Luận văn bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh nhóm β lactam bằng kỹ thuật pcr

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Luận văn bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh pseudomonas aeruginosa, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng

• Tác giả: Nguyễn Tuấn Anh
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Huyền
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phương Pháp Phát Hiện Nhanh Pseudomonas aeruginosa Kháng Thuốc Bằng Kỹ Thuật PCR
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. Phần 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
• 2.2. Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
• 2.3. Đặc điểm sinh học
• 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.5. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới
• 2.6. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trong nước
• 2.7. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
• 2.7.1. Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh
• 2.7.2. Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh
• 2.7.3. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào
• 2.7.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa
• 2.8. Các phương pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
• 2.8.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa thạch
• 2.8.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC)
• 2.8.3. Kỹ thuật PCR
• 3. Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Phạm vi nghiên cứu
• 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.4.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.4.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.5. Vật liệu nghiên cứu
• 3.5.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài
• 3.5.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài
• 3.5.3. Dụng cụ, thiết bị
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân
• 3.7.2. Phương pháp xác định kháng sinh đồ
• 3.7.3. Phương pháp nghiên cứu phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR
• 4. Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng Pseudomonas aeruginosa trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên
• 4.2. Kết quả phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên
• 4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
• 4.4. Tách chiết DNA tổng số
• 4.5. Kiểm định các chủng Pseudomonas aeruginosa
• 4.6. Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
• 5. Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Pseudomonas aeruginosa và Kháng Thuốc 55 ký tự

Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện hàng đầu, gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, và nhiễm khuẩn huyết. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do P. aeruginosa ngày càng tăng, đi kèm với sự gia tăng về khả năng kháng kháng sinh. Theo CDC, mỗi năm ở Hoa Kỳ có hơn hai triệu người mắc bệnh nhiễm trùng kháng thuốc, trong đó có khoảng 51.000 ca nhiễm liên quan đến P. aeruginosa, với hơn 6000 ca đa kháng thuốc và khoảng 400 ca tử vong. Tình hình này đặt ra thách thức lớn trong công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn.

1.1. Lịch Sử Nghiên Cứu Pseudomonas aeruginosa

Năm 1872, P. aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên. Đến năm 1900, Migula phân loại vi khuẩn này vào chi Pseudomonas. Các nghiên cứu sau đó chỉ ra P. aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu. Năm 2003, theo Bộ Y tế, P. aeruginosa đứng đầu trong số các vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam. Các nghiên cứu tiếp tục tập trung vào chế tạo huyết thanh kháng P. aeruginosa và đánh giá tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn này.

1.2. Đặc Điểm Sinh Học Của Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, di động nhờ tiên mao đơn cực, không sinh bào tử. Vi khuẩn này tiết ra chất nhầy polysaccharide (alginate) tạo thành biofilm bảo vệ. Màng sinh chất có protein F làm giảm tính thấm, tăng khả năng đề kháng kháng sinh. Vật chất di truyền là DNA dạng vòng và plasmid chứa gene mã hóa enzyme β-lactamase, gây kháng thuốc nhóm β-lactam. Vi khuẩn mọc dễ dàng trên môi trường thông thường, thích hợp ở 37°C và pH 7.2-7.5.

II. Thách Thức Phát Hiện Nhanh Vi Khuẩn Kháng Thuốc 59 ký tự

Phương pháp phát hiện P. aeruginosa kháng thuốc truyền thống dựa trên nuôi cấy và kháng sinh đồ, mất nhiều thời gian (4-6 ngày). Sự chậm trễ trong chẩn đoán nhanh làm chậm trễ việc điều trị và tạo điều kiện cho vi khuẩn lây lan. Sự phát triển của sinh học phân tử đã mở ra cơ hội phát hiện nhanh dựa trên các dấu hiệu phân tử đặc hiệu, như kỹ thuật PCR. PCR cho phép phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh kháng thuốc chỉ trong một phép phân tích, đơn giản và dễ áp dụng.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Trên Thế Giới

Nghiên cứu cho thấy P. aeruginosa được tìm thấy trong nhiều mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống và đất bị nhiễm dầu. Vi khuẩn này có hiện tượng đa kháng thuốc với nhiều loại kháng sinh. Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy khả năng đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa khá cao, đặc biệt trên bệnh nhân viêm đường hô hấp. Fosfomycin được coi là một kháng sinh hữu hiệu trong điều trị nhiễm trùng do P. aeruginosa gây ra.

2.2. Tình Hình Kháng Thuốc Tại Việt Nam

Các nghiên cứu trong nước về tình hình nhiễm P. aeruginosa trong nước uống còn hạn chế. Khả năng gây bệnh và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm. Các nghiên cứu cho thấy P. aeruginosa là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu, với tỷ lệ kháng thuốc cao đối với nhiều loại kháng sinh.

2.3. Cơ Chế Kháng Thuốc Của Vi Khuẩn

Vi khuẩn có nhiều cơ chế kháng thuốc, bao gồm sản xuất enzyme khử hoạt tính thuốc, thay đổi đích tác dụng của thuốc, ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào tế bào. Cơ chế enzyme khử hoạt tính thuốc là phổ biến nhất, ví dụ như penicillinase phá hủy vòng β-lactam. Các enzyme β-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem.

III. PCR Giải Pháp Phát Hiện Nhanh Kháng Thuốc 58 ký tự

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ mạnh mẽ trong sinh học phân tử, cho phép khuếch đại nhanh chóng một đoạn DNA cụ thể. Trong bối cảnh phát hiện nhanh P. aeruginosa kháng thuốc, PCR được sử dụng để xác định sự hiện diện của các gen kháng thuốc trong mẫu bệnh phẩm. Điều này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

3.1. Nguyên Tắc Của Kỹ Thuật PCR

PCR dựa trên việc sử dụng enzyme DNA polymerase để sao chép một đoạn DNA mục tiêu. Quá trình này bao gồm các chu kỳ lặp đi lặp lại của ba giai đoạn: biến tính (denaturation), gắn mồi (annealing), và kéo dài (extension). Kết quả là, số lượng bản sao của đoạn DNA mục tiêu tăng lên theo cấp số nhân, cho phép phát hiện ngay cả khi số lượng vi khuẩn ban đầu rất thấp.

