Luận án tiến sĩ nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho rt pcr ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho rt pcr ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Nguyễn Thị Thường
• Người hướng dẫn: GS. Huỳnh Phương Liên
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh Y học
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan một số vấn đề về cúm
• 1.2. Phép gọi tên
• 1.3. Hình thái, cấu trúc
• 1.4. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng
• 1.5. Sự nhân lên của virus cúm
• 1.6. Dịch tễ học
• 1.7. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
• 1.8. Tình hình nghiên cứu về cúm và tỷ lệ nhiễm cúm
• 1.9. Tổng quan một số vấn đề về sởi
• 1.10. Phép gọi tên
• 1.11. Hình thái, cấu trúc
• 1.12. Sự nhân lên của virus
• 1.13. Các triển vọng thanh toán sởi
• 1.14. Các nghiên cứu liên quan đến sởi
• 1.15. Sản xuất chứng dương ARN in vitro và kiểm định công hiệu vắc xin
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc. Sinh phẩm hóa chất
• 2.3. Mồi và đầu dò
• 2.4. Phần mềm phân tích và nguồn thông tin
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 2.7. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 2.8. Xây dựng phương pháp kiểm định vắc xin sởi
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sản xuất chứng dương ARN
• 3.2. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển
• 3.3. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã trực tiếp
• 3.4. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR
• 3.5. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.6. Đặc điểm trường hợp tử vong do cúm
• 3.7. Ứng dụng chứng dương trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.8. Tỷ lệ đồng nhiễm cúm và các virus khác
• 3.9. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.10. Kiểm định công hiệu vắc xin sởi
• 3.11. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng tạo đám hoại tử
• 3.12. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng real-time RT-PCR
• 3.13. Sự ổn định của ARN tách chiết bằng TpLR
• 3.14. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.15. Độ lặp lại của phản ứng
• 3.16. Kết quả sản xuất các gam chuẩn
• 3.17. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp. Kiểm tra chuyển nạp
• 3.18. Tạo mạch thẳng ADN plasmid bằng cắt enzyme giới hạn
• 3.19. Kết quả phiên mã in vitro
• 3.20. Tỷ lệ nhiễm cúm tại Hải Dương năm 2009-2011. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.21. Tỷ lệ tử vong và nhiễm cúm của bệnh nhân SARI
• 3.22. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.23. Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hiệu giá vắc xin sởi đơn bằng real-time RT-PCR
• 3.24. Thử nghiệm tối ưu hóa các điều kiện phản ứng
• 3.25. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.26. Thẩm định phương pháp
• 3.27. Bàn luận về các ưu điểm của đề tài
• 3.28. Chất lượng của sinh phẩm
• 3.29. Trang thiết bị máy móc
• 3.30. Quy trình thực hiện thử nghiệm
• 3.31. Phân tích kết quả và sự phù hợp với mục tiêu nghiên cứu
• 3.32. Chứng của phòng thí nghiệm và chứng quốc tế
• 3.33. Hoạt động độc lập
• 3.34. Bàn luận về những hạn chế của đề tài
• 3.35. Hạn chế trong sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 3.36. Hạn chế trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.37. Hạn chế trong nghiên cứu xác định công hiệu vắc xin sởi
• 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất gam chuẩn RT PCR cho cúm và vắc xin sởi

Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn RT-PCR là một bước quan trọng trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi. RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là phương pháp hiện đại giúp phát hiện virus cúm và virus sởi một cách nhanh chóng và chính xác. Việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR không chỉ giúp nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc kiểm định hiệu quả của vắc xin sởi.

1.1. Ý nghĩa của gam chuẩn trong RT PCR

Gam chuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc định lượng ARN virus trong mẫu bệnh phẩm. Nó giúp xác định nồng độ virus và đảm bảo tính chính xác của kết quả xét nghiệm. Việc sử dụng gam chuẩn giúp giảm thiểu sai sót trong quá trình chẩn đoán và kiểm định.

1.2. Lịch sử và phát triển của RT PCR trong chẩn đoán cúm

RT-PCR đã được phát triển từ những năm 1980 và đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán virus. Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện virus cúm và sởi, giúp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi

Chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi gặp nhiều thách thức, bao gồm độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp xét nghiệm. Nhiều phòng thí nghiệm hiện nay vẫn sử dụng các phương pháp truyền thống, dẫn đến kết quả không chính xác. Việc thiếu gam chuẩn chất lượng cao cũng là một vấn đề lớn trong việc kiểm định hiệu quả vắc xin.

2.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng trong chẩn đoán cúm. Nếu độ nhạy thấp, có thể bỏ sót các ca nhiễm. Ngược lại, độ đặc hiệu thấp có thể dẫn đến kết quả dương tính giả, gây hoang mang cho bệnh nhân và bác sĩ.

2.2. Vấn đề trong việc sản xuất gam chuẩn

Việc sản xuất gam chuẩn chất lượng cao gặp nhiều khó khăn. Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng mẫu bệnh phẩm đã được chẩn đoán trước đó, dẫn đến tình trạng không tinh khiết và không định lượng được. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả xét nghiệm.

III. Phương pháp sản xuất gam chuẩn RT PCR cho cúm và sởi

Phương pháp sản xuất gam chuẩn RT-PCR bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc tách chiết ARN đến việc xác định nồng độ virus. Sản xuất ARN in vitro là một trong những giải pháp hiệu quả nhất hiện nay, giúp khắc phục những hạn chế của việc sử dụng mẫu bệnh phẩm.

3.1. Quy trình tách chiết ARN

Quy trình tách chiết ARN cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ tinh khiết và chất lượng của ARN. Việc sử dụng các bộ kit tách chiết chuyên dụng giúp nâng cao hiệu quả và độ chính xác của quá trình này.

3.2. Sản xuất ARN in vitro

Sản xuất ARN in vitro cho phép tạo ra các mẫu chuẩn với nồng độ đã biết, giúp kiểm soát chất lượng trong quá trình xét nghiệm. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả trong việc nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của RT-PCR.

IV. Ứng dụng thực tiễn của gam chuẩn RT PCR trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi

Gam chuẩn RT-PCR đã được ứng dụng rộng rãi trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định hiệu quả vắc xin sởi. Việc sử dụng gam chuẩn giúp nâng cao độ chính xác của kết quả xét nghiệm, từ đó hỗ trợ trong việc kiểm soát dịch bệnh.

