Điện di xung trường): Phân tích phả hệ và so sánh mức độ tương đồng kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn.
• WGS (Giải trình tự toàn bộ hệ gen): Phân tích MLST (Sequence Types), hệ gen lõi (core genome), tìm kiếm toàn bộ hệ gen kháng thuốc và cấu trúc vùng gen lân cận.
• PCR-based Replicon Typing & Thử nghiệm tiếp hợp: Xác định nhóm plasmid và kiểm chứng khả năng truyền ngang gen kháng sang chủng E. coli J53.

5. Tại sao sự hiện diện của E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng lại là mối nguy hại lớn đối với y tế công cộng?

Colistin là kháng sinh thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng để điều trị các ca nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm đa kháng carbapenem (như các chủng sinh NDM-1, KPC, OXA-48). Khi vi khuẩn đường ruột mang gen mcr-1 lan truyền trong cộng đồng qua thực phẩm và nguồn nước, chúng có khả năng truyền plasmid kháng colistin sang các vi khuẩn gây bệnh khác, tạo ra các chủng "siêu vi khuẩn" đề kháng toàn bộ các kháng sinh hiện có, dẫn đến nguy cơ thất bại hoàn toàn trong điều trị lâm sàng.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tuyết Mai đã cung cấp bức tranh toàn diện và có hệ thống về thực trạng lưu hành của vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin trong hệ sinh thái cộng đồng tại nông thôn miền Bắc Việt Nam. Thông qua việc kết hợp các kỹ thuật vi sinh học chuẩn thức và sinh học phân tử chuyên sâu (PFGE, WGS, tiếp hợp plasmid), công trình đã chứng minh tính đa dạng kiểu gen, đặc tính đa kháng kháng sinh, cũng như vai trò trọng yếu của các plasmid IncI2, IncHI2 và transposon Tn6330 trong việc phát tán gen kháng. Kết quả nghiên cứu là bằng chứng khoa học quan trọng phục vụ công tác giám sát dịch tễ học, cảnh báo nguy cơ lây truyền qua chuỗi thức ăn và củng cố các chính sách quản lý kháng sinh theo mô hình Một sức khỏe (One Health).

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 1. Định nghĩa: Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu [6] 1. Cơ chế tác dụng Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng bằng cách: - Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ví dụ nhóm penicillin, nhóm cephalosporin, vancomycin - Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, đặc biệt là chức năng thẩm thấu chọn lọc, làm cho các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài, ví dụ nhóm polymyxin, Daptomycin - Ức chế sinh tổng hợp protein, ví dụn nhóm aminoglycoside, nhóm macrolid - Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic, ví dụ nhóm quinolon - Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào như kháng sinh nhóm sulfamid [6] Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh document, khoa luan17 of 98.

tai lieu, luan van18 of 98. Sự đề kháng kháng sinh Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, nhưng khi trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh. Vi sinh vật đa kháng kháng sinh (MDRO) là các vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn có khả năng kháng một hoặc hơn một loại kháng sinh. Một số vi khuẩn chỉ kháng một loại kháng sinh vẫn được coi là đa kháng kháng sinh như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) hay vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)[31] 1.

Phân loại đề kháng kháng sinh Có 2 loại đề kháng: là đề kháng giả và đề kháng thật - Đề kháng giả: Đề kháng giả là có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản chất, tức là không do nguồn gốc di truyền. Khi vào trong cơ thể, tác dụng của kháng sinh phụ thuộc vào ba yếu tố là kháng sinh - người bệnh - vi khuẩn. Đề kháng giả có thể do một trong ba yếu tố hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba yếu tố[6]. - Đề kháng thật: có 2 loại là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được.

+ Đề kháng tự nhiên do một số loài vi khuẩn không chịu tác dụng của một số kháng sinh nhất định. aeruginosa không chịu tác dụng của penicilin G, S. aureus không chịu tác dụng của colistin. Hoặc vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh beta-lactam ức chế sinh tổng hợp vách.

Đề kháng tự nhiên thường mang tính chất đặc trưng theo từng loại vi khuẩn. - Đề kháng thu được do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gen đề kháng để một vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng, nghĩa là đang nhạy cảm trở thành có khả năng đề kháng kháng sinh. Các gen đề kháng có thể nằm trên một, một số hoặc tất cả các thành phần di truyền của vi khuẩn gồm nhiễm sắc thể, plasmid và transposon. Đề kháng thu được thường mang tính chất của từng cá thể trong loài[6].

document, khoa luan18 of 98. tai lieu, luan van19 of 98. 6 Đề kháng thu được là yếu tố đóng vai trò chính trong việc gia tăng tình hình kháng kháng sinh hiện nay. Các nghiên cứu về kháng kháng sinh của vi khuẩn luôn tập trung phân tích những biến đổi về mặt di truyền của vi khuẩn do đề kháng thu được làm thay đổi tính đề kháng của vi khuẩn như thế nào 1.

Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Sự chọn lọc tự nhiên tạo ra những đáp ứng đặc hiệu dẫn đến các đột biến gen để thích nghi. Gần như toàn bộ các kháng sinh sẵn có hiện nay trong thực hành lâm sàng thu nhận được các đột biến gen từ các chất liệu di truyền hoặc những biến đổi của các gen biểu hiện, tạo ra sự kháng thuốc. Việc hiểu rõ nền tảng cơ bản về sinh học và gen học của sự kháng kháng sinh là vần đề rất quan trọng để làm giảm sự lan rộng của kháng kháng sinh cũng như cải thiện việc điều trị trên lâm sàng. Vi khuẩn thường sử dụng 2 cơ chế chính về mặt gen học để thích ứng và tạo ra sự kháng kháng kháng sinh là: - Đột biến gen thường liên quan tới sự hoạt động của các thuốc kháng sinh; - Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng từ bên ngoài thông qua lây truyền ngang từ các gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGL).

