Luận án tiến sĩ nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho rt pcr ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho rt pcr ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Nguyễn Thị Thường
• Người hướng dẫn: GS. Huỳnh Phương Liên
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh Y học
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan một số vấn đề về cúm
• 1.2. Phép gọi tên
• 1.3. Hình thái, cấu trúc
• 1.4. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng
• 1.5. Sự nhân lên của virus cúm
• 1.6. Dịch tễ học
• 1.7. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
• 1.8. Tình hình nghiên cứu về cúm và tỷ lệ nhiễm cúm
• 1.9. Tổng quan một số vấn đề về sởi
• 1.10. Phép gọi tên
• 1.11. Hình thái, cấu trúc
• 1.12. Sự nhân lên của virus
• 1.13. Các triển vọng thanh toán sởi
• 1.14. Các nghiên cứu liên quan đến sởi
• 1.15. Sản xuất chứng dương ARN in vitro và kiểm định công hiệu vắc xin
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc. Sinh phẩm hóa chất
• 2.3. Mồi và đầu dò
• 2.4. Phần mềm phân tích và nguồn thông tin
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 2.7. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 2.8. Xây dựng phương pháp kiểm định vắc xin sởi
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sản xuất chứng dương ARN
• 3.2. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển
• 3.3. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã trực tiếp
• 3.4. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR
• 3.5. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.6. Đặc điểm trường hợp tử vong do cúm
• 3.7. Ứng dụng chứng dương trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.8. Tỷ lệ đồng nhiễm cúm và các virus khác
• 3.9. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.10. Kiểm định công hiệu vắc xin sởi
• 3.11. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng tạo đám hoại tử
• 3.12. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng real-time RT-PCR
• 3.13. Sự ổn định của ARN tách chiết bằng TpLR
• 3.14. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.15. Độ lặp lại của phản ứng
• 3.16. Kết quả sản xuất các gam chuẩn
• 3.17. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp. Kiểm tra chuyển nạp
• 3.18. Tạo mạch thẳng ADN plasmid bằng cắt enzyme giới hạn
• 3.19. Kết quả phiên mã in vitro
• 3.20. Tỷ lệ nhiễm cúm tại Hải Dương năm 2009-2011. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.21. Tỷ lệ tử vong và nhiễm cúm của bệnh nhân SARI
• 3.22. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.23. Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hiệu giá vắc xin sởi đơn bằng real-time RT-PCR
• 3.24. Thử nghiệm tối ưu hóa các điều kiện phản ứng
• 3.25. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.26. Thẩm định phương pháp
• 3.27. Bàn luận về các ưu điểm của đề tài
• 3.28. Chất lượng của sinh phẩm
• 3.29. Trang thiết bị máy móc
• 3.30. Quy trình thực hiện thử nghiệm
• 3.31. Phân tích kết quả và sự phù hợp với mục tiêu nghiên cứu
• 3.32. Chứng của phòng thí nghiệm và chứng quốc tế
• 3.33. Hoạt động độc lập
• 3.34. Bàn luận về những hạn chế của đề tài
• 3.35. Hạn chế trong sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 3.36. Hạn chế trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.37. Hạn chế trong nghiên cứu xác định công hiệu vắc xin sởi
• 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất gam chuẩn RT PCR cho cúm và vắc xin sởi

Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn RT-PCR là một bước quan trọng trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi. RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là phương pháp hiện đại giúp phát hiện virus cúm và virus sởi một cách nhanh chóng và chính xác. Việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR không chỉ giúp nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc kiểm định hiệu quả của vắc xin sởi.

1.1. Ý nghĩa của gam chuẩn trong RT PCR

Gam chuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng ARN virus trong mẫu bệnh phẩm. Nó giúp xác định nồng độ virus và đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm. Việc sử dụng gam chuẩn giúp giảm thiểu sai sót trong quá trình chẩn đoán và kiểm định.