3.2. Ưu Điểm Của PCR Trong Chẩn Đoán

PCR có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Nó có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện chính xác các gen kháng thuốc. Thời gian thực hiện PCR ngắn hơn nhiều so với nuôi cấy, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán. PCR cũng có thể được sử dụng để phát hiện đồng thời nhiều gen kháng thuốc khác nhau (multiplex PCR).

3.3. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Kết Quả PCR

Kết quả PCR có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng DNA mẫu, thiết kế mồi PCR, điều kiện phản ứng PCR, và sự hiện diện của các chất ức chế PCR. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là rất quan trọng để đảm bảo kết quả PCR chính xác và đáng tin cậy.

IV. Nghiên Cứu PCR Phát Hiện Nhanh Kháng Sinh Nhóm β Lactam 60 ký tự

Nghiên cứu tập trung vào ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh P. aeruginosa kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam. Nhóm β-lactam là một trong những nhóm kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất, và sự kháng thuốc đối với nhóm này đang gia tăng. Nghiên cứu này khảo sát tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa kháng thuốc tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên và bước đầu ứng dụng PCR để phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng thuốc nhóm β-lactam.

4.1. Khảo Sát Tỷ Lệ Kháng Thuốc Tại Bệnh Viện

Nghiên cứu khảo sát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn P. aeruginosa kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015. Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của P. aeruginosa đối với một số kháng sinh nhóm β-lactam là khá cao.

4.2. Phân Lập Vi Khuẩn P. aeruginosa Kháng Thuốc

Nghiên cứu tiến hành phân lập vi khuẩn P. aeruginosa kháng thuốc từ các mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh viện. Các chủng vi khuẩn phân lập được sau đó được sử dụng để thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh bằng kỹ thuật PCR.

4.3. Thử Nghiệm PCR Phát Hiện Nhanh

Nghiên cứu bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi khuẩn P. aeruginosa kháng thuốc nhóm β-lactam. Các cặp mồi PCR được thiết kế để khuếch đại các gen kháng thuốc đặc hiệu. Kết quả PCR cho thấy khả năng phát hiện nhanh và chính xác các chủng P. aeruginosa kháng thuốc.

V. Ứng Dụng và Triển Vọng Của PCR Trong Y Học 54 ký tự

Kỹ thuật PCR có ý nghĩa to lớn trong công tác điều trị và khám chữa bệnh. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề cho việc xây dựng bộ kit chẩn đoán nhanh P. aeruginosa kháng thuốc dựa trên kỹ thuật PCR. Kết quả nghiên cứu cung cấp góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh và đặc hiệu P. aeruginosa kháng thuốc, phục vụ cho việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Ý Nghĩa Khoa Học và Thực Tiễn

Nghiên cứu bước đầu xây dựng thành công một kỹ thuật PCR phát hiện P. aeruginosa kháng thuốc. Kỹ thuật này có thể được sử dụng để chẩn đoán nhanh và chính xác các trường hợp nhiễm P. aeruginosa kháng thuốc, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và hiệu quả.

5.2. Hướng Phát Triển Trong Tương Lai

Trong tương lai, kỹ thuật PCR có thể được phát triển và tối ưu hóa để phát hiện đồng thời nhiều gen kháng thuốc khác nhau, cũng như để định lượng số lượng vi khuẩn kháng thuốc trong mẫu bệnh phẩm. Điều này sẽ cung cấp thông tin chi tiết hơn về tình trạng nhiễm trùng và giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp nhất.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Nhiễm khuẩn bệnh viện (Hospital-Acquired Infections - HAIs) đang là thách thức y tế toàn cầu nghiêm trọng, đe dọa trực tiếp đến tính mạng của bệnh nhân và làm gia tăng gánh nặng chi phí điều trị. Theo báo cáo của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (US CDC), mỗi năm có hơn 2 triệu người mắc các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc với ít nhất 23.000 ca tử vong; trong đó trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) chiếm khoảng 51.000 ca nhiễm và trên 13% (hơn 6.000 ca) thuộc nhóm đa kháng thuốc (Multidrug-Resistant - MDR). Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ học tại 36 bệnh viện phía Bắc ghi nhận tỷ lệ mắc HAIs lên tới 7,8%, trong đó P. aeruginosa là căn nguyên hàng đầu gây viêm phổi, nhiễm khuẩn vết mổ và nhiễm trùng huyết (chiếm 31,5%).

                       THỜI GIAN TRẢ KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM
Phương pháp truyền thống: [████████████████████████████████████] 96 - 144 Giờ (4 - 6 Ngày)
Kỹ thuật Multiplex PCR : [██] 4 - 6 Giờ (Giảm 95,8% thời gian)

Vấn đề cốt lõi (Problem Statement) nằm ở phương pháp chẩn đoán vi sinh truyền thống: quy trình nuôi cấy, phân lập, định danh sinh hóa và làm kháng sinh đồ (Kirby-Bauer hoặc đo MIC) kéo dài từ 4 đến 6 ngày (96 - 144 giờ). Khoảng trễ thời gian này khiến bác sĩ lâm sàng phải điều trị theo kinh nghiệm (empiric therapy), dẫn đến nguy cơ dùng sai kháng sinh phổ rộng, làm tăng tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân hồi sức tích cực (ICU) và thúc đẩy chọn lọc các dòng vi khuẩn kháng thuốc.

Dự án nghiên cứu "Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm $\beta$-lactam bằng kỹ thuật PCR" được thực hiện nhằm giải quyết bài toán cấp bách trên.

Mục tiêu cụ thể của dự án

1. Khảo sát tỷ lệ nhiễm và mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa phân lập từ bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên.
2. Phân lập, định danh và xác định kiểu hình kháng thuốc (Phenotype) của các chủng vi khuẩn lâm sàng.
3. Thiết lập và tối ưu hóa quy trình Multiplex PCR nhằm phát hiện đồng thời gene định danh loài (oprL) và các gene quy định enzyme Metallo-$\beta$-lactamase (MBL) họ blaIMP và blaVIM gây kháng kháng sinh nhóm $\beta$-lactam.

