Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ kỹ thuật chuyên ngành Công nghệ Sinh học (mã số: 60420201) của nghiên cứu sinh Nguyễn Sĩ Tuấn, thực hiện tại Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Thúy Hương và TS. Phạm Hùng Vân, có tiêu đề: "Nghiên cứu tính kháng carbapenem ở mức độ phân tử của Acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai" (năm 2019).
Tính cấp thiết của luận án xuất phát từ thực trạng Acinetobacter baumannii là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện (nhiễm khuẩn huyết, vết thương, viêm phổi bệnh viện) tại Việt Nam và trên thế giới. Năm 2017, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp A. baumannii đề kháng carbapenem vào nhóm ưu tiên số 1 cần nghiên cứu phát triển thuốc mới. Tại Việt Nam, vi khuẩn này tích lũy mức độ kháng thuốc rất cao, làm vô hiệu hóa hầu hết các kháng sinh thông thường kể cả nhóm carbapenem vốn là lựa chọn điều trị cuối cùng. Trong khi đó, các nghiên cứu đánh giá đầy đủ tác dụng phối hợp kháng sinh in-vitro đối với các chủng mang gen carbapenemase còn thiếu hụt, đồng thời chưa có nhiều nghiên cứu phân tích toàn diện hệ gen, yếu tố độc lực, prophage và pan-genome của các chủng lâm sàng tại địa phương bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của luận án được đánh số cụ thể như sau:
- Đặc điểm kháng kháng sinh, tỷ lệ các gen liên quan đến kháng carbapenem và tác dụng diệt khuẩn in-vitro của các phối hợp kháng sinh lên A. baumannii:
- Xác định tỷ lệ đề kháng kháng sinh; nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của colistin, meropenem, rifampicin, tigecycline và tỷ lệ hiệp đồng, cộng lực khi phối hợp meropenem/colistin, meropenem/rifampicin, tigecycline/colistin lên các chủng A. baumannii đề kháng carbapenem.
- So sánh tác dụng hiệp đồng và cộng lực của 3 tổ hợp kháng sinh đối với A. baumannii.
- Xác định tỷ lệ gen bla<sub>NDM-1</sub>, gen mã hóa ISAba1 và các gen mã hóa oxacillinase (bla<sub>OXA</sub>) thường gặp có liên quan đến tính kháng carbapenem ở A. baumannii đề kháng carbapenem.
- Xác định mối tương quan giữa các gen liên quan tính kháng carbapenem với tác dụng hiệp đồng và cộng lực của mỗi tổ hợp kháng sinh lên A. baumannii.
- Về phân tích đặc điểm hệ gen in-silico các chủng A. baumannii đặc trưng bằng phương pháp Tin – Sinh học:
- a. Xác định đặc điểm hệ gen của các chủng A. baumannii đặc trưng.
- b. Xây dựng cây phát sinh loài của các chủng A. baumannii đặc trưng.
- c. Xác định gen gây độc lực, gen đề kháng kháng sinh in-silico, các trình tự chèn, phân tích các gen ortholog và pan-genome của các chủng A. baumannii đặc trưng.
- Phân lập các gen đề kháng kháng sinh từ kết quả in-silico ở các chủng A. baumannii đặc trưng bằng phương pháp thực nghiệm Sinh học Phân tử:
- a. Khuếch đại các gen kháng thuốc bằng phương pháp PCR.
- b. Xác nhận trình tự các gen kháng thuốc bằng phương pháp Sanger cải tiến.
Đối tượng nghiên cứu gồm 105 chủng A. baumannii đề kháng carbapenem phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng và 2 chủng mang đa gen kháng đặc trưng được lựa chọn để giải trình tự hệ gen (ký hiệu DMS06669 và DMS06670). Phạm vi không gian là Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai; thời gian thu thập mẫu từ tháng 1 năm 2013 đến tháng 12 năm 2017.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Trong phần tổng quan, tác giả đã điểm lại các công trình và cột mốc nghiên cứu quan trọng:
- Báo cáo phân loại của WHO (2017) xác lập danh mục 12 họ vi khuẩn ưu tiên, trong đó A. baumannii kháng carbapenem đứng đầu nhóm ưu tiên quan trọng nhất.