1.2. Lịch sử và phát triển của RT PCR trong chẩn đoán cúm

RT-PCR đã được phát triển từ những năm 1980 và đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán virus. Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện virus cúm và sởi, giúp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi

Chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi gặp nhiều thách thức, bao gồm độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp xét nghiệm. Nhiều phòng thí nghiệm hiện nay vẫn sử dụng các phương pháp truyền thống, dẫn đến kết quả không chính xác. Việc thiếu gam chuẩn chất lượng cao cũng là một vấn đề lớn trong việc kiểm định hiệu quả vắc xin.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng trong chẩn đoán cúm. Nếu độ nhạy thấp, có thể bỏ sót các ca nhiễm. Ngược lại, độ đặc hiệu thấp có thể dẫn đến kết quả dương tính giả, gây hoang mang cho bệnh nhân và bác sĩ.

2.2. Vấn đề trong việc sản xuất gam chuẩn

Việc sản xuất gam chuẩn chất lượng cao gặp nhiều khó khăn. Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng mẫu bệnh phẩm đã được chẩn đoán trước đó, dẫn đến tình trạng không tinh khiết và không định lượng được. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả xét nghiệm.

III. Phương pháp sản xuất gam chuẩn RT PCR cho cúm và sởi

Phương pháp sản xuất gam chuẩn RT-PCR bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc tách chiết ARN đến việc xác định nồng độ virus. Sản xuất ARN in vitro là một trong những giải pháp hiệu quả nhất hiện nay, giúp khắc phục những hạn chế của việc sử dụng mẫu bệnh phẩm.

3.1. Quy trình tách chiết ARN

Quy trình tách chiết ARN cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ tinh khiết và chất lượng của ARN. Việc sử dụng các bộ kit tách chiết chuyên dụng giúp nâng cao hiệu quả và độ chính xác của quá trình này.

3.2. Sản xuất ARN in vitro

Sản xuất ARN in vitro cho phép tạo ra các mẫu chuẩn với nồng độ đã biết, giúp kiểm soát chất lượng trong quá trình xét nghiệm. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả trong việc nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của RT-PCR.

IV. Ứng dụng thực tiễn của gam chuẩn RT PCR trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi

Gam chuẩn RT-PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định hiệu quả vắc xin sởi. Việc sử dụng gam chuẩn giúp nâng cao độ chính xác của kết quả xét nghiệm, từ đó hỗ trợ trong việc kiểm soát dịch bệnh.

4.1. Kết quả nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm cúm

Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm cúm tại một số khu vực có sự gia tăng đáng kể. Việc sử dụng gam chuẩn RT-PCR đã giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các ca nhiễm, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

4.2. Kiểm định công hiệu vắc xin sởi

Kiểm định công hiệu vắc xin sởi bằng RT-PCR đã cho thấy kết quả khả quan. Việc sử dụng gam chuẩn giúp xác định chính xác nồng độ virus trong mẫu, từ đó đánh giá hiệu quả của vắc xin một cách khách quan.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu gam chuẩn RT PCR

Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn RT-PCR cho chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực y học. Tương lai, việc phát triển các phương pháp mới và cải tiến quy trình sản xuất sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm định.

5.1. Triển vọng phát triển công nghệ RT PCR

Công nghệ RT-PCR đang ngày càng phát triển, với nhiều cải tiến về độ nhạy và độ đặc hiệu. Việc áp dụng công nghệ mới sẽ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán và kiểm định vắc xin.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong y học

Nghiên cứu về gam chuẩn RT-PCR không chỉ có ý nghĩa trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu về virus khác. Điều này sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Sởi và cúm là hai bệnh do virus gây ra, được đề cập trong Y văn từ trước Công nguyên, qua thời kỳ Trung cổ, các cuộc chiến tranh và cho đến ngày nay. Những nghiên cứu về mọi khía cạnh của cúm và sởi thực sự lớn, khi vào trang mạng http://www. (xem tháng 2 năm 2014), chỉ mất 0,25 giây là có tới 45.000 kết quả liên quan đến cúm và con số tương ứng cho sởi là 0,32 giây với 9. Tổng quan một số vấn đề về cúm Cúm là một bệnh nhiễm virus đường hô hấp cấp tính, thường để lại dấu ấn dịch qua từng thế kỷ [1].

