CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A Cấu tạo chung Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae gồm 3 típ A, B và C, trong đó típ A và B thường gây thành dịch, típ C gây bệnh nhẹ và không lan thành dịch. Hệ gen của vi rút cúm A là Axit Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein. Về mặt cấu trúc, nucleocapsid được bao bọc bởi Hình 1.
Cấu trúc vi rút cúm màng protein nền (M1), phía ngoài Nguồn: http://viralzone.org/ màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong endosome thay đổi, có vai trò quan trọng trong việc hình thành hạt Hình 1. Hình ảnh vi rút cúm vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại Nguồn: www.com glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).
Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1 và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp 5 ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein).
Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA và các protein không cấu trúc NS (non structure). Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A Hệ gen của vi rút cúm A Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần (Bảng 1).
Đoạn RNA 1, 3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA. Mỗi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1- NS2. Tại hai đầu mỗi phân đoạn gen có trình tự nucleotide bảo tồn gồm 13 nucleotide ở đầu 5' (5'-AGUAGAAACAAGG) và 12 nucleotide ở đầu 3' (3'UCGUUUUCGUCC), trừ phân đoạn gen 1, 2, 3 và 7 nucleotide thứ 4 C thay cho U [47]. Trình tự nucleotide này đặc trưng riêng cho vi rút cúm mà không tồn tại ở các vi rút các, có ý nghĩa lớn trong việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích trình tự gen của vi rút.
Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Protein HA được tổng hợp ở dạng tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0. Dưới điều kiện pH axit và các enzyme phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu nối di-sulphua [19]. Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm nhiễm.
Các phân đoạn gen của vi rút cúm A Chiều dài Protein Chiều dài protein Đoạn đoạn gen được mã được mã hóa Chức năng RNA (Nucleotide) hóa (Axit amin) 1 2341 PB2 759 Polymerase khởi đầu phiên mã Kéo dài phiên mã, hoạt hóa PB1 757 enzyme nội bào 2 2341 Thúc đẩy quá trình chết của tế PB1-F2 87 bào chủ 3 2233 PA 716 Kéo dài phiên mã Ngưng kết hồng cầu, bám gắn 4 1778 HA 550 xâm nhập vào tế bào chủ Bám gắn với RNA, điều khiển 5 1565 NP 498 quá trình nhân lên của vi rút. Giải phóng vi rút khỏi tế bảo 6 1413 NA 454 chủ Protein nền: Thành phần chính M1 252 của vi rút. 7 1027 Kênh ion, cởi áo và lắp ráp M2 97 thành phần vi rút Protein đối kháng interferon, NS1 230 điều khiển dấu ấn của vi rút trên tế bào chủ 8 890 Chuyển RNA vi rút từ nhân ra NS2 121 tế bào chất (trong tế bào chủ) 7 Trên bề mặt tế bào biểu mô đường hô hấp của người, HA gắn vào thụ thể α2,6 axit sialic; đối với gia cầm, HA gắn vào thụ thể α2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể α2,3 axit sialic và α2,6 axit sialic. Ngoài ra, HA gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào hồng cầu người nhóm máu O, hồng cầu chuột lang, hồng cầu ngỗng, hoặc gà tây gây nên hiện tượng ngưng kết hồng cầu [118].
Năm vị trí quyết định kháng nguyên khác cũng đã được xác định trên protein HA1, tương tác với kháng thể của vật chủ. Các thay đổi có liên quan đến thay đổi đặc tính kháng nguyên xảy ra chủ yếu trên phần HA1, do vậy, HA1 được sử dụng để tìm hiểu đặc tính kháng nguyên và tiến hóa của vi rút. Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme, neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide.
NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ. Việc loại bỏ phần axit sialic khỏi phần HA mới được tổng hợp còn có tác dụng tránh sự tự ngưng kết giữa các hạt vi rút mới sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào, đảm bảo vi rút mới sau khi được giải phóng có khả năng gây nhiễm. Neuraminidase cũng đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi rút cúm. Sự hoạt động của neuraminidase làm tăng hoạt động của các cytokine, thúc đẩy nhanh quá trình chết của tế bào chủ.