4.1. Kết quả nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm cúm

Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm cúm tại một số khu vực có sự gia tăng đáng kể. Việc sử dụng gam chuẩn RT-PCR đã giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác các ca nhiễm, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

4.2. Kiểm định công hiệu vắc xin sởi

Kiểm định công hiệu vắc xin sởi bằng RT-PCR đã cho thấy kết quả khả quan. Việc sử dụng gam chuẩn giúp xác định chính xác nồng độ virus trong mẫu, từ đó đánh giá hiệu quả của vắc xin một cách khách quan.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu gam chuẩn RT PCR

Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn RT-PCR cho chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực y học. Tương lai, việc phát triển các phương pháp mới và cải tiến quy trình sản xuất sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm định.

5.1. Triển vọng phát triển công nghệ RT PCR

Công nghệ RT-PCR đang ngày càng phát triển, với nhiều cải tiến về độ nhạy và độ đặc hiệu. Việc áp dụng công nghệ mới sẽ giúp nâng cao khả năng chẩn đoán và kiểm định vắc xin.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong y học

Nghiên cứu về gam chuẩn RT-PCR không chỉ có ý nghĩa trong việc chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu về virus khác. Điều này sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh cúm và bệnh sởi là hai bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do virus lây qua đường hô hấp, gây gánh nặng y tế lớn trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 30 triệu ca mắc và 1 triệu trường hợp tử vong do sởi trên thế giới, tập trung chủ yếu ở các quốc gia đang phát triển. Đối với bệnh cúm, các vụ dịch hàng năm gây ra 3 đến 5 triệu ca bệnh nặng và khoảng 250.000 đến 500.000 ca tử vong. Lịch sử đã ghi nhận nhiều đại dịch cúm nguy hiểm như đại dịch năm 1918 (khiến hơn 20 triệu người tử vong), các đại dịch năm 1957, 1968, 1977 và đại dịch cúm A/H1N1pdm09 năm 2009. Tại Việt Nam, từ cuối năm 2003, các đợt dịch cúm gia cầm A/H5N1 ở người đã xuất hiện tại 32 tỉnh, thành phố với tỷ lệ tử vong xấp xỉ 50%; đại dịch A/H1N1pdm09 giai đoạn 2009–2010 đã ghi nhận 11.214 ca mắc và 58 ca tử vong.

Trong chẩn đoán xác định căn nguyên virus và giám sát dịch tễ, kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR và real-time RT-PCR) giữ vai trò then chốt nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, việc áp dụng kỹ thuật này đòi hỏi phải có mẫu chứng dương và gam chuẩn ngoại (external standard) đã biết trước nồng độ để kiểm soát chất lượng phản ứng cũng như thực hiện định lượng nồng độ acid nucleic. Trên thực tế, nhiều phòng thí nghiệm sử dụng RNA tách chiết trực tiếp từ bệnh phẩm dương tính cũ. Nguồn mẫu này có nhược điểm lớn: độ tinh khiết không đồng đều, khó định lượng chính xác số lượng bản sao, nguồn cung hạn chế và tiềm ẩn nguy cơ mất an toàn sinh học. Việc sử dụng DNA plasmid làm chứng dương cũng bộc lộ hạn chế vì không thể kiểm soát được hiệu quả của bước phiên mã ngược (RT), trong khi sử dụng virus sống tính theo đơn vị tạo đám hoại tử (PFU) chỉ đo lường được các hạt virus còn hoạt tính gây nhiễm. Do đó, việc sản xuất mẫu chuẩn RNA in vitro tinh sạch là một yêu cầu kỹ thuật cấp thiết.

Bên cạnh đó, việc kiểm định công hiệu vắc xin sởi sống giảm độc lực (chủng AIK-C do Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế - POLYVAC sản xuất) theo các phương pháp cổ điển như tạo đám hoại tử (PFU) hoặc xác định liều gây nhiễm 50% trên nuôi cấy tế bào (TCID50) đòi hỏi thời gian kéo dài (từ vài ngày đến cả tuần), tốn nhiều công sức và có sự dao động phụ thuộc vào người đọc kết quả. Việc phát triển kỹ thuật real-time RT-PCR định lượng RNA nội bào nhằm xác định công hiệu vắc xin là một hướng tiếp cận nhằm rút ngắn thời gian và chuẩn hóa quy trình.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thường (chuyên ngành Vi sinh Y học, mã số: 62720115, Trường Đại học Y Hà Nội, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Huỳnh Phương Liên và GS. Nguyễn Trần Hiển) được thực hiện nhằm giải quyết 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Sản xuất được các gam chuẩn cho RT-PCR phát hiện đồng thời ARN virus cúm A, B (gen M); cúm A/H5N1 (gen M, H5 và N1); và sởi (gen N);
2. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm mùa và phân típ cúm gia cầm A/H5N1 (nếu có) tại Hải Dương năm 2009 bằng RT-PCR;
3. Xác định công hiệu vắc xin sởi đơn sản xuất tại Việt Nam bằng real-time RT-PCR một bước.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án bao gồm:

• Đối tượng sinh học phân tử: Các đoạn gen đích mã hóa protein M của virus cúm mùa A (H3N2, H1N1), cúm B, cúm đại dịch A/H1N1pdm09; các đoạn gen M, H5, N1 của virus cúm gia cầm A/H5N1; đoạn gen N mã hóa nucleoprotein của virus sởi.
• Đối tượng dịch tễ: Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp thu thập từ các bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARI) tại tỉnh Hải Dương giai đoạn 2009–2011 trong khuôn khổ Dự án Giám sát và điều tra tình hình dịch ở Đông Nam Á (SISEA).
• Đối tượng vắc xin: Hơn 700 liều vắc xin sởi đơn sống giảm độc lực thành phẩm sản xuất trong 4 năm (2010–2013) tại POLYVAC và mẫu vắc xin chuẩn M-0107.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực hiện tại Khoa Virus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, POLYVAC và Trường Đại học Y Hà Nội; các số liệu nghiên cứu và thực nghiệm được tiến hành từ năm 2009 đến năm 2013, luận án bảo vệ năm 2014.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về đặc tính sinh học, dịch tễ học, chẩn đoán phân tử virus cúm và virus sởi, cũng như các phương pháp kiểm định vắc xin:

• Về virus cúm: Luận án hệ thống hóa cấu trúc hạt virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae với bộ gen RNA sợi đơn phân cực âm gồm 8 phân đoạn. Quá trình phiên mã của virus cúm phụ thuộc vào phức hợp 3 enzyme polymerase (PB1, PB2, PA) thông qua cơ chế cắt mũ tiền ARN thông tin (cap-snatching). Cơ chế biến đổi kháng nguyên gồm "trôi dạt kháng nguyên" (antigenic drift) do các đột biến điểm tích lũy và "chuyển dịch kháng nguyên" (antigenic shift) do tái tổ hợp các phân đoạn gen giữa các chủng virus khác nhau—nguyên nhân dẫn đến các đại dịch cúm toàn cầu (như các phân tích của Munier, Viện Pasteur Paris; Naffakh N., Van der Werf S.). Thuốc kháng virus nhóm ức chế neuraminidase (oseltamivir, zanamivir) được phân tích cùng cơ chế kháng thuốc đặc hiệu (đột biến His274Tyr kháng oseltamivir và Gln136Lys kháng zanamivir).
• Về dịch tễ học cúm tại Việt Nam: Các nghiên cứu giám sát trọng điểm hội chứng cúm (ILI) và viêm phổi nặng do virus (SVP) của Nguyễn Thu Yến và cộng sự (2006–2012) trên 29.804 ca ILI xác định tỷ lệ dương tính chung là 22%, chỉ ra sự lưu hành xen kẽ của các phân típ A/H1N1, A/H3N2, cúm B và sự xuất hiện của A/H1N1pdm09 từ tháng 9/2009. Nghiên cứu của Thẩm Chí Dũng và cộng sự (2009–2010) tại xã Cẩm Sơn, huyện Cẩm Giàng, tỉnh Hải Dương ghi nhận tỷ lệ dương tính cúm là 69,3% trong 54 mẫu bệnh phẩm, trong đó A/H1N1pdm09 chiếm 53,7%. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đó chưa đánh giá đầy đủ tỷ lệ nhiễm cúm trên nhóm bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARI) tại Hải Dương cũng như mức độ đồng nhiễm giữa virus cúm với 18 tác nhân virus đường hô hấp khác.
• Về virus sởi và vắc xin sởi: Virus sởi thuộc chi Morbillivirus, họ Paramyxoviridae, mang hệ gen RNA sợi đơn âm không phân đoạn dài khoảng 16.000 nucleotide, mã hóa 6 protein cấu trúc (N, P, M, F, H, L) theo một trật tự phiên mã dốc (gradient transcription) từ đầu 3' đến 5', trong đó gen N ở vị trí đầu tiên có mức độ phiên mã cao nhất và ổn định nhất. Lịch sử giảm độc lực chủng Edmonston để phát triển các chủng vắc xin sởi sống (Edmonston B, Schwarz, Moraten, Zagreb, AIK-C) được tác giả phân tích chi tiết. Tại Việt Nam, POLYVAC sản xuất thành công vắc xin sởi chủng AIK-C trên tế bào phôi gà (CEF).
• Về phương pháp kiểm định công hiệu vắc xin bằng kỹ thuật phân tử: Khái niệm yếu tố bảo vệ (Correlate of Protection - CoP) được luận án phân định giữa CoP cơ học (mCoP) và CoP không cơ học/chất thay thế (nCoP). Năm 2004, Stranska và cộng sự sử dụng real-time PCR trên dịch nổi tế bào để đánh giá độ nhạy cảm của Herpes Simplex Virus (HSV) với thuốc kháng virus nhưng vẫn phải đợi hiệu ứng tế bào bệnh lý (CPE). Năm 2006, Nguyễn Thị Thường, Henry Agut và cộng sự đã cải tiến bằng cách định lượng số bản sao DNA nội bào trong vòng 24 giờ sau nhiễm tế bào Vero, cho thấy sự tương quan chặt chẽ với PFU. Đối với vắc xin sởi, Schalk (2005) và Ammour cùng cộng sự đã thử nghiệm định lượng RNA cho vắc xin MMR, nhưng tồn tại nhược điểm: tỷ lệ DNA plasmid gốc còn dư cao (khoảng 7%), thu hoạch mẫu từ dịch nổi tế bào sau ít nhất 48 giờ và có sự ảnh hưởng chéo giữa các thành phần virus trong vắc xin tam liên.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: (1) Xây dựng quy trình hoàn chỉnh sản xuất gam chuẩn RNA in vitro tinh sạch, loại bỏ triệt để DNA khuôn mẫu, phục vụ cho chẩn đoán cúm và sởi; (2) Cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử về cúm và tình trạng đồng nhiễm virus ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương; (3) Thiết lập và thẩm định phương pháp real-time RT-PCR một bước định lượng RNA nội bào tại thời điểm sớm (24 giờ) để kiểm định công hiệu vắc xin sởi đơn sản xuất tại Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử về tái tổ hợp di truyền, phiên mã in vitro bằng RNA polymerase của thực khuẩn thể (T7/SP6), động học phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực (one-step real-time RT-PCR), và lý thuyết kiểm định sinh phẩm vắc xin dựa trên nCoP.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

                             [Mẫu gen đích]
                 (Cúm A, B, H5N1, H1N1pdm09, Sởi N)
                                   |
         +-------------------------+-------------------------+
         |                                                   |
[Phiên mã cổ điển]                                  [Phiên mã trực tiếp]
(Tạo dòng Plasmid, Cắt thẳng,                       (Mồi gắn promoter T7,
 Phiên mã T7/SP6, Xử lý DNase)                       Phiên mã trực tiếp)
         |                                                   |
         +-------------------------+-------------------------+
                                   |
                     [Bộ Gam Chuẩn RNA In Vitro]
                                   |
         +-------------------------+-------------------------+
         |                                                   |
[Ứng dụng chẩn đoán]                                [Ứng dụng kiểm định]
- RT-PCR đa mồi / Real-time                         - Nhiễm tế bào CEF/Vero
- Sàng lọc SARI Hải Dương                           - Tách RNA nội bào (24h)
- Xác định đồng nhiễm                               - Real-time RT-PCR so sánh PFU

1. Kỹ thuật sản xuất chứng dương và gam chuẩn RNA in vitro

Tác giả tiếp cận qua hai phương pháp:

• Phương pháp phiên mã cổ điển: Khuếch đại đoạn gen đích bằng RT-PCR; tạo dòng plasmid tái tổ hợp bằng vector pGEM T-Easy (Promega) hoặc TOPO pCR2.1 chuyển nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α; kiểm tra khuẩn lạc bằng PCR và giải trình tự gen; cắt mở vòng plasmid bằng enzyme giới hạn thích hợp để tạo phân tử DNA mạch thẳng; tiến hành phiên mã in vitro bằng T7 hoặc SP6 RNA polymerase; xử lý triệt để DNA khuôn mẫu bằng RNase-free DNase; tinh sạch RNA và đo nồng độ bằng quang phổ mật độ quang (OD) tại bước sóng 260/280 nm, tính toán số bản sao RNA/μl.
• Phương pháp phiên mã trực tiếp: Thiết kế cặp mồi cải biên có gắn trực tiếp trình tự promoter của T7 RNA polymerase ở đầu 5'; thực hiện PCR tạo sản phẩm mang promoter và phiên mã trực tiếp thành RNA in vitro không qua bước tạo dòng plasmid.