Hàng năm, thế giới có 3-5 triệu người mắc cúm nặng với 250.000 trường hợp tử vong. Giữa các đại dịch, virus cúm A và B vẫn gây dịch hàng năm [39],[40]. Đôi khi, người ta phát hiện được các trường hợp cúm C ở người [41]. Cúm gia cầm A/H5N1 ở động vật vẫn chưa được kiểm soát trên phạm vi toàn cầu, lây truyền từ động vật sang người và gây tử vong [15],[16],[42],[43].

Phép gọi tên Các virus cúm thuộc trên họ Mononegavirale, họ Orthomyxoviridae, được phân thành các típ (sau năm 2002 đổi thành chi) A, B, và C dựa vào quyết định kháng nguyên nucleoprotein (NP). Họ Orthomyxoviridae còn có các chi Isavirus, Quaranjavirus, và Thogotovirus [1],[2],[38]. Virus cúm A gồm các phân típ dựa vào sự thay đổi hoàn toàn quyết định kháng nguyên haemagglutinin (HA) của thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin Inhibition - HI), virus cúm B chỉ có duy nhất một phân típ [1],[2],[38]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Hình thái, cấu trúc Hạt virus cúm A và cúm B đa hình thái, những phân lập mới thường có dạng hình sợi nhưng lại có dạng hình cầu khi được cấy chuyển trên nuôi cấy tế bào hoặc trứng gà ấp dở. Virus hình cầu có kích thước 80-120nm gồm 70- 75% protein, 20% lipid, và 1% ARN [1],[2],[38]. Cấu trúc hạt virus cúm. Munier - Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44].

Thành phần cấu trúc từ trong ra ngoài của hạt virus gồm bộ máy di truyền (genome), capsid và vỏ ngoài (envelop). Genome virus cúm A và cúm B chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN phân cực âm, có phân đoạn (Hình 1.1) với tên gọi hoặc là theo đoạn ARN, hoặc dựa vào chức năng tạo nên cấu trúc hạt virus. Đoạn 1 đến 8 tương ứng mã hóa các protein PB2, PB1/N40/PB1F2, PA/PA-X, HA, NP, NA, M1/M2/M42, NS1/NEP [1],[2],[38],[44],[45]. Đề tài nghiên cứu này khuếch đại các khu vực ổn định LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 của các đoạn gen 7 mã hóa protein M virus cúm mùa A (H3N2 và H1N1), virus cúm B, và các đoạn gen 7, 6, 4 mã hóa tương ứng protein M, HA và NA của virus cúm gia cầm A/H5N1 và đoạn gen 7 của virus cúm đại dịch A/H1N1pdm09.

Kháng nguyên và tính đa dạng chủng Thích ứng Tổ hợp Tổ hợp trực tiếp lại lại Hình 1. Nguồn gốc các chủng cúm đại dịch 1918-1977. Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. Chuyển đổi kháng nguyên đột ngột (shift) là thay đổi cấu trúc kháng nguyên bề mặt, chủ yếu là HA, do tổ hợp lại vật liệu di truyền của các phân típ khác nhau và thường gây hiện tượng thay thế một loại HA mới, nhìn chung không chịu tác dụng của miễn dịch tồn tại trước đó và đây chính là nguyên nhân của các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ XX và XXI [1],[2],[11- 13],[38],[46].