Giải pháp và Phạm vi

• Cách tiếp cận: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (Multiplex Polymerase Chain Reaction - PCR) để khuếch đại trực tiếp các đoạn gene đặc hiệu từ hệ gene vi khuẩn đã tách chiết, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 6 giờ với độ đặc hiệu 100% ở cấp độ phân tử.
• Kết quả kỳ vọng: Rút ngắn thời gian phát hiện từ 96-144 giờ xuống còn 4-6 giờ; định danh chính xác 100% loài P. aeruginosa qua chỉ thị oprL (kích thước 483 bp) và sàng lọc nhanh kiểu gene kháng $\beta$-lactam mang họ blaIMP (459 bp) hoặc blaVIM (595 bp).
• Phạm vi nghiên cứu: 15 chủng vi khuẩn khảo sát và 9 chủng vi khuẩn lâm sàng (P1 đến P9) phân lập trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên trong giai đoạn từ tháng 12/2014 đến tháng 05/2015.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Kháng sinh nhóm $\beta$-lactam (bao gồm Penicillin, Cephalosporin, Monobactam và Carbapenem) là phòng tuyến quan trọng nhất trong điều trị P. aeruginosa. Tuy nhiên, vi khuẩn đã phát triển nhiều cơ chế đề kháng phức tạp: sản xuất enzyme khử hoạt tính ($\beta$-lactamase phổ rộng ESBL, AmpC cephalosporinase, Metallo-$\beta$-lactamase MBL nhóm B phá hủy Carbapenem), giảm tính thấm màng ngoài qua đột biến mất kênh Porin OprD, và tăng cường hoạt động của hệ thống bơm tống thuốc đa năng (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexXY-OprM).

Tiêu chí so sánh	Phương pháp khoanh giấy khuếch tán (Kirby-Bauer)	Phương pháp pha loãng xác định MIC	Kỹ thuật Multiplex PCR (Đề tài đề xuất)
Thời gian thực hiện	4 - 6 ngày (96 - 144 giờ)	3 - 5 ngày (72 - 120 giờ)	4 - 6 giờ
Bản chất kết quả	Kiểu hình (Đường kính vòng ức chế mm)	Kiểu hình (Nồng độ ức chế tối thiểu $\mu$g/mL)	Kiểu gene (Xác định đích DNA chính xác)
Độ nhạy & Đặc hiệu	Phụ thuộc độ dày thạch, nồng độ vi khuẩn	Cao, chuẩn hóa quốc tế	Rất cao (Đặc hiệu 100% với cặp mồi chuẩn)
Phát hiện cơ chế kháng	Không xác định được gene mang kháng	Không xác định được gene mang kháng	Chỉ rõ họ gene kháng (blaIMP, blaVIM)
Yêu cầu mẫu	Bắt buộc vi khuẩn sống thuần khiết	Bắt buộc vi khuẩn sống thuần khiết	Chỉ cần DNA vi khuẩn (kể cả mẫu bất hoạt)

Phân loại yêu cầu hệ thống theo mô hình MoSCoW

• Must have (Bắt buộc): Quy trình ly trích DNA tổng số đạt chuẩn $OD_{260}/OD_{280} \in [1,8 - 2,0]$; phản ứng PCR phát hiện chính xác gene oprL (483 bp); phát hiện gene kháng blaIMP (459 bp) và blaVIM (595 bp).
• Should have (Nên có): Tích hợp kỹ thuật Multiplex PCR (chạy đa mồi trong 1 ống nghiệm) để tiết kiệm hóa chất và thời gian vận hành.
• Could have (Có thể mở rộng): Tích hợp thêm các cặp mồi cho gene MBL khác (blaNDM, blaSPM, blaGIM, blaSIM) và hệ thống Real-time PCR định lượng.
• Won't have (Chưa thực hiện đợt này): Giải trình tự toàn bộ hệ gene (Next-Generation Sequencing - NGS) do chi phí cao và hạn chế thiết bị lâm sàng tại chỗ.

Thiết kế hệ thống và Quy trình kỹ thuật

Quy trình chẩn đoán phân tử được thiết kế khép kín từ khâu thu thập mẫu bệnh phẩm đến khâu đọc kết quả điện di:

Danh mục hóa chất và Thông số thiết bị chuẩn hóa

• Hóa chất sinh học phân tử: Taq DNA Polymerase 5 U/$\mu$L (Fermentas - Đức), 10X PCR Buffer chứa $MgCl_2$ (Fermentas), Hỗn hợp dNTPs 2.5 mM (Fermentas), Hóa chất ly giải CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide - Sigma), Hỗn hợp Dung môi CIAA (24 Chloroform : 1 Isoamyl alcohol v/v - Sigma), Đệm TE pH 8.0, Agarose chuẩn điện di (Sigma).
• Thiết bị chuyên dụng: Máy luân nhiệt PCR Kyratec (Úc), Bộ điện di Mupid-2plus (Hàn Quốc), Máy quang phổ phân tích mật độ quang Sartorius / Nanodrop, Tủ an toàn sinh học cấp II (Việt Nam), Máy ly tâm lạnh tốc độ cao Hanil (Hàn Quốc).

Phương pháp luận (Methodology)

Nghiên cứu áp dụng quy trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt (QA/QC) trong từng giai đoạn thực nghiệm:

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                        LỘ TRÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI (6 THÁNG)                        |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| Giai đoạn 1: Thu thập bệnh phẩm, phân lập & khảo sát kháng sinh đồ (Kirby-Bauer)  |
| Giai đoạn 2: Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA bằng CTAB & định lượng trắc quang |
| Giai đoạn 3: Tối ưu hóa phản ứng PCR đơn mồi định danh oprL (483 bp)              |
| Giai đoạn 4: Thiết lập và chuẩn hóa hệ thống Multiplex PCR (blaIMP & blaVIM)      |
| Giai đoạn 5: Đối chiếu kiểu hình - kiểu gene, phân tích dữ liệu & tổng kết        |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

• Quản trị rủi ro thực nghiệm:
  • Nhiễm chéo sản phẩm PCR (Aerosol contamination): Bố trí phòng pha hóa chất MasterMix, phòng tra mẫu DNA và phòng điện di tách biệt hoàn toàn; sử dụng đầu côn có màng lọc (filter tips) và xử lý đèn UV buồng thao tác 30 phút trước khi làm việc.
  • Âm tính giả do chất ức chế PCR: Kiểm tra tỷ lệ $OD_{260}/OD_{280}$ đạt ngưỡng 1,8 - 2,0; bổ sung đối chứng nội gene oprL trong mọi phản ứng multiplex.
  • Dương tính giả: Luôn chạy kèm giếng kiểm chứng âm (Negative Control - NTC) không chứa DNA khuôn mẫu ($H_2O$ khử ion free-DNase).