Gen đích	Virus	Chiều dài đoạn gen (bp)	Vai trò trong nghiên cứu
Gen M (đoạn 7)	Cúm mùa A, Cúm B, Cúm A/H1N1pdm09	~100–250 bp	Gam chuẩn phát hiện cúm A/B chung
Gen H5, N1, M	Cúm gia cầm A/H5N1	Đặc hiệu từng đoạn	Gam chuẩn xác định phân típ cúm độc lực cao
Gen N	Virus sởi (AIK-C)	~200–300 bp	Gam chuẩn kiểm định công hiệu vắc xin sởi

2. Kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán và điều tra dịch tễ cúm

• Sử dụng phản ứng RT-PCR đa mồi (multiplex RT-PCR) và RT-PCR bán tổ (semi-nested PCR) kết hợp chứng dương RNA in vitro đã sản xuất để phát hiện đồng thời cúm mùa A, cúm B, virus hợp bào hô hấp (hRSV) và virus gây viêm phổi ở người (hMPV).
• Phân típ cúm A/H1N1pdm09 và A/H5N1 bằng real-time RT-PCR đặc hiệu theo quy trình chuẩn của WHO và CDC Hoa Kỳ.
• Sàng lọc 18 tác nhân virus đường hô hấp theo quy trình chuẩn của Dự án SISEA.

3. Phương pháp xây dựng và thẩm định quy định kiểm định vắc xin sởi

• Nuôi cấy tế bào cảm thụ và gây nhiễm virus vắc xin sởi (chủng AIK-C).
• Tách chiết RNA nội bào sau các khoảng thời gian 24, 48, và 72 giờ bằng phương pháp TpLR so sánh với các kit thương mại.
• Thiết lập phản ứng real-time RT-PCR một bước khuếch đại gen N; xây dựng đường chuẩn tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) và số lượng bản sao RNA hoặc nồng độ log10 PFU.
• Thẩm định phương pháp theo khuyến cáo của WHO và ISO: đánh giá độ đặc hiệu, độ nhạy phát hiện, độ lặp lại trong một lần thử nghiệm (intra-assay repeatability), độ lặp lại trung gian giữa các ngày thử nghiệm (intermediate precision), hệ số biến thiên (CV%), và vẽ biểu đồ kiểm soát chất lượng Levey-Jennings.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 cung cấp cơ sở lý luận chi tiết về hai tác nhân virus nghiên cứu:

• Phân tích chi tiết về phân loại học, cấu trúc phân tử, chu kỳ nhân lên, cơ chế sao chép và các biến đổi kháng nguyên (drift và shift) của virus cúm A, B. Mô tả các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm từ kinh điển (phân lập virus trên tế bào MDCK, trứng gà ấp; thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu HI) đến hiện đại (IFA, ELISA, RT-PCR, giải trình tự gen).
• Tổng hợp tình hình dịch tễ học cúm toàn cầu và tại Việt Nam, đặc biệt là các giai đoạn bùng phát dịch cúm A/H5N1 và đại dịch cúm A/H1N1pdm09 năm 2009.
• Trình bày đặc điểm sinh học phân tử của virus sởi, gradient phiên mã của các gen cấu trúc (N, P/C/V, M, F, H, L), thụ thể xâm nhập CD46 và CDw150 (SLAM). Lịch sử phát triển các chủng vắc xin sởi sống giảm độc lực và quá trình sản xuất vắc xin sởi AIK-C tại Việt Nam.
• Cơ sở lý thuyết về mẫu chuẩn RNA in vitro và việc ứng dụng kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (NAT/real-time RT-PCR) trong kiểm định công hiệu sinh phẩm, phân tích các khái niệm về yếu tố bảo vệ thay thế (nCoP).

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết các nguyên vật liệu, hóa chất, sinh phẩm, chủng virus, mẫu bệnh phẩm và quy trình kỹ thuật:

• Thiết kế các cặp mồi và đầu dò huỳnh quang đặc hiệu cho từng đoạn gen đích (cúm A, B, H5, N1, sởi N).
• Chi tiết quy trình tạo dòng plasmid tái tổ hợp bằng pGEM T-Easy và TOPO pCR2.1, quy trình biến nạp tế bào khả biến, quy trình cắt enzyme giới hạn tạo mạch thẳng để tránh hiện tượng phiên mã vòng lặp.
• Quy trình phản ứng phiên mã in vitro sử dụng T7/SP6 RNA polymerase, kỹ thuật xử lý loại bỏ hoàn toàn DNA nền bằng DNase và đo độ tinh sạch của sản phẩm RNA.
• Phương pháp thu thập, bảo quản mẫu bệnh phẩm bệnh nhân SARI tại Hải Dương; quy trình RT-PCR đa mồi và real-time RT-PCR phát hiện cúm và các virus đường hô hấp.
• Quy trình thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên đĩa nuôi cấy tế bào và quy trình real-time RT-PCR một bước định lượng RNA nội bào vắc xin sởi ở các mốc thời gian (24h, 48h, 72h) trên các định dạng đĩa 24 giếng và 96 giếng.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 3 nhóm nội dung chính:

1. Kết quả sản xuất các gam chuẩn RNA in vitro

• Tác giả đã tạo dòng thành công các đoạn gen đích vào plasmid, kiểm tra chuyển nạp bằng PCR và giải trình tự gen khẳng định độ tương đồng 100% với trình tự công bố trên GenBank.
• Cắt mạch thẳng DNA plasmid đạt hiệu suất cao; phản ứng phiên mã in vitro tạo ra sản phẩm RNA đơn chuỗi đặc hiệu. Sau khi xử lý bằng DNase, phản ứng PCR trực tiếp không còn tín hiệu khuếch đại DNA, chứng minh DNA khuôn mẫu đã được loại bỏ hoàn toàn.
• Xác định nồng độ RNA tinh sạch, nồng độ bản sao đạt mức $10^{9} - 10^{10}$ copies/μl, thiết lập thành công dải gam chuẩn ngoài pha loãng bậc 10 (từ $10^{1}$ đến $10^{8}$ copies/phản ứng) cho các phản ứng RT-PCR phát hiện cúm A, cúm B, cúm A/H5N1 (M, H5, N1) và sởi (N).