- Higgins và cộng sự (2009) nghiên cứu thực nghiệm biến nạp gen bla<sub>OXA-58</sub> vào dòng A. baumannii tham chiếu, chỉ ra sự gia tăng biểu hiện của hệ thống bơm thải AdeABC làm tăng mức độ đề kháng trên lâm sàng.
- Các nghiên cứu dịch tễ về đợt bùng phát các chủng A. baumannii clade B có độc lực cao phân lập từ thương binh tham chiến tại Iraq và Afghanistan.
- Các công trình phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler: lớp A (penicillinase, ESBL và KPC); lớp B (metallo-beta-lactamase như NDM-1 thủy phân hầu hết beta-lactam trừ aztreonam); lớp C (cephalosporinase mã hóa trên nhiễm sắc thể); lớp D (oxacillinase thủy phân carbapenem gồm OXA-51 nội tại và các nhóm mắc phải OXA-23, OXA-24/33/40, OXA-58, OXA-143, OXA-235).
- Nghiên cứu về vai trò của các yếu tố di truyền di động, đặc biệt là trình tự chèn ISAba1 đóng vai trò promoter kích hoạt hoặc làm biểu hiện vượt mức các gen kháng thuốc lân cận.
- Các công bố quốc tế và trong nước của nhóm tác giả (giai đoạn 2014–2017) trên Journal of Medical Microbiology, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, Tạp chí Y học Thực hành, và Tạp chí Truyền nhiễm Việt Nam.
Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là việc cung cấp dữ liệu vi sinh và sinh học phân tử hệ thống về các chủng A. baumannii đa kháng tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai; kiểm chứng thực nghiệm in-vitro hiệu quả của các mô hình phối hợp kháng sinh; và phân tích cấu trúc hệ gen, pan-genome cùng các gen kháng thuốc mới của các chủng đặc trưng mang đồng thời nhiều cơ chế kháng carbapenem.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án kết hợp giữa tiếp cận vi sinh lâm sàng thực nghiệm, sinh học phân tử và tin sinh học:
- Cơ sở lý thuyết: Hệ thống phân loại enzyme beta-lactamase của Ambler; cơ chế tác động và tương tác kháng sinh theo dược động học/dược lực học (PK/PD); lý thuyết về chỉ số nồng độ ức chế phân đoạn (FICI) để xác định kiểu tác dụng phối hợp (hiệp đồng, cộng lực, độc lập, đối kháng); cơ sở di truyền học vi khuẩn về đảo kháng thuốc, prophage, trình tự chèn (IS), phân nhóm cụm gen chỉnh hình (COG), và mô hình tiến hóa pan-genome (mô hình Power-law và hàm số mũ).
- Phương pháp vi sinh lâm sàng: Phân lập vi khuẩn bằng phương pháp cấy đàm; định danh loài và làm kháng sinh đồ bằng hệ thống máy tự động; xác định giá trị MIC của colistin, meropenem, rifampicin, tigecycline; thử nghiệm phối hợp kháng sinh bằng kỹ thuật hiệp đồng bàn cờ (checkerboard).
- Phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số; kỹ thuật multiplex PCR (PCR đa mồi) phát hiện các gen bla<sub>OXA-23</sub>, bla<sub>OXA-51</sub>, bla<sub>OXA-58</sub> và gen 16S-rRNA; kỹ thuật realtime PCR xác định bla<sub>NDM-1</sub>, bla<sub>KPC</sub> và ISAba1; điện di trên gel agarose; giải trình tự thế hệ mới (NGS) nền tảng Illumina; khuếch đại PCR và giải trình tự kiểm chứng Sanger cải tiến trên hệ thống ABI-3500.
- Phương pháp Tin – Sinh học (In-silico): Đánh giá chất lượng đoạn đọc (raw reads, clean reads); lắp ráp hệ gen dự thảo (scaffolds, chỉ số N50); phân tích phát sinh loài dựa trên độ tương đồng nucleotide trung bình (ANI) so sánh với dữ liệu KEGG; dự đoán xác suất gây bệnh và họ protein gây bệnh bằng PathogenFinder 1.1; xác định các vùng prophage bằng công cụ PHAST; khai thác gen kháng thuốc qua cơ sở dữ liệu ResFinder 1.18; phân tích các nhóm COG và tính toán pan-genome trên 23 hệ gen A. baumannii.
- Phương pháp thống kê: Sử dụng phép kiểm định McNemar để so sánh tỷ lệ tác dụng hiệp đồng và cộng lực giữa các tổ hợp kháng sinh.
- Nguồn dữ liệu: 105 chủng vi khuẩn lâm sàng thu thập tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai (2013–2017) và 21 hệ gen A. baumannii công bố trên cơ sở dữ liệu quốc tế.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Giới thiệu
Chương này trình bày tổng quan về vi khuẩn Acinetobacter baumannii, sinh bệnh học, và tình hình đề kháng kháng sinh. Tác giả tổng hợp các đặc điểm nhận diện giống Acinetobacter qua các thử nghiệm sinh hóa:
| Thử nghiệm sinh hóa |
A. baumannii |
A. lwoffii |
| Oxidase |
- |
- |
| Di động |
- |
- |
| Phát triển trên thạch MacConkey |
+ |
+ |
| Phát triển ở 42°C |
+ |
- |
| OF glucose |
+ |
- |
| Khử NO3 |
- |
- |
| Gelatin |
V |
V |
| Urea |
V |
V |
| Sinh sắc tố |
- |
- |
(Ghi chú: +: > 90% chủng dương tính; -: > 90% chủng âm tính; V: 11% - 89% chủng dương tính)
Chương 1 cũng phân tích chi tiết các cơ chế đề kháng carbapenem gồm: sự sản xuất enzyme carbapenemase lớp A (KPC), lớp B (metallo-beta-lactamase như NDM-1), lớp D (oxacillinase như OXA-23, OXA-51, OXA-58); cơ chế điều hòa biểu hiện gen nhờ các trình tự chèn ISAba; biến đổi tính thấm màng ngoài và hệ thống bơm thải chủ động. Tác giả điểm lại tình hình đề kháng tại khu vực Nam Á, Đông Nam Á và Việt Nam, đồng thời trình bày nguyên lý giải trình tự hệ gen thế hệ mới (NGS).
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 2 mô tả chi tiết thiết kế nghiên cứu trên 105 chủng A. baumannii kháng carbapenem tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai và phòng thí nghiệm Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM:
- Mô tả quy trình cấy đàm, định danh vi khuẩn và thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh tự động.
- Mô tả quy trình kỹ thuật hiệp đồng bàn cờ nhằm xác định chỉ số FICI cho 3 tổ hợp: meropenem/colistin, meropenem/rifampicin, và tigecycline/colistin.
- Quy trình tách chiết DNA, phản ứng multiplex PCR xác định nhóm gen bla<sub>OXA</sub>, realtime PCR xác định bla<sub>KPC</sub>, bla<sub>NDM-1</sub>, ISAba1.
- Quy trình giải trình tự toàn bộ hệ gen hai chủng đặc trưng DMS06669 và DMS06670 bằng công nghệ Illumina; các bước tin sinh học xử lý dữ liệu thô, lắp ráp scaffold, phân tích phát sinh loài ANI, phân tích prophage (PHAST), gen độc lực (PathogenFinder), gen kháng thuốc (ResFinder), nhóm trực giao COG và đường cong pan-genome.
- Phương pháp thiết kế mồi, thực hiện PCR và giải trình tự Sanger cải tiến để kiểm chứng thực nghiệm in-vitro các gen kháng thuốc dự đoán in-silico.
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và phân tích tin sinh học:
- Tỷ lệ đề kháng kháng sinh: 105 chủng A. baumannii kháng 100% với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, fluoroquinolone và aminoglycoside (kháng 100% gentamicin). Kháng sinh còn nhạy cảm tỷ lệ thấp gồm tobramycin (7,5%), amikacin (10,4%), và Bactrim (26,4%). Ba kháng sinh còn giữ được độ nhạy cảm cao là colistin (100%), tigecycline (99,1%), và rifampicin (59,5% theo phân bố MIC nhạy cảm).
- Phân bố giá trị MIC: 100% chủng nghiên cứu có MIC của meropenem đạt mức ≥ 32 µg/ml.
| Kháng sinh |
Giá trị MIC (µg/ml) và phân bố tần số / tỷ lệ (%) |
| Colistin |
0,5 µg/ml: 5 chủng (4,7%); 1,0 µg/ml: 87 chủng (82,1%); 2,0 µg/ml: 13 chủng (12,3%) |
| Meropenem |
32 µg/ml: 23 chủng (21,7%); 64 µg/ml: 64 chủng (60,4%); 128 µg/ml: 18 chủng (17,9%) |
| Rifampicin |
1,0 µg/ml: 2 chủng (1,9%); 2,0 µg/ml: 13 chủng (12,3%); 8,0 µg/ml: 33 chủng (31,1%); 16 µg/ml: 8 chủng (7,5%) |
| Tigecycline |
0,125 µg/ml: 2 chủng (1,9%); 0,25 µg/ml: 13 chủng (12,3%); 0,5 µg/ml: 48 chủng (45,3%); 1,0 µg/ml: 33 chủng (31,1%); 2,0 µg/ml: 8 chủng (7,5%); 8,0 µg/ml: 1 chủng (0,9%) |
- Tác dụng diệt khuẩn in-vitro của các phối hợp kháng sinh:
| Tổ hợp kháng sinh |
Hiệp đồng (n, %) |
Cộng lực (n, %) |
Độc lập (n, %) |
Đối kháng (n, %) |
Tổng tỷ lệ Hiệp đồng + Cộng lực (%) |
| Meropenem / Colistin |
45 (42,9%) |
54 (51,4%) |
6 (5,7%) |
0 (0,0%) |
94,3% |
| Meropenem / Rifampicin |
36 (34,3%) |
50 (47,6%) |
18 (17,1%) |
1 (1,0%) |
81,9% |
| Tigecycline / Colistin |
5 (4,4%) |
34 (31,8%) |
67 (63,8%) |
0 (0,0%) |
36,2% |
Kiểm định McNemar cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tác dụng hiệp đồng và cộng lực giữa các tổ hợp:
- Meropenem/colistin so với Meropenem/rifampicin: p = 0,011 (bác bỏ giả thuyết tương đương).
- Meropenem/colistin so với Tigecycline/colistin: p = 0,001 (bác bỏ giả thuyết tương đương).
- Meropenem/rifampicin so với Tigecycline/colistin: p = 0,001 (bác bỏ giả thuyết tương đương).
Tác giả ghi nhận nồng độ dưới MIC của colistin (ở mức 1,0 µg/ml chuyển 32,4% và ở mức 2,0 µg/ml chuyển 96,2%) và của rifampicin (ở mức 2,0 µg/ml chuyển 61% và ở mức 4,0 µg/ml chuyển 93,3%) có khả năng chuyển các chủng vi khuẩn từ không nhạy meropenem thành nhạy cảm (MIC meropenem < 8 µg/ml).
- Phân bố các gen kháng carbapenem:
| Gen kháng carbapenem |
Tần số (n = 105) |
Tỷ lệ (%) |
| bla<sub>OXA-51</sub> |
102 |
97,1% |
| ISAba1 |
98 |
93,3% |
| bla<sub>OXA-23</sub> |
83 |
79,0% |
| bla<sub>NDM-1</sub> |
14 |
13,3% |
| bla<sub>OXA-58</sub> |
8 |
7,6% |
| bla<sub>KPC</sub> |
0 |
0,0% |
Về sự tích lũy gen: có 80% chủng mang đồng thời 3 gen liên quan đến kháng carbapenem (trong đó 97,6% chứa ISAba1, 90,5% chứa bla<sub>OXA-23</sub>, và 88,1% mang bộ ba ISAba1 + bla<sub>OXA-23</sub> + bla<sub>OXA-51</sub>). Có 5 chủng (4,8%) mang đồng thời 4 gen kháng.
- Đặc điểm hệ gen chủng DMS06669 và DMS06670:
| Đặc điểm hệ gen |
Chủng DMS06669 |
Chủng DMS06670 |
| Số đoạn đọc thô (Raw reads) |
4.750.865 |
4.998.333 |
| Số đoạn đọc sạch (Clean reads) |
3.768.594 (79,31%) |
- |
| Kích thước hệ gen dự thảo (bp) |
4.369.281 (ước tính 4,2 Mb) |
3.860.520 (ước tính 3,8 Mb) |
| Số lượng Scaffolds |
24 |
16 |
| Chiều dài Scaffold N50 (bp) |
4.207.939 |
3.815.999 |
| Hàm lượng GC (%) |
38,94% |
- |
| Số trình tự mã hóa (CDS) |
4.101 |
3.643 |
| Số lượng tRNA / rRNA |
63 / 3 |
65 / 3 |
| Trình tự CRISPR |
2 |
3 |
| Số họ protein gây bệnh (PathogenFinder) |
632 |
622 |
| Xác suất là tác nhân gây bệnh ở người |
85,8% |
85,3% |
| Vùng prophage (PHAST) |
4 vùng (3 nguyên vẹn: 26,7; 37,3; 45,2 kb; 1 không nguyên vẹn: 25,3 kb) |
2 vùng không nguyên vẹn (21 kb và vùng 30 CDS) |
| Trình tự chèn (IS) |
20 IS |
17 IS |
Phân tích phát sinh loài ANI xếp chủng DMS06669 vào nhóm 6 chủng cùng với ATCC_17978, D1279779, ZW85-1, ab031, và SDF. Chủng DMS06670 nằm cùng một nhánh với LAC-4 và BJAB0715.
Khai thác in-silico bằng ResFinder 1.18:
- Chủng DMS06669 mang 18 gen kháng thuộc 8 lớp kháng sinh: aminoglycoside (aadA16, aadB, aadA1, rmtB), beta-lactam (bla<sub>VEB-7</sub>, bla<sub>OXA-10</sub>, bla<sub>OXA-58</sub>, bla<sub>ADC-25</sub>, bla<sub>NDM-1</sub>, bla<sub>OXA-64</sub>), phenicol (cmlA1, floR), sulphonamide (sul1), tetracycline (tet(39)), macrolide-lincosamide-streptogramin B (mph(E), msr(E)), rifampicin (ARR-3), trimethoprim (dfrA27). Gen bla<sub>OXA-64</sub> chưa từng công bố trước đó ở A. baumannii, đồng thời sự hiện diện đồng thời của bla<sub>NDM-1</sub> và bla<sub>OXA-58</sub> trên cùng một chủng vi khuẩn là ghi nhận chưa từng thấy trong các y văn trước đó.
- Chủng DMS06670 mang 9 gen kháng thuốc: aac(3)-IId, bla<sub>CARB-2</sub>, bla<sub>OXA-58</sub>, bla<sub>ADC-25</sub>, bla<sub>OXA-68</sub>, bla<sub>NDM-1</sub>, mph(E), msr(E), sul1. Trong đó, bla<sub>CARB-2</sub> là gen mới chưa từng được công bố trên A. baumannii.
Phân tích COG giữa 6 chủng (DMS06669, DMS06670, AYE, SDF, 1656-2, AB307-0294) chỉ ra 2.109 COG chung cốt lõi; DMS06669 chứa 573 singleton (18 COG duy nhất liên quan chức năng đáp ứng kháng sinh, nucleotidyltransferase, dị hóa kháng sinh); DMS06670 chứa 273 singleton (6 COG duy nhất liên quan dị hóa nicotin, chuyển hóa isoprenoid).
Phân tích pan-genome trên 23 hệ gen A. baumannii ghi nhận tổng số 15.883 gen. Đường cong pan-genome tuân theo mô hình Power-law (r² = 0,999, hệ số Bpan = 0,44), chứng minh A. baumannii có pan-genome "mở" với sự bổ sung thêm 211 gen mới khi mở rộng tập dữ liệu; đường cong core-genome giảm theo quy luật hàm mũ (r² = 0,964).
Thực nghiệm sinh học phân tử bằng PCR và Sanger cải tiến đã phân lập và xác nhận trình tự in-vitro 19 gen kháng thuốc từ kết quả in-silico của 2 chủng (trong tổng số các gen in-silico, duy nhất gen aac(3)-IId ở DMS06670 là không tìm được chủng đối chứng tương đồng để phân lập).
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Chương 4 đúc kết các kết quả đạt được về tỷ lệ kháng sinh đồ, mô hình hiệp đồng in-vitro, phân bố gen kháng carbapenem, đặc tính hệ gen NGS, và kết quả kiểm chứng gen kháng thuốc in-vitro. Phần kiến nghị đề xuất tiếp tục các hướng nghiên cứu sâu hơn trên mô hình động vật và khảo sát các yếu tố gây bệnh.
Kết quả và những đóng góp mới
Luận án tự đúc kết các đóng góp mới về mặt lý luận và thực tiễn như sau:
- Về tỷ lệ đề kháng kháng sinh: Cung cấp dữ liệu chi tiết về tính kháng thuốc của 105 chủng A. baumannii tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai. Bên cạnh việc xác nhận vi khuẩn đề kháng mức độ cao với hầu hết các kháng sinh và còn nhạy cảm 100% với colistin, tác giả ghi nhận vi khuẩn còn nhạy cảm thấp với Bactrim (26,4%), nhạy cảm cao với tigecycline (99,0% – 99,1%) và rifampicin. Kết quả nghiên cứu đưa ra khuyến cáo thực nghiệm rằng tổ hợp tigecycline/colistin ít có hiệu quả hiệp đồng và cộng lực in-vitro (36,2%) so với tổ hợp meropenem/colistin (94,3%) và meropenem/rifampicin (81,9%).
- Về dịch tễ học phân tử: Bổ sung cơ sở dữ liệu về các gen liên quan tính kháng carbapenem ở mức kiểu gen tại tỉnh Đồng Nai với tỷ lệ cao của ISAba1 (93,3%), bla<sub>OXA-51</sub> (97,1%), bla<sub>OXA-23</sub> (79%), và bla<sub>NDM-1</sub> (13,3%).
- Về hệ gen học: Phát hiện 9 gen đề kháng kháng sinh chưa từng được công bố trong một chủng A. baumannii trước đây, trong đó có 2 gen kháng beta-lactam mới là bla<sub>OXA-64</sub> và bla<sub>CARB-2</sub>; ghi nhận lần đầu tiên sự cùng tồn tại của bla<sub>NDM-1</sub> và bla<sub>OXA-58</sub> trên cùng một chủng vi khuẩn. Dữ liệu giải trình tự phát hiện các vùng prophage, protein đặc trưng loài và các yếu tố độc lực làm cơ sở nghiên cứu bệnh sinh phân tử.
- Về kiểm chứng thực nghiệm: Cung cấp 19 trình tự gen kháng thuốc in-vitro đã giải trình tự Sanger cải tiến thành công, trong đó có gen bla<sub>CARB-2</sub> lần đầu tiên được phân lập ở A. baumannii.
Kiến nghị của luận án gồm 4 điểm:
- Thử nghiệm phối hợp meropenem/tigecycline và rifampicin/colistin để đánh giá toàn diện hơn tác dụng hiệp đồng và cộng lực giữa các kháng sinh còn nhạy cảm.