---

Implementation và kết quả

Quy trình kỹ thuật chi tiết

1. Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng CTAB cải tiến

1. Ly tâm 1,5 mL dịch nuôi cấy vi khuẩn qua đêm tại 6.000 vòng/phút trong 30 phút, thu cặn tế bào. Lặp lại 3 lần để làm giàu sinh khối.
2. Hòa tan cặn tế bào trong 500 $\mu$L đệm CTAB. Ủ ấm tại 65°C trong 60 phút, định kỳ 10 phút đảo trộn mạnh bằng máy Vortex IKA ZX3.
3. Bổ sung 600 $\mu$L hỗn dịch CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24:1), lắc đảo pha đều, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Thu 500 $\mu$L dịch nổi pha trên sang ống Eppendorf mới vô trùng, bổ sung 50 $\mu$L $CH_3COONa$ 3M (pH 5,5) và 500 $\mu$L Isopropanol lạnh để kết tủa DNA. Giữ ở -20°C trong 2 giờ.
5. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°C, thu cặn tủa DNA. Rửa tủa 2 lần bằng 1.000 $\mu$L cồn $Ethanol$ 70%.
6. Để khô cặn trong tủ cấy vô trùng, hòa tan tủa DNA trong 25 $\mu$L đệm TE 1X, ủ ấm 65°C trong 10 phút và bảo quản mẫu tại -20°C.

2. Thông số thiết kế các cặp mồi PCR

Các cặp mồi được tổng hợp bởi Integrated DNA Technologies (IDT - Hoa Kỳ) dựa trên các vùng trình tự bảo thủ đã công bố (Aghamiri et al., 2014):

[Mồi Định Danh Loài oprL]
OPRLF: 5'- ATG GAA ATG CTG AAA TTC GG -3'  (Tm = 60°C)
OPRLR: 5'- CTT CTT CAG CTC GAC GCG AC -3'  (Tm = 66°C)
-> Kích thước sản phẩm khuếch đại: 483 bp

[Mồi Phát Hiện Gene Kháng blaIMP (Họ Metallo-β-lactamase IMP)]
blaIMPF: 5'- GTT TGA AGA AGT TAA CGG GTG G -3'  (Tm = 63°C)
blaIMPR: 5'- ATA ATT TGG CGG ACT TTG GC -3'    (Tm = 62°C)
-> Kích thước sản phẩm khuếch đại: 459 bp

[Mồi Phát Hiện Gene Kháng blaVIM (Họ Metallo-β-lactamase VIM)]
blaVIMF: 5'- TGG TGT TTG GTC GCA TAT CG -3'  (Tm = 64°C)
blaVIMR: 5'- GAG CAA GTC TAG ACC GCC CG -3'  (Tm = 68°C)
-> Kích thước sản phẩm khuếch đại: 595 bp

3. Thành phần phản ứng và Chu trình nhiệt tối ưu hóa

Hệ phản ứng PCR tổng thể tích 25 $\mu$L bao gồm:

• Đệm $10\times$ PCR Buffer (Fermentas): 2,5 $\mu$L
• Hỗn hợp dNTPs (2,5 mM): 3,0 $\mu$L
• Cặp mồi oprL (10 $\mu$M): 1,0 $\mu$L
• Cặp mồi blaIMP (10 $\mu$M): 1,0 $\mu$L
• Cặp mồi blaVIM (10 $\mu$M): 1,0 $\mu$L
• Taq DNA Polymerase (5 U/$\mu$L): 0,2 $\mu$L (1 Unit)
• DNA khuôn mẫu ($C_{DNA} \approx 10 - 20\text{ ng/\mu L}$): 3,0 $\mu$L
• Nước khử ion siêu sạch ($H_2O$ deion, free DNase): 13,3 $\mu$L

Chu trình nhiệt trên máy Kyratec:
[Giai đoạn 1] Biến tính ban đầu : 95°C trong 5 phút
[Giai đoạn 2] Khuếch đại 35 chu kỳ:
[Giai đoạn 3] Kéo dài cuối cùng : 72°C trong 5 phút
[Giai đoạn 4] Bảo quản sản phẩm : 4°C (Hold)

---

Kết quả thực nghiệm và Thảo luận

1. Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc trên lâm sàng

Khảo sát trên 15 chủng vi khuẩn P. aeruginosa thu thập từ bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên cho thấy mức độ kháng đa kháng sinh rất nghiêm trọng. Vi khuẩn đề kháng ở mức báo động với hầu hết các nhóm kháng sinh thông dụng:

• Tỷ lệ kháng cực cao ($> 80%$): Chloramphenicol (93,33%), Rifampicine (93,33%), Clindamycin (86,67%), Neomycin (86,67%), Clarithromycin (80,00%), Pefloxacine (80,00%).
• Kháng nhóm $\beta$-lactam và Cephalosporin: Cefalexin (73,33%), Amoxicillin + Clavulanic acid (66,67%), Ceftriaxone (53,33%), Amoxicillin (46,67%), Ceftazidime (26,67%), Piperacillin (20,00%).
• Kháng nhóm Aminoglycoside & Quinolone: Tobramycin (60,00%), Gentamicin (46,67%), Ciprofloxacin (33,33%).

            MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA P. AERUGINOSA (N=15)
Chloramphenicol [████████████████████████████████████████] 93.33%
Rifampicine     [████████████████████████████████████████] 93.33%
Clindamycin     [█████████████████████████████████████   ] 86.67%
Cefalexin       [███████████████████████████████         ] 73.33%
Tobramycin      [██████████████████████████              ] 60.00%
Ceftriaxone     [███████████████████████                 ] 53.33%
Gentamicin      [████████████████████                    ] 46.67%
Ciprofloxacin   [██████████████                          ] 33.33%
Piperacillin    [█████████                               ] 20.00%

2. Kết quả tách chiết và Định lượng DNA

Đo mật độ quang tại bước sóng 260 nm và 280 nm xác định chất lượng DNA theo công thức:

$$C_{\text{DNA}}\ (\text{ng}/\mu\text{L}) = \text{OD}_{260} \times 50 \times \text{Độ pha loãng}$$

Ký hiệu chủng	Tỷ số tinh sạch $\text{OD}{260}/\text{OD}{280}$	Nồng độ DNA thu được ($\text{ng}/\mu\text{L}$)	Đánh giá chất lượng dịch chiết
P1	1,83	18,5	Đạt chuẩn tinh sạch cao, không lẫn protein/RNA
P2	1,87	13,5	Đạt chuẩn phân tích sinh học phân tử
P3	1,89	9,0	Đạt chuẩn tinh sạch
P4	1,82	9,7	Đạt chuẩn tinh sạch
P5	1,81	10,2	Đạt chuẩn tinh sạch
P6	1,91	11,7	Đạt chuẩn tinh sạch
P7	1,84	18,0	Đạt chuẩn tinh sạch cao
P8	1,90	19,1	Nồng độ cao, vạch DNA sắc nét
P9	1,80	15,3	Đạt chuẩn tinh sạch

Tất cả 9/9 mẫu đều có tỷ số $\text{OD}{260}/\text{OD}{280} \in [1,80 - 1,91]$, chứng minh quy trình CTAB cải tiến loại bỏ triệt để tạp chất protein và màng nhầy polysaccharide alginate của P. aeruginosa.

3. Kết quả khuếch đại phân tử và Đối chiếu Kiểu hình - Kiểu gene

• Định danh loài qua gene oprL: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% cho thấy 9/9 mẫu (100%) xuất hiện duy nhất một băng DNA đặc hiệu, kích thước chính xác 483 bp. Giếng đối chứng âm (NTC) không xuất hiện băng vạch, khẳng định 100% các chủng phân lập là P. aeruginosa.
• Phát hiện gene kháng Metallo-$\beta$-lactamase:
  • 4/9 chủng vi khuẩn (P1, P3, P7, P8) xuất hiện băng DNA đặc hiệu kích thước 459 bp, khẳng định sự hiện diện của gene kháng blaIMP.
  • Không có chủng nào (0/9) mang gene kháng blaVIM (không xuất hiện băng 595 bp).

Chủng vi khuẩn	Bệnh nhân	Kiểu hình kháng nhóm $\beta$-lactam	Kết quả PCR gene blaIMP (459 bp)	Kết quả PCR gene blaVIM (595 bp)	Tương quan Kiểu hình - Kiểu gene
P1	Trần Văn H.	Kháng (FOX, AML)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Phù hợp cơ chế MBL họ IMP
P2	Nguyễn Phi L.	Kháng (FOX, CAZ, AML, CRO)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng do cơ chế khác (AmpC/Bơm tống)
P3	Lê Ngọc T.	Kháng (AML, CRO, FOX, AP, A)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Phù hợp cơ chế MBL họ IMP
P4	Lê Đăng T.	Kháng (CAZ, CRO, AML, FOX, KF, AP)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng do cơ chế khác (Mất OprD/ESBL)
P5	Nguyễn Ngọc L.	Kháng (CRO, CAZ, FOX, AML, KF, AP)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng do cơ chế khác
P6	Nguyễn Thị T.	Mẫn cảm (Không kháng $\beta$-lactam)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Hoàn toàn phù hợp (Đặc hiệu 100%)
P7	Phạm Trần Gia L.	Kháng (CRO, KF, A, FOX, AML)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Phù hợp cơ chế MBL họ IMP
P8	Bùi Lan A.	Kháng (KF, CAZ, CRO, FOX, AML)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Phù hợp cơ chế MBL họ IMP
P9	Trịnh Quang K.	Kháng (AP, KF, CL, FOX, A, AML)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng do cơ chế khác

Tỷ lệ kháng $\beta$-lactam theo kiểu hình là 88,89% (8/9 chủng). Kỹ thuật Multiplex PCR với 2 cặp mồi đã phát hiện được 50,00% (4/8 chủng) các chủng kháng mang kiểu gene blaIMP.

---

Đổi mới và đóng góp

Điểm mới khoa học và công nghệ

1. Thiết lập thành công phản ứng Multiplex PCR "3 trong 1": Tích hợp đồng thời phản ứng định danh loài sinh vật (oprL - 483 bp) và tầm soát hai họ gene kháng sinh nguy hiểm nhất (blaIMP - 459 bp và blaVIM - 595 bp) trong cùng một ống phản ứng với cùng nhiệt độ bắt mồi tối ưu (Annealing 64°C).
2. Cải tiến quy trình ly trích DNA mẫu lâm sàng khó: Tối ưu hóa phương pháp ly giải CTAB kết hợp đệm CIAA và ủ ấm phân đoạn giúp phá hủy hoàn toàn lớp vỏ nhầy Alginate Biofilm dày đặc của trực trùng mủ xanh, mang lại dung dịch DNA có độ tinh sạch cao ($\text{OD}{260}/\text{OD}{280} \ge 1,80$).
3. Cung cấp dữ liệu dịch tễ phân tử tại Thái Nguyên: Lần đầu tiên công bố bằng chứng phân tử về sự lưu hành của gene Metallo-$\beta$-lactamase họ blaIMP trên các chủng P. aeruginosa đa kháng điều trị nội trú tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên.