Từ các gen kháng kháng sinh này sẽ tổng hợp ra các protein chức năng, tạo ra các cơ chế kháng khác nhau [69]. Đột biến kháng thuốc Đột biến kháng thuốc xảy ra khi có một tập hợp nhỏ trong quần thể vi khuẩn nhạy cảm với thuốc kháng sinh phát triển các đột biến gen ảnh hưởng tới hoạt động của thuốc kháng sinh. Nhóm vi khuẩn này vẫn tồn tại khi có mặt của thuốc kháng sinh. Khi đột biến xảy ra, kháng sinh đã loại bỏ hết quần thể nhạy cảm và chỉ còn các vi khuẩn kháng kháng sinh chiếm ưu thế.

Các đột biến kháng thuốc thông qua các cơ chế sau: - Làm thay đổi đích tác động Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do đó kháng sinh không còn vị trí để tác động, ví dụ: A. baumannii kháng lại imipenem và P. aeruginosa kháng ticarcillin và imipenem do chúng thay đổi vị trí gắn vào protein của các kháng sinh. Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolon là ức chế hoạt động của đoạn document, khoa luan19 of 98.

tai lieu, luan van20 of 98. 7 gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV của tế bào vi khuẩn. Ví dụ tính kháng quinolon của S. typhi xảy ra do đột biến điểm của các đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [103, 124].

- Thay đổi các con đường chuyển hóa thông qua sự thay đổi mạng lưới điều hòa Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh. Ví dụ với các enzym beta-lactamase có khả năng phá hủy penicillin được báo cáo trước khi được đưa vào sử dụng vào đầu những năm 1940. Sau đó hàng loạt các enzym beta-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện. Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [82].

- Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, giảm sự hấp thu thuốc Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracyclin hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid. Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam vào vi khuẩn được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [82]. - Cơ chế bơm đẩy (efflux pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E. aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào [69].

Như vậy, từ khi tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn đã phát triển các cơ chế kháng thuốc phức tạp để chống lại sự tác động của kháng sinh và tồn tại, quá trình này diễn ra theo sự tiến hóa tự nhiên, trải qua hàng trăm năm. Sự đề kháng với một loại kháng sinh thường xảy ra qua nhiều nhiều con đường khác nhau. Tuy nhiên, mỗi loài vi khuẩn có một cơ chế kháng ưu tiên khác với các loài khác đối với cùng loại kháng sinh như các vi khuẩn gram âm kháng kháng sinh nhóm beta-lactam document, khoa luan20 of 98. tai lieu, luan van21 of 98.

8 thông qua việc sinh enzym beta-lactamase trong khi vi khuẩn gram dương lại kháng qua việc làm biến đổi vùng gắn kháng sinh trên vách, penicillin-binding proteins (PBPs) [69].2: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 1. Lây truyền ngang từ gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGT) Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua con đường lây truyền ngang từ gen chuyển là con đường rất thường gặp trong kháng kháng sinh. Vi khuẩn thường thu nhận các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua 03 cơ chế chính là: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp. Biến nạp là hình thức đơn giản nhất nhưng chỉ có một số ít các vi khuẩn tự nhiên có thể tiếp nhận các DNA ngoại lai và phát triển tính kháng.

Các vụ dịch lây lan các vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện thường liên quan đến cơ chế tiếp hợp- một phương pháp chuyển gen hiệu quả thông qua việc tiếp xúc giữa tế bào cho và tế bào nhận thông qua pili giới tính (như E. coli), thường xảy ra với tỷ lệ cao ở đường tiêu hóa dưới ở người khi được điều trị bằng kháng sinh. Tiếp hợp, theo nguyên tắc chung, thường sử dụng các yếu tố di truyền động (mobile genetic elements- MGEs) là phương tiện để chia sẻ các thông tin di truyền có giá trị trong đó có yếu tố kháng kháng sinh. MGEs quan trọng nhất là plasmid và transposon-có vai trò quan trọng document, khoa luan21 of 98.

tai lieu, luan van22 of 98. 9 trong việc phát triển và lây lan các vi khuẩn kháng kháng sinh trên lâm sàng. Một trong những cơ chế hiệu quả nhất để tích lũy các gen đề kháng kháng sinh thông qua các integron, integron cũng chứa trình tự ADN đặc biệt cho phép integraz chèn các nhóm gen gọi là cassette vào nhiễm sắc thể, mà trên đó có promoter cho phép các gen cassette mới được biểu hiện [97].3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông qua các yếu tố truyền gen (D) (nguồn: Christian von Wintersdorff (2016), Dissemination of Antimicrobial Resistance in Microbial Ecosystems through Horizontal Gene Transfer)[102]. Plasmid: Plasmid là các phân tử ADN vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể và có khả năng tự nhân lên.

Plasmid chứa các gen mã hóa nhiều đặc tính khác nhau giúp tế bào chủ tồn tại được dưới áp lực của chọn lọc. Một số plasmid có vai trò quan trọng trong vi sinh y học là plasmid mang gen đề kháng kháng sinh và kim loại nặng (R-plasmid), plasmid sinh độc tố, plasmid chứa yếu tố độc lực (khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào).