Luận văn bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh nhóm β lactam bằng kỹ thuật pcr

Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện hàng đầu… 57 trang · Đại học Nông Lâm Thái Nguyên · 2015.

• Tác giả: Nguyễn Tuấn Anh
• Người hướng dẫn: Nguyễn Thị Huyền
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phương Pháp Phát Hiện Nhanh Pseudomonas aeruginosa Kháng Thuốc Bằng Kỹ Thuật PCR
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. Phần 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 2. Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
• 2.2. Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
• 2.3. Đặc điểm sinh học
• 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.5. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới
• 2.6. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trong nước
• 2.7. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
• 2.7.1. Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh
• 2.7.2. Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh
• 2.7.3. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào
• 2.7.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa
• 2.8. Các phương pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
• 2.8.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa thạch
• 2.8.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC)
• 2.8.3. Kỹ thuật PCR
• 3. Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Phạm vi nghiên cứu
• 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.4.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.4.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.5. Vật liệu nghiên cứu
• 3.5.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài
• 3.5.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài
• 3.5.3. Dụng cụ, thiết bị
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân
• 3.7.2. Phương pháp xác định kháng sinh đồ
• 3.7.3. Phương pháp nghiên cứu phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR
• 4. Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng Pseudomonas aeruginosa trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên
• 4.2. Kết quả phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên
• 4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
• 4.4. Tách chiết DNA tổng số
• 4.5. Kiểm định các chủng Pseudomonas aeruginosa
• 4.6. Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
• 5. Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Pseudomonas aeruginosa và Kháng Thuốc 55 ký tự

Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện hàng đầu, gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, và nhiễm khuẩn huyết. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do P. aeruginosa ngày càng tăng, đi kèm với sự gia tăng về khả năng kháng kháng sinh. Theo CDC, mỗi năm ở Hoa Kỳ có hơn hai triệu người mắc bệnh nhiễm trùng kháng thuốc, trong đó có khoảng 51.000 ca nhiễm liên quan đến P. aeruginosa, với hơn 6000 ca đa kháng thuốc và khoảng 400 ca tử vong. Tình hình này đặt ra thách thức lớn trong công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn.

1.1. Lịch Sử Nghiên Cứu Pseudomonas aeruginosa

Năm 1872, P. aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên. Đến năm 1900, Migula phân loại vi khuẩn này vào chi Pseudomonas. Các nghiên cứu sau đó chỉ ra P. aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu. Năm 2003, theo Bộ Y tế, P. aeruginosa đứng đầu trong số các vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam. Các nghiên cứu tiếp tục tập trung vào chế tạo huyết thanh kháng P. aeruginosa và đánh giá tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn này.

1.2. Đặc Điểm Sinh Học Của Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, di động nhờ tiên mao đơn cực, không sinh bào tử. Vi khuẩn này tiết ra chất nhầy polysaccharide (alginate) tạo thành biofilm bảo vệ. Màng sinh chất có protein F làm giảm tính thấm, tăng khả năng đề kháng kháng sinh. Vật chất di truyền là DNA dạng vòng và plasmid chứa gene mã hóa enzyme β-lactamase, gây kháng thuốc nhóm β-lactam. Vi khuẩn mọc dễ dàng trên môi trường thông thường, thích hợp ở 37°C và pH 7.2-7.5.

II. Thách Thức Phát Hiện Nhanh Vi Khuẩn Kháng Thuốc 59 ký tự

Phương pháp phát hiện P. aeruginosa kháng thuốc truyền thống dựa trên nuôi cấy và kháng sinh đồ, mất nhiều thời gian (4-6 ngày). Sự chậm trễ trong chẩn đoán nhanh làm chậm trễ việc điều trị và tạo điều kiện cho vi khuẩn lây lan. Sự phát triển của sinh học phân tử đã mở ra cơ hội phát hiện nhanh dựa trên các dấu hiệu phân tử đặc hiệu, như kỹ thuật PCR. PCR cho phép phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh kháng thuốc chỉ trong một phép phân tích, đơn giản và dễ áp dụng.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Trên Thế Giới

Nghiên cứu cho thấy P. aeruginosa được tìm thấy trong nhiều mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống và đất bị nhiễm dầu. Vi khuẩn này có hiện tượng đa kháng thuốc với nhiều loại kháng sinh. Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy khả năng đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa khá cao, đặc biệt trên bệnh nhân viêm đường hô hấp. Fosfomycin được coi là một kháng sinh hữu hiệu trong điều trị nhiễm trùng do P. aeruginosa gây ra.

2.2. Tình Hình Kháng Thuốc Tại Việt Nam

Các nghiên cứu trong nước về tình hình nhiễm P. aeruginosa trong nước uống còn hạn chế. Khả năng gây bệnh và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm. Các nghiên cứu cho thấy P. aeruginosa là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu, với tỷ lệ kháng thuốc cao đối với nhiều loại kháng sinh.

2.3. Cơ Chế Kháng Thuốc Của Vi Khuẩn

Vi khuẩn có nhiều cơ chế kháng thuốc, bao gồm sản xuất enzyme khử hoạt tính thuốc, thay đổi đích tác dụng của thuốc, ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào tế bào. Cơ chế enzyme khử hoạt tính thuốc là phổ biến nhất, ví dụ như penicillinase phá hủy vòng β-lactam. Các enzyme β-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem.

III. PCR Giải Pháp Phát Hiện Nhanh Kháng Thuốc 58 ký tự

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ mạnh mẽ trong sinh học phân tử, cho phép khuếch đại nhanh chóng một đoạn DNA cụ thể. Trong bối cảnh phát hiện nhanh P. aeruginosa kháng thuốc, PCR được sử dụng để xác định sự hiện diện của các gen kháng thuốc trong mẫu bệnh phẩm. Điều này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

3.1. Nguyên Tắc Của Kỹ Thuật PCR

PCR dựa trên việc sử dụng enzyme DNA polymerase để sao chép một đoạn DNA mục tiêu. Quá trình này bao gồm các chu kỳ lặp đi lặp lại của ba giai đoạn: biến tính (denaturation), gắn mồi (annealing), và kéo dài (extension). Kết quả là, số lượng bản sao của đoạn DNA mục tiêu tăng lên theo cấp số nhân, cho phép phát hiện ngay cả khi số lượng vi khuẩn ban đầu rất thấp.

3.2. Ưu Điểm Của PCR Trong Chẩn Đoán

PCR có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Nó có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện chính xác các gen kháng thuốc. Thời gian thực hiện PCR ngắn hơn nhiều so với nuôi cấy, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán. PCR cũng có thể được sử dụng để phát hiện đồng thời nhiều gen kháng thuốc khác nhau (multiplex PCR).

3.3. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Kết Quả PCR

Kết quả PCR có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng DNA mẫu, thiết kế mồi PCR, điều kiện phản ứng PCR, và sự hiện diện của các chất ức chế PCR. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là rất quan trọng để đảm bảo kết quả PCR chính xác và đáng tin cậy.

IV. Nghiên Cứu PCR Phát Hiện Nhanh Kháng Sinh Nhóm β Lactam 60 ký tự

Nghiên cứu tập trung vào ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh P. aeruginosa kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam. Nhóm β-lactam là một trong những nhóm kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất, và sự kháng thuốc đối với nhóm này đang gia tăng. Nghiên cứu này khảo sát tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa kháng thuốc tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên và bước đầu ứng dụng PCR để phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng thuốc nhóm β-lactam.

4.1. Khảo Sát Tỷ Lệ Kháng Thuốc Tại Bệnh Viện

Nghiên cứu khảo sát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn P. aeruginosa kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015. Kết quả cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của P. aeruginosa đối với một số kháng sinh nhóm β-lactam là khá cao.

4.2. Phân Lập Vi Khuẩn P. aeruginosa Kháng Thuốc

Nghiên cứu tiến hành phân lập vi khuẩn P. aeruginosa kháng thuốc từ các mẫu bệnh phẩm thu thập được tại bệnh viện. Các chủng vi khuẩn phân lập được sau đó được sử dụng để thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh bằng kỹ thuật PCR.

4.3. Thử Nghiệm PCR Phát Hiện Nhanh

Nghiên cứu bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi khuẩn P. aeruginosa kháng thuốc nhóm β-lactam. Các cặp mồi PCR được thiết kế để khuếch đại các gen kháng thuốc đặc hiệu. Kết quả PCR cho thấy khả năng phát hiện nhanh và chính xác các chủng P. aeruginosa kháng thuốc.

V. Ứng Dụng và Triển Vọng Của PCR Trong Y Học 54 ký tự

Kỹ thuật PCR có ý nghĩa to lớn trong công tác điều trị và khám chữa bệnh. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề cho việc xây dựng bộ kit chẩn đoán nhanh P. aeruginosa kháng thuốc dựa trên kỹ thuật PCR. Kết quả nghiên cứu cung cấp góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh và đặc hiệu P. aeruginosa kháng thuốc, phục vụ cho việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Ý Nghĩa Khoa Học và Thực Tiễn

Nghiên cứu bước đầu xây dựng thành công một kỹ thuật PCR phát hiện P. aeruginosa kháng thuốc. Kỹ thuật này có thể được sử dụng để chẩn đoán nhanh và chính xác các trường hợp nhiễm P. aeruginosa kháng thuốc, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và hiệu quả.

5.2. Hướng Phát Triển Trong Tương Lai

Trong tương lai, kỹ thuật PCR có thể được phát triển và tối ưu hóa để phát hiện đồng thời nhiều gen kháng thuốc khác nhau, cũng như để định lượng số lượng vi khuẩn kháng thuốc trong mẫu bệnh phẩm. Điều này sẽ cung cấp thông tin chi tiết hơn về tình trạng nhiễm trùng và giúp bác sĩ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp nhất.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những tác nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện (HAIs), đặc biệt là viêm phổi bệnh viện, nhiễm trùng vết thương, vết mổ, vết bỏng và nhiễm khuẩn huyết nặng với tỷ lệ tử vong cao. Theo các dữ liệu dịch tễ học được tổng hợp trong khóa luận, tại Hoa Kỳ, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) ước tính mỗi năm có khoảng 51.000 ca nhiễm trùng liên quan đến P. aeruginosa, trong đó hơn 6.000 ca (13%) là đa kháng thuốc và dẫn đến khoảng 400 ca tử vong. Tại Việt Nam, khảo sát tại 36 bệnh viện phía Bắc ghi nhận 7,8% bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn bệnh viện, trong đó P. aeruginosa chiếm 31,5% nguyên nhân chính; các nghiên cứu tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội (Việt Đức, Xanh Pôn, 108, 103) cũng chỉ ra trực trùng mủ xanh đề kháng rất cao với nhiều kháng sinh thông dụng như Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%), Gentamicin (54%).