Đây là điểm đáng lưu ý trong chẩn đoán cúm và xác định phân típ cúm A bằng RT-PCR vì khi một đoạn gen bị thay thế thì có thể phải thiết LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 kế lại cặp mồi và đầu dò (real-time) đặc hiệu, đồng thời phải sản xuất lại chứng dương ARN. Nguồn gốc các đại dịch cúm có thể hoặc là do hiện tượng tổ hợp lại các đoạn gen, hoặc là do thích ứng trực tiếp từ loài khác [1],[13],[38],[46]. Chi tiết, cúm đại dịch A/H1N1 năm 1918 có thể do thích ứng trực tiếp từ A/H1N1 thủy cầm hoặc do tổ hợp từ một nguồn khác không rõ (không có số liệu di truyền trước 1918), sau đó đại dịch cúm năm 1957 là do tổ hợp của 5 đoạn gen chủng A/H1N1 năm 1918 và 3 đoạn gen HA, NA, PB1 của chủng A/H2N2 thủy cầm để tạo thành virus A/H2N2 đại dịch 1957. Đại dịch cúm 1968 là do tổ hợp của 6 đoạn gen chủng 1957 và 2 đoạn gen HA và PB1 của A/H3Nx thủy cầm để hình thành chủng A/H3N2 đại dịch 1968 Hong Kong và chủng này hiện lưu hành như một chủng cúm mùa đến tận ngày nay.

Chủng cúm mùa A/H1N1 hiện tại là do chủng đại dịch 1977 tiếp tục lưu hành (Hình 1. Biến đổi kháng nguyên từ từ (drift) là những thay đổi nhỏ và liên tục các acid amin hoặc đột biến điểm tại các khu vực kháng nguyên protein vỏ HA và NA do lỗi của ARN polymerase hoặc do hiện tượng áp lực chọn lọc miễn dịch của kháng thể. Những chủng này không chuyển đổi hoàn toàn kháng nguyên do vậy vẫn chịu một phần miễn dịch từ những lần nhiễm cúm trước và chủng mới nổi trội hơn chủng cũ [1],[38]. Đây cũng là một điểm quan trọng cần lưu ý trong thiết kế mồi.

Mặc dù không có hiện tượng thay thế một đoạn gen hoàn toàn mới nhưng nhiều đột biến điểm có thể làm thiết kế mồi thông thường không phát hiện được hết các chủng, chính vì vậy nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp thiết kế thoái hóa mồi để tăng độ nhạy phát hiện của cặp mồi và đầu dò. Điều này đặc biệt quan trọng trong chẩn đoán cúm gia cầm A/H5N1 ở người [47]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sự nhân lên của virus cúm Các hệ thống tế bào phân lập virus cúm là tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào thường trực thận chó (Madin-Darby Canine Kidney - MDCK).

Phân lập virus cúm trên nuôi cấy tế bào có thể có hoặc không tạo hủy hoại tế bào (Cytopathic Effects - CPE) [2],[19]. Virus được hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ qua thụ thể tế bào là acid sialic (SA) và xâm nhập vào tế bào qua con đường endocytosis. Acid sialic gắn với galactose qua cầu nối α2,3 hoặc α2,6. Đây chính là yếu tố quyết định độc lực của một số chủng virus và bệnh cảnh lâm sàng vì ở đường hô hấp trên thì α2,6 nhiều hơn hẳn α2,3 và ngược lại với đường hô hấp dưới [1],[44],[45].

Sau hấp phụ, nhờ pH thấp của khoang nội bào mà HA tạo ra hiện tượng tiền thay đổi phù hợp về hình thái để peptide hòa màng tiến gần tới màng của nội bào, chèn peptide hòa màng vào màng của nội bào. Sau đó, hiện tượng bán hòa màng xảy ra, màng của virus và màng của tế bào vật chủ được kéo lại gần nhau rồi hình thành nên một lỗ hòa màng, tiếp đó xuất hiện những thay đổi phù hợp để bộc lộ peptide hòa màng làm cho kênh ion M2 bơm các proton để giải phóng phức hợp ribonucleoprotein (RNP) của virus và màng virus hòa với màng của khoang nội bào. ARN được vận chuyển vào nhân tế bào qua lỗ màng nhân nhờ RNP gắn với α và β karyopherin [1],[44],[45],[48]. Tại nhân tế bào, ARN virus đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp ARN bổ trợ chuỗi dương, sau đó đến lượt ARN chuỗi dương này làm khuôn mẫu để tổng hợp trở lại ARN virus chuỗi âm và ARN thông tin.