- Nghiên cứu thời gian diệt khuẩn trên mô hình động vật thí nghiệm (chuột viêm phổi, thỏ viêm màng não) để đánh giá tác dụng in-vivo của các phối hợp kháng sinh.
- Phân lập và khảo sát các gen độc lực, vùng prophage và protein đặc trưng loài để nghiên cứu cơ chế sinh bệnh mức phân tử và tìm kháng nguyên ứng viên cho vaccine.
- Phân lập và phân tích biểu hiện của các trình tự chèn ISAba nhằm làm rõ mức độ điều hòa kháng thuốc.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của luận án gắn liền với phạm vi nghiên cứu:
- Thử nghiệm tác dụng phối hợp diệt khuẩn của các kháng sinh mới được thực hiện in-vitro qua phương pháp bàn cờ, chưa tiến hành đánh giá dược động học/dược lực học in-vivo trên cơ thể sống.
- Số lượng chủng được giải trình tự toàn bộ hệ gen thế hệ mới (NGS) dừng lại ở 2 chủng đại diện đặc trưng (DMS06669 và DMS06670), chưa mở rộng giải trình tự cho toàn bộ 105 chủng nghiên cứu.
- Các vùng prophage và họ protein gây bệnh mới dừng lại ở mức dự đoán in-silico và thống kê so sánh, chưa tiến hành thử nghiệm knock-out hoặc biểu hiện chức năng thực nghiệm.
Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: đánh giá tác dụng phối hợp kháng sinh trên mô hình động vật thí nghiệm; nghiên cứu biểu hiện mức độ phiên mã của promoter ISAba1; và khai thác các protein đặc trưng loài phục vụ mục tiêu điều chế vaccine phòng ngừa A. baumannii.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn cho nhiều nhóm đối tượng:
- Bác sĩ lâm sàng, dược sĩ bệnh viện và chuyên viên kiểm soát nhiễm khuẩn: Tham khảo số liệu kháng thuốc tại chỗ, phân bố giá trị MIC, và các bằng chứng thực nghiệm về hiệu quả vượt trội của tổ hợp meropenem/colistin hoặc meropenem/rifampicin so với tổ hợp tigecycline/colistin để cân nhắc xây dựng phác đồ điều trị phối hợp khi gặp vi khuẩn đa kháng.
- Nghiên cứu sinh và học viên ngành Vi sinh học, Y học thực nghiệm, Công nghệ sinh học: Tham khảo quy trình kỹ thuật chuẩn về multiplex PCR phát hiện nhóm gen bla<sub>OXA</sub>, realtime PCR phát hiện bla<sub>NDM-1</sub>, ISAba1, và quy trình thực hiện kỹ thuật hiệp đồng bàn cờ.
- Nhà nghiên cứu Tin – Sinh học: Tham khảo quy trình phân tích hệ gen vi khuẩn vi sinh lâm sàng, phương pháp phân tích phát sinh loài ANI, khai thác cơ sở dữ liệu ResFinder, PathogenFinder, PHAST, phân tích cụm gen trực giao COG và mô hình hóa pan-genome vi khuẩn.
Câu hỏi thường gặp
1. Những kháng sinh nào còn duy trì được tỷ lệ nhạy cảm cao với các chủng A. baumannii kháng carbapenem trong nghiên cứu?
Dữ liệu thử nghiệm tính nhạy cảm cho thấy chỉ có colistin (nhạy cảm 100%) và tigecycline (nhạy cảm 99,0% – 99,1%) duy trì được độ nhạy cảm cao trên hầu hết các chủng phân lập. Kháng sinh rifampicin còn nhạy cảm ở mức 59,5% (hoặc 91,4% tùy theo ngưỡng đánh giá phối hợp), Bactrim chỉ còn nhạy cảm 26,4%, trong khi aminoglycoside, fluoroquinolone và các beta-lactam khác hầu như bị kháng hoàn toàn.