Phương pháp chẩn đoán vi sinh truyền thống hiện nay chủ yếu dựa trên nuôi cấy phân lập trên môi trường thạch, kết hợp thử nghiệm sinh hóa và làm kháng sinh đồ. Quy trình này đòi hỏi thời gian kéo dài từ 4 đến 6 ngày mới cho kết quả hoàn chỉnh, dẫn đến sự chậm trễ trong việc đưa ra phác đồ điều trị kháng sinh thích hợp, làm tăng chi phí điều trị và nguy cơ lây lan các chủng vi khuẩn đa kháng trong môi trường bệnh viện. Trước thực tiễn đó, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử như phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn và các gene chỉ thị kháng thuốc mang tính cấp thiết.

Khóa luận được thực hiện với các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm $\beta$-lactam bằng kỹ thuật PCR.
2. Yêu cầu/nhiệm vụ nghiên cứu:
   • Khảo sát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên.
   • Phân lập và xác định kiểu hình đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa thu thập được.
   • Ứng dụng kỹ thuật PCR và multiplex PCR để định danh loài và phát hiện các gene quy định tính kháng kháng sinh nhóm $\beta$-lactam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc phân lập từ các bệnh phẩm (nước tiểu, mủ, dịch mũi họng) của bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên.
• Phạm vi không gian: Khoa Vi sinh vật – Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên và Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận kết hợp đồng thời phương pháp vi sinh học lâm sàng chuẩn thức và các kỹ thuật sinh học phân tử để đối chiếu giữa kiểu hình kháng thuốc (phenotype) và kiểu gene kháng thuốc (genotype).

Khung lý thuyết và cơ chế sinh học

• Đặc điểm vi sinh vật: Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí, có khả năng hình thành lớp màng sinh học (biofilm) cấu tạo từ polysaccharide alginate (mannuronic acid và glucuronic acid), sở hữu protein F màng ngoài làm giảm tính thấm chọn lọc.
• Cơ chế kháng $\beta$-lactam: Vi khuẩn vô hiệu hóa kháng sinh qua 4 cơ chế chính:
  1. Sinh enzyme phân hủy: Các nhóm enzyme AmpC cephalosporinase, $\beta$-lactamase phổ rộng (ESBL), penicillinase (PSE, CARB), enzyme nhóm OXA và đặc biệt là metallo $\beta$-lactamase (MBL) chứa ion kẽm có khả năng thủy phân cả carbapenem và penicillin. Khóa luận tập trung vào 2 họ gene mã hóa metallo $\beta$-lactamase phổ biến là blaIMP và blaVIM.
  2. Đột biến hoặc mất kênh porin OprD: Làm giảm khả năng xâm nhập của kháng sinh nhóm carbapenem qua màng ngoài.
  3. Hệ thống bơm tống thuốc (efflux pumps): Các bơm đa kháng phụ thuộc màng như MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexXY.
  4. Biến đổi protein đích gắn penicillin (PBPs).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp phân lập và định danh vi sinh:
   • Tiến hành nhuộm soi Gram sơ bộ từ bệnh phẩm.
   • Nuôi cấy ria 3 vùng trên thạch máu, thạch chocolate hoặc pha loãng đối với mẫu nước tiểu ($10^{-1}, 10^{-2}$), ủ ấm ở 37°C trong 18–24 giờ.
   • Xác định đặc tính sinh vật hóa học thông qua bộ kit 10 chỉ thị theo hướng dẫn xét nghiệm vi sinh lâm sàng của Phạm Hùng Vân (2006): phản ứng oxidase, môi trường Citrate Simmons, thạch Kligler ($H_2S$, lên men glucose/lactose), thạch Mannitol, thạch mềm kiểm tra tính di động, môi trường Ure-Indol, môi trường Clarklubs (Methyl Red và Voges-Proskauer), môi trường LDC, ADH, ODC.
2. Phương pháp xác định kháng sinh đồ: Sử dụng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch Mueller-Hinton (kỹ thuật Kirby-Bauer) theo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI, 2010), đánh giá đường kính vòng vô khuẩn theo 3 mức độ: Nhạy cảm (S), Trung gian (I), Kháng (R) đối với 25 loại kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau.
3. Phương pháp tách chiết và kiểm tra DNA:
   • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp biến tính CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) kết hợp hỗn hợp dung môi hữu cơ CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol, tỷ lệ 24:1 v/v) và kết tủa bằng Isopropanol, rửa lại bằng ethanol 70%, hòa tan trong đệm TE 1X (Wilson và cộng sự, 1992).
   • Kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA bằng máy đo mật độ quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm (tiêu chuẩn dung dịch DNA tinh sạch: tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$ đạt từ 1,8 đến 2,0).
4. Phương pháp PCR và Multiplex PCR:
   • Định danh loài P. aeruginosa bằng phản ứng PCR đơn với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gene oprL (mã hóa protein màng ngoài).
   • Phát hiện gene kháng metallo $\beta$-lactamase bằng kỹ thuật Multiplex PCR sử dụng đồng thời 2 cặp mồi đặc hiệu cho gene blaIMP và blaVIM.
   • Thành phần phản ứng 25 $\mu$l: $10\times$ PCR buffer (2,5 $\mu$l), dNTPs 2,5 mM (3 $\mu$l), mỗi mồi nồng độ 10 $\mu$M (1 $\mu$l), Taq DNA polymerase 5 U/$\mu$l (0,2 $\mu$l), DNA khuôn (3 $\mu$l), nước khử ion vô trùng $dH_2O$ (13,3 $\mu$l).
   • Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm (Biến tính: 95°C trong 30 giây $\rightarrow$ Bắt cặp mồi: 64°C trong 30 giây $\rightarrow$ Kéo dài: 72°C trong 30 giây); Kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút; giữ mẫu ở 4°C.
   • Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1,5% – 2,5% nhuộm Ethidium bromide trong đệm 0,5X TAE, đọc kết quả trên máy soi gel tử ngoại.

Tên cặp mồi	Trình tự nucleotide ($5' \rightarrow 3'$)	Nhiệt độ nóng chảy $T_m$ (°C)	Kích thước sản phẩm PCR (bp)	Mục đích sử dụng
OPRLF OPRLR	ATGGAAATGCTGAAATTCGG CTTCTTCAGCTCGACGCGAC	60 66	483	Định danh loài P. aeruginosa
blaIMPF blaIMPR	GTTTGAAGAAGTTAACGGGTGG ATAATTTGGCGGACTTTGGC	63 62	459	Phát hiện gene kháng blaIMP
blaVIMF blaVIMR	TGGTGTTTGGTCGCATATCG GAGCAAGTCTAGACCGCCCG	64 68	595	Phát hiện gene kháng blaVIM

---

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Mở đầu

Tác giả nêu bật tính cấp bách của nhiễm khuẩn bệnh viện do trực trùng mủ xanh gây ra trong bối cảnh tỷ lệ đề kháng kháng sinh gia tăng nhanh chóng. Luận văn chỉ rõ nhược điểm tốn nhiều thời gian (4–6 ngày) của quy trình chẩn đoán vi sinh truyền thống và đặt ra mục tiêu xây dựng quy trình phân tích phân tử bằng kỹ thuật PCR nhằm rút ngắn thời gian phát hiện vi khuẩn P. aeruginosa kháng kháng sinh nhóm $\beta$-lactam, phục vụ kịp thời công tác điều trị lâm sàng.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về lịch sử phân loại, đặc điểm hình thái học, cấu trúc sinh học phân tử của P. aeruginosa. Tác giả hệ thống hóa các cơ chế đề kháng thuốc kháng sinh chính ở vi khuẩn Gram âm, phân loại chi tiết các nhóm enzyme $\beta$-lactamase (AmpC, ESBL, Penicillinase, OXA-type, Carbapenemase và Metallo $\beta$-lactamase họ IMP, VIM, SPM, GIM) cùng cơ chế giảm tính thấm porin OprD và bơm đẩy chủ động (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexXY). Chương này cũng so sánh nguyên lý, ưu điểm và giới hạn của 3 phương pháp phát hiện kháng thuốc: kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên đĩa thạch, phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và kỹ thuật PCR.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết toàn bộ vật liệu nghiên cứu, hóa chất (Sigma, Fermentas), thiết bị chuyên dụng và quy trình thực nghiệm. Tác giả mô tả chi tiết quy trình lấy bệnh phẩm, phương pháp nhuộm Gram, quy trình cấy ria 3 vùng, phương pháp cấy định lượng nước tiểu, các bước đọc phản ứng sinh hóa trên 10 ống môi trường chuyên biệt, quy trình làm kháng sinh đồ Kirby-Bauer theo chuẩn CLSI, các bước tách chiết DNA bằng CTAB cải tiến, công thức định lượng DNA dựa trên quang phổ $OD_{260}$ và thiết lập chu trình nhiệt của phản ứng PCR/multiplex PCR.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả tập trung phân tích 3 nội dung thực nghiệm trọng tâm:

1. Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh trên bệnh nhân lâm sàng: Phân tích dữ liệu từ 15 chủng P. aeruginosa thu thập từ hồ sơ bệnh án và phân lập thực tế tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên đối với 25 loại kháng sinh. Kết quả cho thấy 100% chủng khảo sát kháng ít nhất một loại kháng sinh, mức độ đa kháng diễn ra nghiêm trọng.

Nhóm tỷ lệ kháng	Tên kháng sinh	Số chủng kháng / Tổng số ($n=15$)	Tỷ lệ kháng (%)
Rất cao ($\ge 80%$)	Chloramphenicol (C) Rifampicine (RP) Clindamyxin (CD) Neomycin (NE) Clarithromycin (CLA) Pefloxacine (PEF)	14 14 13 13 12 12	93,33% 93,33% 86,67% 86,67% 80,00% 80,00%
Cao ($50% - 79%$)	Cefalexin (CL) Amoxicillin + A.clavulanic (AML) Doxycyline (DO) Norfloxacine (NOR) Tobramyxin (TOB) Ceftriaxon (CRO)	11 10 10 9 9 8	73,33% 66,67% 66,67% 60,00% 60,00% 53,33%
Trung bình ($30% - 49%$)	Amoxicillin (A) Gentamycine (GM) Metronidazole (MZ) Netilmycine (NET) Cotrimoxazol (TS) Spectinomycin (SPC) Ciprofloxacine (CIP)	7 7 7 7 6 6 5	46,67% 46,67% 46,67% 46,67% 40,00% 40,00% 33,33%
Thấp ($< 30%$)	Ceftazidime (CAZ) Nitrofurantoin (F) Cephalothin (KF) Piperacillin (PIP) Ampicillin (AP) Cefoxitin (FOX)	4 4 3 3 2 2	26,67% 26,67% 20,00% 20,00% 13,33% 13,33%

2. Kết quả phân lập và kiểu hình của 9 chủng vi khuẩn: Nghiên cứu phân lập trực tiếp được 9 chủng vi khuẩn lâm sàng (ký hiệu từ P1 đến P9). Kiểu hình kháng sinh đồ cho thấy:

   • 1 chủng kháng 7 loại kháng sinh (chủng P6).
   • 1 chủng kháng 11 loại kháng sinh (chủng P7).
   • 2 chủng kháng 13 loại kháng sinh (chủng P1, P3).
   • 4 chủng kháng 14 loại kháng sinh (chủng P2, P5, P8, P9).
   • 1 chủng kháng 18 loại kháng sinh (chủng P4).
   • 100% chủng (9/9) kháng Clarithromycin, Clindamycin và Chloramphenicol; 8/9 chủng kháng Cefalexin và Neomycin. Ngược lại, Cotrimoxazol và Piperacillin có hiệu lực tốt nhất với 8/9 chủng còn mẫn cảm.

3. Phát hiện nhanh bằng kỹ thuật sinh học phân tử:

   • Tách chiết DNA: Đạt nồng độ từ 9,0 ng/$\mu$l (chủng P3) đến 19,1 ng/$\mu$l (chủng P8), tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$ nằm trong khoảng từ 1,80 đến 1,91 đảm bảo độ tinh sạch phục vụ phản ứng PCR.
   • Định danh gene oprL: 9/9 mẫu (100%) xuất hiện một băng DNA duy nhất, rõ nét ở kích thước 483 bp khi điện di sản phẩm PCR với cặp mồi OPRLF-OPRLR, mẫu kiểm chứng âm không lên băng, khẳng định chính xác cả 9 chủng phân lập đều là P. aeruginosa.
   • Phát hiện gene kháng metallo $\beta$-lactamase: Phản ứng multiplex PCR với 2 cặp mồi blaIMP và blaVIM cho thấy 4/9 chủng (P1, P3, P7, P8) xuất hiện vạch sản phẩm kích thước 459 bp đặc thù của họ gene blaIMP. Không có chủng nào mang gene blaVIM (595 bp).

Ký hiệu chủng	Nồng độ DNA tách chiết (ng/$\mu$l)	Tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$	Sản phẩm PCR định danh oprL (483 bp)	Mang gene blaIMP (459 bp)	Mang gene blaVIM (595 bp)	Kiểu hình kháng nhóm $\beta$-lactam
P1	18,5	1,83	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Kháng (+)
P2	13,5	1,87	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng (+)
P3	9,0	1,89	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Kháng (+)
P4	9,7	1,82	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng (+)
P5	10,2	1,81	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng (+)
P6	11,7	1,91	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Nhạy (-)
P7	18,0	1,84	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Kháng (+)
P8	19,1	1,90	Dương tính (+)	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Kháng (+)
P9	15,3	1,80	Dương tính (+)	Âm tính (-)	Âm tính (-)	Kháng (+)

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả chính về mức độ kháng thuốc của các chủng thu thập tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên, xác nhận tính khả thi của cặp mồi oprL trong định danh loài và đánh giá mức độ tương quan giữa gene blaIMP với kiểu hình kháng kháng sinh nhóm $\beta$-lactam. Đề xuất các nghiên cứu tiếp theo để mở rộng dải mồi và tối ưu hóa quy trình xét nghiệm nhanh.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

• Khảo sát xác định tình trạng đa kháng thuốc nghiêm trọng của P. aeruginosa tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên, với tỷ lệ kháng Chloramphenicol và Rifampicine đạt 93,33%, Clindamycin và Neomycin đạt 86,67%, trong khi các kháng sinh còn tỷ lệ nhạy cảm tương đối cao là Piperacillin (kháng 20,00%), Ampicillin và Cefoxitin (kháng 13,33%).
• Phân lập thành công 9 chủng P. aeruginosa lâm sàng, trong đó có chủng P4 kháng tới 18/25 loại kháng sinh thử nghiệm.
• Thiết lập thành công quy trình tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB cho nồng độ đạt từ 9,0 đến 19,1 ng/$\mu$l với tỷ số tinh sạch $OD_{260}/OD_{280}$ đạt 1,80 – 1,91.
• Chứng minh cặp mồi OPRLF-OPRLR định danh chính xác 100% (9/9 chủng) trực trùng mủ xanh qua việc khuếch đại đặc hiệu đoạn gene oprL kích thước 483 bp.
• Xác định được sự hiện diện của gene kháng metallo $\beta$-lactamase họ blaIMP (459 bp) trên 4 chủng (P1, P3, P7, P8), chiếm tỷ lệ 44,44% tổng số chủng phân lập và chiếm 50,00% trong tổng số 8 chủng có kiểu hình kháng $\beta$-lactam. Không phát hiện thấy sự có mặt của gene blaVIM.

So sánh với các nghiên cứu trước

Kết quả phát hiện gene kháng metallo $\beta$-lactamase bằng kỹ thuật PCR trong khóa luận (đạt 44,44% tổng số chủng và 50,00% số chủng kháng $\beta$-lactam) có sự tương đồng chặt chẽ với công bố của Aghamiri và cộng sự (2014) trên 216 chủng P. aeruginosa kháng $\beta$-lactam (ghi nhận 41,67% chủng mang gene MBL, trong đó họ blaIMP chiếm ưu thế với 32,41% và họ blaVIM chiếm 9,26%). Sự tương đồng này khẳng định blaIMP là một trong những chỉ thị di truyền quan trọng quy định tính kháng $\beta$-lactam của trực trùng mủ xanh tại khu vực nghiên cứu.

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Xây dựng thành công quy trình sinh học phân tử bước đầu cho phép định danh loài và phát hiện gene kháng thuốc nhanh chóng, rút ngắn đáng kể thời gian chẩn đoán so với phương pháp nuôi cấy sinh hóa truyền thống (từ 4–6 ngày xuống còn vài giờ).
• Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm quan trọng làm tiền đề cho việc nghiên cứu, phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh P. aeruginosa đa kháng thuốc phục vụ trực tiếp công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Nghiên cứu mới chỉ tập trung phân tích 2 họ gene mã hóa metallo $\beta$-lactamase (blaIMP và blaVIM), do đó kỹ thuật PCR chưa giải thích được cơ chế đề kháng trên 4 chủng vi khuẩn còn lại có kiểu hình kháng $\beta$-lactam nhưng âm tính với cả 2 gene trên (độ nhạy phát hiện kiểu hình kháng $\beta$-lactam đạt 50,00%).
• Số lượng chủng vi khuẩn phân lập và thử nghiệm sinh học phân tử còn tương đối nhỏ ($n=9$), thời gian khảo sát thực nghiệm giới hạn trong 6 tháng (12/2014 – 05/2015) tại một cơ sở bệnh viện.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Bổ sung các cặp mồi khuếch đại các họ gene metallo $\beta$-lactamase khác như blaSPM, blaGIM, blaSIM, cũng như các nhóm gene $\beta$-lactamase khác (AmpC, ESBL họ TEM, SHV, CTX-M, OXA-type).
• Nghiên cứu tích hợp các chỉ thị phân tử phát hiện cơ chế đề kháng do đột biến giảm biểu hiện kênh porin OprD hoặc tăng cường hoạt động của các hệ thống bơm tống thuốc (MexAB-OprM, MexXY).
• Mở rộng quy mô khảo sát trên số lượng mẫu bệnh phẩm lớn hơn và tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR nhiều tác tử hướng tới sản xuất bộ kit chẩn đoán thương mại hoàn chỉnh.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:

• Sinh viên và học viên chuyên ngành: Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Dược học và Kỹ thuật xét nghiệm y học có thể tham khảo quy trình tách chiết DNA từ vi khuẩn Gram âm bằng phương pháp CTAB, thông số thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR/Multiplex PCR, cũng như quy trình định lượng quang phổ và điện di gel agarose.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm và cán bộ y tế: Sử dụng làm tài liệu tham khảo về quy trình thực hành nuôi cấy, thử nghiệm sinh hóa 10 chỉ thị và kỹ thuật kháng sinh đồ đĩa giấy Kirby-Bauer theo tiêu chuẩn CLSI.
• Các nhóm nghiên cứu về kháng kháng sinh: Cung cấp số liệu thực tế về mức độ đề kháng kháng sinh và tỷ lệ lưu hành của gene blaIMP trên các chủng P. aeruginosa lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao gene oprL được lựa chọn làm chỉ thị phân tử để định danh loài Pseudomonas aeruginosa?

Gene oprL mã hóa cho một loại peptidoglycan-associated lipoprotein nằm ở màng ngoài của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa. Trình tự gene này mang tính bảo tồn cao và đặc hiệu tuyệt đối cho loài P. aeruginosa, không bị trùng lặp với các loài vi khuẩn Gram âm khác. Trong nghiên cứu này, việc sử dụng cặp mồi OPRLF-OPRLR khuếch đại đoạn gene oprL kích thước 483 bp đã định danh chính xác 100% cả 9 chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân.

2. Sự khác biệt giữa tỷ lệ kháng $\beta$-lactam theo kiểu hình và kiểu gene trong nghiên cứu này là gì?

Kiểu hình kháng kháng sinh nhóm $\beta$-lactam (xác định bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán) đạt 88,89% (8/9 chủng kháng), trong khi tỷ lệ phát hiện gene kháng metallo $\beta$-lactamase (blaIMP/blaVIM) bằng kỹ thuật PCR chỉ đạt 44,44% (4/9 chủng dương tính với blaIMP). Điều này cho thấy độ chính xác trong việc phát hiện kiểu hình kháng $\beta$-lactam qua 2 họ gene trên đạt 50,00% (4/8 chủng). 4 chủng kháng kiểu hình còn lại không mang blaIMP hay blaVIM mà đề kháng thông qua các cơ chế khác như mang gene MBL khác (blaSPM, blaGIM), sinh enzyme AmpC, ESBL, đột biến mất porin OprD hoặc cơ chế bơm tống thuốc chủ động.

3. Quy trình tách chiết DNA bằng CTAB trong khóa luận đạt hiệu quả và độ tinh sạch ra sao?

Phương pháp tách chiết sử dụng đệm CTAB kết hợp dung môi CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol 24:1) và kết tủa bằng Isopropanol đã thu nhận được DNA tổng số của cả 9 chủng vi khuẩn với nồng độ dao động từ 9,0 ng/$\mu$l đến 19,1 ng/$\mu$l. Tỷ số quang phổ $OD_{260}/OD_{280}$ của 9 mẫu đạt từ 1,80 đến 1,91 (nằm trong giới hạn chuẩn 1,8 – 2,0), chứng minh mẫu DNA hoàn toàn sạch protein và RNA tạp, đáp ứng yêu cầu cho phản ứng PCR.

4. Kết quả phản ứng multiplex PCR cho thấy những họ gene kháng metallo $\beta$-lactamase nào xuất hiện?

Phản ứng multiplex PCR sử dụng đồng thời 2 cặp mồi blaIMPF-blaIMPR và blaVIMF-blaVIMR chỉ phát hiện duy nhất một băng sản phẩm DNA kích thước 459 bp trên 4 chủng vi khuẩn (P1, P3, P7, P8), tương ứng với gene kháng metallo $\beta$-lactamase họ IMP (blaIMP). Không có chủng nào xuất hiện băng sản phẩm kích thước 595 bp của họ gene blaVIM.

5. Những loại kháng sinh nào bị vi khuẩn đề kháng cao nhất và loại nào còn hiệu lực điều trị tốt nhất?

Trong tổng số 25 loại kháng sinh khảo sát, các kháng sinh có tỷ lệ bị đề kháng cao nhất gồm Chloramphenicol (93,33%), Rifampicine (93,33%), Clindamycin (86,67%), Neomycin (86,67%), Clarithromycin (80,00%) và Pefloxacine (80,00%). Ngược lại, các kháng sinh có tỷ lệ vi khuẩn mẫn cảm cao nhất, có thể ưu tiên trong điều trị gồm Cotrimoxazol và Piperacillin (8/9 chủng phân lập còn nhạy cảm), tiếp đến là Cefoxitin và Ampicillin (tỷ lệ kháng chỉ chiếm 13,33%).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Tuấn Anh đã khảo sát thành công thực trạng đa kháng kháng sinh nghiêm trọng của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập từ bệnh nhân tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên. Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả tuyệt đối của kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi khuếch đại gene oprL (483 bp) trong định danh nhanh loài trực trùng mủ xanh. Đồng thời, phản ứng multiplex PCR bước đầu phát hiện chính xác gene kháng metallo $\beta$-lactamase họ blaIMP (459 bp) trên 50,00% các chủng có kiểu hình kháng $\beta$-lactam, đặt nền tảng khoa học và kỹ thuật quan trọng cho việc phát triển các bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán nhanh vi khuẩn kháng thuốc trong y học lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Chúng gây nên những bệnh lí với nhiều mức độ khác nhau như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn huyết nặng với tỉ lệ tử vong khá cao. Tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa) đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam.

Cùng với sự gia tăng về tỉ lệ nhiễm khuẩn khả năng kháng kháng sinh cũng tăng cao. Theo báo cáo của CDC ước tính rằng mỗi năm ở Hoa Kì có hơn hai triệu người mắc bệnh với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh thì có ít nhất 23.000 người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P. Trong các ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa có hơn 6000 (13%) là đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (Fatima A.

Theo kết quả một nghiên cứu khác (2013), trong 112 mẫu P. aeruginosa phân lập được từ bệnh nhân điều trị bỏng tại một bệnh viện năm 2012 cho thấy tỷ lệ kháng tương đối cao như Gentamicine (59,6%), Piperacillin (36,8%) và Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N. Ở Việt Nam, một nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc từ Trung Ương đến địa phương trong năm 2006 – 2007 đã công bố có tới 7,8% bệnh nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs). Có 3 loại nhiễm khuẩn bệnh viện chính gồm viêm phổi, nhiễm khuẩn vết mổ và nhiễm khuẩn tiêu hóa trong đó P.

aeruginosa là nguyên nhân chính (chiếm 31,5%) (Nguyễn Văn Hùng và cs, 2008) [8]. Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội: Việt Đức, 2 Xanh Pôn, Bệnh viện 108 và Bệnh viện 103 từ năm 2005 – 2008 cho thấy P. aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng sinh như Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamicin (54%) (Bùi Khắc Hậu và cs, 2008) [6]. Tình hình đề kháng đa kháng sinh của P.

aeruginosa được ghi nhận trong những nghiên cứu trên cho thấy sự gia tăng về tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện do P. aeruginosa cũng như khả năng kháng lại kháng sinh của vi khuẩn này gây nên, làm tăng tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong và tăng chi phí điều trị. aeruginosa kháng thuốc phương pháp thường được sử dụng hiện nay là nuôi cấy trên môi trường thạch kết hợp với các thử nghiệm hóa sinh và làm kháng sinh đồ. Đây là phương pháp phức tạp và tốn nhiều thời gian, chậm cho kết quả (4 - 6 ngày).