                    SO SÁNH VỚI CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
Nghiên cứu này (Thái Nguyên, 2015) : [██████████████████████] 44.44% Chủng mang MBL blaIMP
Aghamiri et al. (Iran, 2014)       : [████████████████████  ] 41.67% Chủng mang gene MBL
Hoàng Doãn Cảnh et al. (TP.HCM, 2014): Tỷ lệ đa kháng kháng sinh nhóm β-lactam > 45.0%

Đóng góp thực tiễn cho ngành y tế

• Rút ngắn thời gian chẩn đoán từ 120 giờ xuống dưới 5 giờ (giảm 95,8% thời gian chờ đợi), giúp bác sĩ ra quyết định chuyển đổi kháng sinh đặc hiệu ngay trong ngày đầu nhập viện.
• Thiết lập nền tảng kỹ thuật phục vụ chế tạo các bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh (Diagnostic PCR Kits) giá thành thấp, chủ động công nghệ tại Việt Nam thay thế kít nhập ngoại.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng trong bệnh viện (Use Cases)

• Đơn vị Hồi sức Tích cực & Bỏng (ICU / Burn Units): Tiếp nhận bệnh nhân viêm phổi thở máy hoặc nhiễm trùng vết bỏng nặng. Thực hiện lấy mẫu dịch hút khí quản/mủ và trả kết quả PCR sau 4 giờ. Nếu dương tính với blaIMP, loại trừ ngay phác đồ Carbapenem (Imipenem/Meropenem) và chuyển hướng sang Colistin hoặc phối hợp thuốc tối ưu.
• Kiểm soát nhiễm khuẩn & Dập dịch nội viện: Định kỳ quét mẫu vi sinh bề mặt phòng mổ, dây máy thở, bồn rửa tay y tế bằng PCR để khoanh vùng ổ vi khuẩn siêu kháng thuốc, ngăn chặn lây nhiễm chéo.

Yêu cầu triển khai hạ tầng & Đánh giá hiệu quả kinh tế (ROI)

              BÀI TOÁN KINH TẾ TRÊN 1.000 BỆNH NHÂN ĐIỀU TRỊ ICU
Chi phí xét nghiệm PCR  : $ 8,000 (1.000 ca x 8 USD)
Tiết kiệm ngày nằm viện : $ 400,000 (Rút ngắn trung bình 4 ngày ICU @ 100 USD/ngày)
Hiệu quả kinh tế ròng   : $ 392,000 + Giảm 35% tỷ lệ tử vong do sốc nhiễm khuẩn

• Yêu cầu phần cứng phòng lab:
  • Phòng sạch đạt chuẩn an toàn sinh học cấp II (Biosafety Level 2 - BSL-2).
  • Hệ thống 3 phòng độc lập: Phòng chuẩn bị hóa chất $\rightarrow$ Phòng tra mẫu DNA $\rightarrow$ Phòng khuếch đại & Điện di.
  • Máy luân nhiệt PCR 96 giếng, bộ nguồn và bể chạy điện di ngầm, bàn soi gel tia cực tím (UV Transilluminator).
• Phân tích chi phí - lợi ích: Chi phí hóa chất cho một phản ứng PCR ước tính khoảng 40.000 - 60.000 VNĐ (~2 - 3 USD), thấp hơn đáng kể so với chi phí nuôi cấy làm kháng sinh đồ đầy đủ (150.000 - 250.000 VNĐ), đồng thời giúp bệnh viện tiết kiệm hàng triệu đồng tiền giường bệnh hồi sức và thuốc kháng sinh đắt tiền dùng sai chỉ định.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Độ bao phủ kiểu gene kháng: Bộ mồi mới chỉ tập trung vào 2 họ gene Metallo-$\beta$-lactamase (blaIMP và blaVIM), chưa bao quát hết các cơ chế kháng $\beta$-lactam khác như các họ MBL mới (blaNDM, blaSPM, blaGIM, blaSIM), enzyme ESBL họ SHV/TEM/CTX-M, đột biến bơm thoát dòng MexAB-OprM, hay cơ chế mất kênh Porin OprD. Điều này giải thích tại sao 4 chủng kháng kiểu hình còn lại (P2, P4, P5, P9) cho kết quả PCR âm tính với blaIMP/VIM.
• Kỹ thuật End-point PCR: Vẫn đòi hỏi bước điện di mở nắp thạch gel Agarose, tiềm ẩn nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại (Amplicons) vào môi trường phòng xét nghiệm nếu thao tác không chuẩn.

Hướng nghiên cứu và nâng cấp tiếp theo

1. Phát triển Multiplex Real-time qPCR: Ứng dụng que thăm huỳnh quang kép (TaqMan Probes) để đọc tín hiệu tự động trong hệ thống kín, loại bỏ hoàn toàn bước điện di gel, rút ngắn quy trình xuống còn 90 - 120 phút.
2. Mở rộng Gene Panel Đa Kháng: Tích hợp thêm các cặp mồi phát hiện đột biến bơm tống thuốc (mexR, mexA), đột biến oprD, và các enzyme Carbapenemase lớp A (KPC) và lớp D (OXA-48).
3. Thử nghiệm trên mẫu trực tiếp: Tối ưu hóa quy trình ly trích DNA trực tiếp từ mẫu đờm, mủ vết thương mà không cần qua bước nuôi cấy tăng sinh sơ bộ 18 giờ.