2. Kết quả ứng dụng trong chẩn đoán và xác định tỷ lệ nhiễm cúm tại Hải Dương (2009–2011)

• Ứng dụng gam chuẩn và quy trình RT-PCR trên nhóm bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARI) tại Hải Dương giai đoạn 2009–2011:

Chỉ số nghiên cứu	Số liệu ghi nhận trong nghiên cứu
Tỷ lệ dương tính với virus cúm	Xác định rõ tỷ lệ nhiễm cúm A/H1N1pdm09, cúm mùa A và cúm B ở bệnh nhân SARI
Phân bố phân típ cúm	Cúm đại dịch A/H1N1pdm09 chiếm ưu thế trong giai đoạn cuối năm 2009, cúm mùa A/H3N2 và cúm B xuất hiện xen kẽ
Tỷ lệ đồng nhiễm virus	Ghi nhận các ca đồng nhiễm giữa virus cúm với các tác nhân đường hô hấp khác (hRSV, hMPV, Adenovirus,...) trong số 18 tác nhân của dự án SISEA
Đặc điểm dịch tễ học	Phân tích chi tiết phân bố theo nhóm tuổi (tỷ lệ mắc cao ở trẻ em và người trẻ tuổi), theo giới tính và theo các tháng trong năm

3. Kết quả xác định công hiệu vắc xin sởi bằng real-time RT-PCR một bước

• Thử nghiệm tối ưu hóa điều kiện phản ứng cho thấy thời điểm gặt RNA nội bào thích hợp nhất là 24 giờ sau khi gây nhiễm tế bào, khi đó lượng RNA virus phản ánh chính xác sự nhân lên ban đầu mà không bị ảnh hưởng bởi sự giải phóng ồ ạt hoặc thoái hóa tế bào muộn.
• Đường chuẩn tuyến tính của phản ứng real-time RT-PCR có hệ số tương quan tuyến tính cao ($R^2 > 0,99$).
• So sánh hiệu giá xác định bằng phương pháp real-time RT-PCR định lượng RNA nội bào với phương pháp tạo đám hoại tử (PFU) trên mẫu vắc xin chuẩn M-0107 và hơn 700 liều vắc xin sởi thành phẩm của POLYVAC (thuộc 10 loạt sản xuất từ 2010–2013) cho thấy sự tương quan chặt chẽ.
• Thẩm định phương pháp cho thấy độ lặp lại trong cùng một lần thử nghiệm (intra-assay) và độ lặp lại trung gian (inter-assay) có hệ số biến thiên $CV < 5%$, biểu đồ Levey-Jennings nằm trong giới hạn kiểm soát chuẩn.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả thảo luận về:

• Ưu điểm của quy trình sản xuất gam chuẩn RNA in vitro: Tính an toàn sinh học vượt trội so với mẫu bệnh phẩm sống; khả năng định lượng chính xác số bản sao; kiểm soát được toàn bộ quy trình RT-PCR bao gồm cả bước phiên mã ngược; quy trình phiên mã trực tiếp bằng mồi gắn promoter T7 giúp tiết kiệm thời gian tạo dòng plasmid.
• Dữ liệu dịch tễ học cúm: So sánh diễn biến dịch cúm SARI tại Hải Dương với các nghiên cứu giám sát ILI và SVP trên toàn quốc của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và các nước trong khu vực (Trung Quốc, Campuchia, Lào, Thái Lan).
• Tính khả thi của phương pháp kiểm định vắc xin sởi bằng real-time RT-PCR: Rút ngắn thời gian kiểm định từ 7 ngày (phương pháp PFU) xuống còn 24–28 giờ; giảm bớt sự phụ thuộc vào đánh giá chủ quan của kỹ thuật viên; nâng cao độ lặp lại và khả năng tự động hóa trong kiểm định chất lượng xuất xưởng vắc xin.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Thiết lập hoàn chỉnh công nghệ sản xuất gam chuẩn RNA in vitro: Luận án đã xây dựng quy trình công nghệ tạo các gam chuẩn RNA in vitro đơn chuỗi tinh khiết cho các gen đích quan trọng của virus cúm A, B, cúm gia cầm A/H5N1 và virus sởi, xử lý triệt để nền DNA khuôn mẫu, cho phép kiểm soát chất lượng và định lượng chính xác trong các xét nghiệm RT-PCR.
2. Đề xuất và chứng minh mô hình nCoP trong kiểm định vắc xin sởi: Chứng minh việc định lượng RNA nội bào bằng real-time RT-PCR một bước tại thời điểm sớm (24 giờ sau nhiễm) có sự tương quan chặt chẽ với hiệu giá PFU truyền thống, cung cấp cơ sở khoa học cho việc áp dụng chỉ số thay thế (nCoP) trong kiểm định công hiệu vắc xin virus sống giảm độc lực.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Ứng dụng trong chẩn đoán và giám sát dịch tễ: Cung cấp bộ sinh phẩm chứng dương RNA an toàn, ổn định cho mạng lưới phòng thí nghiệm chẩn đoán cúm và sởi; bổ sung dữ liệu dịch tễ học phân tử về cúm và tình trạng đồng nhiễm virus ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương trong vụ đại dịch 2009–2011.
2. Đổi mới quy trình kiểm định vắc xin sởi tại Việt Nam: Xây dựng phương pháp xác định công hiệu vắc xin sởi đơn chủng AIK-C bằng real-time RT-PCR một bước có độ lặp lại cao, rút ngắn thời gian thử nghiệm xuống còn 24 giờ, hỗ trợ đắc lực cho quy trình kiểm soát chất lượng tại cơ sở sản xuất (POLYVAC) và cơ quan kiểm định quốc gia.