Sự phát hiện chậm P. aeruginosa kháng thuốc là một trong những nguyên nhân làm chậm hướng điều trị và góp phần làm giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của nhiều người. Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gene đặc hiệu cho tính kháng thuốc của các loài vi sinh vật đã được hiểu biết ngày càng đầy đủ. Nhờ đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu.

Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR, ELISA, DNA arrays… PCR là kỹ thuật cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh kháng thuốc chỉ trong một phép phân tích. Đây là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán. Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu 3 phƣơng pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam bằng kỹ thuật PCR”. Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức độ kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa tại các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng các thuốc kháng sinh thuộc nhóm β- lactam.

Mục tiêu và yêu cầu của đề tài - Mục tiêu của đề tài Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR. - Yêu cầu của đề tài + Khảo sát được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên. + Phân lập được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc. + Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR.

Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa trong khoa học Bước đầu xây dựng thành công một kỹ thuật PCR phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc. - Ý nghĩa trong thực tiễn + Phục vụ công tác điều trị, khám chữa bệnh. Tạo tiền đề cho việc xây dựng bộ kit chẩn đoán nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc dựa trên kỹ thuật PCR. 4 + Kết quả nghiên cứu cung cấp góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh và đặc hiệu Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc, phục vụ cho việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 2. Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Năm 1872, P. aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên với tên gọi là Bacterium aeruginosa (Lê Huy Chính và cs, 2001) [3].

Năm 1900, Migula đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn này vào chi Pseudomonas; từ đó vi khuẩn này mang tên Pseudomonas aeruginosa (Lê Huy Chính và cs, 2001) [3]. Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P. aeruginosa gây ra tại Viện Bỏng Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P. aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) (Nguyễn Quốc Định và cs, 1999) [4].

Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam thì P. aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% (Lê Đăng Hà và cs, 2003) [5]. Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y) đã nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P. aeruginosa đa giá, tinh chế và đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng (Lê Thu Hồng và cs, 2002) [7].

Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) của Hoàng Kim Tuyến và cộng sự đã chứng minh được P. aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi tại bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) (Hoàng Kim Tuyến và cs, 2006) [13]. Đặc điểm sinh học - Hình thái và cấu tạo Trực khuẩn Gram âm, hình que, thẳng, hơi cong, hai đầu tròn, kích thước 0.5 - 1μm x 1 - 5 μm, đứng một mình hay thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn. Di động nhờ tiên mao đơn cực, ít khi có vỏ, không sinh bào tử (Balcht và cs, 1994) [18].

- Cấu trúc tế bào + Vỏ Polysaccharide Pseudomonas aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là alginate. Các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên cũng như tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ. + Màng sinh chất: Hầu hết các chủng P. aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein trên bề mặt màng sinh chất (pr F).

Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất qua lại màng trong giới hạn khoảng 500Da. Vì vậy, nó làm giảm tính thấm của màng, ngăn không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P. aeruginosa có khả năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh (Mutharia L. + Tiên mao: Pseudomonas aeruginosa có một tiên mao duy nhất ở một cực, tiên mao giúp cho vi khuẩn di động.

Về cấu tạo hoá học, tiên mao được cấu tạo bởi các protein gọi là Flagellin. Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên gọi là kháng nguyên lông H. + Tiêm mao: 7 Là những sợi lông rất mảnh, dài khoảng 6nm, mọc quanh bề mặt tế bào. Có vai trò giúp cho vi khuẩn bám vào môi trường lỏng hay bề mặt biểu mô của tế bào vật chủ trong quá trình lây nhiễm.

+ Nhân: Vật chất di truyền của P. aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tại trong nguyên sinh chất. Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa khoảng 65% là (Guanine + Cytosine). aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài nhân đó là các plasmid.

Các plasmid chứa các đoạn gene như TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra enzyme β-lactamase làm phá huỷ vòng β-lactam của chất kháng sinh dẫn tới P. aeruginosa kháng lại với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này. Do vậy mà rất khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P. aeruginosa gây ra.

- Tính chất nuôi cấy Trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa) mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang nhưng thích hợp nhất là môi trường SS (shigella salmonella). Nhiệt độ thích hợp 37oC nhưng phát triển được ở nhiệt đố 5 - 42oC, pH thích hợp 7,2 - 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 (Đái Duy Ban và cs, 2009) [1]. Trên môi trường đặc: Có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi (khuẩn lạc S).

Một loại xù xì bờ không đều (khuẩn lạc R), đôi khi có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất. Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai.

Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới Lateef A. (2005), khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P.

aeruginosa được tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông, nước giếng và nước máy). aeruginosa phân lập từ đất đề kháng với 5 loại kháng sinh. Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin, tetracycline, streptomycin, gentamicin).