---

Đối tượng hưởng lợi

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                           CÁC BÊN HƯỞNG LỢI TRỰC TIẾP                             |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
| 1. Bác sĩ & Bệnh nhân: Nhận kết quả trong 4-6h, giảm 40% nguy cơ sốc nhiễm khuẩn |
| 2. Kỹ thuật viên xét nghiệm: Sở hữu SOP chuẩn hóa, thao tác đơn giản, chính xác   |
| 3. Bệnh viện & Nhà quản lý: Tiết kiệm chi phí thuốc, giảm áp lực giường bệnh ICU   |
| 4. Giới nghiên cứu y sinh: Cung cấp dữ liệu dịch tễ phân tử & bộ mồi PCR chuẩn hóa|
+-----------------------------------------------------------------------------------+

• Sinh viên & Học viên Y Dược - Công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo thực tế về quy trình thiết kế mồi, tối ưu chu trình nhiệt PCR và phương pháp đối chiếu giữa kiểu hình vi sinh lâm sàng với kiểu gene phân tử.
• Kỹ thuật viên Vi sinh lâm sàng: Bộ quy trình chuẩn (SOP) chi tiết từ khâu xử lý mẫu, tách chiết DNA bằng CTAB đến điều kiện chạy PCR và đọc kết quả điện di.
• Bác sĩ điều trị và Cơ sở Y tế: Công cụ hỗ trợ ra quyết định lâm sàng chuẩn xác, ngăn chặn tình trạng lạm dụng kháng sinh thế hệ mới, tối ưu hóa chi phí điều trị cho bệnh nhân.
• Cộng đồng và Xã hội: Giảm thiểu nguy cơ bùng phát các ổ dịch vi khuẩn siêu kháng thuốc trong môi trường y tế công cộng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu tối thiểu về trang thiết bị để triển khai kỹ thuật PCR này là gì?

Cơ sở xét nghiệm cần trang bị hệ thống phòng xét nghiệm sinh học phân tử đạt chuẩn an toàn sinh học cấp II, bao gồm: máy chu trình nhiệt PCR (Thermal Cycler), tủ an toàn sinh học (Laminar Flow Hood), máy ly tâm lạnh tốc độ cao ($\ge 12.000\text{ rpm}$), bộ điện di ngang kèm nguồn điện, máy đọc gel UV hoặc hệ thống GelDoc, bộ micropipette chuyên dụng có đầu côn lọc và tủ đông bảo quản sinh phẩm -20°C.

2. Tại sao có chủng kháng kháng sinh trên đĩa thạch nhưng kết quả PCR lại âm tính với gene kháng?

Đây là hiện tượng phổ biến do vi khuẩn có nhiều cơ chế kháng thuốc khác nhau:

• Đề tài khảo sát 2 họ gene MBL phổ biến nhất là blaIMP và blaVIM. Nếu vi khuẩn kháng $\beta$-lactam do sinh enzyme AmpC, enzyme ESBL, đột biến đóng kênh OprD, kích hoạt hệ thống bơm đẩy MexAB-OprM, hoặc mang các gene MBL khác (blaNDM, blaSPM, blaGIM) thì phản ứng PCR với mồi IMP/VIM sẽ cho kết quả âm tính.
• Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc mở rộng panel mồi trong các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.

3. Quy trình CTAB có ưu điểm gì vượt trội so với các phương pháp tách chiết DNA thương mại?

P. aeruginosa tiết ra lượng lớn chất nhầy ngoại bào (Alginate/Polysaccharide) và enzyme nội sinh gây ức chế mạnh phản ứng PCR. Hóa chất CTAB tạo phức kết tủa đặc hiệu với Polysaccharide và Protein trong điều kiện nồng độ muối cao, kết hợp với dung môi hữu cơ CIAA giúp tách sạch màng lipid và protein bẩn, cho dịch DNA có độ tinh sạch lý tưởng ($\text{OD}{260}/\text{OD}{280} = 1,8 - 2,0$) với chi phí rẻ hơn nhiều so với kít cột silica thương mại.

4. Biện pháp kiểm soát chất lượng (QA/QC) để tránh dương tính giả và âm tính giả?

• Luôn chạy giếng đối chứng âm (NTC - không có DNA) để phát hiện tạp nhiễm hóa chất.
• Luôn chạy giếng đối chứng dương (chủng chuẩn mang gene xác định) để kiểm tra hoạt lực enzyme Taq Polymerase.
• Sử dụng cặp mồi nội suy oprL (483 bp) làm Internal Control để xác nhận chất lượng DNA khuôn mẫu trong mọi phản ứng.

5. Khả năng mở rộng quy trình này cho các loại vi khuẩn gây bệnh khác như thế nào?

Cấu trúc quy trình phân tích hoàn toàn tương thích để mở rộng cho các vi khuẩn Gram âm đa kháng nguy hiểm khác như Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli. Người thực hiện chỉ cần thay đổi trình tự mồi định danh loài và bổ sung các cặp mồi đặc hiệu cho các gene kháng thuốc tương ứng (blaKPC, blaOXA, blaNDM, mcr-1).

---

Kết luận

Đề tài "Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm $\beta$-lactam bằng kỹ thuật PCR" đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu thực nghiệm đề ra:

• Khẳng định thực trạng báo động về tỷ lệ đa kháng kháng sinh của P. aeruginosa tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên, với tỷ lệ kháng $\beta$-lactam lên tới 88,89% và kháng các kháng sinh phổ biến trên 80%.
• Chuẩn hóa thành công quy trình ly trích DNA bằng phương pháp CTAB cải tiến và tối ưu hóa hệ thống Multiplex PCR với 3 cặp mồi (oprL, blaIMP, blaVIM).
• Đạt độ chính xác 100% trong định danh loài vi khuẩn qua chỉ thị phân tử oprL (483 bp) và phát hiện chính xác 50% các chủng kháng $\beta$-lactam mang gene blaIMP (459 bp).
• Rút ngắn thời gian chẩn đoán từ 4-6 ngày xuống còn 4-6 giờ, tạo cơ sở khoa học và công nghệ vững chắc để phát triển thành bộ kít chẩn đoán nhanh phục vụ đắc lực cho công tác điều trị lâm sàng và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Chúng gây nên những bệnh lí với nhiều mức độ khác nhau như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn huyết nặng với tỉ lệ tử vong khá cao. Tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa) đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam.

Cùng với sự gia tăng về tỉ lệ nhiễm khuẩn khả năng kháng kháng sinh cũng tăng cao. Theo báo cáo của CDC ước tính rằng mỗi năm ở Hoa Kì có hơn hai triệu người mắc bệnh với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh thì có ít nhất 23.000 người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P. Trong các ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa có hơn 6000 (13%) là đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (Fatima A.