Cụ thể, phức hợp RNP gắn với 3 polymerase có vai trò thiết yếu trong quá trình nhân lên của virus cúm. PA có khu vực endonuclease và vị trí gắn với PB1, PB1 có vị trí gắn với PA và vị trí gắn với PB2, PB2 có vị trí gắn với PB1 và vị trí gắn với cấu trúc “đội mũ” của tiền ARN thông tin (Hình 1. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 ARN virus cúm có cấu trúc “đội mũ” m7GpppXm(N10-13) và nó được PB2 sử dụng như đoạn mồi để khởi đầu quá trình phiên mã và sau đó PA của virus sẽ cắt cấu trúc mũ của ARN thông tin. Quá trình tổng hợp chuỗi bổ trợ được xúc tác nhờ enzyme PB1, chính là ARN polymerase phụ thuộc ARN dựa trên khuôn mẫu là ARN virus.

Sau cùng, quá trình tổng hợp chuỗi kết thúc khi xuất hiện tín hiệu poly A từ cấu trúc khuôn mẫu poly U (Hình 1. Cơ chế phiên mã của virus cúm A. Munier, Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. PB2 gắn với cấu trúc mũ b.

PA endonuclease cắt ARN thông tin c. PB1 sử dụng ARN virus làm khuôn mẫu kéo dài chuỗi d. Tổng hợp poly A Quá trình dịch mã xảy ra tại bào tương, các protein M1, 3 polymerase, và NP được vận chuyển vào nhân tế bào. Tại nhân, sau khi phức hợp RNP được hình thành thì các protein NEP/NS2 gắn vào phức hợp này rồi từ nhân ra bào tương qua lỗ màng nhân.

Ở bào tương, chúng theo khung tế bào để đến LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 bộ Golgi rồi đi từ khu vực Cis sang Trans của bộ Golgi để tới màng tế bào và lắp ráp thành hạt virus hoàn chỉnh với HA, NA, M2 - là những protein đã trưởng thành ở lưới nội bào có hạt. Quá trình lắp ráp thiên về giả thiết cơ chế lắp ráp lựa chọn hơn là ngẫu nhiên. Hạt virus được giải phóng khỏi tế bào gây nhiễm theo cơ chế nảy chồi. Hiện tượng cắt mối liên kết giữa SA và galactose nhờ hoạt tính salidase tạo nên chức năng neuramidase.

Điều này cho phép giải phóng hạt virus gây bệnh khỏi tế bào vật chủ nhiễm, làm cho các phần tử virus mới được tổng hợp không ngưng kết với nhau, và cho phép virus đi xuyên qua lớp màng nhày của đường hô hấp. Sau khi hạt virus mới được tổng hợp và giải phóng khỏi tế bào thì có hiện tượng cắt HA0 thành HA1 và HA2 nhờ protease ngoại bào nằm ở đường hô hấp. Đây cũng chính là một trong số các yếu tố quyết định độc lực của cúm ở một số loài (không có độc lực cao nếu tổ chức không có nhiều protease tại chỗ). Dịch tễ học Virus cúm truyền bệnh từ người sang người qua đường không khí, điều này giải thích hình thái xuất hiện bệnh đột ngột và mức độ lan truyền dịch nhanh trong cộng đồng.

Trong cùng vụ dịch, tỷ lệ tấn công trẻ em cao hơn người lớn. Ở giai đoạn trung bình, khoảng 25% dân số bị nhiễm và trong số này, một phần ba phải đi điều trị, tỷ lệ nhập viện cao hơn hẳn ở nhóm tuổi nhỏ và người có tuổi.