2. Hiệu quả diệt khuẩn in-vitro của tổ hợp meropenem/colistin và meropenem/rifampicin khác biệt như thế nào so với tổ hợp tigecycline/colistin?
Tổ hợp meropenem/colistin cho tỷ lệ hiệp đồng và cộng lực cao nhất đạt 94,3% (42,9% hiệp đồng, 51,4% cộng lực), tiếp theo là meropenem/rifampicin đạt 81,9% (34,3% hiệp đồng, 47,6% cộng lực). Ngược lại, tổ hợp tigecycline/colistin chỉ đạt 36,2% tác dụng hiệp đồng và cộng lực, trong khi tỷ lệ độc lập lên tới 63,8%. Kiểm định McNemar xác nhận sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,001).
3. Tỷ lệ phân bố các gen kháng carbapenem và trình tự chèn ISAba1 trên 105 chủng lâm sàng được ghi nhận ra sao?
Tỷ lệ hiện diện của các gen lần lượt là: bla<sub>OXA-51</sub> đạt 97,1% (102 chủng); trình tự chèn ISAba1 đạt 93,3% (98 chủng); bla<sub>OXA-23</sub> đạt 79,0% (83 chủng); bla<sub>NDM-1</sub> đạt 13,3% (14 chủng); bla<sub>OXA-58</sub> đạt 7,6% (8 chủng); và không phát hiện chủng nào mang gen bla<sub>KPC</sub> (0%). Đa số các chủng (80%) tích lũy đồng thời 3 gen kháng carbapenem.
4. Hai chủng đặc trưng DMS06669 và DMS06670 mang những gen kháng beta-lactam nào đáng chú ý chưa từng công bố trước đây ở A. baumannii?
Phân tích hệ gen in-silico bằng ResFinder phát hiện chủng DMS06669 mang gen bla<sub>OXA-64</sub> và chủng DMS06670 mang gen bla<sub>CARB-2</sub>. Cả hai gen này chưa từng được công bố trước đó trên các chủng A. baumannii. Ngoài ra, chủng DMS06669 còn là trường hợp đầu tiên ghi nhận sự đồng xuất hiện của cả hai gen carbapenemase quan trọng là bla<sub>NDM-1</sub> và bla<sub>OXA-58</sub>.
5. Kết quả phân tích pan-genome của 23 hệ gen A. baumannii phản ánh đặc điểm sinh học gì của loài vi khuẩn này?
Pan-genome của 23 hệ gen chứa tổng cộng 15.883 gen. Đường cong kích thước pan-genome tăng dần và phù hợp với mô hình hồi quy Power-law (r² = 0,999, hệ số Bpan = 0,44), khẳng định A. baumannii sở hữu một pan-genome "mở". Đặc điểm này phản ánh khả năng liên tục thu nhận các vật liệu di truyền ngoại lai từ môi trường để gia tăng tính đa dạng sinh học và thích nghi đề kháng kháng sinh.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Sĩ Tuấn đã làm rõ bức tranh đề kháng kháng sinh mức độ phân tử của 105 chủng A. baumannii kháng carbapenem tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai giai đoạn 2013–2017. Công trình chứng minh hiệu quả diệt khuẩn in-vitro vượt trội của tổ hợp meropenem/colistin và meropenem/rifampicin, đồng thời chỉ ra tỷ lệ tích lũy cao của các gen bla<sub>OXA-51</sub>, bla<sub>OXA-23</sub>, bla<sub>NDM-1</sub> và trình tự chèn ISAba1. Thông qua giải trình tự toàn bộ hệ gen hai chủng đặc trưng bằng công nghệ NGS, luận án phát hiện các gen kháng beta-lactam mới (bla<sub>OXA-64</sub>, bla<sub>CARB-2</sub>), mô tả đặc tính pan-genome mở, và kiểm chứng thành công 19 trình tự gen kháng thuốc in-vitro bằng phương pháp Sanger cải tiến, đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho nghiên cứu y sinh học phân tử tại Việt Nam.