Ngoài ra, các nhà khoa học đã chứng minh được vi khuẩn gây nhiễm trùng thứ phát như viêm phổi đặc biệt nguy hiểm cho các bệnh nhân có bệnh mạn tính, trẻ nhỏ, người già và phụ nữ có thai, có quan hệ chặt chẽ với những hoạt động của neuraminidase như nhiễm Streptococcus pneumonia, có thể làm quá trình viêm nhiễm đường hô hấp trầm trọng hơn [122]. Vi rút cúm A được chia thành các phân típ dựa trên hai kháng nguyên bề mặt heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) của vi rút. Sử dụng HA để xác định phân nhóm của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau, trong đó H17 được xác định từ vi rút phân lập từ dơi 8 [105]. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1 đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9).
Dựa vào sự khác nhau về axit amin tại vùng đầu phía ngoài, neuraminidase của vi rút cúm được chia làm 2 nhóm riêng biệt [109]: Nhóm 1 gồm N1, N4, N5 và N8 Nhóm 2 gồm N2, N3, N6, N7 và N9. Sự thay đổi axit amin tại vị trí 147-152 đã tạo nên vùng khác biệt về hình khối nằm ngay cạnh vị trí hoạt động của N1 mà không xảy ra trên N2. Vùng khác biệt này có thể được coi là vùng đích của thuốc kháng vi rút trong tương lai. Thuốc kháng vi rút oseltaminvir, zanamivir gắn vào NA, ức chế khả năng giải phóng của vi rút cúm dựa trên hiểu biết về hoạt động của neuraminidase, xúc tác quá trình cắt đứt mối liên kết α2,3 hoặc α2,6 ketosidic giữa axit sialic và thụ thể HA.
Tuy nhiên, các đột biến về axit amin trên phân đoạn gen mã hóa NA tại các vị trí bám gắn với thuốc là nguyên nhân của sự kháng thuốc của vi rút, cụ thể với N1 tại vị trí I117V, I222K, S246N, H275Y và N294S; với N2 tại các vị trí E119V, Q136K, R292K và N294S. Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 được coi là gen có tính bảo tồn cao, mã hóa cho hai protein M1 và M2. Protein M1 được mã hóa từ nucleotide vị tí 26 đến 784, protein M2 được tổng hợp qua quá trình ghép nối từ nucleotide vị trí 26- 51 và từ 740-1007 [19, 65]. Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp vỏ của vi rút, làm cầu nối giữa các thành phần bên trong và các protein bề mặt của vi rút, có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho vi rút nảy chồi.
M2 là một protein xuyên màng, phần ngoài tương tác với hệ miễn dịch của vật chủ [54] và phần xuyên màng hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, phá vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1 với RNP, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm [3] [22, 56, 57]. 9 Amantadine gắn vào kênh ion xuyên màng, ngăn chăn sự “cởi áo” này. Tuy nhiên, những thay đổi axit amin tại vị trí bám gắn 26, 27, 30, 31 và 34 trên kênh ion với amantadine đã tạo ra sự kháng thuốc của vi rút (vị trí gắn kết V27A Valin chuyển sang Alanin, A30T Alanin sang Threonin, S31N Serin sang Asparagin và G34E Glycin sang Axit Glutamic), trong đó vị trí 31 chuyển từ Serin sang Asparagin là vị trí có tần suất xuất hiện nhiều [47, 52]. Hiện tượng kháng amantadine xảy ra phổ biến trên gen M của vi rút cúm A/H3N2, ít gặp ở các chủng cúm A/H1N1, tuy nhiên khi chủng cúm A/H1N1pdm09 xuất hiện thì hầu hết gen M, do hiện tượng trao đổi và tích hợp gen, mang gen M của chủng vi rút cúm lợn Á Âu có đột biến kháng thuốc amantadine tại vị trí 31 (S31N) [18, 53].
Các polymerase PB1, PB2 và PA: Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm có các phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase. Phức hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm vụ khởi đầu và kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút [15] (hình 1. Trong quá trình hoạt động của vi rút cúm, đột biến xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa PB2 có liên quan đến khả năng thích nghi của vi rút [56, 99], đặc biệt với vi rút cúm gia cầm H5N1. Đột biến này đã được xác định trên gen PB2 của chủng cúm gia cầm mới xuất hiện A/H7N9 [62, 63].