Kiến nghị và đề xuất

• Đề xuất áp dụng rộng rãi quy trình sản xuất bộ gam chuẩn RNA in vitro làm chứng dương chuẩn thức cho các phòng xét nghiệm vi sinh phân tử trên toàn quốc.
• Kiến nghị tiếp tục triển khai phương pháp real-time RT-PCR định lượng RNA nội bào như một phương pháp kiểm tra nhanh song hành cùng phương pháp PFU/TCID50 trong kiểm định xuất xưởng vắc xin sởi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên các nội dung bàn luận của tác giả trong văn bản luận án:

• Hạn chế trong sản xuất chứng dương RNA in vitro: Phân tử RNA có bản chất kém bền vững hơn DNA, dễ bị phân hủy bởi enzyme RNase ngoại nhiễm trong môi trường; do đó đòi hỏi điều kiện bảo quản nhiệt độ âm sâu ($-80^\circ\text{C}$) và các thao tác kỹ thuật nghiêm ngặt.
• Hạn chế trong nghiên cứu dịch tễ học cúm: Dữ liệu giám sát SARI chỉ thu thập tập trung tại địa bàn tỉnh Hải Dương trong giai đoạn 2009–2011, chưa bao phủ toàn diện các vùng sinh thái dịch tễ khác trên cả nước.
• Hạn chế trong kiểm định vắc xin sởi: Nghiên cứu mới chỉ tập trung thẩm định trên vắc xin sởi đơn liều chủng AIK-C sản xuất tại POLYVAC; chưa mở rộng đánh giá trên các loại vắc xin phối hợp (vắc xin sởi - rubella MR, hoặc sởi - quai bị - rubella MMR) do hiện tượng tương tác giữa các chủng virus sống khác nhau trong cùng một sinh phẩm.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo: Hoàn thiện các nghiên cứu đánh giá độ ổn định dài hạn của gam chuẩn RNA đông khô; triển khai nghiên cứu thẩm định liên phòng thí nghiệm (inter-laboratory validation) cho phương pháp real-time RT-PCR kiểm định vắc xin; nghiên cứu phát triển các cặp mồi và đầu dò đặc hiệu để áp dụng phương pháp định lượng RNA nội bào trên vắc xin phối hợp sởi - rubella (MR).

---

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo thực tiễn và học thuật cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Vi sinh vật học, Vi sinh Y học và Công nghệ sinh học: Tham khảo chi tiết các quy trình tạo dòng phân tử, kỹ thuật phiên mã in vitro tạo RNA chuẩn, thiết kế mồi/đầu dò và phương pháp thẩm định quy trình sinh học phân tử theo tiêu chuẩn quốc tế.
• Cán bộ xét nghiệm và kiểm soát dịch bệnh (hệ thống Y tế dự phòng, Viện Vệ sinh Dịch tễ, Trung tâm Kiểm soát bệnh tật - CDC): Ứng dụng quy trình RT-PCR đa mồi và bộ chứng dương RNA in vitro an toàn trong chẩn đoán xác định cúm mùa, cúm đại dịch A/H1N1pdm09, cúm gia cầm A/H5N1 và virus sởi.
• Các nhà nghiên cứu và kiểm định vắc xin (các viện kiểm định quốc gia, trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin như POLYVAC): Tham khảo phương pháp định lượng RNA nội bào thời điểm 24 giờ bằng real-time RT-PCR một bước nhằm hiện đại hóa và rút ngắn thời gian kiểm định công hiệu vắc xin sởi sống.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao việc sản xuất gam chuẩn RNA in vitro lại vượt trội hơn so với việc dùng RNA tách chiết từ bệnh phẩm hoặc dùng DNA plasmid?

RNA tách chiết từ bệnh phẩm cũ thường không tinh khiết, nồng độ không đồng nhất, số lượng bản sao không xác định được chính xác, nguồn mẫu hạn chế và có nguy cơ lây nhiễm mầm bệnh cho nhân viên xét nghiệm. Trong khi đó, DNA plasmid dù bền vững nhưng không thể kiểm soát được hoạt tính của enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase - RT) trong phản ứng RT-PCR. Gam chuẩn RNA in vitro giải quyết được toàn bộ các nhược điểm này: tinh khiết, định lượng chính xác số bản sao, an toàn sinh học và kiểm soát được toàn diện cả hai bước phiên mã ngược và khuếch đại PCR.

2. Luận án đã lựa chọn những đoạn gen đích nào để sản xuất gam chuẩn cho virus cúm và virus sởi?

• Virus cúm: Tác giả chọn vùng bảo tồn trên đoạn gen 7 (mã hóa protein nền M) của virus cúm mùa A (H3N2, H1N1), virus cúm B và virus cúm đại dịch A/H1N1pdm09; cùng các đoạn gen mã hóa protein M (gen 7), HA (gen 4) và NA (gen 6) của virus cúm gia cầm A/H5N1.
• Virus sởi: Tác giả chọn đoạn gen N (mã hóa nucleoprotein). Đây là gen nằm ở đầu 3' của hệ gen virus sởi, có gradient phiên mã cao nhất và trình tự ổn định cao.

3. Phương pháp định lượng RNA nội bào bằng real-time RT-PCR để kiểm định vắc xin sởi có ưu điểm gì so với phương pháp PFU truyền thống?

Phương pháp PFU truyền thống dựa trên sự tạo đám hoại tử trên nuôi cấy tế bào, đòi hỏi thời gian nuôi cấy kéo dài khoảng 7 ngày, quy trình phức tạp và việc đếm vết hoại tử phụ thuộc nhiều vào yếu tố chủ quan của người đọc. Phương pháp real-time RT-PCR định lượng RNA nội bào cho phép thu hoạch mẫu sớm tại thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm tế bào, quy trình thực hiện nhanh chóng trong vòng 24–28 giờ, kết quả có tính khách quan cao, độ lặp lại tốt ($CV < 5%$) và có mức độ tương quan tuyến tính chặt chẽ với hiệu giá PFU.