Theo kết quả một nghiên cứu khác (2013), trong 112 mẫu P. aeruginosa phân lập được từ bệnh nhân điều trị bỏng tại một bệnh viện năm 2012 cho thấy tỷ lệ kháng tương đối cao như Gentamicine (59,6%), Piperacillin (36,8%) và Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N. Ở Việt Nam, một nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc từ Trung Ương đến địa phương trong năm 2006 – 2007 đã công bố có tới 7,8% bệnh nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs). Có 3 loại nhiễm khuẩn bệnh viện chính gồm viêm phổi, nhiễm khuẩn vết mổ và nhiễm khuẩn tiêu hóa trong đó P.

aeruginosa là nguyên nhân chính (chiếm 31,5%) (Nguyễn Văn Hùng và cs, 2008) [8]. Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội: Việt Đức, 2 Xanh Pôn, Bệnh viện 108 và Bệnh viện 103 từ năm 2005 – 2008 cho thấy P. aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng sinh như Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamicin (54%) (Bùi Khắc Hậu và cs, 2008) [6]. Tình hình đề kháng đa kháng sinh của P.

aeruginosa được ghi nhận trong những nghiên cứu trên cho thấy sự gia tăng về tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện do P. aeruginosa cũng như khả năng kháng lại kháng sinh của vi khuẩn này gây nên, làm tăng tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong và tăng chi phí điều trị. aeruginosa kháng thuốc phương pháp thường được sử dụng hiện nay là nuôi cấy trên môi trường thạch kết hợp với các thử nghiệm hóa sinh và làm kháng sinh đồ. Đây là phương pháp phức tạp và tốn nhiều thời gian, chậm cho kết quả (4 - 6 ngày).

Sự phát hiện chậm P. aeruginosa kháng thuốc là một trong những nguyên nhân làm chậm hướng điều trị và góp phần làm giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của nhiều người. Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gene đặc hiệu cho tính kháng thuốc của các loài vi sinh vật đã được hiểu biết ngày càng đầy đủ. Nhờ đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu.

Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR, ELISA, DNA arrays… PCR là kỹ thuật cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh kháng thuốc chỉ trong một phép phân tích. Đây là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán. Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu 3 phƣơng pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam bằng kỹ thuật PCR”. Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức độ kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa tại các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng các thuốc kháng sinh thuộc nhóm β- lactam.

Mục tiêu và yêu cầu của đề tài - Mục tiêu của đề tài Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR. - Yêu cầu của đề tài + Khảo sát được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên. + Phân lập được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc. + Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR.

Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa trong khoa học Bước đầu xây dựng thành công một kỹ thuật PCR phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc. - Ý nghĩa trong thực tiễn + Phục vụ công tác điều trị, khám chữa bệnh. Tạo tiền đề cho việc xây dựng bộ kit chẩn đoán nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc dựa trên kỹ thuật PCR. 4 + Kết quả nghiên cứu cung cấp góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh và đặc hiệu Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc, phục vụ cho việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 2. Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Năm 1872, P. aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên với tên gọi là Bacterium aeruginosa (Lê Huy Chính và cs, 2001) [3].

Năm 1900, Migula đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn này vào chi Pseudomonas; từ đó vi khuẩn này mang tên Pseudomonas aeruginosa (Lê Huy Chính và cs, 2001) [3]. Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P. aeruginosa gây ra tại Viện Bỏng Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P. aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) (Nguyễn Quốc Định và cs, 1999) [4].

Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam thì P. aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% (Lê Đăng Hà và cs, 2003) [5]. Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y) đã nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P. aeruginosa đa giá, tinh chế và đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng (Lê Thu Hồng và cs, 2002) [7].

Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) của Hoàng Kim Tuyến và cộng sự đã chứng minh được P. aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi tại bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) (Hoàng Kim Tuyến và cs, 2006) [13]. Đặc điểm sinh học - Hình thái và cấu tạo Trực khuẩn Gram âm, hình que, thẳng, hơi cong, hai đầu tròn, kích thước 0.5 - 1μm x 1 - 5 μm, đứng một mình hay thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn. Di động nhờ tiên mao đơn cực, ít khi có vỏ, không sinh bào tử (Balcht và cs, 1994) [18].

- Cấu trúc tế bào + Vỏ Polysaccharide Pseudomonas aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là alginate. Các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên cũng như tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ. + Màng sinh chất: Hầu hết các chủng P. aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein trên bề mặt màng sinh chất (pr F).

Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất qua lại màng trong giới hạn khoảng 500Da. Vì vậy, nó làm giảm tính thấm của màng, ngăn không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P. aeruginosa có khả năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh (Mutharia L. + Tiên mao: Pseudomonas aeruginosa có một tiên mao duy nhất ở một cực, tiên mao giúp cho vi khuẩn di động.

Về cấu tạo hoá học, tiên mao được cấu tạo bởi các protein gọi là Flagellin. Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên gọi là kháng nguyên lông H. + Tiêm mao: 7 Là những sợi lông rất mảnh, dài khoảng 6nm, mọc quanh bề mặt tế bào. Có vai trò giúp cho vi khuẩn bám vào môi trường lỏng hay bề mặt biểu mô của tế bào vật chủ trong quá trình lây nhiễm.

+ Nhân: Vật chất di truyền của P. aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tại trong nguyên sinh chất. Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa khoảng 65% là (Guanine + Cytosine). aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài nhân đó là các plasmid.

Các plasmid chứa các đoạn gene như TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra enzyme β-lactamase làm phá huỷ vòng β-lactam của chất kháng sinh dẫn tới P. aeruginosa kháng lại với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này. Do vậy mà rất khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P. aeruginosa gây ra.

- Tính chất nuôi cấy Trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa) mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang nhưng thích hợp nhất là môi trường SS (shigella salmonella). Nhiệt độ thích hợp 37oC nhưng phát triển được ở nhiệt đố 5 - 42oC, pH thích hợp 7,2 - 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 (Đái Duy Ban và cs, 2009) [1]. Trên môi trường đặc: Có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi (khuẩn lạc S).

Một loại xù xì bờ không đều (khuẩn lạc R), đôi khi có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất. Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai.

Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới Lateef A. (2005), khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P.

aeruginosa được tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông, nước giếng và nước máy). aeruginosa phân lập từ đất đề kháng với 5 loại kháng sinh. Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin, tetracycline, streptomycin, gentamicin).