4. Luận án sử dụng nguồn vắc xin sởi nào để tiến hành thử nghiệm và kết quả kiểm định đạt được ra sao?

Luận án sử dụng hơn 700 liều vắc xin sởi đơn sống giảm độc lực (chủng AIK-C) sản xuất trên tế bào phôi gà (CEF) tại Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC) trong giai đoạn 2010–2013 (gồm 10 loạt sản xuất thành phẩm) cùng mẫu vắc xin chuẩn M-0107. Kết quả cho thấy hiệu giá RNA đo bằng real-time RT-PCR có sự tương thích cao với hiệu giá PFU của nhà sản xuất, đạt độ ổn định và lặp lại tốt qua các đợt kiểm tra độc lập.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thường đã hoàn thành xuất sắc 3 mục tiêu nghiên cứu đề ra: xây dựng thành công quy trình sản xuất các bộ gam chuẩn RNA in vitro tinh sạch phục vụ chẩn đoán định lượng cúm và sởi; cung cấp bức tranh dịch tễ học phân tử về tỷ lệ nhiễm cúm và đồng nhiễm virus ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương giai đoạn 2009–2011; thiết lập và thẩm định thành công phương pháp one-step real-time RT-PCR định lượng RNA nội bào tại thời điểm 24 giờ để kiểm định công hiệu vắc xin sởi đơn sản xuất tại Việt Nam. Công trình có giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao trong công tác giám sát bệnh truyền nhiễm đường hô hấp và kiểm định chất lượng sinh phẩm vắc xin tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Sởi và cúm là hai bệnh do virus gây ra, được đề cập trong Y văn từ trước Công nguyên, qua thời kỳ Trung cổ, các cuộc chiến tranh và cho đến ngày nay. Những nghiên cứu về mọi khía cạnh của cúm và sởi thực sự lớn, khi vào trang mạng http://www. (xem tháng 2 năm 2014), chỉ mất 0,25 giây là có tới 45.000 kết quả liên quan đến cúm và con số tương ứng cho sởi là 0,32 giây với 9. Tổng quan một số vấn đề về cúm Cúm là một bệnh nhiễm virus đường hô hấp cấp tính, thường để lại dấu ấn dịch qua từng thế kỷ [1].

Hàng năm, thế giới có 3-5 triệu người mắc cúm nặng với 250.000 trường hợp tử vong. Giữa các đại dịch, virus cúm A và B vẫn gây dịch hàng năm [39],[40]. Đôi khi, người ta phát hiện được các trường hợp cúm C ở người [41]. Cúm gia cầm A/H5N1 ở động vật vẫn chưa được kiểm soát trên phạm vi toàn cầu, lây truyền từ động vật sang người và gây tử vong [15],[16],[42],[43].

Phép gọi tên Các virus cúm thuộc trên họ Mononegavirale, họ Orthomyxoviridae, được phân thành các típ (sau năm 2002 đổi thành chi) A, B, và C dựa vào quyết định kháng nguyên nucleoprotein (NP). Họ Orthomyxoviridae còn có các chi Isavirus, Quaranjavirus, và Thogotovirus [1],[2],[38]. Virus cúm A gồm các phân típ dựa vào sự thay đổi hoàn toàn quyết định kháng nguyên haemagglutinin (HA) của thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin Inhibition - HI), virus cúm B chỉ có duy nhất một phân típ [1],[2],[38]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Hình thái, cấu trúc Hạt virus cúm A và cúm B đa hình thái, những phân lập mới thường có dạng hình sợi nhưng lại có dạng hình cầu khi được cấy chuyển trên nuôi cấy tế bào hoặc trứng gà ấp dở. Virus hình cầu có kích thước 80-120nm gồm 70- 75% protein, 20% lipid, và 1% ARN [1],[2],[38]. Cấu trúc hạt virus cúm. Munier - Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44].

Thành phần cấu trúc từ trong ra ngoài của hạt virus gồm bộ máy di truyền (genome), capsid và vỏ ngoài (envelop). Genome virus cúm A và cúm B chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN phân cực âm, có phân đoạn (Hình 1.1) với tên gọi hoặc là theo đoạn ARN, hoặc dựa vào chức năng tạo nên cấu trúc hạt virus. Đoạn 1 đến 8 tương ứng mã hóa các protein PB2, PB1/N40/PB1F2, PA/PA-X, HA, NP, NA, M1/M2/M42, NS1/NEP [1],[2],[38],[44],[45]. Đề tài nghiên cứu này khuếch đại các khu vực ổn định LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 của các đoạn gen 7 mã hóa protein M virus cúm mùa A (H3N2 và H1N1), virus cúm B, và các đoạn gen 7, 6, 4 mã hóa tương ứng protein M, HA và NA của virus cúm gia cầm A/H5N1 và đoạn gen 7 của virus cúm đại dịch A/H1N1pdm09.

Kháng nguyên và tính đa dạng chủng Thích ứng Tổ hợp Tổ hợp trực tiếp lại lại Hình 1. Nguồn gốc các chủng cúm đại dịch 1918-1977. Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. Chuyển đổi kháng nguyên đột ngột (shift) là thay đổi cấu trúc kháng nguyên bề mặt, chủ yếu là HA, do tổ hợp lại vật liệu di truyền của các phân típ khác nhau và thường gây hiện tượng thay thế một loại HA mới, nhìn chung không chịu tác dụng của miễn dịch tồn tại trước đó và đây chính là nguyên nhân của các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ XX và XXI [1],[2],[11- 13],[38],[46].

Đây là điểm đáng lưu ý trong chẩn đoán cúm và xác định phân típ cúm A bằng RT-PCR vì khi một đoạn gen bị thay thế thì có thể phải thiết LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 kế lại cặp mồi và đầu dò (real-time) đặc hiệu, đồng thời phải sản xuất lại chứng dương ARN. Nguồn gốc các đại dịch cúm có thể hoặc là do hiện tượng tổ hợp lại các đoạn gen, hoặc là do thích ứng trực tiếp từ loài khác [1],[13],[38],[46]. Chi tiết, cúm đại dịch A/H1N1 năm 1918 có thể do thích ứng trực tiếp từ A/H1N1 thủy cầm hoặc do tổ hợp từ một nguồn khác không rõ (không có số liệu di truyền trước 1918), sau đó đại dịch cúm năm 1957 là do tổ hợp của 5 đoạn gen chủng A/H1N1 năm 1918 và 3 đoạn gen HA, NA, PB1 của chủng A/H2N2 thủy cầm để tạo thành virus A/H2N2 đại dịch 1957. Đại dịch cúm 1968 là do tổ hợp của 6 đoạn gen chủng 1957 và 2 đoạn gen HA và PB1 của A/H3Nx thủy cầm để hình thành chủng A/H3N2 đại dịch 1968 Hong Kong và chủng này hiện lưu hành như một chủng cúm mùa đến tận ngày nay.

Chủng cúm mùa A/H1N1 hiện tại là do chủng đại dịch 1977 tiếp tục lưu hành (Hình 1. Biến đổi kháng nguyên từ từ (drift) là những thay đổi nhỏ và liên tục các acid amin hoặc đột biến điểm tại các khu vực kháng nguyên protein vỏ HA và NA do lỗi của ARN polymerase hoặc do hiện tượng áp lực chọn lọc miễn dịch của kháng thể. Những chủng này không chuyển đổi hoàn toàn kháng nguyên do vậy vẫn chịu một phần miễn dịch từ những lần nhiễm cúm trước và chủng mới nổi trội hơn chủng cũ [1],[38]. Đây cũng là một điểm quan trọng cần lưu ý trong thiết kế mồi.

Mặc dù không có hiện tượng thay thế một đoạn gen hoàn toàn mới nhưng nhiều đột biến điểm có thể làm thiết kế mồi thông thường không phát hiện được hết các chủng, chính vì vậy nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp thiết kế thoái hóa mồi để tăng độ nhạy phát hiện của cặp mồi và đầu dò. Điều này đặc biệt quan trọng trong chẩn đoán cúm gia cầm A/H5N1 ở người [47]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Sự nhân lên của virus cúm Các hệ thống tế bào phân lập virus cúm là tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào thường trực thận chó (Madin-Darby Canine Kidney - MDCK).

Phân lập virus cúm trên nuôi cấy tế bào có thể có hoặc không tạo hủy hoại tế bào (Cytopathic Effects - CPE) [2],[19]. Virus được hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ qua thụ thể tế bào là acid sialic (SA) và xâm nhập vào tế bào qua con đường endocytosis. Acid sialic gắn với galactose qua cầu nối α2,3 hoặc α2,6. Đây chính là yếu tố quyết định độc lực của một số chủng virus và bệnh cảnh lâm sàng vì ở đường hô hấp trên thì α2,6 nhiều hơn hẳn α2,3 và ngược lại với đường hô hấp dưới [1],[44],[45].

Sau hấp phụ, nhờ pH thấp của khoang nội bào mà HA tạo ra hiện tượng tiền thay đổi phù hợp về hình thái để peptide hòa màng tiến gần tới màng của nội bào, chèn peptide hòa màng vào màng của nội bào. Sau đó, hiện tượng bán hòa màng xảy ra, màng của virus và màng của tế bào vật chủ được kéo lại gần nhau rồi hình thành nên một lỗ hòa màng, tiếp đó xuất hiện những thay đổi phù hợp để bộc lộ peptide hòa màng làm cho kênh ion M2 bơm các proton để giải phóng phức hợp ribonucleoprotein (RNP) của virus và màng virus hòa với màng của khoang nội bào. ARN được vận chuyển vào nhân tế bào qua lỗ màng nhân nhờ RNP gắn với α và β karyopherin [1],[44],[45],[48]. Tại nhân tế bào, ARN virus đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp ARN bổ trợ chuỗi dương, sau đó đến lượt ARN chuỗi dương này làm khuôn mẫu để tổng hợp trở lại ARN virus chuỗi âm và ARN thông tin.

Cụ thể, phức hợp RNP gắn với 3 polymerase có vai trò thiết yếu trong quá trình nhân lên của virus cúm. PA có khu vực endonuclease và vị trí gắn với PB1, PB1 có vị trí gắn với PA và vị trí gắn với PB2, PB2 có vị trí gắn với PB1 và vị trí gắn với cấu trúc “đội mũ” của tiền ARN thông tin (Hình 1. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 ARN virus cúm có cấu trúc “đội mũ” m7GpppXm(N10-13) và nó được PB2 sử dụng như đoạn mồi để khởi đầu quá trình phiên mã và sau đó PA của virus sẽ cắt cấu trúc mũ của ARN thông tin. Quá trình tổng hợp chuỗi bổ trợ được xúc tác nhờ enzyme PB1, chính là ARN polymerase phụ thuộc ARN dựa trên khuôn mẫu là ARN virus.

Sau cùng, quá trình tổng hợp chuỗi kết thúc khi xuất hiện tín hiệu poly A từ cấu trúc khuôn mẫu poly U (Hình 1. Cơ chế phiên mã của virus cúm A. Munier, Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. PB2 gắn với cấu trúc mũ b.

PA endonuclease cắt ARN thông tin c. PB1 sử dụng ARN virus làm khuôn mẫu kéo dài chuỗi d. Tổng hợp poly A Quá trình dịch mã xảy ra tại bào tương, các protein M1, 3 polymerase, và NP được vận chuyển vào nhân tế bào. Tại nhân, sau khi phức hợp RNP được hình thành thì các protein NEP/NS2 gắn vào phức hợp này rồi từ nhân ra bào tương qua lỗ màng nhân.

Ở bào tương, chúng theo khung tế bào để đến LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 bộ Golgi rồi đi từ khu vực Cis sang Trans của bộ Golgi để tới màng tế bào và lắp ráp thành hạt virus hoàn chỉnh với HA, NA, M2 - là những protein đã trưởng thành ở lưới nội bào có hạt. Quá trình lắp ráp thiên về giả thiết cơ chế lắp ráp lựa chọn hơn là ngẫu nhiên. Hạt virus được giải phóng khỏi tế bào gây nhiễm theo cơ chế nảy chồi. Hiện tượng cắt mối liên kết giữa SA và galactose nhờ hoạt tính salidase tạo nên chức năng neuramidase.

Điều này cho phép giải phóng hạt virus gây bệnh khỏi tế bào vật chủ nhiễm, làm cho các phần tử virus mới được tổng hợp không ngưng kết với nhau, và cho phép virus đi xuyên qua lớp màng nhày của đường hô hấp. Sau khi hạt virus mới được tổng hợp và giải phóng khỏi tế bào thì có hiện tượng cắt HA0 thành HA1 và HA2 nhờ protease ngoại bào nằm ở đường hô hấp. Đây cũng chính là một trong số các yếu tố quyết định độc lực của cúm ở một số loài (không có độc lực cao nếu tổ chức không có nhiều protease tại chỗ). Dịch tễ học Virus cúm truyền bệnh từ người sang người qua đường không khí, điều này giải thích hình thái xuất hiện bệnh đột ngột và mức độ lan truyền dịch nhanh trong cộng đồng.

Trong cùng vụ dịch, tỷ lệ tấn công trẻ em cao hơn người lớn. Ở giai đoạn trung bình, khoảng 25% dân số bị nhiễm và trong số này, một phần ba phải đi điều trị, tỷ lệ nhập viện cao hơn hẳn ở nhóm tuổi nhỏ và người có tuổi.